Hier presenteren we een protocol om van melanoompatiënten afgeleide organoïden te genereren door het kweken van gedissocieerde celsuspensies uit vers melanoomweefsel. Deze organoïden recapituleren getrouw patiëntspecifieke tumoren in vitro en bieden een innovatieve benadering voor het onderzoeken van immunosuppressieve mechanismen van tumoren, screening van geneesmiddelen, mechanismen voor resistentie tegen geneesmiddelen en benaderingen voor kankerbewaking.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Onthulling van therapeutische mogelijkheden met van melanoom patiënt afgeleide organoïde modellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Met de ontwikkeling van immunotherapie is er een voortdurende behoefte om modellen te ontwikkelen die de tumormicro-omgeving van inheemse tumoren kunnen samenvatten. Hoewel traditionele twee- en driedimensionale modellen inzicht kunnen bieden in de ontwikkeling en progressie van kanker, missen deze cruciale aspecten die een getrouwe nabootsing van inheemse tumoren in de weg staan. Een alternatief model dat veel aandacht heeft gekregen, is de van de patiënt afgeleide organoïde. De ontwikkeling van deze organoïden recapituleert de complexe intercellulaire communicatie, tumormicro-omgeving en histoarchitectuur van tumoren. Dit artikel beschrijft het protocol voor het opstellen van melanoompatiënt-afgeleide organoïde (MPDO) modellen. Om deze modellen te valideren, beoordeelden we de samenstelling van immuuncellen, inclusief de expressieniveaus van T-celactiveringsmarkers, om de cellulaire heterogeniteit van de organoïden te bevestigen. Om het potentiële nut van MPDO's in cellulaire therapieën te beschrijven, evalueerden we bovendien de cytotoxische mogelijkheden van de behandeling van de organoïden met γδ T-cellen. Concluderend bieden de MPDO-modellen veelbelovende mogelijkheden voor het begrijpen van de complexiteit van tumoren, het valideren van therapeutische strategieën en het mogelijk bevorderen van gepersonaliseerde behandeling.
Inleiding
Conventionele 2D-celkweekmodellen zijn essentiële hulpmiddelen in kankeronderzoek voor het bestuderen van kankerprogressie en -therapie1. Deze modellen maken niet alleen gecontroleerde experimentele omstandigheden mogelijk om de moleculaire en cellulaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en progressie van kanker, maar bieden ook kosteneffectieve en relatief snelle experimentele resultaten. Het gebruik ervan is echter beperkt vanwege de beperkte cellulaire diversiteit in de tumormicro-omgeving (TME), die niet kan worden gerecapituleerd in een coplanaire aard van monocultuurm....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Menselijk melanoomweefsel werd verkregen van patiënten die werden behandeld aan de Universiteit van Pennsylvania met behulp van het weefselverzamelingsprotocol (UPCC08607) dat is goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Pennsylvania. Alle patiënten hebben geïnformeerde toestemming ondertekend. Na resectie van het menselijk melanoomweefsel wordt het tumorweefsel in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) geplaatst en op 4 °C gehouden tot verwerking (binnen 6 uur). Melanoompatiënt-afgeleide organoïden (MPDO's) zijn afgeleid van een verse tumor, zoals geïllustreerd in figuur 1.<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De vorm en grootte van de MPDO's werden in de loop van de tijd gevolgd om hun groeidynamiek te bestuderen. Zoals te zien is in figuur 2, nam de organoïde tijdens de eerste groeiperiode aanzienlijk toe gedurende de 7 afgebeelde dagen. Na de observatie van de MPDO-groeidynamiek werd de aandacht gericht op het evalueren van de samenstelling van immuuncellen om de getrouwe recapitulatie van organoïden naar de oorspronkelijke tumoren te verifiëren. Deze beoordeli.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De opkomst van BOB's heeft meerdere beperkingen van andere eerder gevestigde kankeronderzoeksmethoden aangepakt en tegelijkertijd transformatieve potentiële toepassingen in het veld geïntroduceerd. Deze organoïdetechnologie werd voor het eerst voorgesteld in 2009 door Hans Clevers en collega's, die in staat waren om met succes een intestinaal organoïdekweeksysteem op te zetten door Lgr5+ -stamcellen afkomstig van de darm van muizen te kweken in een 3D-matrixgel die R-sponsin, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door subsidies van de R01(CA258113), SPORE (CA261608) en P01 (CA114046). Figuur 1 is opgesteld in BioRender.com.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 431420 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 105 mm Polystyrene Forceps Sterile | Caplugs Evergreen | 222-1121-B1I | |
| 150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | CLS430825 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody | BioLegend | 308120 | |
| Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody | BioLegend | 350522 | |
| Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody | BioLegend | 345028 | |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304050 | |
| Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter | Millipore Sigma | PIHP03050 | |
| Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
| Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Gibco | 17104019 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile | Max Scientific | 07-6048 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM - high glucose 4.5 mg/mL | Corning | MT10-0130CV | |
| Dnase I - Grade II | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| DPBS, 1% | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum, FBS | Corning | MT35-010-CV | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 556547 | |
| Forskolin | Tocris | 1099 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10131035 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| Ham's F12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11765054 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10687010 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| L-WRN cell | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced | Corning | 356231 | |
| Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM | Millipore Sigma | SLGVR33RB | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask | ThermoFisher | 132867 | |
| PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301010 | |
| PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD Biosciences | 561272 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15-1MG | |
| Recombinant Human FGF-acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%) | Quality Biological | 118-085-721 | |
| Stainless Steel Surgical Blades no. 22 | Integra | 4-322 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 |
Referenties
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research. Cancers (Basel). 11 (8), 1098(2019).
- Shannon, A. E., Boos, C. E., Hummon, A. B. Co-culturing multicellular tumor models: Modeling the tumor ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
