Methodenartikel

Karakterisering van modulatoren van protease-geactiveerde receptoren met een calciummobilisatietest met behulp van een plaatlezer

DOI:

10.3791/66507

⸱

24 mei 2024

 , 
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een verbeterd protocol ontwikkeld voor een calciummobilisatietest met endotheelcellen, die wordt gebruikt om liganden van protease-geactiveerde receptoren (PAR's) te identificeren. Het nieuwe protocol verkort de totale testtijd met 90-120 minuten en levert reproduceerbare concentratie-responscurves op.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veranderingen in de calciumconcentratie in cellen worden snel gevolgd op een high-throughput manier met behulp van intracellulaire, fluorescerende, calciumbindende kleurstoffen en beeldvormingsinstrumenten die fluorescerende emissies van maximaal 1.536 putjes tegelijk kunnen meten. Deze instrumenten zijn echter veel duurder en kunnen een uitdaging zijn om te onderhouden in vergelijking met algemeen verkrijgbare plaatlezers die putten afzonderlijk scannen. Hier wordt een geoptimaliseerde plaatlezertest beschreven voor gebruik met een endotheelcellijn (EA.hy926) om de protease-geactiveerde receptor (PAR)-gestuurde activering van Gαq-signalering en daaropvolgende calciummobilisatie te meten met behulp van de calciumbindende kleurstof Fluo-4. Deze test is gebruikt om een reeks PAR-liganden te karakteriseren, waaronder de allosterische PAR1-gerichte ontstekingsremmende "parmoduline"-liganden die in het Dockendorff-laboratorium zijn geïdentificeerd. Dit protocol maakt een geautomatiseerde vloeistofverwerker overbodig en maakt de medium-throughput screening van PAR-liganden in platen met 96 putjes mogelijk en zou van toepassing moeten zijn op de studie van andere receptoren die calciummobilisatie initiëren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protease-geactiveerde receptoren (PAR's)1,2,3 zijn een subfamilie van klasse A G eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's) die tot expressie worden gebracht in verschillende celtypen, waaronder bloedplaatjes en endotheelcellen 4,5,6,7. In tegenstelling tot de meeste GPCR's hebben PAR's een unieke intramoleculaire activeringswijze. De meeste GPCR's worden geactiveerd door oplosbare liganden die interageren met een aparte bindingszak, maar PAR's worden geactiveerd door de proteolytische splitsing van de N-terminus, wat resulteert in een nieuwe vastgebonden ligand die kan interageren met het extracellulaire lus 2-domein op het oppervlak van een cel 6,8,9. Deze interactie activeert de receptor en kan verschillende signaalroutes initiëren, waardoor effecten zoals ontsteking en activering van bloedplaatjes worden bevorderd 4,10,11,12. Verschillende proteasen kunnen PAR's activeren door splitsing op unieke plaatsen op de N-terminus, waardoor verschillende tethered liganden (TL) worden onthuld die receptorconformaties stabiliseren, die verschillende signaalroutes initiëren 9,13,14,15. In het best bestudeerde lid van de subfamilie, PAR1, wordt splitsing door trombine bijvoorbeeld gebruikt om tal van biologische processen te ondersteunen, waaronder activering van bloedplaatjes en rekrutering van leukocyten naar het endotheel, maar kan leiden tot schadelijke effecten wanneer de receptor tot overexpressie wordt gebracht of overactiveerd 4,16,17,18,19,20,21 . Omgekeerd kan splitsing door geactiveerd proteïne C (aPC) ontstekingsremmende effecten en het behoud van endotheelbarrières bevorderen 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PAR's kunnen ook op intermoleculaire wijze worden geactiveerd door peptide-analogen van de TL's 13,30,31. Deze peptiden worden routinematig gebruikt om PAR-remming (modulatie) te meten in plaats van PAR-gerichte proteasen, en ze worden in dit protocol gebruikt.

Talrijke aandoeningen worden in verband gebracht met pathologische PAR1-signalering, waaronder sepsis22,32, hart- en vaatziekten 33,34,35,36,37,38, nierziekte 39,40,41,42, sikkelcelziekte 43, fibrose44, osteoporose en artrose45,46, neurodegeneratie 47,48,49,50,51 en kanker 52,53,54,55,56,57,58,59. Antagonisten van PAR1 zijn sinds de jaren 1990 bestudeerd als plaatjesaggregatieremmers voor hart- en vaatziekten, en de groeiende lijst van ziekten die verband houden met de receptor vereist de identificatie van nieuwe liganden voor gebruik als biologische sondes (gereedschapsverbindingen) of als potentiële therapieën. Momenteel is er slechts één door de FDA goedgekeurde PAR1-antagonist, vorapaxar, die wordt gebruikt voor de behandeling van coronaire hartziekte bij patiënten met een hoog risico 34,36,37,60. Een alternatieve PAR1-antagonist, de pepducine PZ-128, voltooide een succesvolle fase II-studie om trombose bij hartkatheterisatiepatiënten te voorkomen38. De Dockendorff-groep heeft zich gericht op de medicinale chemie en farmacologie van een aparte klasse van kleine moleculen, PAR1-liganden die bekend staan als parmodulinen61,62. In tegenstelling tot gerapporteerde PAR1-antagonisten zoals vorapaxar, zijn parmodulinen allosterische, bevooroordeelde modulatoren van PAR1 die selectief de Gαq-route blokkeren en cytoprotectieve effecten bevorderen die vergelijkbaar zijn met aPC. In tegenstelling tot krachtige orthosterische PAR1-antagonisten zoals vorapaxar, zijn gepubliceerde parmodulinen ook omkeerbaar 63,64,65.

Aanvankelijk werden parmodulinen geïdentificeerd door Flaumenhaft en collega's voor hun vermogen om P-selectine-expressie of granulaatsecretie in bloedplaatjes te remmen 61,66. Er was echter een alternatieve methode nodig om de effecten van parmodulinen op endotheelcellen te bestuderen. Een veelgebruikte methode om GPCR-gerelateerde signalering te monitoren, is het meten van intracellulaire Ca2+-mobilisatie, een belangrijke secundaire boodschapper die kan worden gemeten met behulp van een geschikte intracellulaire calciumbindende kleurstof67,68. Er is substantieel bewijs geleverd dat aantoont dat calciummobilisatie geïnduceerd door PAR1 plaatsvindt door de activering van Gαq69,70. Eenmaal geactiveerd door zijn gebonden ligand (of een geschikt exogeen ligand), ondergaat PAR1 een conformationele verandering die ervoor zorgt dat guanosinedifosfaat (GDP) gebonden aan de Gαq-subeenheid wordt vervangen door guanosinetrifosfaat (GTP)68. De Gαq-subeenheid activeert vervolgens fosfolipase Cβ (PLC-β), dat de hydrolyse van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PIP2) katalyseert, waarbij 1,4,5-inositoltrifosfaat (IP3) en diacylglycerol (DAG) worden gevormd. Ten slotte bindt IP3 aan IP3-gevoelige Ca2+-kanalen in het membraan van het endoplasmatisch reticulum, waardoor Ca2+ kan worden afgegeven aan het cytoplasma, waar het kan binden aan Ca2+-afhankelijke fluorescerende kleurstoffen, zoals Fluo-4, die aan de cellen worden toegevoegd71. Dit proces vindt binnen enkele seconden plaats en kan de concentratie van Ca2+ 100-voudig verhogen, wat leidt tot een drastische verandering in de hoeveelheid calciumgebonden kleurstof en een robuust fluorescentiesignaal.

In 2018 maakte de Dockendorff-groep een medium-throughput Ca2+ mobilisatietest bekend die zou kunnen worden gebruikt om antagonisten van de Gαq-route van PAR172 te identificeren. De test gebruikte EA.hy92673, een hybride menselijke endotheelcellijn, die voor meerdere passages kan worden gebruikt zonder een merkbare verandering in PAR1-expressie, en is vastgesteld voor in vitro metingen van cytoprotectieve effecten.

Het oorspronkelijke protocol gebruikte EA.hy926-cellen in platen met 96 putjes en geladen met Fluo-4/AM-kleurstof, die werd gekozen vanwege de intense fluorescentie bij 488 nm en de hoge celpermeabiliteit. Nadat de kleurstof in de cellen was geladen, werden lange wasstappen uitgevoerd met een geautomatiseerde 8-kanaals vloeistofverwerker (snellere methoden voor vloeistofbehandeling, zoals een 96-kanaals wasmachine, waren ontoegankelijk). De reproduceerbaarheid van deze test was superieur aan die zonder de zorgvuldige, geautomatiseerde robotische mediaveranderingen. Antagonisten werden vervolgens met de cellen geïncubeerd, PAR1 werd geactiveerd door de sequentiële toevoeging van een selectieve agonist (16 putjes per keer) en veranderingen in fluorescentie als gevolg van calciummobilisatie en kleurstofbinding werden gemeten om de activiteit te bepalen.

Hoewel dit protocol de meting van PAR1-gemedieerde calciummobilisatie mogelijk maakt, wordt het beperkt door de tijd die nodig is om elke plaat met 96 putjes te testen. Lange experimenteertijden zijn problematisch, niet alleen omdat het aantal verbindingen dat elke dag kan worden gescreend beperkt is, maar ook omdat kleurstofefflux in de loop van de tijd optreedt, waardoor het testvenster wordt verkleind door de basale fluorescentie te verhogen. Een van de bijdragen aan de lange experimenttijd is het gebruik van een 8-kanaals vloeistofhandler voor het wassen van borden, wat meer dan 30 minuten toevoegt aan elk experiment. De benodigde tips werden ook moeilijk te verkrijgen door problemen met de toeleveringsketen. Hier wordt een bijgewerkt protocol gerapporteerd voor de PAR-gemedieerde calciummobilisatietest waarvoor geen vloeistofverwerker nodig is en die daarom met een hogere doorvoer kan worden uitgevoerd. Dit protocol moet ook geschikt zijn voor het meten van signalering met andere GPCR's die leiden tot intracellulaire calciummobilisatie. Dit bijgewerkte plaatlezerprotocol is ideaal voor academische en kleine industriële laboratoria die niet over de middelen beschikken voor dure celbeeldvormingsinstrumenten, maar die snel tal van verbindingen moeten screenen. Voor een voorbeeld van een calciummobilisatietest met behulp van een plaatimager, zie Caers et al.74.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle media-uitwisselingen/toevoegingen die in stap 1 en 2 van het volgende protocol worden uitgevoerd, worden uitgevoerd in een steriele hoes. Tenzij anders vermeld, moet al het plastic dat in de steriele kap wordt gebruikt, gesteriliseerd en verzegeld of op de juiste manier worden gesteriliseerd via een autoclaaf worden gekocht.

1. Start van de EA.hy926-cellijn

  1. Verkrijg EA.hy926-cellen.
  2. Bewaar injectieflacon(s) met cellen in de dampfase van een tank met vloeibare stikstof.
  3. Bereid DMEM volledig medium voor door DMEM, FBS en pen/streptokokken (zie de materiaaltabel voor specifieke details) eerst op te warmen in een waterbad van 37 °C gedurende 15-30 minuten. Voeg 50 ml FBS en 1 ml pen/streptokokken toe aan 500 ml DMEM. Meng de oplossing voorzichtig door inversie.
    OPMERKING: Te krachtig mengen veroorzaakt overmatige hoeveelheden belletjes.
  4. Verwijder een injectieflacon met cellen uit vloeibare stikstof en verwarm deze gedurende 5 minuten in een waterbad van 37 °C.
  5. Steriliseer de injectieflacon met cellen en de fles DMEM compleet medium door te spuiten met alcohol en verplaats deze vervolgens naar de steriele kap.
  6. Gebruik een pipet van 1.000 μl om de cellen voorzichtig over te brengen naar een steriele centrifugebuis van 15 ml. Voeg 1 ml DMEM toe aan de injectieflacon om te spoelen en voeg toe aan de centrifugebuis.
  7. Maak een korrel cellen met behulp van een centrifuge (150 × g, 5 min, 22 °C). Verwijder het medium uit de centrifugebuis door middel van aspiratie; Pas op dat u de celkorrel niet verstoort.
  8. Voeg 3 ml DMEM compleet medium toe aan de centrifugebuis en breek de pellet voorzichtig uit elkaar door de celsuspensie te mengen met behulp van een pipet van 1.000 μl.
    OPMERKING: Het veroorzaken van luchtbellen door te krachtig te mengen, moet worden vermeden, omdat dit de cellen kan activeren of beschadigen.
  9. Meng 10 μl van de celsuspensie met 10 μl trypanblauw in een microcentrifugebuisje met behulp van een pipet met tips van 20 μl of 200 μl. Voeg 10 μL van het mengsel van celsuspensie en trypanblauw toe aan een hemocytometer en tel de cellen.
    OPMERKING: Het gebruik van pipetpunten van 0,1-10 μl kan de cellen afschuiven. Tips van dit formaat mogen niet worden gebruikt bij het hanteren van de celsuspensie.
  10. Voeg DMEM compleet medium toe aan de celsuspensie om een dichtheid van 66.000 cellen/ml te maken met behulp van een serologische pipet van 10 of 25 ml. Pipetteer 15 ml van de celsuspensie in de T-75 kweekkolf(en). Zorg voor een gelijkmatige spreiding van de celsuspensie door de kolf van noord naar zuid en van oost naar west te bewegen.
  11. Incubeer de cellen totdat ze samenvloeiing bereiken (meestal na 4-6 dagen), zoals geschat door onderzoek onder een microscoop. Gebruik nu de cellen in het experiment (te beginnen met sectie 2) of zaai ze in nieuwe kolven voor expansie om bevroren bouillons te bereiden (bij een aanbevolen zaaidichtheid van 1.000.000 cellen in 15 ml volledig medium per T-75-kolf).
    OPMERKING: Cellen kunnen tot 3 weken in de kweekkolven worden gekweekt zonder een merkbaar verschil in vorm, gezondheid of prestaties in de test. Het volledige medium moet elke 3-4 dagen worden vervangen.

2. Toevoeging van EA.hy926-cellen aan platen met 96 putjes

OPMERKING: Cellen van één confluente T-75-kweekkolf kunnen worden gebruikt om twee of drie analyseplaten te bereiden of optioneel worden uitgebreid tot maar liefst 15 verse T-75-kolven. Op een normale werkdag kunnen ten minste vijf testplaten worden gescreend volgens het protocol in secties 4 en 5. De volgende instructies beschrijven het voorbereiden en testen van één analyseplaat, maar extra platen kunnen worden voorbereid door stap 2.2, 2.7, 2.12 en 3.2 te herhalen om het gewenste aantal analyseplaten voor te bereiden. Meestal worden vier testplaten per dag voorbereid om concentratieresponsen met maximaal 16 verbindingen te meten, waarvoor twee T-75-kolven met confluente cellen nodig zijn.

  1. Verwarm DMEM complete medium in een waterbad van 37 °C gedurende 15-30 min. Steriliseer de fles DMEM complete medium door deze met alcohol te besproeien en verplaats deze vervolgens naar de steriele kap.
  2. Voeg 100 μl van een gesteriliseerde gelatineoplossing van 0,4% toe aan alle putjes van een zwartwandige, 96-well, doorzichtige bodemplaat met een deksel. Incubeer de plaat met de gelatineoplossing in een incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 30 min.
  3. Bevestig met een omgekeerde microscoop dat de cellen in een T-75-kweekkolf voor 80-100% samenvloeien. Verwijder DMEM volledig medium uit de T-75 kolf via aspiratie.
  4. Was de cellen in de kolf met 10 ml PBS en beweeg de kolf voorzichtig van noord naar zuid en van oost naar west. Verwijder de PBS uit de kolf via aspiratie.
  5. Voeg 5 ml celdissociatieoplossing toe aan de kolf en incubeer de kolf in een incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende ~12 min. Tik na 6 minuten op de kolf om de dissociatie te vergemakkelijken.
    OPMERKING: Het langer dan 15 minuten incuberen van cellen met het genoemde celdissociatiemiddel zorgt ervoor dat cellen beginnen samen te klonteren, wat het verkrijgen van een nauwkeurig aantal cellen moeilijker maakt en de test kan verstoren.
  6. Voeg 5 ml van het voorverwarmde DMEM complete medium toe aan de kolf en meng voorzichtig door de celdissociatieoplossing/celsuspensie. Voeg met een serologische pipet van 10 ml de celsuspensie toe aan een steriel centrifugebuisje van 50 ml. Maak een korrel cellen met behulp van een centrifuge (150 × g, 5 min, 22 °C).
  7. Terwijl de pellet wordt gevormd, verwijdert u de gelatineoplossing van de plaat met 96 putjes via aspiratie met behulp van een pasteurpipet die is aangesloten op een vacuüm. Verwijder het plaatdeksel vanaf het moment dat de gelatine wordt verwijderd totdat de oplossing klaar is om te worden geplateerd.
    OPMERKING: Optioneel kan een meerkanaalspipet of steriel spruitstuk worden gebruikt dat op een vacuüm is aangesloten.
  8. Verwijder het medium uit de centrifugebuis door aspiratie met behulp van een pasteurpipet die is aangesloten op een vacuüm of een serologische pipet; Pas op dat u de celkorrel niet verstoort.
  9. Voeg vers DMEM compleet medium toe aan de centrifugebuis met behulp van een serologische pipet van 5 of 10 ml. Breek de celkorrel voorzichtig door het DMEM complete medium te mengen met een pipet van 1.000 μl of een serologische pipet van 5 ml.
    OPMERKING: Meestal wordt acht milliliter DMEM gebruikt, maar er kunnen grotere volumes worden toegevoegd om het tellen van cellen te vergemakkelijken.
  10. Meng 10 μl van de celsuspensie met 10 μl trypanblauw in een microcentrifugebuisje met behulp van een pipet met tips van 20 μl of 200 μl. Voeg 10 μL van het mengsel van celsuspensie en trypanblauw toe aan een hemocytometer en tel de cellen.
  11. Voeg DMEM complete media toe aan de celsuspensie om een dichtheid van 600.000 cellen/ml te maken met behulp van een serologische pipet van 10 of 25 ml. Dit geeft een uiteindelijke dichtheid van 60.000 cellen/putje in een plaat met 96 putjes (door experimenten bepaald als de optimale dichtheid).
    OPMERKING: Een normale succesvolle celcultuur levert tussen de 12.000.000 en 15.000.000 cellen op, die twee tot drie platen met 96 putjes kunnen zaaien.
  12. Meng de celsuspensie door de centrifugebuis voorzichtig om te keren en voeg deze toe aan een meerkanaals pipetreservoir van 50 ml. Meng de suspensie in het reservoir elke 30 s door het reservoir zachtjes heen en weer te schudden en voeg 100 μL van de celsuspensie toe aan elk putje met behulp van een meerkanaalspipet. Plaats de transparante plaatafdekking terug en schud de plaat voorzichtig door deze van noord naar zuid en van oost naar west over het oppervlak van de steriele kap te schuiven om een gelijkmatige celverdeling te garanderen. Incubeer de plaat in de incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 16-24 uur.
    OPMERKING: Extra celsuspensie kan worden gebruikt om extra platen voor te bereiden, of stappen 1.10-1.11 kunnen worden herhaald om de cellijn voort te zetten.

3. Voorbereiding van de calciummobilisatietest

  1. Bereid testreagentia voor.
    1. Bereid probenecideoplossing (250 mM, waterig) door 36 mg probenecide toe te voegen aan een microcentrifugebuisje en deze op te lossen in 0,6 M NaOH (500 μl). Vortex de oplossing.
      OPMERKING: Probenecide verbetert het behoud van kleurstof in de cel door organische ionentransporters 75,76,77 te remmen.
    2. Om de HBSS-HEPES-analysebuffer te maken, voegt u HEPES (1,19 g) toe aan een fles van 500 ml Ca/Mg/fenolroodvrij HBSS (waardoor een 10 mM-oplossing van HEPES wordt gemaakt). Vul de buffer aan met MgCl2 (1 M waterige oplossing, 500 μL) en CaCl2 (1 M waterige oplossing, 500 μL). Meng de oplossing en bewaar in de koelkast bij 5 °C wanneer deze niet in gebruik is.
      1. Voeg voor elke plaat met 96 putjes 50 ml van de HBSS-HEPES-analysebuffer toe aan een centrifugebuis van 50 ml, vul aan met 500 μl probenecideoplossing en meng goed. Verwarm de buffer voor gebruik tot kamertemperatuur.
    3. Maak een 10% Pluronic F-127 oplossing in DMSO door Pluronic F-127 (20 mg) toe te voegen aan een microcentrifugebuisje of HPLC-flacon en deze op te lossen met 200 μL DMSO.
      OPMERKING: Deze oplossing kan bij kamertemperatuur worden bewaard en is voldoende voor ongeveer 30 borden. Pluronic F-127 lost zeer langzaam op bij kamertemperatuur en moet voorzichtig worden verwarmd om het oplossen te vergemakkelijken.
    4. Bereid de kleurstoflaadbuffer voor door eerst 24 μL DMSO toe te voegen aan een injectieflacon met Fluo-4/AM (50 μg) om de kleurstof op te lossen. Voeg in een in folie verpakte centrifugebuis van 15 ml 6 ml HBSS-HEPES-analysebuffer toe en vul aan met 6 μl 10% Pluronic F-127 en 6 μl Fluo-4/AM-oplossing. Draai de oplossing kort in een draaikolk en laat 10 minuten op kamertemperatuur, uit het licht, staan.
      OPMERKING: Om fotobleken van Fluo-4 te voorkomen, houdt u de kleurstof uit het licht door aluminiumfolie rond de centrifugebuis met de kleurstofoplossing en het deksel van de analyseplaat te wikkelen.
  2. Bereid de analyseplaten voor.
    1. Verwijder de testplaat van de incubator en bevestig de samenvloeiing met een omgekeerde microscoop. Verwijder de volledige DMEM-media handmatig door deze in een gootsteen te vegen en de bovenkant van de plaat met keukenpapier te deppen.
      NOTITIE: Medium wordt voldoende verwijderd door de plaat horizontaal te houden en te tikken, gevolgd door de plaat 180° te draaien en te herhalen.
    2. Voeg HBSS-HEPES-analysebuffer plus probenecideoplossing toe aan een meerkanaals pipetoplosmiddelreservoir van 50 ml.
      NOTITIE: Deze oplossing zal worden gebruikt voor latere wasstappen en moet opzij worden gezet en afgedekt met aluminiumfolie totdat het nodig is.
    3. Voeg 100 μl van de HBSS-HEPES-testbuffer plus probenecideoplossing toe aan elk putje met een meerkanaalspipet en laat de cellen 5 minuten in de aanwezigheid van probenecide zitten. Verwijder de HBSS-HEPES-analysebuffer door deze op dezelfde manier in de gootsteen te vegen als in stap 3.2.1.
    4. Voeg de buffer voor het laden van de kleurstof toe aan een apart multikanaals pipetoplosmiddelreservoir van 50 ml. Voeg 50 μl van de kleurstoflaadbuffer toe aan elk putje van de testplaat met behulp van een meerkanaalspipet. Incubeer de plaat gedurende 45 minuten (37 °C, 5% CO2).
    5. Terwijl de plaat in de couveuse ligt, bereidt u de agonist/antagonist-oplossingen voor.
      1. Antagonistische oplossingen worden opgeslagen als 31,6 mM-oplossingen in DMSO. Verdun in een PCR-buisje 2 μL van de stockoplossing met 38 μL 0,1% BSA/water om een oplossing van 1,58 mM te verkrijgen. 2 μL van deze oplossing geeft een uiteindelijke concentratie van 31,6 μM in de testplaat. Verdun 4 μl van de 1,58 mM-antagonistoplossing met 36 μl 5% DMSO/water (geen BSA-toevoeging) en bereid de resterende concentraties door middel van seriële verdunningen.
      2. Bereid een 108,3 μM (16,7x) oplossing van TFLLRN-NH2 in HBSS-HEPES-analysebuffer, die een eindconcentratie van 6,5 μM zal geven wanneer 6 μL wordt toegevoegd aan elk putje van de testplaat. Los bijvoorbeeld een aliquot van 2 mg TFLLRN-NH2 op met 5,244 ml HBSS-HEPES-analysebuffer om een voorraadoplossing van 0,5 mM te verkrijgen. Meng 1,083 ml van deze oplossing met 3,917 ml HBSS-HEPES-analysebuffer om een oplossing van 108,3 μM te verkrijgen.
        OPMERKING: TFLLRN-NH2-oplossingen moeten worden bewaard in een vriezer van -20 °C wanneer ze niet in gebruik zijn.
    6. Verwijder de plaat uit de incubator en zorg ervoor dat de kleurstof wordt opgenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop op een geschikte instelling (typisch voor groen fluorescerend eiwit, zie figuur 1 voor een voorbeeld van Fluo-4 dat met succes in cellen is geladen). Verwijder de buffer voor het laden van de kleurstof door op dezelfde manier op de plaat te tikken als in stap 3.2.1.
    7. Was de cellen 2x met 50 μL van de HBSS-HEPES-testbuffer plus probenecide-oplossing (uit stap 3.2.3) in elk putje (verwijder door het medium in de gootsteen te vegen).
    8. Voeg 92 μl HBSS-HEPES-testbuffer toe aan elk putje en bekijk de cellen opnieuw met een fluorescentiemicroscoop om er zeker van te zijn dat overtollige kleurstof volledig is verwijderd en dat de cellen hecht blijven.
    9. Gebruik een meerkanaalspipet om 2 μl van de antagonistoplossingen en het medium toe te voegen aan de juiste putjes (zie tabel 1 voor een representatieve plaatkaart).

4. Uitvoeren van de calciummobilisatietest

  1. Stel de plaatlezer als volgt in: temperatuur: 37 °C; excitatie golflengte: 485 nm; Emissie golflengte: 525 nm; meethoogte: 7,8 mm (geoptimaliseerd); aantal flitsen: 100; Aantal herhalingen: 20.
  2. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten in de plaatlezer bij 37 °C. Meet de achtergrondfluorescentie in kolommen 1 en 2 (vijf scans per putje).
  3. Werp de plaat uit de plaatlezer en voeg snel 6 μL agonistoplossing toe aan elk putje in kolommen 1 en 2 van een PCR-strip met 8 buisjes met behulp van een meerkanaalspipet.
    OPMERKING: Voor deze stap gebruiken we een elektronische 8-kanaals pipet met pipetpunten van 0,1-10 μL.
  4. Meet de verandering in fluorescentie als calciummobilisatie in de cellen plaatsvindt. Voer 20 scans uit van elke put volgens de bovenstaande instellingen.
    OPMERKING: Het scannen van elke put in twee kolommen duurt 20x elk ongeveer 5 minuten (d.w.z. ~15 s tussen scans van elke put).
  5. Herhaal stap 4.2-4.4 voor de kolommen 3-12 in stappen van twee kolommen.

5. Gegevensanalyse

  1. Exporteer gegevens uit de test als afzonderlijke spreadsheets voor elke groep met twee kolommen.
  2. Vind het gemiddelde van de basale fluorescentiemetingen met behulp van de functie AVG (eerste scan: laatste scan). Doe dit voor elke put in beide kolommen.
  3. Bepaal de maximale fluorescentie na toevoeging van de agonist met behulp van de functie MAX (eerste scan: laatste scan).
  4. Bereken de verandering in fluorescentie door de basale fluorescentie af te trekken van de maximale fluorescentie.
  5. Trek de verandering in fluorescentie berekend voor de negatieve controle (toevoeging van medium zonder agonist) af van elk putje in dezelfde kolom.
  6. Bereken de relatieve (genormaliseerde) verandering in fluorescentie door de verandering in fluorescentie in elk putje te delen door de verandering in fluorescentie in het voertuig (0,1% DMSO/water) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 put.
  7. Kopieer de niet-controlewaarden, als percentages, in een softwareprogramma voor statistieken en grafieken. Als u de software waarnaar wordt verwezen gebruikt, kiest u de XY-tabeloptie, waarbij de getallen worden gekozen als de X-as en repliceert u waarden in subkolommen naast elkaar als de Y-as.
  8. Gebruik het programma om concentratie-responscurven (CRC's) uit de gegevens te plotten. Als u de software gebruikt waarnaar wordt verwezen, kiest u de optie log (remmer) vs. respons - variabele helling (vier parameters).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze test is over het algemeen om concentratie-responscurven (CRC's) te produceren voor drie tot vier nieuwe parmodulines. Op elke testplaat wordt vaak een extra CRC voor een bekende verbinding, zoals NRD-21, gegenereerd die fungeert als een kwaliteitscontrole voor het experiment vanwege de bekende IC50. Om CRC's te genereren, moet een plaatkaart worden gepland, zoals die in tabel 1 is afgebeeld. Als in plaats daarvan enkelvoudige concentratieresponsen gewenst zijn, moeten verbindingen in eindconcentraties van 10 μM (of andere voorkeursconcentraties) aan ten minste drie putjes worden toegevoegd.

Bij het uitvoeren van de test moet er een snelle toename van de fluorescentie zijn (de toename moet beginnen binnen de eerste 3-4 scans) die wordt weergegeven door de plaatlezer (zie figuur 2A voor een voorbeelduitvoer in vergelijking met de mislukte uitvoer in figuur 2B). Het is belangrijk op te merken dat de agonist snel (binnen 15 s) moet worden toegevoegd om de plaatlezer in staat te stellen de toename van de fluorescentie nauwkeurig vast te leggen. In een werkexperiment zou het fluorescentiesignaal voor de voertuigput vlak moeten blijven, terwijl het fluorescentiesignaal in de positieve controleputjes (voertuig + 6,5 μM TFLLRN-NH2) na drie of vier scans zou moeten beginnen toe te nemen. Zodra de maximale waarde is bereikt (na ~10 scans), zou het fluorescentiesignaal langzaam moeten beginnen af te nemen. In experimenten met zeer effectieve antagonisten moeten de putten met de hoogste concentraties antagonisten een signaal hebben dat relatief vlak blijft, vergelijkbaar met de negatieve controle. Er zou ook weinig verschil moeten zijn tussen het signaal van de positieve controleputten en die met lage concentraties van de antagonist (Figuur 2C). Als de laagste concentraties antagonisten de calciummobilisatie nog steeds remmen, moeten de gescreende concentraties worden aangepast om lagere concentraties op te nemen. Gegenereerde CRC's moeten ten minste één datapunt ~100% hebben om de sigmoïdale aard van de curve volledig aan te tonen.

Het meest voorkomende teken dat een experiment niet werkt, is als de positieve controleput (medium + 6,5 μM TFLLRN-NH2) geen grote toename van de fluorescentie vertoont (Figuur 2B). Dit kan om verschillende redenen gebeuren: het celgetal kan laag zijn (als confluentie niet is bevestigd), de agonistoplossing kan in het gedrang komen of er kunnen onvoldoende hoeveelheden kleurstof door de cellen zijn opgenomen. Het is ook mogelijk om per ongeluk geen agonist toe te voegen aan bepaalde putjes.

Met een geprogrammeerde methode worden gegevens uitgevoerd als zes afzonderlijke spreadsheets, die elk gegevens voor twee kolommen bevatten. De vijf scans van de basale fluorescentie staan in hun eigen rij, met de 20 scans die zijn gemaakt na toevoeging van de agonist in de rij direct eronder (zie figuur 3 voor representatieve output). Voor een voorbeeldberekening wordt een kolom uit een experiment met NRD-21 gebruikt. In het geëxporteerde bestand (Figuur 3) wordt de basale fluorescentie van elk putje uitgevoerd naar de kolommen C tot en met G, en gegevens van na de agonisttoevoeging (de volgende 20 scans) worden uitgevoerd naar de kolommen C tot en met V in de volgende rij. Rijen 14-17 in het bestand bevatten de positieve controle van twee afzonderlijke kolommen. Het gemiddelde van de basale rij voor een van de positieve controleputten werd berekend met behulp van het commando "=GEMIDDELDE(C16:G16)", wat een waarde van 1,039.8 opgaf. Dit commando werd herhaald voor de extra basale metingen in elke put. Het maximum van de experimentele scans werd berekend met behulp van het commando "=MAX(C16:V16)", wat een waarde van 2,629 gaf. Opnieuw werd het bevel herhaald voor alle putten. De basale fluorescentie voor elk putje werd vervolgens afgetrokken van de maximale waarde. In dit experiment werden de gegevens genormaliseerd door de verandering in fluorescentie in de negatieve controle van elk putje af te trekken (wat 142,6 was in de voorbeeldkolom). Deze waarden werden vervolgens gedeeld door de vergelijkbaar berekende waarde van de positieve controle. In deze kolom was de maximale waarde 2.629, de gemiddelde basale meting was 1.039,8 en de waarde afgetrokken voor de blanco was 142,6. De gecorrigeerde positieve controlewaarde is dus 1.446,6 (berekend op basis van de vergelijking). Deze vergelijking wordt herhaald voor elk putje in de kolom en de berekende waarden worden gedeeld door 1,446.6 om hun relatieve verandering in fluorescentie te geven. De ratio's werden vervolgens omgezet in percentages en gekopieerd naar de analytische software. Dit proces werd herhaald voor de andere 11 kolommen.

Om de gegevens te verwerken met behulp van de software waarnaar wordt verwezen, moet een XY-tabel worden geselecteerd met de optie om drie herhaalde metingen in kolommen naast elkaar te hebben. De -log-waarden van elke concentratie moeten worden ingevoerd in de x-waarden en de berekende percentages moeten worden opgeteld bij de y-waarden. Er moet een niet-lineaire regressieanalyse worden uitgevoerd op de gegevens, waardoor vier concentratie-responscurven worden geproduceerd. Het programma voert ook IC50-waarden , gekwantificeerde foutstatistieken en goodness of fit-statistieken uit.

figure-results-1
Figuur 1: Fluo-4/AM geladen in EA.hy926 cellen. Fluo-4 wordt selectief geladen in EA.hy926-cellen, na kleurstofincubatie- en wasstappen. Alle fluorescentie bevindt zich in cellen, zonder kleurstoflekkage. Afbeelding verkregen met behulp van de GTP-instelling op een EVOS-celimager en 20x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Potentiële output van de test. (A) Representatieve plaatlezeroutput van een werkende test. Rij A is de negatieve controle en heeft geen verandering in fluorescentie. Rij B is de positieve controle en vertoont een snelle toename van de fluorescentie. Rijen C-H zijn de experimentele putjes, met de hogere concentraties parmoduline lager in de plaat. (B) Voorbeelduitvoer van een mislukt experiment. Er is geen toename van de fluorescentie te zien in rij B, de positieve controle. (C) Verandering in fluorescentie in de loop van de tijd geïnduceerd door de PAR1-agonist TFLLRN-NH2. Het scannen van twee kolommen van een plaat met 96 putjes met behulp van de meegeleverde instellingen duurt ~5 minuten op de PerkinElmer EnSpire-plaatlezer (d.w.z. ~15 s tussen scans van elke put). Verschillende NRD-21-oplossingen zijn zoals aangegeven, "Agonist" is 6,5 μM TFLLRN-NH2, n = 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Voorbeeld Excel-uitvoer voor een werkende test. Basale fluorescentie wordt uitgevoerd in even rijen, beginnend bij rij 10, en het resultaat van de eerste 10 scans na toevoeging van de agonist wordt weergegeven in de daaropvolgende oneven genummerde rijen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Afbeelding 4: Robotische vloeistofbehandeling versus 'flicking'. Het voorcoaten van de testplaten met gelatine en het handmatig uitvoeren van media-uitwisselingen door de plaat te tikken en droog te deppen, produceert concentratie-responscurven met een lagere variabiliteit. (A) Concentratie-responscurven van parmodulinen ML161 en NRD-21 en 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (geautomatiseerde vloeistofbehandeling). (B) Concentratie-responscurven van parmodulinen ML161 en NRD-21 en 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (gelatine-bedekte, geflikkeerde platen). Gegevens zijn middelen ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Temperatuurstudies. Het uitvoeren van de test bij 37 °C genereert meer reproduceerbare gegevens dan bij kamertemperatuur. (A) Concentratie-responscurven van ML161 en 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (kamertemperatuur). (B) Concentratie-responscurven van ML161 en 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C). Gegevens zijn middelen ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Onderzoek naar de celdichtheid. De optimale celdichtheid is 60.000 cellen/putje bij het zaaien 16-24 uur voorafgaand aan het begin van een test. (A) Concentratie-responscurven van TFLLRN-NH2 bij verschillende celdichtheden, n = 3. (B) Concentratie-responscurve van TFLLRN-NH2 bij de optimale celdichtheid van 60.000 cellen/put. Gegevens zijn middelen ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Analysevolume. Het gebruik van een analysevolume van 100 μl genereert meer reproduceerbare concentratie-responscurven dan tests met een eindvolume van 200 μl. (A) Concentratie-responscurven van ML161 en 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (200 μL eindvolume). (B) Concentratie-responscurven van ML161 en 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (100 μL eindvolume). Gegevens zijn middelen ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Generatie van Z'-factoren om het vermogen van de test te bepalen om een trefferverbinding te detecteren. Calciummobilisatieresponsen met 6,5 μM TFLLRN-NH2 (kolom B) plus optionele PAR1-antagonisten 10 μM NRD-21 (kolom C) of 0,316 μM vorapaxair (kolom D). (A) De bepaling is 16 uur na het zaaien van de cellen voltooid. (B) De bepaling is 24 uur na het zaaien van de cellen voltooid. (C) Tabel met berekende Z'-factoren aan de hand van de volgende vergelijking: figure-results-9, waarbij σp de standaarddeviatie van de positieve controle is, σn de standaarddeviatie is voor de negatieve controle of het monster, μp het gemiddelde van de positieve controle en μn het gemiddelde van de negatieve controle of het monster is. Elke waarde wordt berekend door voertuig + 6,5 μM TFLLRN-NH2 aan te wijzen als de positieve controle en te vergelijken met de aangegeven toestand als de negatieve controle (medium) of monster (NRD-21 en vorapaxair). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 9: Calciummobilisatie van een PAR2-agonist. Verandering in fluorescentie in de loop van de tijd geïnduceerd door 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4. Gegevens zijn middelen ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Voorbeeld van een plaatkaart met 96 putjes voor samengestelde screening. Elke concentratie wordt gemeten in drievoud. Rij A bevat negatieve controles (geen antagonist; geen agonist) en rij B bevat positieve controles (geen antagonist; agonist). Kolommen 1 tot en met 3 bevatten zes halflogconcentraties van de parmoduline NRD-21 die optioneel kunnen worden gebruikt voor kwaliteitscontrole. PM-A, PM-B, PM-C zijn naamloze parmodulines. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Vergelijking van eerder gepubliceerd protocol en nieuw, geoptimaliseerd protocol. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel het eerder gerapporteerde protocol72 over het algemeen betrouwbaar was en ons in staat stelde een nieuw leadparmoduline te identificeren, was NRD-21,62 een efficiënter protocol gewenst. De test kwam verder in het gedrang tijdens het aanbodtekort als gevolg van de COVID-19-pandemie. Het verkrijgen van tips voor de geautomatiseerde vloeistofverwerker werd moeilijk, en pogingen om de tips te wassen, steriliseren en hergebruiken produceerden CRC's met aanzienlijke variatie. Dit faciliteerde een dringende reeks experimenten die waren ontworpen om een verbeterde PAR-gestuurde calciummobilisatietest te stroomlijnen.

Het identificeren van een geldig alternatief voor het gebruik van de geautomatiseerde vloeistofverwerker voor wasstappen was de belangrijkste prioriteit in deze studie. Tijdens de eerdere ontwikkeling van de test verminderde het gebruik van de robotische vloeistofverwerker fouten die werden veroorzaakt door handmatige mediawisselingen. Dit voegde echter veel tijd toe aan de test, aangezien de media-uitwisselingen met de 8-kanaals vloeistofverwerker de totale tijd van elke testplaat met 30-45 minuten verhoogden. Hoewel een "flicking"-methode voor media-uitwisseling eerder was geprobeerd, werden deze experimenten uitgevoerd zonder de testplaten met gelatine te bedekken voorafgaand aan het zaaien van cellen. Door de platen voor te behandelen met gelatine, werd ervoor gezorgd dat de cellen op hun plaats bleven, ongeacht de kracht die werd gebruikt om media handmatig te verwijderen. CRC's gegenereerd in een test met behulp van gelatine-gecoate, geveegde platen hadden betere goodness-of-fit-scores en kleinere foutbalken op meerdere datapunten dan curves waarbij de geautomatiseerde vloeistofverwerker werd gebruikt (Figuur 4). De RMSE-waarden (Root-Mean-Square Error) voor de plaat met behulp van de geautomatiseerde vloeistofverwerker waren 9,687 voor de ML161-curve en 10,690 voor de NRD-21-curve, terwijl de RMSE-waarden voor de plaat met gelatine en een handmatige media-uitwisseling 7,658 waren voor de ML161-curve en 6,408 voor de NRD-21-curve. Lagere RMSE-waarden geven een curve aan die beter past bij de gegeven gegevens. Deze verandering verkort ook de totale testtijd aanzienlijk. Als alternatief kan een geautomatiseerde platenwasser met meerdere kanalen worden gebruikt.

De methode van agonistadditie was een extra factor die werd bestudeerd. Dit werd gedaan om te bepalen of agonist tegelijkertijd aan alle plaatputjes kon worden toegevoegd, gevolgd door een scan van de hele plaat in één keer; Dit zou de noodzaak voor onderzoekers elimineren om in de buurt van de plaatlezer te blijven voor de duur van de tijdgevoelige test voor tal van afzonderlijke agonisttoevoegingen, wat de doorvoer aanzienlijk zou kunnen verhogen. Helaas was het toevoegen van agonist aan alle putjes en het scannen van de hele plaat problematisch, omdat de respons te snel is om de voorbijgaande maximale calciumconcentratie in elk putje betrouwbaar te meten, wat zeer variabele CRC's oplevert. Het verminderen van het aantal gescande kolommen van 12 naar 6 verbeterde de resultaten enigszins, maar de beste resultaten werden gegenereerd door slechts twee kolommen (16 putjes) tegelijk te scannen. Men zou kunnen veronderstellen dat het verlagen van de temperatuur van de test van 37 °C naar kamertemperatuur de verandering in calciumconcentratie voldoende zou kunnen vertragen om betrouwbare metingen mogelijk te maken. Hoewel meerdere calciummobilisatieprotocollen met verschillende kleurstoffen of cellijnen zijn gevalideerd bij kamertemperatuur78,79, worden in deze specifieke test verbeterde resultaten waargenomen bij 37 °C. De gemeten antagonistische concentratie-responscurves bij kamertemperatuur (~23 °C) waren niet zo uniform als bij 37 °C (Figuur 5A vs. Figuur 5B). Op basis van deze resultaten is vastgesteld dat het optimaal is om twee kolommen tegelijk te scannen bij 37 °C.

Een andere variabele die onder de loep werd genomen om de testtijd te verkorten, was de incubatietijd van de antagonist. In het vorige protocol werden antagonisten gedurende 40 minuten geïncubeerd voorafgaand aan de toevoeging van agonisten, maar hier werd vastgesteld dat 15 minuten voldoende tijd is voor parmodulines om te interageren met PAR1. Dit werd getest door parmoduline-oplossingen tegelijkertijd aan meerdere kolommen toe te voegen, gevolgd door agonist op verschillende tijdstippen toe te voegen (agonist werd toegevoegd op t = 15 min, 30 min en 45 min). De activiteit van parmodulinen bleef behouden, maar werd niet verbeterd, door de antagonisten langer te incuberen. Als gevolg van deze bevinding worden in het nieuwe protocol antagonistoplossingen in één keer aan de hele plaat toegevoegd en worden agonistoplossingen na een incubatie van 15 minuten aan de eerste kolommen toegevoegd. Door deze wijziging wordt de totale experimenttijd met 30 minuten verder verkort. Opgemerkt moet worden dat antagonisten met een langzame bindingskinetiek, zoals vorapaxar, mogelijk langere incubatietijden nodig hebben80,81.

Hoewel het verkorten van de testtijd en het elimineren van de afhankelijkheid van de vloeistofverwerker de belangrijkste factoren waren die een update van het testprotocol noodzakelijk maakten, werd ook een alternatieve celkweekmethode getest. Voorheen werden platen bezaaid met cellen rechtstreeks uit bevroren voorraden en mochten ze 40-48 uur na het zaaien in de platen groeien. De langere tijd tussen het zaaien van de platen en het uitvoeren van tests beperkte echter het aantal experimenten dat elke week kon worden uitgevoerd. Het gebruik van cellen die in kweekkolven worden gekweekt, verkort deze tijd drastisch. Cellen werden gekweekt in met weefselkweek behandelde T-75-kolven en werden van het oppervlak van de kolf verwijderd met behulp van een niet-enzymatisch celdissociatiemiddel. Dit kan belangrijk zijn om te voorkomen dat bepaalde receptoren op het celoppervlak, met name PAR2, worden beschadigd door trypsine. Eenmaal toegevoegd aan de testplaat, hebben de cellen voldoende tijd nodig om te bezinken en aan de gelatine te kleven. Omdat de flicking-methode van mediaverwijdering ook cellen kan verplaatsen, is er voldoende tijd nodig om de cellen in de gelatine te laten inbedden. Een experiment waarbij de cellen twee uur lang konden bezinken, veroorzaakte een aanzienlijk verlies van cellen, wat resulteerde in een onbruikbare test (gegevens niet getoond). Bezinkingstijden tussen 2 uur en 12 uur beperken het aantal platen dat op één dag kan worden geanalyseerd, dus een langere nachtelijke incubatie heeft de voorkeur. Het bleek dat het incuberen van de nieuw gekweekte cellen ergens tussen 16 uur en 24 uur ervoor zorgde dat de cellen volledig aan de gelatine bleven plakken en dat reproduceerbare gegevens konden worden verkregen.

Door over te schakelen van bevroren naar in kweekkolven gekweekte cellen, veranderde ook de optimale dichtheid van de celzaaiing. Het was voorspelbaar dat het zaaien van putten met de dichtheid van 25.000 cellen/put die standaard was in het vorige protocol, niet toestond dat cellen samenvloeiing bereikten met een kortere incubatietijd. Agonistische CRC's werden gegenereerd met acht afzonderlijke celdichtheden om optimale omstandigheden te bepalen (Figuur 6). Voorheen werd TFLLRN-NH2 gebruikt als PAR1-agonist bij 5 μM, omdat dit een redelijke antagonisme met parmodulinen met een lagere oplosbaarheid mogelijk maakte. Er is geen significant verschil in het achtergrond- of maximale signaal bij het zaaien met 45.000-65.000 cellen/put, maar er is een afname in variabiliteit met 5 μM TFLLRN-NH2 bij het toevoegen van 60.000 cellen/putje. Interessant is dat er geen significante toename is van de maximale fluorescentie bij een hoger aantal cellen, dus 60.000 cellen/put werd gekozen als de optimale dichtheid vanwege de verminderde variabiliteit. Agonist CRC's produceerden ook een EC50 van 6,5 μM voor TFLLRN-NH2, dus dit werd gekozen als de nieuwe standaard agonistconcentratie.

Een andere factor die werd geanalyseerd, waren de volumes die in de test werden gebruikt. In het vorige protocol werd 2 μL agonist aan elk putje toegevoegd om een uiteindelijk analysevolume van 200 μL te verkrijgen. Er werd verondersteld dat het toevoegen van grotere hoeveelheden agonistoplossing - maar het constant houden van de eindconcentratie - zou kunnen helpen bij het mengen, waardoor een sneller en betrouwbaarder signaal ontstaat. Om deze hypothese te testen, werd de toevoeging van 2 μL, 6 μL en 10 μL TFLLRN-NH2 aan 100 μL of 200 μL HEPES-HBSS in een testplaat met verschillende concentraties NRD-21 vergeleken. CRC's van NRD-21 van elke aandoening werden gegenereerd om te bepalen welke combinatie van agonistvolume en eindtestvolume de meest consistente gegevens opleverde. Hoewel toevoegingen van zowel 2 μL als 6 μL resulteerden in gegenereerde CRC's met weinig variabiliteit, kon hetzelfde niet worden gezegd over curves geproduceerd door de toevoeging van 10 μL TFLLRN-NH2 (gegevens niet getoond); de toename van de fluorescentie was niet consistent in deze putten in omvang of timing, wat CRC's produceert die identiek zouden moeten zijn, maar in plaats daarvan drastisch verschillen. Hoewel toevoegingen van 2 μL en 6 μL vergelijkbare resultaten opleverden, trad de verandering in fluorescentie veel sneller op met de toevoeging van 6 μL TFLLRN-NH2, waardoor het totale aantal scans in elk putje kon worden gehalveerd, van 40 scans naar 20 scans. Er werd ook vastgesteld dat het gebruik van een eindvolume van 100 μL meer uniforme CRC's oplevert in vergelijking met die gegenereerd met een eindvolume van 200 μL (Figuur 7).

Om te bepalen of het nieuwe protocol geschikt is voor tests met een hogere doorvoer, werden Z'-factoren voor de test berekend (Figuur 8). Een Z'-factor is een statistische methode die de kwaliteit van een screeningstest meet en bepaalt of een test op betrouwbare wijze onderscheid maakt tussen actieve en inactieve verbindingen82. Z'-factoren werden berekend voor tests die werden uitgevoerd tussen 16 en 24 uur na het zaaien van de platen en bij verschillende celpassages. In alle gevallen - voor zowel de modus agonist alleen als agonist plus antagonist - waren de berekende Z'-factoren groter dan 0,5, wat wijst op een uitstekende test82. De berekende Z'-factoren waren ook vergelijkbaar met die berekend voor de vorige test, wat aangeeft dat de wijzigingen die in het protocol zijn aangebracht om een snellere test te produceren, geen negatieve invloed hadden op de kwaliteit.

Het protocol voor PAR-gestuurde calciummobilisatie werd bijgewerkt door middel van experimenten die IC50-waarden uit CRC's genereerden, maar de test kan ook worden gebruikt om de werkzaamheid van PAR1-antagonisten bij enkelvoudige concentraties te meten. De test kan ook worden gebruikt om de activiteit van PAR2-liganden te meten; de PAR2-agonist SLIGKV-NH2 kan bijvoorbeeld TFLLRN-NH2 vervangen in het bijgewerkte protocol (figuur 9); het vorige protocol werd ook gebruikt met PAR2-agonisten en -antagonisten83. Hoewel dit protocol hier niet expliciet is getest, zou het ook van toepassing moeten zijn op menselijke navelstrengader-endotheelcellen (HUVEC), die met het vorige protocol werden gebruikt, en mogelijk andere aanhangende cellijnen. Een beperking van het gebruik van een scannende plaatlezer met protocollen zoals deze is dat ze niet geschikt zijn voor het bestuderen van snelle (sub-seconde) reacties, althans niet parallel zoals mogelijk is met een plaatbeeldvormer.

Concluderend wordt hier een sneller en eenvoudiger protocol gerapporteerd voor de endotheliale PAR-gestuurde calciummobilisatietest met behulp van een plaatlezer. Door de noodzaak van een geautomatiseerde vloeistofverwerker te elimineren, de incubatietijd van de antagonist te verkorten en het aantal scans voor elk putje te verminderen, werd de totale testtijd met ten minste 90-120 minuten verlaagd en werden de analysekosten verlaagd (voor een vergelijking tussen de eerder gerapporteerde en de huidige protocollen, zie tabel 2). Dit maakt het niet alleen mogelijk om elke dag meer verbindingen te screenen, maar elimineert ook het risico van een verminderde testperiode door kleurstofefflux, wat tot onbetrouwbare resultaten zou kunnen leiden. De nieuw geoptimaliseerde test maakt het mogelijk om sneller in endotheelcellen te screenen van PAR1- of PAR2-liganden, of mogelijk andere GPCR-liganden die intracellulaire calciummobilisatie activeren, in laboratoria die beperkt zijn tot het gebruik van plaatlezers.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.D. is de uitvinder van patenten met parmodulines en is de oprichter en aandeelhouder van Function Therapeutics, Inc., dat parmodulines ontwikkelt voor klinisch gebruik.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) en Dr. Leggy Arnold (University of Wisconsin-Milwaukee) voor het bieden van ruimte en indirecte ondersteuning van dit project, en Dr. John McCorvy (Medical College of Wisconsin) voor relevant advies. We danken het National Heart, Lung and Blood Institute (R15HL127636), het Amerikaanse ministerie van Defensie (W81XWH22101) en de National Science Foundation (2223225) voor hun subsidie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin kan optioneel worden gebruikt, maar moet zeker worden vermeden bij PAR2-assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met fenolroodCorning10-013-CV
Fetal bovien serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatine van porcine huidMilliporeSigmaG2500Gebruik om een waterige 0,4% (w/v) oplossing te maken met gedeïoniseerd water. Autoclaveer voor gebruik om te steriliseren.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blauw (0,4% w/v)Corning25-900-CI
Calciummobilisatie Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-eetaansulfonzuur (HEPES)Thermo172571000
Bovien serumalbumine (BSA)Avantor97061-420
Calciumchloride dihydraatThermo42352-0250
DimethylsulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/fenol-rood vrij)Corning21-022-CV
Magnesiumchloride hexahydraatMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
NatriumhydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA-zout)Bereidt door Trudy Holyst bij het Versiti Blood Research Institute
Materialen
96-well culture-treated, zwart-wandige, helderbodem assayplaatCorning3603met transparante deksels
Centrifugebuis, 15 mLAvantor89039-664
Centrifugebuis, 50 mLAvantor89039-656
Cultuurkolf, T-75Corning353136voor weefselcultuur behandeld
Weggeef reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerNiet langer verkrijgbaar
Microcentrifugebuis, 1,5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmoet worden gesteriliseerd
PCR tube strip met aparte platte dop stripsAvantor76318-802
Pipettips, 20 µLBiotix63300042steriele, gefilterde tips
Pipettips, 200 µLBiotix63300044steriele, gefilterde tips
Pipettips, 1250 µLBiotix63300047steriele, gefilterde tips
PrismGraphPadvolume 6 gebruikt
Serologische pipet, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serologische pipet, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serologische pipet, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4(2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582(2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, Pt 1 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597(2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062(2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124(2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100(2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23(2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516(2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Plate reader assayendotheelcellenPAR1 modulatorenFluo 4 kleurstofhigh throughput screeningGq signalering96 wellsplaatfluorescentiemeting

Gerelateerde artikelen