Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Z-scores voor het beoordelen van de ovariële reserve bij jonge patiënten die vruchtbaarheidsbehoud ondergaan

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66504

⸱

25 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Obstetrics and Gynecology, Department of Clinical Science, Intervention and Technology, Karolinska Institutet, 2Department of Gynecology and Reproductive Medicine, Karolinska University Hospital, 3Applied Tumor Genomics Research Program, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 4Department of Medical and Clinical Genetics, Medicum, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 5Children's Hospital, Pediatric Research Centre, University of Helsinki and Helsinki University Hospital, 6NORDFERTIL Research Lab Stockholm, Department of Women's, and Children's Health, Karolinska Institutet, and Karolinska University Hospital, 7Department of Obstetrics and Gynecology, Helsinki University Hospital, University of Helsinki, 8Department of Cell and Molecular Biology, Uppsala University, 9Department of Women's and Children's Health, Uppsala University

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een methode voor het beoordelen van de ovariële reserve bij patiënten jonger dan 25 jaar die vruchtbaarheidsbehoud nodig hebben door cryopreservatie van eierstokweefsel. Deze methode omvat: (1) histologische beoordeling van de ovariële reserve in corticale monsters, (2) vergelijking met een referentiedataset en (3) berekening van Z-scores.

Samenvatting

Vrouwen worden geboren met een niet-hernieuwbare pool van ovariële follikels, ook wel de ovariële reserve genoemd. Deze reserve bestaat uit primordiale follikels in de eierstokken en kan worden beïnvloed door vele factoren, zoals genetische en endocriene aandoeningen, medische ingrepen en hormoonontregelaars. Behoud van de vruchtbaarheid wordt aanbevolen wanneer gonadotoxische behandelingen nodig zijn. De voorkeursopties voor vrouwen zijn cryopreservatie van eicellen en embryo's. Bij zeer jonge, seksueel onvolgroeide patiënten is cryopreservatie van eierstokweefsel echter de enige optie. Het kennen van de folliculaire dichtheid van ingevroren weefselmonsters is essentieel bij vruchtbaarheidsbegeleiding voor jonge patiënten. Dit protocol demonstreert het gebruik van Z-scores voor corticale follikeldichtheid als een hulpmiddel om de kwaliteit van eierstokweefsel te evalueren bij meisjes en jonge vrouwen van 25 jaar en jonger die vruchtbaarheidsbehoud ondergaan. De follikeldichtheid in patiëntmonsters wordt vergeleken met leeftijdsgenormaliseerde referentiestandaarden, ontwikkeld door Hassan et al. om mogelijke afwijkingen van de standaard te schatten. De follikeldichtheid wordt gemeten door middel van histologische kwantificering. Hiervoor wordt een klein stukje ovariumcorticaal weefsel (~ 2 mm x 2 mm x 2 mm) gefixeerd in Bouin's of formaldehyde-oplossing, ingebed in paraffine, in secties met een dikte van 4 μm, gekleurd met hematoxyline en eosine en gedigitaliseerd met behulp van een diascanner. Folliculaire stadia die in de cortex aanwezig zijn, variëren van primordiale tot primaire follikels. Het corticale gebied bevond zich op histologische secties op 1 mm van het oppervlakte-epitheel. De follikeldichtheid wordt berekend met behulp van een gewijzigde formule gepresenteerd door Schmidt et al., en de Z-score wordt bepaald aan de hand van het referentiegemiddelde en de standaarddeviatie. De Z-score geeft aan hoeveel de gemeten waarde afwijkt van het referentiegemiddelde, en bepaalt zo de verminderde (<-1,7 Z-score) ovariële reserve. Met deze methode kan de dichtheid van de follikels worden gebruikt als een waardevolle maatstaf voor de ovariële reserve voor jonge patiënten die vruchtbaarheidsbehoud nodig hebben.

Inleiding

De eierstok is een dynamisch, endocrinologisch actief orgaan, bestaande uit een buitenste cortex en een binnenste merg. Heterogeen verdeeld in de eierstokken zijn follikels, die de gonadale eicel bevatten omgeven door stromale granulosacellen1. Alle follikels zijn al gevormd tijdens de ontwikkeling van de foetus, met een piek rond de 20 weken zwangerschapsduur, gevolgd door een exponentiële achteruitgang. Bij de geboorte blijven 1-2 miljoen primordiale follikels achter in de cortex, en slechts een paar honderdduizend follikels overleven tot de puberteit2. De niet-groeiende follikelpool, ook wel de ovariële reserve genoemd, beïnvloedt onder andere de vruchtbaarheid van een vrouw. De ovariële reserve bevindt zich in de cortex en verplaatst zich naar de medulla naarmate de follikels groeien en rijpen. Sommige onderzoekers erkennen dat de ovariële reserve alleen uit primordiale follikels bestaat, terwijl anderen alle unilaminaire follikels omvatten (d.w.z. primordiale, intermediaire en primaire)3,4,5,6. Tijdens het leven van een vrouw rijpen slechts 300-400 follikels en overleven om uiteindelijk een eisprong te ondergaan. De menopauze begint wanneer het aantal follikels daalt tot ongeveer duizend, wat meestal gebeurt rond de leeftijd van50 jaar 2,7. Er is momenteel een debat gaande over de aanwezigheid van oögonale stamcellen (OSC's) in volwassen menselijke eierstokken die eicellen kunnen vormen na xenotransplantatie. Sommige studies suggereren het isoleren van cellen die een genprofiel van primitieve kiemcellen tot expressie brengen en differentiëren tot eicellen 8,9, terwijl andere aangeven dat de vermeende OSC's perivasculaire cellen van de bloedvaten zijn 10,11,12.

Voortijdige ovariële insufficiëntie (POI) wordt gedefinieerd door het stopzetten van de menstruatiecyclus met verhoogde FSH-waarden vóór de leeftijd van 40 jaar13. De oorzaken van POI zijn multifactorieel en kunnen idiopathisch optreden; Het ontstaat echter vaak als gevolg van medische aandoeningen14. Bepaalde aangeboren genetische aandoeningen worden bijvoorbeeld in verband gebracht met POI vanwege een verminderde ovariële reserve al bij de geboorte, zoals het syndroom van Turner15. POI kan ook optreden als bijwerking van gonadotoxische behandelingen, wat vooral problematisch is bij zeer jonge patiënten, omdat het kan leiden tot een onvermogen om een normale puberteit te ondergaan en de ovariële reserve drastisch kan aantasten. Afhankelijk van het risico op POI en de leeftijd van de patiënt, zijn er verschillende opties voor het behoud van de vruchtbaarheid beschikbaar, zoals cryopreservatie van rijpe eicellen, cryopreservatie van embryo's na in-vitrofertilisatie en cryopreservatie van eierstokweefsel (OTC). Voor pre-puberale patiënten is OTC de enige haalbare optie vanwege hun seksuele onvolwassenheid16,17. In de Verenigde Staten wordt het behoud van de vruchtbaarheid door middel van OTC onlangs beschouwd als een acceptabele klinische routine18. OTC wordt echter in veel Europese landen nog steeds als experimenteel beschouwd en ethische goedkeuring is vereist, met name voor autotransplantatie 19,20. Daarom moeten de inclusiecriteria voor OTC-protocollen zorgvuldig worden overwogen en moet voor elke patiënt een risico-batenanalyse worden uitgevoerd. Niet alle kinderen die gonadotoxische therapieën krijgen, komen in aanmerking voor vruchtbaarheidsbehoud. In Zweden wordt alleen patiënten met een hoog of zeer hoog risico aanbevolen om vruchtbaarheidsbehoud te ondergaan in overeenstemming met de richtlijnen voor vruchtbaarheidsbehoud van de Nordic Society of Paediatric Hematology and Oncology21. Deze groep omvat (1) pre- en post-puberale kinderen die stamceltransplantatie nodig hebben of bestraling met de eierstok krijgen in het bereik, en (2) post-puberale kinderen met hoge cumulatieve doses alkylerende chemotherapie. Voor meisjes vóór de menarche omvatten de inclusiecriteria voor een zeer hoog risico op onvruchtbaarheid degenen die worden behandeld met een van de volgende: stralingsdosis >10 Gy voor de eierstok, of allogene of autologe hematopoëtische stamceltherapie (HSCT). Uitsluitingscriteria zijn onder meer degenen die vóór de operatie aanvullende bloedproducten nodig hebben voor andere antistollingspreparaten of die een aantal neutrofielen <1 hebben. Voor meisjes/vrouwen na de menarche omvatten de inclusiecriteria voor een hoog of zeer hoog risico op onvruchtbaarheid degenen die worden behandeld met een van de volgende: stralingsdosis >10 Gy voor de eierstok, of allogene HSCT, cyclofosfamide >9 g/m², ifosfamide >60 g/m², procarbazine of nitrosoureumverbindingen (BCNU/CCNU) >360 mg/m². Uitsluitingscriteria zijn onder meer die met een verhoogd risico op bloedingen, een verhoogd risico op infectie, een verhoogd risico op chirurgische complicaties of een verhoogd risico op pijnproblemen, zoals beoordeeld door de verantwoordelijke arts.

Voor OTC wordt eierstokweefsel verzameld tijdens buikoperaties door middel van laparotomie of laparoscopie door middel van eenzijdige ovariëctomie of biopsie. De medulla wordt verwijderd uit het verzamelde eierstokweefsel en de resterende cortex wordt vervolgens in kleinere fragmenten verdeeld voor cryopreservatie door middel van gecontroleerde bevriezing of vitrificatie voor later gebruik bij vruchtbaarheidsherstel22. De monsters worden vervolgens opgeslagen in vloeibare stikstof totdat de patiënt herstelt van haar behandeling en een gezin wil stichten. Afhankelijk van het type kanker en bij afwezigheid van contra-indicaties voor transplantatie van eierstokweefsel, wordt het weefsel vervolgens ontdooid en automatisch getransplanteerd om de hormonale en eierstokfunctie te herstellen. OTC is succesvol gebleken, met een zwangerschapspercentage van 50% en meer dan 200 levendgeborenen gemeld na transplantatie van ingevroren ovariumweefsel verzameld tijdens de volwassenheid 23,24,25. Er zijn maar weinig gemelde levendgeborenen na autotransplantatie van eierstokweefsel dat tijdens de kindertijd is verzameld, en er zijn er geen gemeld na autotransplantatie van ongetwijfeld pre-puberaal ovariumweefsel 26,27,28,29,30. Weefselkwaliteit is een voorwaarde voor succesvol vruchtbaarheidsherstel31. Daarom is het essentieel om de kwaliteit van de verzamelde weefselmonsters te bestuderen.

Momenteel is een manier om de kwaliteit van het eierstokweefsel te schatten door middel van histologische secties en handmatige telling van de follikels. Het beoordelen van de normaliteit van de follikeldichtheid is echter moeilijk vanwege de natuurlijke achteruitgang van de reserve met toenemende leeftijd en de heterogene verdeling van follikels. Bovendien is de vergelijking met referentiewaarden een uitdaging omdat ze niet gestandaardiseerd zijn voor biopsiegrootte en leeftijd. Andere beoordelingsopties, zoals AMH-serumspiegels of kleuring van verteerd weefsel met calceïne of neutraal rood, zijn ofwel niet goed ingeburgerd of hebben hun eigen beperkingen. Wallace en Kelsey publiceerden eerder een model van normale ovariële reserve over de leeftijd door gegevens te verzamelen over het aantal follikels van hele eierstokken van patiënten zonder bekende eierstokpathologieën. Bovendien, omdat biopsieën niet representatief zijn voor de hele eierstok, ontwikkelden Schmidt et al. een methode voor het schatten van het totale aantal follikels op basis van corticale biopsieën32. Met behulp van een aangepaste versie van deze methode en het model van de normale ovariële reserve werd een referentiedataset voor de follikeldichtheid van vrouwen in de leeftijd van 0-25 jaar vastgesteld33.

Dit artikel beschrijft de strategie voor het beoordelen van de normaliteit van de follikeldichtheid op basis van kleine eierstokmonsters door (1) directe kwantificering van de follikels met behulp van histologie en (2) vergelijking van de resultaten met leeftijdsgenormaliseerde standaardreferenties via Z-scores. Het gebruik van Z-scores beschrijft de relatie tussen de follikeldichtheid van een ovariumbiopy en een leeftijds- en grootte-gestandaardiseerd referentiegroepgemiddelde. Dit zal van grote waarde zijn voor artsen bij het adviseren van hun patiënten voor autotransplantatie en verdere behandeling na behoud van de vruchtbaarheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle uitgevoerde procedures werden goedgekeurd door de Zweedse Ethische Beoordelingsautoriteit (Sveafertil-patiënten, Dnr: 2019-03802) en door de Ethische Commissie van het Universitair Ziekenhuis van Helsinki (HCH-patiënten, Dnr 340/13/03/03/2015). Schriftelijke en mondelinge informatie over de studie werd verstrekt door de onderzoeksverpleegkundigen en geïnformeerde toestemming werd verkregen in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Voor patiënten jonger dan 18 jaar werd geïnformeerde toestemming verkregen van de wettelijke voogden. Alle monsters werden gepseudonimiseerd en verwerkt volgens de Europese Algemene Verordening Gegevensbescherming (AVG). De details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Verzameling en verwerking van eierstokweefsel

OPMERKING: Identificeer alle patiënten die in aanmerking komen voor vruchtbaarheidsbehoud wanneer er een indicatie is voor een hoog of zeer hoog risico op onvruchtbaarheid volgens lokale richtlijnen (bijv. Scandinavische, Europese of internationale specifieke richtlijnen). Rekruteer in Europa alleen minderjarige patiënten als onderdeel van onderzoeksprogramma's voor het behoud van de vruchtbaarheid. Bepaal het risico op onvruchtbaarheid met behulp van de richtlijnen van uw land voor het behoud van de vruchtbaarheid.

  1. Voer de chirurgische ingreep uit onder algehele narcose. Dien intraveneus propofol (2 mg/kg), sufentanil (0,5 microgram/kg) en rocuroniumbromide (0,6 mg/kg) toe voor de inductie van anesthesie.
    1. Intubeer en beadem de patiënt met een ademvolume van 6-8 ml/kg en een positieve uitademingsdruk van 6-8 cm van H2O. Dien sevofluraan 1% tot 2% toe via de endotracheale tube om de inhalatie-anesthesie te behouden.
    2. Handhaaf de neuromusculaire blokkade met rocuroniumbromide (0,15 mg/kg) tijdens de chirurgische ingreep om voldoende spierontspanning te bieden en laparoscopie mogelijk te maken bij lagere intra-abdominale insufflatiedrukken.
    3. Gebruik de bispectrale index om de anesthesiediepte te bepalen om snel ontwaken te vergemakkelijken met een verlaagde anesthesiedosis. Antagoniseer de resterende neuromusculaire blokkade met sugammadex (2-4 mg/kg).
  2. Steek met behulp van een driepoortstechniek een trocar van 10 mm in de peritoneale holte bij de navel om een optische lens te introduceren met een camera eraan, en twee trocars van 5 mm in de linker- en rechterdarmbeenderen (2 cm boven en 2 cm mediaal van de respectieve voorste bovenste darmbeenwervelkolom) onder direct zicht voor de chirurgische instrumentatie en weefselwinning. Inspecteer de bekkenorganen, inclusief beide eierstokken, om de normaliteit te bevestigen.
    1. Identificeer de eierstok die het gemakkelijkst toegankelijk is en pak deze vervolgens vast. Snijd een volume af dat ongeveer een derde van de eierstok is (of zoals aangegeven in uw ethische vergunning) en gebruik vervolgens, indien nodig, diathermie om hemostase te verzekeren.
      OPMERKING: Voer de biopsie alleen uit als er geen contra-indicaties zijn, zoals risicofactoren voor overmatige intra- of postoperatieve bloeding of een verhoogd risico op infectie. Specificeer duidelijk en volg de in- en uitsluitingscriteria van het land. De hele eierstok kan worden ingenomen als het risico op onvruchtbaarheid erg hoog is en/of het risico om slechts een deel af te snijden als te hoog wordt beschouwd (bijvoorbeeld door een bloeding). Vermijd het gebruik van diathermie voordat u het monster verzamelt, omdat dit het weefsel kan beschadigen.
  3. Plaats het weefsel in de operatiekamer in een buisje met 5 ml 1x Dulbecco's fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) met CaCl2, MgCl2, 1 g/l D-glucose, 36 mg/l pyruvaat, ofwel opgewarmd tot 37 °C als het monster onmiddellijk in het laboratorium wordt verwerkt (binnen 30 minuten) of op 4 °C wordt gehouden tijdens langere transporten (tot 24 uur).
    OPMERKING: Transportoplossingen omvatten een scala aan in de handel verkrijgbare oplossingen voor orgaantransport/perfusie, evenals eenvoudige buffers zoals PBS en MEM34.
  4. Snijd een klein stukje van het eierstokweefsel (2 mm x 2 mm x 2 mm) van het oppervlak van de eierstok. Dit stuk bevat de cortex, het buitenste deel van de eierstok waar de ovariële follikels zich bevinden35.
    LET OP: Behandel menselijke weefsels zoals de eierstok met behulp van bioveiligheidsniveau 2-praktijken en -procedures.
    OPMERKING: Een gespecialiseerde afdeling voor reproductieve geneeskunde cryopbewaart klinisch de rest van het eierstokweefsel voor mogelijk toekomstig gebruik bij het herstel van de vruchtbaarheid van de patiënten.
  5. Breng het weefsel gedurende 2 uur in 350 μl Bouin's oplossing bij kamertemperatuur of een nacht in 350 μl 4% formaldehyde bij 4 °C en zorg ervoor dat het weefsel volledig is ondergedompeld. Was het weefsel na incubatie drie keer met 70% ethanol.
    1. Was voor de oplossing van Bouin totdat de gele kleur verdwijnt. Veranker het weefsel in paraffinewas36. Snijd minimaal 30 seriële weefselcoupes met een dikte van 4 μm en plaats ze op glasplaatjes.
      LET OP: Behandel Bouin's oplossing en formaldehyde in een chemische kap en met de juiste beschermende uitrusting.
      OPMERKING: Formaldehyde kan leiden tot krimpgerelateerde artefacten in het weefsel. De oplossing van Bouin heeft daarom de voorkeur voor het behoud van histologie. De oplossing van Bouin brengt echter extra risico's met zich mee, waardoor verschillende instellingen de voorkeur geven aan het gebruik van formaldehyde37.

2. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring

  1. Weeg 5 g eosine Y-poeder af in een geautoclaveerde glazen fles van 100 ml. Voeg 800 ml 95% ethanol en 200 ml gedeïoniseerd water toe om een 0,5% eosine-bouillonoplossing te maken. Bereid een werkoplossing van 0,25% eosine voor door 200 ml van de 0,5% eosine-stockoplossing te verdunnen met 160 ml 100% ethanol, 1 ml azijnzuur en 40 ml gedeïoniseerd water.
    OPMERKING: Het poeder lost mogelijk niet volledig op. Filtreer de oplossing voor gebruik om neerslag te verminderen.
  2. Plaats dia's in rekken. Dompel het rek met objectglaasjes onder in de overeenkomstige containers in de volgende volgorde: 15 minuten in xyleen, 5 minuten in 100% ethanol, 10 keer onderdompelen in 70% ethanol, 10 keer onderdompelen in 50% ethanol en vervolgens 10 keer onderdompelen in gedeïoniseerd water.
    1. Dompel het rekje met glaasjes 3 minuten onder in hematoxyline-oplossing en breng het rekje met glaasjes vervolgens 30 s over naar een bak met gedestilleerd kraanwater om overtollige hematoxylinevlek weg te spoelen.
    2. Plaats het rekje met glaasjes in een bak met differentiatieoplossing (1 ml 37% HCl toegevoegd aan 100 ml 70% ethanol) gedurende 1 minuut en breng het rekje met objectglaasjes vervolgens over in een bak met gedestilleerd kraanwater gedurende 30 s.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de weefselsecties zijn ondergedompeld in de vloeistof. Voeg indien nodig meer reagens toe aan de container. Vervang xyleen na elke 5 keer gebruik bij het kleuren van grote hoeveelheden. Bereid 50% ethanol voor door 70% ethanol te verdunnen (voeg bijvoorbeeld 35 ml 70% ethanol toe aan 15 ml DPBS om 50 ml 50% ethanol te maken).
      LET OP: Hanteer xyleen in een kap en met de juiste beschermende uitrusting.
  3. Plaats het rek met glaasjes 30-60 s in Scott's kraanwater (ook wel blauwoplossing genoemd) en breng het rek met glaasjes vervolgens 30 s over in een bak met gedestilleerd kraanwater. Dompel het rek met glaasjes 1 minuut onder in de eosine-werkoplossing.
    1. Dehydrateer de objectglaasjes door ze in de volgende reagentia te plaatsen: 100% ethanol gedurende 30 s, een tweede container met 100% ethanol gedurende 30 s en dompel ze vervolgens tweemaal in xyleen. Nadat u het rek uit de xyleenoplossing hebt gehaald, laat u het drogen in een glazen container om te voorkomen dat xyleen in de kap druppelt.
    2. Monteer de schuif met 2 druppels montagevloeistof. Plaats de afdekglaasjes voorzichtig om luchtbellen te voorkomen en laat de montageoplossing drogen.
      LET OP: Hanteer xyleen in een kap en met de juiste beschermende uitrusting.
  4. Digitaliseer dia's door ze indien mogelijk te scannen met diascanners. Als deze optie niet beschikbaar is, gebruik dan een gewone omgekeerde microscoop met een vergroting van 20-40x om de follikels direct te tellen. Zorg ervoor dat u een foto maakt van de hele biopsie om gebiedsmeting in beeldanalysesoftware te vergemakkelijken.

3. Follikel tellen

  1. Als dia's zijn gedigitaliseerd, opent u de bestanden met behulp van de juiste software (bijv. open-source software QuPath38). Indien niet gedigitaliseerd, voert u de analyse rechtstreeks uit met behulp van een omgekeerde microscoop en de bijbehorende software.
    1. Sleep het bestand naar het hoofdvenster van QuPath. Stel het beeldtype in op Brightfield H&E (zie afbeelding 1A). Definieer 1 mm van het oppervlakte-epitheel (een enkele laag kubusvormige cellen die het oppervlak bekleden) met behulp van de schaalbalk. Klik op de ellips en annoteer de follikels (zie figuur 1B).
    2. Tel het aantal follikels binnen dit gebied van 1 mm, van het primordiale tot het primaire stadium. Identificeer het stadium van elke follikel (primordiaal - een laag afgeplatte granulosacellen rond de eicel; tussenstadium - een mengsel van afgeplatte en kubusvormige granulosacellen; primair - een volledige laag kubusvormige granulosacellen rond de eicel).
    3. Voer de monster-ID, de leeftijd, het aantal follikels voor elk objectglaasje, de dikte van de sectie en den-de sectie die wordt geteld in het vel met de naam Follikel in mm3 in het Excel-bestand van de Follikel Z-scorecalculator in (zie aanvullend bestand 1 en figuur 2A).
      OPMERKING: Vanwege de diameter van de follikels (kleinste follikels >35 μm), kan dezelfde follikel in opeenvolgende secties verschijnen. Wees extra voorzichtig bij het tellen van secties waarbij de afstand tussen de secties kleiner is dan de follikeldiameter. Tel bij voorkeur de follikels van elke 10esectie ( bijv. sectie #10, #20, #30). Het oppervlakte-epitheel kan tijdens de weefselverwerking loskomen en is mogelijk slechts gedeeltelijk aanwezig in de objectglaasjes. Tel alleen follikels met zichtbaar cytoplasma. Voor kwaliteitscontrole laat u twee mensen onafhankelijk van elkaar de follikels tellen en bepalen hoe goed hun tellingen op één lijn liggen. Bereken de concordantie tussen waarnemers met behulp van een eenvoudige correlatiefunctie tussen het aantal follikels van elke waarnemer voor hetzelfde monster.
  2. Identificeer de grootste 10% van de follikels in elke getelde sectie door oogbollen. Meet de gemiddelde diameter van deze eicellen door op het lijngereedschap te klikken, twee loodrechte lijnen door het eicelmembraan te trekken en Meten en vervolgens Annotatiemetingen weergeven te selecteren (zie figuur 1C).
    1. Noteer de metingen onder de kolom Lengte μm (zie figuur 1D). Voer de gemiddelde diameter van alle eicellen in het veld Gemiddelde eiceldiameter (μm) in voor elk objectglaasje in het Excel-bestand van de Follikel Z-score calculator (Follikel in mm3, zie Aanvullend bestand 1 en Figuur 2A).
  3. Plaats de afbeelding in het midden van het scherm in QuPath en klik vervolgens op het ImageJ-pictogram . Selecteer Snapshot naar ImageJ sturen (zie afbeelding 3A). Baken in afbeelding J 1 mm van de rand af met behulp van het penseel . Klik op de afbeelding, vervolgens op Type en selecteer 8-bits (zie afbeelding 3B).
    1. Klik op het lijngereedschap , teken een lijn op de schaalbalk linksonder in het scherm (zie Figuur 3C). Klik op Analyseren, vervolgens op Schaal instellen, voer de lengte in die wordt aangegeven in de schaalbalk in het veld Bekende afstand en klik op OK (zie afbeelding 3C). Klik op Afbeelding, vervolgens op Aanpassen, Helderheid/contrast en selecteer Auto (zie afbeelding 3D).
    2. Klik op Afbeelding, vervolgens op Aanpassen, Drempel en selecteer Auto (zie afbeelding 3E). Klik op het toverstokgereedschap , selecteer het gebied en druk vervolgens op Ctrl + M (zie afbeelding 3F). Voer de oppervlaktewaarde in het Excel-bestand van de follikel Z-score calculator in (follikel in mm3, zie aanvullend bestand 1 en figuur 2A).

4. Berekeningen van follikeldichtheid, corticaal volume en Z-score

  1. Gebruik het meegeleverde Excel-bestand van de Follicle Z-score calculator om de onderstaande berekeningen automatisch uit te voeren. De resultaten verschijnen in de fiche "Z-score (follikel per mm³)" in de Excel-calculator (zie aanvullend bestand 1), op voorwaarde dat de gegevens vermeld in sectie 3 worden ingevoerd in de fiche "follikels in mm³".
  2. Om de follikeldichtheid in deze secties te berekenen, gebruikt u de gewijzigde formule gepresenteerd door Schmidt et al.32. Pas eerst de correctiefactor α toe om rekening te houden met dubbeltelling van dezelfde follikel. De gewijzigde formule is als volgt:
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    OPMERKING: In deze formule is t de dikte van de doorsnede, d is de diameter van de eicel en q is het quotiënt van de follikeldiameter gedeeld door de dikte van de doorsnede.
  3. Extrapoleer het totale aantal follikels (n follikels) in de cortex uit het aantal follikels in de sectie met behulp van de volgende formule33:
    figure-protocol-3
    OPMERKING: Deze formule houdt ook rekening met alle niet-berekende secties. Hier staat γ voor het aantal secties dat niet wordt berekend (bijv. γ = 10 als elke 10esectie wordt geteld), α de correctiefactor is berekend in 4.1, N het aantal getelde secties en n i het totale aantal follikels in de getelde secties.
    1. Extrapoleer het volledige corticale volume (V) van de getelde gebieden met behulp van de volgende formule33:
      figure-protocol-4
      OPMERKING: Hier is Ai het gebied van de sectie en ti is de weefseldikte. Controleer stap 4.2 op γ en N.
    2. Gebruik de volgende formule33 om de follikeldichtheid te berekenen:
      figure-protocol-5
  4. Bepaal of er sprake is van een verminderde (<-1,7 Z-score) ovariële reserve door de Z-score te berekenen met behulp van de formule33:
    figure-protocol-6
    OPMERKING: De Z-score wordt automatisch berekend in het blad "Z-score (follikel per mm³)" in de Excel-calculator (zie aanvullend bestand 1) op basis van informatie in sectie 3 (Follikeltelling) (Figuur 2B). In deze formule staat Z voor de Z-score, x voor de berekende follikeldichtheid (follikels/cm3) van de onderzoekssteekproef (stap 4.4), M voor de gemiddelde follikeldichtheid van de betreffende leeftijdsgroep en SD voor de standaarddeviatie van de betreffende leeftijdsgroep. Referentiewaarden voor vrouwen in de leeftijd van 0-25 jaar zijn vastgesteld in Hassan et al.33. Gemiddelden en standaarddeviaties van follikeldichtheden van de respectieve leeftijdsgroepen zijn te vinden in het Excel-bestand van de Follikel Z-score calculator (aanvullend bestand 1) en worden gebruikt voor de berekeningen van de Z-score.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Ovariumfollikels worden gekwantificeerd na succesvolle secties, kleuring en scannen van objectglaasjes. De verschillende stadia en gezondheid van de follikels worden onderscheiden en verder geanalyseerd. In figuur 4A wordt een HE-gekleurde dwarsdoorsnede van een Bouin-gefixeerde eierstok van een volwassene weergegeven, met voorbeelden van corticaal en medullair weefsel. Figuur 4B toont een representatief beeld van de eierstok va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vrouwen worden geboren met een eindige pool van eicellen, die niet kunnen worden aangevuld. Ovariële reserve is een belangrijke bepalende factor voor het voortplantingsvermogen van een vrouw. Dit artikel schetst een methode voor de histologische kwantificering van follikeldichtheid en de vergelijking ervan met referentiestandaarden met behulp van Z-scores van ovariële corticale follikeldichtheden bij jonge patiënten en vrouwen tot 25 jaar.

In dit protocol word...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We willen de zorgprofessionals bedanken die ons hebben geholpen bij het werven van deelnemers en het verzamelen van weefsels en alle patiënten die hun eierstokweefsel hebben gedoneerd. We erkennen ook het Kinderkankerfonds (PR2020-0096) en het Karolinska Institutet PhD-financiering KID, wiens financiering dit werk mogelijk heeft gemaakt. We willen ook de faciliteit voor morfologische fenotypeanalyse bedanken voor de voorbereiding van de histologische dia's. We danken Nicola Byers voor het redigeren van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x Dulbecco's Phosphate Buffered SalineThermo Fisher14190144
1x Phosphate Buffered Saline w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate Thermo Fisher14287-080
37% Hydrochloric acidSigma-Aldrich1.09057.1000
70% ethanolHistolabs01370.01L
95% ethanolFisher scientific10572143
Absolute ethanolHistolabs01399.01L
Bouin's solutionSigma-AldrichHT10132-1L
Eosin Y Free acidSigma-AldrichE4009-5G 
FormaldehydeThermo Fisher28908
Haematoxylin solution according to DelafieldSigma-Aldrich03971-250ML
ImageJ
Microsoft Excel
Microtome 
Pertex mounting solution Histolabs00840-05
PropofolBaxter Holding B.V.N01AX10ATC-code provided instead of catalog number
QuPathhttps://qupath.github.io/
Rocuronium bromide B. Braun Melsungen AG M03AC09ATC-code provided instead of catalog number
Scott's tap water substitute concentrateSigma-AldrichS5134-6x100ml
SevofluraneBaxter Medical AB N01AB08ATC-code provided instead of catalog number
Slide scanner 
SufentanilHameln Pharma gmbhN01AH03ATC-code provided instead of catalog number
SugammadexBaxter Holding B.V.V03AB35ATC-code provided instead of catalog number
SuperFrost plus white Histolabs 06400 
SuperFrost Plus White microscope slidesHistolabs 06400 
XyleneSaveen Werner131769.1611

Referenties

  1. Richards, J. A. S. The ovarian cycle. Vitam Horm. 107, 1-25 (2018).
  2. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 1-9 (2010).
  3. Monniaux, D., et al. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: What is the link. Biol Reprod. 90 (4), 1-11 (2014).
  4. Gougeon, A. The early stages of follicular growth in biology and pathology of the oocyte. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Cambridge University Press. 50-61 (2013).
  5. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Ann Endocrinol. 71 (3), 132-143 (2010).
  6. Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and non-growing follicle counts according to the stages of reproductive aging workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
  7. Gold, E. B. The timing of the age at which natural menopause occurs. Obstet Gynecol Clin North Am. 38 (3), 425-440 (2011).
  8. Alberico, H., et al. Workflow optimization for identification of female germline or oogonial stem cells in human ovarian cortex using single-cell RNA sequence analysis. Stem Cells. 40, 523-536 (2022).
  9. White, Y. A. R., et al. Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women. Nat Med. 18 (3), 413-422 (2012).
  10. Wagner, M., et al. Single-cell analysis of human ovarian cortex identifies distinct cell populations but no oogonial stem cells. Nat Commun. 11, 1147(2020).
  11. Yoshihara, M., et al. In reply: Revisiting claims of the continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41 (2), 205-206 (2023).
  12. Yoshihara, M., et al. The continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41, 105-110 (2023).
  13. Van Kasteren, Y. M., Schoemaker, J. Premature ovarian failure: A systematic review on therapeutic interventions to restore ovarian function and achieve pregnancy. Hum Reprod Update. 5 (5), 483-492 (1999).
  14. McGlacken-Byrne, S. M., Conway, G. S. Premature ovarian insufficiency. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 81, 98-110 (2022).
  15. Viuff, M., Gravholt, C. H. Turner syndrome and fertility. Ann Endocrinol. 83 (4), 244-249 (2022).
  16. Poirot, C., et al. Ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in 418 girls and adolescents up to 15 years of age facing highly gonadotoxic treatment: Twenty years of experience at a single center. Acta Obstet Gynecol Scand. 98 (5), 630-637 (2019).
  17. Jensen, A. K., et al. Cryopreservation of ovarian tissue for fertility preservation in a large cohort of young girls: Focus on pubertal development. Hum Reprod. 32 (1), 154-164 (2017).
  18. The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Fertility preservation in patients undergoing gonadotoxic therapy or gonadectomy: A committee opinion. Fertil Steril. 112 (6), 1022-1033 (2019).
  19. ART Fact Sheet. , European Society of Human Reproduction and Embryology. https://www.eshre.eu/Press-Room/Resources (2020).
  20. Antonouli, S., et al. A comprehensive review and update on human fertility cryopreservation methods and tools. Front Vet Sci. 10, 1151254(2023).
  21. Nordic Society of Pediatric Hematology and Oncology (NOPHO). , http://www.nopho.net (2013).
  22. Bahroudi, Z., et al. Review of ovarian tissue cryopreservation techniques for fertility preservation. J Gynecol Obstet Hum Reprod. 51 (2), 102290(2022).
  23. Jensen, A. K., et al. 86 successful births and 9 ongoing pregnancies worldwide in women transplanted with frozen-thawed ovarian tissue: Focus on birth and perinatal outcome in 40 of these children. J Assist Reprod Genet. 34 (3), 325-336 (2017).
  24. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  25. Dolmans, M. M., Falcone, T., Patrizio, P. Importance of patient selection to analyze in vitro fertilization outcome with transplanted cryopreserved ovarian tissue. Fertil Steril. 114 (2), 279-280 (2020).
  26. Demeestere, I., et al. Live birth after autograft of ovarian tissue cryopreserved during childhood. Hum Reprod. 30 (9), 2107-2109 (2015).
  27. Ernst, E., Kjærsgaard, M., Birkebæk, N. H., Clausen, N., Andersen, C. Y. Case report: Stimulation of puberty in a girl with chemo- and radiation therapy-induced ovarian failure by transplantation of a small part of her frozen/thawed ovarian tissue. Eur J Cancer. 49 (4), 911-914 (2013).
  28. Rodriguez-Wallberg, K. A., et al. Successful pregnancies after transplantation of ovarian tissue retrieved and cryopreserved at time of childhood acute lymphoblastic leukemia - a case report. Haematologica. 106 (10), 2783-2787 (2021).
  29. Matthews, S. J., Picton, H., Ernst, E., Andersen, C. Y. Successful pregnancy in a woman previously suffering from β-thalassemia following transplantation of ovarian tissue cryopreserved before puberty. Minerva Ginecol. 70 (4), 432-435 (2018).
  30. Kristensen, S. G., et al. Use of cryopreserved ovarian tissue in the Danish fertility preservation cohort. Fertil Steril. 116 (4), 1098-1106 (2021).
  31. Donfack, N. J., et al. Expectations and limitations of ovarian tissue transplantation. Zygote. 25 (4), 391-403 (2017).
  32. Schmidt, K. L. T., Byskov, A. G., Andersen, A. N., Müller, J., Andersen, C. Y. Density and distribution of primordial follicles in single pieces of cortex from 21 patients and in individual pieces of cortex from three entire human ovaries. Hum Reprod. 18 (6), 1158-1164 (2003).
  33. Hassan, J., et al. Reference standards for follicular density in ovarian cortex from birth to sexual maturity. Reprod Biomed Online. 47, 103287(2023).
  34. Vilela, J. deM. V., Dolmans, M. M., Amorim, C. A. Ovarian tissue transportation: A systematic review. Reprod Biomed Online. 42 (2), 351-365 (2021).
  35. Gibson, E., Mahdy, H. Anatomy, abdomen and pelvis, ovary. , StatPearls Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK545187/ (2023).
  36. Nagaraj, A. S., et al. Establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing. J Vis Exp. (141), e58569(2018).
  37. Adeniran, B. V., Bjarkadottir, B. D., Appeltant, R., Lane, S., Williams, S. A. Improved preservation of ovarian tissue morphology that is compatible with antigen detection using a fixative mixture of formalin and acetic acid. Hum Reprod. 36 (7), 1871-1890 (2021).
  38. Bankhead, P., et al. QuPath: Open-source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 1-7 (2017).
  39. Björvang, R. D., et al. Persistent organic pollutants and the size of ovarian reserve in reproductive-aged women. Environ Int. 155, 106589(2021).
  40. Kwok, R., Johnson, N. P. Ovarian biopsy has no role as a routine diagnostic test of ovarian reserve: A systematic review. Reprod Biomed Online. 24, 492-495 (2012).
  41. Ahmad, A., et al. High-throughput spatial sensitive, quantitative phase microscopy using low spatial and high temporal coherent illumination. Sci Rep. 11 (1), 1-13 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Z-scorebeoordelingcryopreservatie van eiersteweefselfolliceldichtheidhistologische kwantificeringprimordiale follikelscryopreservatie van oocytencryopreservatie van embryo'sleeftijdsgenormaliseerde referentie
Z-scores voor het beoordelen van de ovariële reserve bij jonge patiënten die vruchtbaarheidsbehoud ondergaan
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.