Het hier beschreven heterotope hulplevertransplantatieprotocol bij ratten biedt een praktisch onderzoeksinstrument voor het onderzoeken van mechanismen van afstoting van het levertransplantaat. Dit model helpt bij het verlichten van de chirurgische hindernissen en dierlijke stress van orthotope levertransplantatie bij ratten.
Methodenartikel
Heterotopisch aanvullend transplantaatmodel voor ratten in de hele lever met behulp van een hepaticouretostomie voor onderzoeken naar afstoting van transplantaten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Transplantatiemodellen voor kleine dieren zijn onmisbaar voor orgaantolerantiestudies die haalbare therapeutische interventies in preklinische studies onderzoeken. Protocollen voor levertransplantatie bij ratten (LTx) maken doorgaans gebruik van een orthotopisch model waarbij de inheemse lever van de ontvangers wordt verwijderd en vervangen door een donorlever. Deze technisch veeleisende chirurgische ingreep vereist geavanceerde microchirurgische vaardigheden en wordt verder gecompliceerd door lange anhepatische en ischemietijden van het onderlichaam. Dit leidde tot de ontwikkeling van een minder gecompliceerde heterotope methode die sneller kan worden uitgevoerd zonder anhepatische of ischemietijd van het onderlichaam, waardoor de stress na de operatie voor het ontvangende dier wordt verminderd.
Dit heterotope LTx-protocol omvat twee hoofdstappen: het wegsnijden van de lever van de donorrat en het transplanteren van de hele lever in de ontvangende rat. Tijdens de excisie van de donorlever ligeert de chirurg de suprahepatische vena cava (SHVC) en de leverslagader (HA). Aan de kant van de ontvanger verwijdert de chirurg de linkernier en plaatst de donorlever met de poortader (PV), infrahepatische vena cava (IHVC) en galwegen naar de niervaten gericht. Verder anastomoseert de chirurg de nierader van de ontvanger van begin tot eind met de IHVC van de lever en arterialiseert de PV met de nierslagader met behulp van een stent. Een hepaticourerietstomie wordt gebruikt voor galafvoer door de galwegen naar de urineleider van de ontvanger te anastomoseren, waardoor de afvoer van gal via de blaas mogelijk wordt.
De gemiddelde duur van de transplantatie was 130 minuten, de duur van koude ischemie was ongeveer 35 minuten en de duur van warme ischemie was minder dan 25 minuten. Hematoxyline- en eosinehistologie van de hulplever van syngene transplantaties vertoonden 30 dagen na transplantatie een normale hepatocytenstructuur zonder significante parenchymale veranderingen. Daarentegen vertoonden allogene transplantaatmonsters na transplantatie 8 dagen uitgebreide lymfocytische infiltratie met een Banff Schema afstotingsactiviteitsindexscore van 9. Daarom faciliteert deze LTx-methode een alternatief voor een afstotingsmodel met lage morbiditeit voor orthotope LTx.
Inleiding
LTx bij kleine dieren is een model van onschatbare waarde voor het onderzoeken van mechanismen van leverafstoting. Heterotope hulplevertransplantatie met poortaderarterialisatie (HALT-PVA) bij ratten werd in 1968 geïntroduceerd door Lee en Edgington1toen ze meldden dat ze de nierader en slagader van een ontvanger gebruikten om een getransplanteerde hulplever opnieuw te vasculariseren. Vervolgens hebben Hess et al.2 het protocol verbeterd met de vermindering van functionele concurrentie tussen de inheemse en hulplevers door de inheemse en donorlever te verkleinen en de verbinding met de galwegen van de donor te reconstrueren, wat resulteert in overleving van het transplantaat op lange termijn. Verdere verfijningen werden aangebracht met de introductie van cuff anastomose 3,4, en Schleimer et al.5 bepaalden de optimale stentdiameter voor het reguleren van de bloedstroom om fysiologische portale stroom te verkrijgen en hyper- of hypoperfusie van het transplantaat te voorkomen. Andere onderzoekers ontwikkelden significante wijzigingen in de methode door de milt6 of gemeenschappelijke iliacale7-slagader te gebruiken voor de toevoer van transplantaatbloed, terwijl sommigen modellen ontwikkelden die alleen veneus bloed8 of alleen arterieel bloed via de leverslagader9 gebruikten om het hulplevertransplantaat te voeden.
De huidige studie veronderstelde dat functionele concurrentie van de natuurlijke lever de afstoting van het allotransplantaat niet zou verstoren, dus ontwikkelden we een protocol op basis van het flow-gereguleerde Schleimer-model10 dat geen enkele verkleining van de natieve of hulplever omvatte. De linkerkant van de ontvanger werd geselecteerd om het transplantaat te lokaliseren, omdat deze een optimale oriëntatie bood tussen de nier- en donorlevervaten van de ontvanger. Aanvankelijk probeerden we galreconstructie via hepaticoduodenomie, maar deze onderzoeken bevestigden eenvoudigweg de bewering van Schleimer dat "galdrainage de achilleshiel is van levertransplantatie"10. Dit leidde tot de ontwikkeling van een nieuwe techniek waarbij de galwegen van begin tot eind worden geanastomoseerd met behulp van een stent met de urineleider van de ontvangers, waardoor de afvoer van gal via de blaas mogelijk wordt. Een opmerkelijk voordeel van het gebruik van een hepaticoureterostomie is dat de functionaliteit van de transplantaatlever dagelijks kan worden gecontroleerd door de urine te observeren; Een galproducerend levertransplantaat kleurt de urine heldergeel. Figuur 1 geeft het schematische overzicht van de HALT-PVA-methode weer.
Een belangrijk voordeel van heterotope LTx ten opzichte van orthotope rat heeft betrekking op de afwezigheid van anhepatische of totale ischemietijd van het onderlichaam, waardoor heterotope ontvangers sneller en gemakkelijker kunnen herstellen. Bovendien vertrouwen LTx-immunologische onderzoeken waarbij gebruik wordt gemaakt van orthotope methoden vaak op ernstige afstoting of dood van de ontvanger als experimenteel eindpunt, wat niet het geval is bij heterotope transplantaties, waarbij het dier gezond blijft, zelfs als het allotransplantaat stopt met functioneren als gevolg van afstoting. Beide kenmerken van de heterotope methode ondersteunen de principes van het internationale 3R-initiatief (Vervanging, Vermindering en Verfijning)11, dat een kader bevordert voor het minimaliseren van de pijn, het lijden en het leed dat onderzoeksdieren ervaren en het verbeteren van hun welzijn.
Het HALT-PVA-model dat hier wordt gerapporteerd, is een praktische en betrouwbare methode voor het onderzoeken van de mechanismen van afstoting van levertransplantaten in preklinische studies. Deze nuttige experimentele techniek helpt bij het overwinnen van de aanzienlijke chirurgische eisen en dierlijke stress van orthotope LTx bij ratten. In de toekomst zijn we van plan deze methode te gebruiken om de mechanismen van acute immuunafstoting te onderzoeken en tegelijkertijd nieuwe doelen en therapeutische strategieën te verkennen om afstoting van levertransplantaten te onderdrukken.
Protocol
Dieren werden gefokt en gehuisvest in specifieke pathogeenvrije omstandigheden in de dierenverzorgingsfaciliteiten van het University of Wisconsin (UW)-Madison Institute for Medical Research in overeenstemming met institutionele richtlijnen. Het onderzoeksprotocol (nr. M006022) werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de UW School of Medicine and Public Health, en alle dieren werden ethisch behandeld.
1. Dieren
- Gebruik volwassen Lewis-vrouwtjesratten met een gewicht van 205-235 g en Lewis-mannetjes van 250-280 g als donorratten. Gebruik volwassen mannelijke Lewis en Brown Norway-ratten met een gewicht van 365-420 g als ontvangers.
- Voer syngene transplantaties uit door Lewis-donoren te transplanteren in Lewis-ontvangers, terwijl de allogene transplantaties Lewis-donoren gebruikten die werden getransplanteerd in Brown Norway-ontvangers.
- Voer alle operaties uit door twee personen met behulp van een microscoop met twee koppen.
2. Procedure voor de aanschaf van hulpleverdonoren
- Verdoof de donorrat met 5% isofluraaninhalatie in een inductiekamer. Registreer het gewicht van de rat en scheer de buik met een elektrische tondeuse.
- Plaats de rat in rugligging op een verwarmd operatiekussen met zijn neus in een anesthesiekegel en immobiliseer de ledematen met tape. Desinfecteer de buik met 75% alcohol en verlaag het isofluraan tot 2%.
- Maak met een schaar een longitudinale middellijn huid en spierincisie van het schaambeen tot de xiphoid. Verleng deze in de buurt van het midden van de longitudinale incisie zijdelings naar links en rechts en installeer vervolgens oprolmechanismen aan beide zijden van de buikwand en het xiphoid-proces.
- Trek met vochtige wattenstaafjes de darmen terug naar de linkerkant van de buik terwijl u een veerschaar gebruikt om de gastroligamenten die aan de lever zijn bevestigd door te knippen en vervolgens de darmen te immobiliseren onder bevochtigd gaas. Bedek de lever met een klein stukje steriel gaasje bevochtigd met warme zoutoplossing.
- Gebruik vochtige wattenstaafjes om de lever terug te trekken en de falciforme, driehoekige, hepatogastrische en hepatoduodenale ligamenten te ontleden. Schroei vervolgens dicht met een bipolaire tang en verdeel de para-oesofageale vaten tussen de linker laterale en voorste caudatuskwab.
- Gebruik een hoektang of naaldhouders, ontleed achter de SHVC die inferieur is aan het middenrif, haal vervolgens een 5-0 zijden hechtdraad onder de SHVC en leg losjes een dubbele knoop voor later gebruik.
- Trek de rechter inferieure zijkwab naar boven, snijd het ligament door en immobiliseer onder bevochtigd gaasje. Isoleer de IHVC van het retroperitoneale weefsel tot aan de rechter nierader en lig de rechter bijnierader met een 6-0 zijden hechtdraad zo dicht mogelijk bij de IHVC. Splits deze ader later wanneer het transplantaat wordt verwijderd.
- Gebruik een hydrodissectienaald van 27 G (Figuur 2A) om de PV los te koppelen van het omringende bindweefsel en scheid het van de pylorus- en miltaders door ze af te binden en te delen met behulp van een 7-0 zijden hechtdraad.
- Isoleer, ligate met 6-0 zijden hechtdraad en verdeel de gemeenschappelijke leverslagader dicht bij waar deze onder de PV passeert.
- Ligate de galwegen met een 5-0 zijden hechtdraad bij de vertakking van de gastroduodenale slagader met behoud van het vetweefsel rond de galwegen zoveel mogelijk; Vermijd in het bijzonder het scheiden van de galwegen van de juiste leverslagader, terwijl u de totale lengte zo kort mogelijk houdt.
- Maak met een veerschaar een kleine incisie in de wand van de galwegen proximaal van de ligatie. Plaats een polyimide-slangstent met een diameter van 0.0215 inch en 5 mm lang in het lumen van de galwegen en zet deze vast met een 6-0 zijden hechtdraad, waarbij u het ene uiteinde van de hechtdraad lang laat voor later gebruik. Verdeel het galkanaal door te snijden tussen de 5-0 en 6-0 ligaties.
- Markeer de bovenkant van de IHVC en PV met een chirurgische verfpen om de bloedvaten tijdens de anastomose uit te lijnen, en klem vervolgens de poortader vast met een microvaatklem zo distaal mogelijk van de lever.
- Steek een spuit van 20 ml met een naald van 26 G in de PV proximaal van de microklem en perfuseer de lever met 10-15 ml ijskoude gehepariniseerde zoutoplossing; verdeel tegelijkertijd de IHVC met behulp van een veerschaar zo dicht mogelijk bij de rechter nierader.
- Snijd de lever weg met behulp van een veerschaar door de PV proximaal van de microklem te ontleden, de 5-0 hechting die eerder rond de SHVC is geplaatst, vast te draaien en het middenrif te ontleden om de intrathoracale vena cava te transecteren.
- Ga verder met het ontleden van de resterende ligamenten aan de achterkant van de lever en verdeel de eerder geligeerde bijnierader. Leg de weggesneden lever in een koude zoutoplossing op ijs.
3. Transplantatieprocedure voor hulpleverontvanger
- Verdoof de ontvangende rat met 5% isofluraaninhalatie in een inductiekamer. Registreer het gewicht van de rat en scheer de buik met een elektrische tondeuse.
- Plaats de rat in rugligging op een verwarmd operatiekussen met zijn neus in een anesthesiekegel en immobiliseer de ledematen met tape. Breng een oogglijmiddel aan, desinfecteer de buik met 75% alcohol en verlaag het isofluraan tot 2%.
- Maak met een schaar een longitudinale middellijn huid en spierincisie van het schaambeen tot de xiphoid en installeer vervolgens oprolmechanismen aan beide zijden van de buikwand.
- Trek met vochtige wattenstaafjes de darmen terug naar de rechterkant van de buik en bedek ze met bevochtigd gaasje. Breng nog een vochtig gaasje aan om de maag, milt en lever te bedekken, zodat de linker nier en niervaten blootliggen.
- Gebruik een hydrodissectienaald van 27 G en een tang met stompe punt om de linker nierader van de nierslagader te scheiden en voorzichtig vet en bindweefsel uit beide bloedvaten te verwijderen.
- Isoleer de gonadale en bijnieraders en gebruik 6-0 zijde om ze tijdelijk proximaal van de nierader te binden. Schroei, met behulp van een bipolaire tang, alle microzijtakken die de nierader en slagader tussen de aorta/VC en de nier isoleren.
- Mobiliseer en ligate de urineleider met een 6-0 zijden hechtdraad aan de inferieure pool. Markeer de nierader en slagader met een chirurgische verfstift om de bloedvaten tijdens anastomose te helpen oriënteren en ervoor te zorgen dat er geen verdraaiingen zijn.
- Klem de nierslagader en de nierader met een microvatklem zo dicht mogelijk bij de aorta en VC vast. Transecteer de nierslagader met een veerschaar net voorbij de vaatvertakking en verdeel de nierader ongeveer halverwege tussen het VC en de nier. Mobiliseer de linkernier uit het omliggende bindweefsel en verwijder deze.
- Spoel beide bloedvaten met gehepariniseerde zoutoplossing met behulp van een hydrodissectienaald van 27 G om al het resterende bloed te verwijderen.
- Knip met een veerschaar een kleine opening in de opening van de vissenbek in de vork van de nierslagader om een trechtervormige opening te maken en breng een stent van 8 mm in die uit een katheter van 26 G is gesneden (Figuur 2B). Zet de stent vast met 6-0 zijden hechtdraad, waarbij het ene uiteinde van de hechtdraad lang blijft voor later gebruik.
- Breng de donorlever aan en plaats deze met de PV, IHVC en galwegen naar de linker nierader en slagader van de ontvanger. Gebruik een 9-0 nylon hechtdraad om twee steunhechtingen aan weerszijden van de IHVC-nieraderverbinding te installeren.
- Vergelijk de breedte van de bloedvaten en maak met een veerschaar een kleine incisie in de visbek in de voorkant van de nierader totdat deze een vergelijkbare breedte heeft als de IHVC van de donor (Figuur 2C).
- Gebruik een 9-0 nylon hechtdraad om de lever IHVC van begin tot eind met de nierader te anastomoseren met 9 of 10 lopende hechtingen over zowel de voor- als de achterwand van het vat. U kunt ook een manchetmethode gebruiken om deze anastomose 3,4 te voltooien.
- Bevestig dat de plaatsing van de nierslagader zich onder de IHVC bevindt (Figuur 2D) en breng de stent die eerder in de nierslagader is geplaatst in de leverpoortader in en zet deze vast met een 6-0 zijden hechtdraad, waarbij het ene uiteinde van de hechting lang blijft om zich aan de tegenoverliggende draad op de slagader te hechten. Trek de uiteinden naar elkaar toe om te voorkomen dat ze van de stent glijden.
- Verwijder eerst de microklem op de nierader en verwijder vervolgens de microklem op de nierslagader.
- Gebruik tijdens de reperfusie van de lever gaas en wattenstaafjes om lichte druk uit te oefenen rond het anastomosegebied totdat een open anastomose is bereikt (Figuur 2D). Verwijder de tijdelijke ligaties die eerder op de bijnier- en gonadale aders zijn geplaatst.
- Mobiliseer voorzichtig ongeveer 10 mm langs het uiteinde van de linker urineleider van het omliggende bindweefsel, zodat er een aanzienlijke hoeveelheid vetweefsel overblijft. Maak met een veerschaar een kleine incisie in de wand van de urineleider proximaal van de eerder geplaatste 5-0 ligatie.
- Breng de polyimide-stent die eerder aan de galwegen was bevestigd, in de kleine incisie die in de urineleiderwand is gemaakt. Zet vast met een 6-0 zijden hechtdraad en bind het ene uiteinde aan elkaar met de lange draad aan de kant van de galwegen van de stent, waarbij u beide uiteinden stevig naar elkaar toe trekt.
- Breng de darmen terug naar hun natuurlijke positie (Figuur 2E), irrigeer met 2-3 ml zoutoplossing en sluit de buik in twee lagen met behulp van 3-0 zijden hechtingen.
- Injecteer 0,1 mg/kg buprenorfine subcutaan, plaats de ontvanger in een schone, verwarmde kooi en controleer het herstel gedurende 1-2 uur voordat u het dier terugbrengt naar de dierenverblijven.
4. Postoperatieve opvolging
- Injecteer vanaf dag 2 na de operatie allogene transplantatieontvangers dagelijks subcutaan met heparine (1 IE/g).
- Injecteer vanaf dag 2 na de operatie syngene transplantatieontvangers om de dag subcutaan met heparine (1 IE/2 g).
Resultaten
Momenteel zijn 29 paren ratten gebruikt om het HALT-PVA-protocol op te stellen, 17 syngene transplantaties en 12 allogene transplantaties. De syngene getransplanteerde levers overleefden tot hun aangewezen 8 of 30 dagen experimentele eindpunt met een slagingspercentage van 70%, terwijl allogene getransplanteerde levers overleefden tot hun aangewezen 3 of 8 dagen eindpunten met een slagingspercentage van 50%. Mislukkingen zijn onder meer ratten die stierven als gevolg van chirurgische complicaties en hulplevers die faalden, zelfs als de ontvanger het overleefde.
De gemiddelde duur van de operatie was 130 minuten, met een koude ischemietijd van ongeveer 35 minuten en een warme ischemietijd van minder dan 25 minuten. Op voorwaarde dat er geen intra-operatieve complicaties waren, werden de ontvangers wakker en werden ze binnen 10-20 minuten actief, begonnen ze binnen 1 uur te drinken en te lopen en 24 uur later gedroegen ze zich als normale gezonde ratten.
Syngene levertransplantaten vertoonden 30 dagen na de transplantatie een uitstekende kleur en doorgankelijkheid van de galwegen (Figuur 3), terwijl de histologie van hematoxyline en eosine (H&E) een normale hepatocytenstructuur vertoonden zonder significante parenchymale veranderingen op zowel de 8-daagse als de 30-daagse tijdstippen (Figuur 4A,B). Na slechts 3 dagen vertoonde de histologie van de allogene transplantaties een significante poortontsteking (Figuur 4C), terwijl de 8-daagse allogene transplantaten acute cellulaire afstoting vertoonden met uitgebreide lymfatische infiltratie (Figuur 4D).
Representatieve allogene en syngene LTx-monsters werden beoordeeld door een gecertificeerde leverpatholoog en afstoting werd gescoord met behulp van de Banff Schema rejection activity index (RAI)12. Pathologische evaluatie stelde vast dat er geen afstoting aanwezig was, met een Banff RAI van 0, in zowel 8-daagse als 30-daagse syngene transplantaties, terwijl 8-daagse allotransplantaten ernstig werden afgekeurd met een Banff RAI-score van 9 (Tabel 1).
Figuur 1: Schematisch schema van de HALT-PVA-procedure van de rat .De PV wordt met de linker nierslagader gearterialiseerd met behulp van een stent, de IHVC wordt van begin tot eind geanastomoseerd naar de linker nierader en het galkanaal wordt met behulp van een stent aan de urineleider bevestigd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Chirurgische ingreep. (A) Hydrodissectie van PV. Dissocieer de PV van het omringende bindweefsel met een hydrodissectienaald van 27 G. (B) Arteriële stent inbrengen. De arteriële stent wordt ingebracht in een kleine trechtervormige opening die in de vork van de nierslagader is gesneden. (C) Verwijding van de nierader. Om overeen te komen met de grotere breedte van de donor-IHVC voor anastomose, wordt een kleine snee in de vissenbek in het gezicht van de nierader van de ontvanger gemaakt nadat twee hechtingen op hun plaats zijn geplaatst. (D) Geperfundeerd levertransplantaat onmiddellijk na anastomose. Het positioneren van de nierslagader en PV-verbinding onder de nierader en IHVC is cruciaal om trombose van het transplantaat te voorkomen. (E) Rat HALT-PVA in situ. De hulplever wordt tegen de linkerwand van de buik geplaatst voordat de darmen worden teruggevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Syngene HALT-PVA 30 dagen na transplantatie. (A) Na 30 dagen heeft de hulplever een vergelijkbare kleur en textuur als de oorspronkelijke lever, terwijl (B) het galkanaal en de PV-stent patent en onbeperkt blijven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histologie van hulplevertransplantaten. H&E-kleuring van (A) 8-daagse en (B) 30-daagse post-transplantatie syngene transplantaten die een normale hepatocytenstructuur vertonen samen met (C) 3-daagse en (D) 8-daagse allogene transplantaten die portale ontsteking en lymfocytische infiltratie vertonen. Schaal balk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Allogene Tx's | Portaal ontsteking | Letsel aan de galwegen | Veneuze endo-ontsteking | Banff RAI |
| 3-daags (LT-34) | 2 | 2 | 3 | 7 |
| 3-daags (LT-38) | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 8-daags (LT-20) | 3 | 3 | 3 | 9 |
| 8-daags (LT-40) | 3 | 3 | 3 | 9 |
| Syngene Tx's | ||||
| 8-dagen (LT-13) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 8-daags (LT-19) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 30 dagen (LT-28) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 30 dagen (LT-32) | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tabel 1: Banff-schema. Afstotingsactiviteitsindex (RAI) van allogene en syngene LTx's van ratten.
Discussie
Levertransplantatie is de enige behandelingsoptie voor patiënten met leverziekte in het eindstadium, met bijna 9.000 LTx's die jaarlijks worden uitgevoerd in de VS13. Helaas wordt immunologische afstoting gezien bij tot 25% van de LTx-ontvangers, en deze afstoting is schadelijk voor het getransplanteerde orgaan en de patiënt14,15. Om de resultaten na LTx te verbeteren, is de ontwikkeling van innovatieve modellen nodig om orgaanafstoting te bestuderen en strategieën te implementeren om afstoting te verminderen.
Vergeleken met orthotope levertransplantatie bij ratten is het huidige heterotope model opmerkelijk eenvoudig vast te stellen. De mate van technische moeilijkheidsgraad kan het beste worden berekend door rekening te houden met de moeilijkste stap in de procedure, namelijk de end-to-end anastomosen van de IHVC naar de nierader. Onze persoonlijke voorkeur voor deze verbinding is om gebruik te maken van traditioneel hechten, terwijl anderen een manchetsysteem handiger vinden 3,4; Hoe dan ook, iedereen die vertrouwd is met end-to-end anastomose van een ader van 3 mm op welke manier dan ook, heeft alle technische vaardigheden die nodig zijn om deze procedure te volbrengen. Omdat we toegang hebben tot een microscoop met twee koppen, geven we er de voorkeur aan om deze operaties met twee personen uit te voeren; Dit is echter geen vereiste voor succes met dit protocol, aangezien het ook solo is uitgevoerd.
De primaire postoperatieve complicatie van dit model is trombose van de transplantaatlever, die door drie dingen wordt uitgelokt. Ten eerste kan de arteriële stent zelf trombose veroorzaken als de uiteinden van de stent bramen of onregelmatigheden vertonen die wervelturbulentie in de bloedstroom veroorzaken. De stent moet worden gesneden met een scherp scheermes, niet met een schaar, en vervolgens onder de microscoop worden geïnspecteerd om er zeker van te zijn dat er geen onvolkomenheden zijn. Ten tweede, als de nierslagader/PV-stentanastomose bovenop de nierader/IHVC-anastomose wordt geplaatst, zal dit de bloedstroom beperken en trombose veroorzaken. De uiteindelijke plaatsing van de arteriële stent moet onder de IHVC plaatsvinden, zie figuur 2D. Ten derde is postoperatieve behandeling met het antistollingsmiddel heparine essentieel voor het voorkomen van trombose van allogene transplantaties, terwijl een lagere dosis heparine ook nuttig is om het risico op trombose in de syngene transplantaten te elimineren.
Het lagere overlevingspercentage voor de allogene transplantaties in vergelijking met de syngene transplantaten die hier worden gerapporteerd, weerspiegelt de protrombotische aard van de afstotende hulplever, die trombose van de arteriële stent veroorzaakt. Er waren verschillende pogingen nodig om een doseringsschema voor heparine te vinden dat kon voorkomen dat de stent tromboging bij allogene transplantaties. Aanvankelijk faalde 50% van de eerste 6 ontvangers van een allotransplantaat die de operatie overleefden, als gevolg van trombose, maar na een verhoging van de dosering van heparine overleefden de volgende, laatste drie allogene transplantaties zonder trombose. In de toekomst verwachten we, na het bepalen van een effectieve dosis heparine, dat het slagingspercentage van allogene transplantaties aanzienlijk zal toenemen. Evenzo traden de meeste syngene mislukkingen vroeg in de ontwikkeling op, en we verwachten dat het slagingspercentage van syngene transplantaties ook zal verbeteren.
We gebruikten het acute afstotingsmodel van Lewis naar Brown Norway LTx omdat de combinatie van Brown Norway naar Lewis16 niet afwijst. Het is opmerkelijk dat wanneer orthotope transplantatiemethoden worden gebruikt met dit afstotingsmodel en leverafstoting optreedt, de ontvangende dieren ernstige morbiditeit ondergaan omdat ze depressief en inactief worden en stoppen met eten voordat ze binnen 14 dagen sterven16. Met dit heterotope LTx-model wordt overlijden echter niet als eindpunt gebruikt en treedt morbiditeit niet op; Het dier blijft gezond en actief voor de duur van het experiment, zelfs wanneer de hulplever volledig wordt afgestoten. Ongetwijfeld draagt dit heterotope LTx-model aanzienlijk bij aan het minimaliseren van de pijn, het lijden en het leed dat de ontvangende dieren ervaren.
Recente ontwikkelingen in normotherme ex vivo leverperfusie (NEVLP) zijn een opwindende vooruitgang in de manier waarop levers worden bewaard voorafgaand aan klinische transplantatie 17,18,19. Tijdens NEVLP hervat de donorlever de fysiologische activiteit, waardoor therapeutische interventies voorafgaand aan de transplantatie mogelijk zijn20,21. NEVLP wordt ook steeds vaker gebruikt om de levensvatbaarheid van marginale organen te beoordelen (levers van oudere of zwaarlijvige donoren of levers verkregen van donoren na hartdood)22,23. Hoewel opwindend, is slechts een handvol laboratoria in staat geweest om rattenlevers te transplanteren na NEVLP24,25. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de chirurgische stress voor het dier en de hoge technische eisen om de lever voor te bereiden op zowel NEVLP als transplantatie. Daarentegen is de heterotope LTx-operatietechniek die in dit manuscript wordt beschreven, technisch minder veeleisend en veroorzaakt het minder stress bij het dier. Als zodanig kan het een haalbare optie zijn voor kleine diermodellen van NEVLP en daaropvolgende transplantatie.
Concluderend presenteren we een alternatief levertransplantatiemodel met een lage morbiditeit dat gunstig kan zijn voor toekomstige onderzoeken naar transplantaatafstoting.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Health (NIH) K08AI155816, toegekend aan DA.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3-0 Silk Suture | Ethicon | C013D | |
| 5-0 Silk ties | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 6-0 Silk ties | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 7-0 Silk ties | Teleflex | 103-s | |
| 9-0 Polyamide Suture | AROSurgical | T05A09N10-13 | Zwart |
| Bipolar Cautery | Codman & Shurtleff Inc. | P.H. 234 | |
| Buprenorfine HCL | Hospira | 409201232 | |
| Forceps, Adson-Brown | Fine Science Tools | 11627-12 | 12.5 cm |
| Forceps, Angled Dumont | Fine Science Tools | 11253-25 | Medical #5/45 11 cm |
| Forceps, Suture Tying | Fine Science Tools | 18025-10 | 10 cm |
| Heparine Natrium Injectie, USB | Fresenius Kabi | 504015 | 10.000 USP eenheden per 10 mL |
| Hydrodissectie Canule | Ambler Surgical | 1021E | 27 G |
| Isofluraan | Dechra Vet. Products | 17033-091-25 | |
| I.V. Katheter | Kendall | 2619PUR | 26 G x 3/4" |
| Magneet Retractie Systeem | Fine Science Tools | 18200-50 | |
| Micro Klauwtjes | Fine Science Tools | 18055-05 | 6 mm |
| Micro Klauwtjes | Fine Science Tools | 18055-06 | 4 mm |
| Micro Klauwtoestel | Fine Science Tools | 18057-14 | 14 cm |
| Micro Naaldhouder | S&T | C-14 | 14 cm |
| Microscoop | Zeiss | Universal S3 | Dubbelkop |
| Oogzalf | Puralube | 14590500 | |
| Polyimidi Slang | Cole Parmer | 95820-04 | OD 0.0215", ID 0.0195", wand 0.0010" |
| Zoutmoplossing | Baxter | 281324 | 0,9% natriumchloride |
| Chirurgische Veerscharen | S&T | SDC-15 | Blunt 14 cm |
| Chirurgische Veerscharen | Fine Science Tools | 15021-15 | Vannas 14 cm |
Referenties
- Lee, S., Edgington, T. S. Heterotopic liver transplantation utilizing inbred rat strains. Am J Pathol. 52 (3), 649-669 (1968).
- Hess, F., Jerusalem, C., Van der Heyde, M. N. Advantages of auxiliary liver homotransplantation in rats. Arch Surg. 104, 76-80 (1972).
- Marni, A., Ferrero, M. Heterotopic liver grafting in the rat. A simplified method using cuff techniques. Transplantation. 39 (3), 329-331 (1985).
- Kobayashi, E., et al. Auxiliary heterotopic liver transplantation in the rat: a simplified model using cuff technique and application for congenitally hyperbilirubimemic Gunn rat. Microsurgery. 18 (2), 97-102 (1998).
- Schleimer, K., et al. Auxiliary liver transplantation with flow-regulated portal vein arterialization offers a successful therapeutic option in acute hepatic failure--investigations in heterotopic auxiliary rat liver transplantation. Transpl Int. 19 (7), 581-588 (2006).
- Qiao, J., Han, C., Zhang, J., Wang, Z., Meng, X. A new model of auxiliary partial heterotopic liver transplantation with liver dual artery supply. Exp Ther Med. 9 (2), 367-371 (2015).
- Li, J., Ren, J., Zhang, J., Meng, X. A. Modified kidney-sparing portal vein arterialization model of heterotopic auxiliary liver transplantation increases liver IL-6, TNF-α, and HGF levels and enhances liver regeneration: an animal model. BMC Surg. 2, 281-292 (2022).
- Ono, Y., et al. Regeneration and cell recruitment in an improved heterotopic auxiliary partial liver transplantation (APLT) model in the rat. Transplantation. 101 (1), 92-100 (2017).
- Wang, J., et al. Auxiliary partial liver grafting in rats: effect of host hepatectomy on graft regeneration, and review of literature on surgical technique. Microsurgery. 22 (8), 371-377 (2002).
- Schleimer, K., et al. Heterotopic auxiliary rat liver transplantation with flow-regulated portal vein arterialization in acute hepatic failure. J Vis Exp. (91), e51115(2014).
- Prescott, M. J., Lidster, K. Improving quality of science through better animal welfare: the NC3Rs strategy. Lab Animal. 46 (4), 152-156 (2017).
- Banff schema for grading liver allograft rejection: an international consensus document. Hepatology. 25 (3), 658-663 (1997).
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2020 Annual Data Report: Liver. Am J Transplant. 22, Suppl 2 204-309 (2022).
- Nacif, L. S., et al. Late acute rejection in liver transplant: a systematic review. Arq Bras Cir Dig. 28 (3), 212-215 (2015).
- Levitsky, J., et al. Acute rejection increases risk of graft failure and death in recent liver transplant recipients. Clin Gastroenterol Hepatol. 15 (4), 584-593 (2017).
- Gong, J., Cao, D., Chen, Y., Li, J., Gong, J., Zeng, Z. Role of programmed death ligand 1 and Kupffer cell in immune regulation after orthotopic liver transplantation in rats. Int Immunopharmacol. 48, 8-16 (2017).
- Ceresa, C. D. L., Nasralla, D., Coussios, C. C., Friend, P. J. The case for normothermic machine perfusion in liver transplantation. Liver Transpl. 24 (2), 269-275 (2018).
- Nasralla, D., et al. A randomized trial of normothermic preservation in liver transplantation. Nature. 557 (7703), 50-56 (2018).
- Markmann, J. F., et al. Impact of portable normothermic blood-based machine perfusion on outcomes of liver transplant: The OCS liver PROTECT randomized clinical trial. JAMA Surg. 157 (3), 189-198 (2022).
- Goldaracena, N., et al. Anti-inflammatory signaling during ex vivo liver perfusion improves the preservation of pig liver grafts before transplantation. Liver Transpl. 22 (11), 1573-1583 (2016).
- Carlson, K. N., et al. Interleukin-10 and transforming growth factor-beta cytokines decrease immune activation during normothermic ex vivo machine perfusion of the rat liver. Liver Transpl. 27 (11), 1577-1591 (2021).
- Ig-Izevbekhai, K., Goldberg, D. S., Karp, S. J., Foley, D. P., Abt, P. L. Immunosuppression in donation after circulatory death liver transplantation: Can induction modify graft survival. Liver Transpl. 26 (9), 1154-1166 (2020).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion Injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890(2019).
- Schlegel, A., Graf, R., Clavien, P. A., Dutkowski, P. Hypothermic oxygenated perfusion (HOPE) protects from biliary injury in a rodent model of DCD liver transplantation. J Hepatol. 59 (5), 984-991 (2013).
Herprints en machtigingen
