Op Escherichia coli gebaseerde complementatietest om de chaperonnefunctie van heat shock-eiwit te bestuderen 70

Summary

Dit protocol demonstreert de chaperonne-activiteit van heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-cellen dienen als model voor de test omdat ze een inheemse, functioneel gehandicapte Hsp70 herbergen, waardoor ze vatbaar zijn voor hittestress. De heterologe introductie van functioneel Hsp70 redt de groeideficiëntie van de cellen.

Abstract

Heat shock protein 70 (Hsp70) is een geconserveerd eiwit dat het vouwen van andere eiwitten in de cel vergemakkelijkt, waardoor het een moleculaire chaperonne wordt. Hoewel Hsp70 niet essentieel is voor de groei van E. coli-cellen onder normale omstandigheden, wordt deze chaperonne onmisbaar voor de groei bij verhoogde temperaturen. Aangezien Hsp70 sterk geconserveerd is, is een manier om de chaperonnefunctie van Hsp70-genen van verschillende soorten te bestuderen, ze heterologisch tot expressie te brengen in E. coli-stammen die ofwel een tekort aan Hsp70 hebben of een native Hsp70 tot expressie brengen die functioneel gecompromitteerd is. E. coli dnaK756-cellen zijn niet in staat om λ bacteriofaag-DNA te ondersteunen. Bovendien vertoont hun oorspronkelijke Hsp70 (DnaK) verhoogde ATPase-activiteit, terwijl het een verminderde affiniteit voor GrpE (Hsp70-nucleotide-uitwisselingsfactor) vertoont. Als gevolg hiervan groeien E. coli dnaK756-cellen adequaat bij temperaturen van 30 °C tot 37 °C, maar sterven ze bij verhoogde temperaturen (>40 °C). Om deze reden dienen deze cellen als model voor het bestuderen van de chaperonne-activiteit van Hsp70. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de toepassing van deze cellen om een complementatietest uit te voeren, waardoor de studie van de in cellulo chaperonnefunctie van Hsp70 mogelijk wordt.

Introduction

Heat shock-eiwitten spelen een belangrijke rol als moleculaire chaperonnes door het vouwen van eiwitten te vergemakkelijken, eiwitaggregatie te voorkomen en het^{verkeerd vouwen} van eiwitten om te ^keren1,2. Heat shock proteïne 70 (Hsp70) is een van de meest prominente moleculaire chaperonnes en speelt een centrale rol in eiwithomeostase ^3,4. DnaK is de E. coli Hsp70 homoloog⁵.

Er zijn verschillende biofysische, biochemische en celgebaseerde testen ontwikkeld om de chaperonne-activiteit van Hsp70 te onderzoeken en te screenen op remmers die gericht zijn op deze chaperonne ^6,7,8. Hsp70 is een sterk geconserveerd eiwit. Om deze reden zijn verschillende Hsp70's van eukaryote organismen, zoals Plasmodium falciparum (de belangrijkste verwekker van malaria), gemeld om de DnaK-functie in E. coli ^6,9 te vervangen. Op deze manier is een op E. coli gebaseerde complementatietest ontwikkeld met betrekking tot de heterologe expressie van Hsp70's in E. coli om hun cytoprotectieve functie te onderzoeken. Meestal omvat deze test het gebruik van E. coli-cellen die ofwel een tekort hebben aan DnaK of die een native DnaK tot expressie brengen die functioneel gecompromitteerd is. Hoewel DnaK onder normale omstandigheden niet essentieel is voor de groei van E. coli, wordt het essentieel wanneer de cellen worden gekweekt onder stressvolle omstandigheden zoals verhoogde temperaturen of andere vormen van^stress10,11.

E. coli-stammen die zijn ontwikkeld om de functie van Hsp70 te bestuderen met behulp van een complementatietest zijn onder meer E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) en E. coli dnaK756. E. coli dnaK103-cellen produceren een afgeknotte DnaK die niet functioneel is, en als zodanig groeien de cellen voldoende bij 30 °C, terwijl de stam gevoelig is voor koude- en hittestress ^12,13. Ook de E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) stam wordt niet hoger dan 40 °C^14,15. De E. coli dnaK756-stam brengt een gemuteerd native DnaK (DnaK756) tot expressie dat wordt gekenmerkt door drie glycine-naar-aspartaatsubstituties op posities 32, 455 en 468, wat aanleiding geeft tot gecompromitteerde proteostatische uitkomsten. Bijgevolg is deze stam resistent tegen bacteriofaag λ DNA¹⁴. Bovendien vertoont E. coli dnaK756 een verhoogde ATPase-activiteit, terwijl de affiniteit voor de nucleotide-uitwisselingsfactor, GrpE, verminderd is¹⁶. E. coli DnaK-mutante stammen dienen als ideale modellen voor het onderzoeken van de chaperonne-activiteit van Hsp70 door middel van een complementatiebenadering. Aangezien DnaK alleen essentieel is onder stressvolle omstandigheden, wordt de complementatietest meestal uitgevoerd bij verhoogde temperaturen (Figuur 1). Enkele voordelen van het gebruik van E. coli voor dit onderzoek zijn het goed gekarakteriseerde genoom, de snelle groei en de lage kosten van kweek en^onderhoud17.

In dit artikel beschrijven we in detail een protocol waarbij E. coli dnaK756-cellen worden gebruikt om de functie van Hsp70 te bestuderen. De Hsp70's die we in de test hebben gebruikt, zijn wild-type DnaK en zijn chimere derivaat, KPf (bestaande uit het ATPase-domein van DnaK dat is gefuseerd met het C-terminale substraatbindende domein van Plasmodium falciparum Hsp70-1 ^6,18). KPf-V436F werd heteroloog uitgedrukt als een negatieve controle, aangezien de mutatie in wezen blokkeert om substraten te binden, waardoor de chaperonne-activiteit wordt opgeheven⁹.

Protocol

1. Transformatie

NOTITIE: Gebruik steriel glaswerk voor kweek, pipetpunten en vers bereide en geautoclaveerde media. Bereid culturen van de E. coli-cellen in 2x gisttrypton (YT) [1,6% trypton (w/v), 1% gistextract (w/v), 0,5% NaCl (w/v), 1,5% agar (w/v)] agar. Algemene reagentia die in het protocol worden gebruikt en hun bronnen zijn te vinden in de materiaaltabel.

1. Label 2,0 ml microcentrifugebuisjes en aliquot 50 μL competente E. coli dnaK756-cellen, waarbij de cellen op ijs worden gehouden.
2. Aan de microcentrifugebuisjes van 2,0 ml met competente cellen, aliquot 10-50 ng pQE60/DnaK, pQE60/KPf en pQE60/KPf-V436F plasmide-DNA⁹ in afzonderlijke buisjes.
3. Houd de microcentrifugebuisjes van 2,0 ml met de competente cellen en plasmide-DNA gedurende 30 minuten op ijs.
4. Verhit het competente cellen-DNA-mengsel gedurende 60 s bij 42 °C en zet de microcentrifugebuisjes gedurende 10 minuten terug op ijs.
5. Voeg 950 μL verse 2x YT-bouillon toe (voorgeïncubeerd bij 37 °C) en incubeer bij 37 °C terwijl je gedurende 1 uur schudt met 150 omwentelingen/min. Laat de cellen veel langer groeien om hun herstel te bevorderen als dat nodig is.
   NOTITIE: Schud de cellen niet krachtig.
6. Pipetteer 100 μL van de cellen en verdeel ze over 2x YT-agarplaten met 50 μg/ml kanamycine, 10 μg/ml tetracycline voor de betreffende stam en 100 μg/ml ampicilline (zie materiaaltabel) voor plasmideselectie.
7. Centrifugeer de rest van de cellen (waarvan het volume nu ongeveer 900 μl is) gedurende 1 minuut bij 5000 x g (bij 4 °C) met behulp van een tafelmicrocentrifuge.
8. Decanteer ongeveer 800 μL van de bouillon en gebruik het resterende medium om de gepelleteerde cellen te resuspenderen.
9. Plaat de herstelde cellen op de 2x YT-agarplaat.
10. Incubeer beide agarplaten een nacht (of ongeveer 17 uur) bij 37 °C.
    OPMERKING: Deze cellen groeien erg langzaam en moeten mogelijk veel langer worden geïncubeerd. Wees voorzichtig om de kolonies te spotten, die erg klein kunnen beginnen. De plaat met cellen die na centrifugatie (stap 1.7) opnieuw in suspensie zijn gebracht, dient als back-up in het geval dat de omzettingsefficiëntie van de cellen slecht is, in welk geval de gepelleteerde cellen het herstel van eventuele getransformeerde cellen kunnen verbeteren. Als de omzettingsefficiëntie echter uitstekend is, kan de agarplaat waarop geconcentreerde cellen werden geplateerd, worden gekenmerkt door een overwoekerde cultuur bij incubatie, waardoor het moeilijk wordt om afzonderlijke kolonies te identificeren. In dat geval kan de andere agarplaat degene zijn waarop goed gespreide kolonies groeien.

2. Cel plateren

1. Pak een enkele kolonie van de transformanten en inoculeer deze in 10 ml 2x YT-bouillon aangevuld met 50 μg/ml kanamycine, 10 μg/ml tetracycline voor de selectie van de E. coli dnaK756-cellen en 100 μg/ml ampicilline voor plasmideselectie.
   NOTITIE: Gebruik kolven (≥50 ml) om beluchting te garanderen bij het roeren van de cultuur. Incubeer het entmateriaal een nacht (17 uur) bij 37 °C en schud het met 150 omwentelingen/min.
2. Voer de volgende ochtend een absorptiemeting uit bij OD₆₀₀.
3. Reinig het oppervlak van de werkbank met 75% ethanol om het oppervlak af te vegen ter voorbereiding op het spotten van cellen.
4. Gebruik een microcentrifugebuis van 2 ml om de cultuur te standaardiseren tot een OD_600-waarde van 2,0 met behulp van 2x YT-bouillon.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat de OD-metingen correct worden uitgevoerd, aangezien deze stap belangrijk is voor het standaardiseren van de celdichtheid over de verschillende monsters.
5. Bereid met behulp van microcentrifugebuisjes van 2 ml seriële verdunningen van de cellen van 10⁰ tot ^10-5.
6. Incubeer de agarplaten die moeten worden gebruikt om de cellen op te spotten in een oven die is ingesteld op 40 °C om de platen te laten drogen met gedeeltelijk geopende deksels om ervoor te zorgen dat waterdamp ontsnapt.
   OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de cellen op gelijkmatig gescheiden afstanden worden gespot, tekent u lijnen op een stuk papier waarop een sjabloon met spotting-locaties is afgedrukt.
7. Breng 2 μl van de serieel verdunde cellen aan op de agarplaten, aangevuld met 50 μg/ml kanamycine, 10 μg/ml tetracycline, 100 μg/ml ampicilline en 0,5 mM IPTG (voor de inductie van expressie van de recombinante eiwitten) (zie materiaaltabel).
8. Plaats elk monster op twee afzonderlijke platen (één om te incuberen bij 37 °C en de andere bij 43,5 °C).
   NOTITIE: Vermijd het doorboren van de agarplaat.
9. Spot controlemonsters op dezelfde plaat als de experimentele monsters om milieueffecten te minimaliseren.
10. Voer de spotting snel uit om ervoor te zorgen dat het proces is voltooid voordat de cellen beginnen te groeien, omdat dit scheve groeipatronen kan veroorzaken.
    OPMERKING: Het is belangrijk om spuitbussen te vermijden bij het spotten, omdat deze de platen zouden besmetten. Het is ook belangrijk om de platen tussen de vlekken gesloten te houden om besmetting te voorkomen.
11. Incubeer de ene plaat bij 37 °C (permissieve groeitemperatuur) en de andere bij de niet-permissieve groeitemperatuur van 43,5 °C.
    NOTITIE: Incubeer de platen ondersteboven om te voorkomen dat er stoom op het deksel terechtkomt, omdat het gecondenseerde water de gevlekte kolonies van hun plaats zou spoelen.
12. Plaats alle borden tegelijkertijd in de broedstoofmachines en vermijd het openen van de broedmachine tot de volgende ochtend.
    NOTITIE: Het wordt afgeraden om de deur van de couveuse meerdere keren te openen tijdens het incuberen van de platen. Dit komt omdat de toegang van lucht in de incubator kan leiden tot temperatuurschommelingen die de celgroei nadelig beïnvloeden.

3. Bevestiging van de expressie van recombinante eiwitten

1. Pak met behulp van een steriele lus een deel van de resterende cellen op uit dezelfde kolonie getransformeerde E. coli dnaK756-cellen.
2. Inoculeer de cellen in 10 ml YT-bouillon aangevuld met 50 μg/ml kanamycine, 10 μg/ml tetracycline en 100 μg/ml ampicilline. 's Nachts (17 uur) incuberen bij 37 °C en schudden bij 150 omwentelingen/min.
3. Breng de kweek over in 90 ml steriele 2x YT-bouillon met de nodige antibiotica zoals vermeld in stap 3.2. Laat de cellen groeien tot halverwege de logfase (OD₆₀₀ = 0,4-0,6).
4. Neem 2 ml van de monstercultuur vóór inductie (0 uur inductiemonster).
5. Voeg IPTG toe tot een eindconcentratie van 1 mM om de eiwitproductie te induceren en de cellen opnieuw te incuberen bij 37 °C.
6. Neem 6 uur na de inductie een tweede monster van 2 ml.
7. Oogst de cellen door te centrifugeren op 5000 x g gedurende 10 min. Houd de centrifugetemperatuur op 4 °C.
8. Gooi de supernatant weg.
9. Resuspendeer de pellet in PBS-buffer (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄) en bewaar bij -20 °C.

4. SDS-PAGE en western blot analyses

1. Bereid 2x 10% SDS-gels zoals eerder beschreven¹⁹.
2. Bewaar een van de SDS-PAGE-gels voor latere kleuring met Coomassie-kleuring om de eiwitbanden te bekijken. Gebruik de tweede SDS-PAGE-gel om een western blot-analyse uit te voeren.
3. Aliquot 80 μL van de geresuspendeerde monsters en meng dit met 20 μL 4x Laemmli SDS-laadbuffer.
4. Kook de suspensie gedurende 10 minuten op 100 °C. Laad vervolgens 10 μL van elk monster op de geprefabriceerde SDS-gel (zie Materiaaltabel).
5. Voer elektroforese uit bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met een spanning van 120 V in een 1x oplossing van SDS lopende buffer (25 mm Tris, 250 mm glycine, 0,1% (w/v) SDS).
6. Kleuring de gel met Coomassie kleuring (zie Materiaaltabel) gedurende 1 uur, gevolgd door ontkleuring met behulp van ontkleuringsbuffer (50% (v/v) methanol, 10% (v/v) azijnzuur in gedestilleerd water) gedurende 2 uur.
7. Visualiseer de eiwitbanden die in de gel aanwezig zijn met behulp van een gelbeeldvormingssysteem (zie Tabel met materialen). Voer een andere SDS-PAGE-gel opnieuw uit met dezelfde monsters volgens het bovengenoemde protocol.
8. Wanneer de elektroforetische run eindigt, neemt u SDS-PAGE-gels om een western blot-analyse uit te voeren zoals eerder beschreven¹⁹.
9. Was het nitrocellulosemembraan waarop de eiwitten zijn overgebracht driemaal in wasbuffer (TBS-Tween, pH 7,4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Tween]).
10. Gebruik α-DnaK (zie Materiaaltabel) om respectievelijk DnaK te detecteren en α-PfHsp70-1⁷ om KPf en zijn mutant, KPf-V436F, te detecteren.
11. Gebruik de antilichamen in een verdunning van 1:2000 in 5% magere melk. Incubeer bij 4 °C en schud gedurende 1 uur bij 60 omwentelingen/min.
12. Verwijder niet-specifiek gebonden antilichamen door het nitrocellulosemembraan in TBS-Tween 3 keer in 15 minuten te wassen.
13. Incubeer het membraan in het secundaire antilichaam (α-konijn, zie Materiaaltabel) onder dezelfde omstandigheden als in de vorige stap. Dit wordt gevolgd door een daaropvolgende wasbeurt onder dezelfde omstandigheden als het primaire antilichaam.
14. Los de banden op met behulp van verbeterd chemiluminescentie (ECL)-detectiereagens.
15. Visualiseer de banden met behulp van een gelimager.

Results

Figuur 2 toont een afbeelding van de gescande agar met cellen die werden gespot en gekweekt bij de permissieve groeitemperatuur van respectievelijk 37 °C en 43,5 °C. Aan de rechterkant van figuur 2 geven uitgesneden western blot-componenten de expressie weer van DnaK, KPf en KPf-V436F in E. coli dnaK756-cellen. Zoals verwacht slaagden alle E. coli dnaK756-cellen die werden gekweekt bij de permissieve groeitemperatuur van 37 °C erin om te groeien. Onder de niet-permissieve groeiomstandigheden van 43,5 °C slaagden echter alleen cellen die heteroloog DnaK en KPf tot expressie brachten erin te groeien, zoals eerder gerapporteerd ^6,9,20 (Figuur 2). Aan de andere kant groeiden cellen die KPf-V436F tot expressie brengen alleen bij 37 °C, maar groeiden ze niet bij 43,5 °C. Dit toont aan dat DnaK en KPf in staat waren om het groeidefect van E. coli dnaK756-cellen te herstellen onder hittestressomstandigheden. Het falen van cellen die heteroloog KPf-V436F tot expressie brengen om de groei van cellen bij 43,5 °C te ondersteunen, toont het gebrek aan chaperonnefunctie van dit eiwit aan. In dit opzicht dient KPf-V436F als een ideaal negatief controle-eiwit.

Figuur 1: Principe van de complementatietest met behulp van E. coli dnaK756-cellen om de chaperonnefunctie van heterologisch tot expressie gebrachte eiwitten te bestuderen. E. coli dnaK756 brengt een natief DnaK756-eiwit tot expressie dat de cellen niet kan beschermen tegen hittestress. Introductie van functioneel heteroloog Hsp70 redt de cellen van de dood bij blootstelling aan hittestress. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Complementatieplaattest die de mogelijkheden van DnaK en KPf aantoont om E. coli dnaK756-cellen te beschermen tegen hittestress. De getransformeerde cellen werden gekweekt bij 37 °C (permissieve groeitemperatuur) en 43,5 °C (niet-permissieve groeitemperatuur). De cellen werden gestandaardiseerd en geplateerd als seriële verdunningen. 'N' symboliseert 'Neat', wat staat voor de eerste plek die bestaat uit onverdunde cellen. Uiterst rechts bevinden zich de excisies van de westelijke vlek die de expressie van de drie eiwitten vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het protocol demonstreert het nut van E. coli dnaK756-cellenbij het onderzoeken van de chaperonnefunctie van heterologisch tot expressie gebracht Hsp70. Deze test zou kunnen worden gebruikt om remmers te screenen die gericht zijn op de Hsp70-functie in cellulo. Een beperking van deze methode is echter dat Hsp70's die niet in staat zijn om DnaK in E. coli te vervangen, niet compatibel zijn met deze test. Gebrek aan posttranslationele modificatie²¹ van sommige niet-inheemse Hsp70's kan een verklaring zijn voor hun gebrek aan functie binnen het E. coli-systeem . Een op gist gebaseerde complementatietest²² kan enkele van de tekortkomingen van de op E. coli gebaseerde test aanpakken.

Verschillende belangrijke stappen zijn cruciaal om reproduceerbare resultaten te garanderen. Deze omvatten ervoor zorgen dat alleen cellen die door het respectieve plasmideconstruct worden getransformeerd, worden gebruikt tijdens het plateren. Daarnaast is het belangrijk om besmetting van de cultuur tijdens de stappen te voorkomen. Bovendien, aangezien gestreste E. coli DnaK-cellen gevoelig zijn voor overmatige filamentatie¹⁰, is het belangrijk om krachtig schudden tijdens de kweek te vermijden, aangezien deze fysieke belasting uitgebreide filamentatie bevordert. Overmatig filamente cellen geven hogere valse schijnbare groeiwaarden bij OD₆₀₀, wat leidt tot een overschatting van de kweekgroei en een negatieve invloed heeft op de celstandaardisatie voorafgaand aan het plateren. Hoewel Hsp70 onder normale omstandigheden niet essentieel is voor de groei van E. coli, zijn cellen zonder dit eiwit stressgevoelig10. Om deze reden groeien E. coli dnaK756-cellen veel langzamer nadat ze zijn getransformeerd of tijdens hun herstel uit glycerolvoorraden. Bovendien zijn ze extreem gevoelig voor temperatuurschommelingen. Daarom is het belangrijk om de deur van de incubator niet te openen zodra de vergulde agarplaten erin zijn geplaatst totdat het tijd is om de platen te bekijken.

De western blot-gegevens zijn belangrijk om de expressie van de respectievelijke recombinante Hsp70-eiwitten in E. coli dnaK756-cellen te bevestigen. Het niet tot expressie brengen van het betreffende eiwit leidt tot een vals-negatief resultaat voor cellen die groeien onder een niet-permissieve groeitemperatuur.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Bestanddeel voor monsterlaaddye
Azijnzuur	Labchem	101005125	Bestanddeel van destainer
Acrylamide	Sigma-Aldrich	8008300100	Component van SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	Bestanddeel van medium en vloeibare groeitest
Agarose	Clever Scientific	14131031	Gecertificeerde moleculaire biologie agarose
Ammoniumpersulfaat	Sigma-Aldrich	101875295	Bestanddeel voor SDS-PAGE gel
Ampicilline	VWR International	0339—EU—25G	Selectief antibioticum
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Component van SDS
Broomfenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Bestanddeel voor monsterlaaddye
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	Voor competente cellen bereiding
Coomassie briljantblauw	VWR International	443293X	SDS-PAGE kleurstof
Dinatriumfosfaat	Sigma-Aldrich	RB10368	Bestanddeel van PBS buffer
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Western blot detectiereagens
Ethidiumbromide	Thermofischer Scientific	17898	DNA intercalerende kleurstof
Glycerol	Merck	SAAR2676520L	Bestanddeel voor monsterlaaddye
Glycine	VWR International	10119CU	Component van SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	inductor
Kanamycine	Melford	K0126	Selectief antibioticum
Magnesiumchloride	Merck	SAAR4123000EM	Bestanddeel van medium en vloeibare groeitest
Methanol	Labchem	113140129	Bestanddeel van destainer
Monobasicum kaliumfosfaat	Merck	1,04,87,30,250	Bestanddeel van PBS buffer
Pepton	Merck	HG000BX4.250	Bestanddeel van medium en vloeibare groeitest
Kaliumchloride	Merck	SAAR5042020EM	Bestanddeel van PBS buffer
PVDF membraan	Thermofischer scientific	PB7320	Western blot membraan
Natriumchloride	Merck	SAAR5822320EM	Bestanddeel van medium en vloeibare groeitest
Natriumdodecylsulfaat	VWR International	108073	Om tot expressie gebrachte eiwitten op te lossen
Spectramax iD3	Separations	373705019	Geautomatiseerde platenlezer
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Component van SDS gel
Tetracycline	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Selectief antibioticum
Tris	VWR International	19A094101	Component van SDS gel
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Bestanddeel voor Western wash buffer
Western transferkamer	Thermofisher Scientific	PB0112	Overdracht van eiwit naar nitrocellulose membraan
Gistextract	Merck	HG000BX6.500	Bestanddeel van medium en vloeibare groeitest
α-DnaK antilichaam	Inqaba	BK CAC09317	Primair antilichaam
α-konijnantilichaam	Thermofischer scientific	31460	Secundair antilichaam