De gedecellulariseerde miltmatrix (DSM) bevat veelbelovende toepassingen op het gebied van leverweefselmanipulatie. Dit protocol schetst de procedure voor het bereiden van DSM bij ratten, waaronder het oogsten van milten van ratten, het decellulariseren ervan door middel van perfusie en het evalueren van de resulterende DSM om de kenmerken ervan te bevestigen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fabricage van gedecellulariseerde miltmatrix afgeleid van ratten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Levertransplantatie is de primaire behandeling voor leverziekte in het eindstadium. Het tekort aan en de ontoereikende kwaliteit van donororganen maken de ontwikkeling van alternatieve therapieën echter noodzakelijk. Biokunstmatige levers (BAL's) die gebruik maken van gedecellulariseerde levermatrix (DLM) zijn naar voren gekomen als veelbelovende oplossingen. Het vinden van geschikte DLM's blijft echter een uitdaging. Het gebruik van een gedecellulariseerde miltmatrix (DSM) is onderzocht als basis voor BAL's en biedt een direct beschikbaar alternatief. In deze studie werden milten van ratten geoogst en gedecellulariseerd met behulp van een combinatie van vries-dooicycli en perfusie met decellularisatiereagentia. Het protocol bewaarde de microstructuren en componenten van de extracellulaire matrix (ECM) binnen de DSM. Het volledige decellularisatieproces duurde ongeveer 11 uur, wat resulteerde in een intacte ECM binnen de DSM. Histologische analyse bevestigde de verwijdering van cellulaire componenten met behoud van de structuur en samenstelling van de ECM. Het gepresenteerde protocol biedt een uitgebreide methode voor het verkrijgen van DSM en biedt mogelijke toepassingen in leverweefselmanipulatie en celtherapie. Deze bevindingen dragen bij aan de ontwikkeling van alternatieve benaderingen voor de behandeling van leverziekte in het eindstadium.
Inleiding
Levertransplantatie blijft de enige definitieve behandeling voor leverziekte in het eindstadium 1,2,3. Het kritieke tekort en de afnemende kwaliteit van donororganen hebben de behoefte aan alternatieve behandelingen echter vergroot4. Op het gebied van regeneratieve geneeskunde zijn biokunstmatige levers (BAL's) die gebruik maken van gedecellulariseerde levermatrix (DLM) naar voren gekomen als veelbelovende oplossingen 5,6,7. De DLM behoudt de oorspronkelijke leverstructuur, inclusief het ingewikkelde microvasculaire netwerk en componenten van de ECM, en biedt een steiger voor het creëren van transplanteerbare BAL's die mogelijk leverziekten zouden kunnen verlichten.
Ondanks de belofte staat de acceptatie van deze technologie voor uitdagingen, met name bij het vinden van geschikte DLM's. Er is een tekort aan DLM's van menselijke oorsprong, terwijl die uit dierlijke bronnen de risico's van ziekteoverdracht en afstoting van het immuunsysteem met zich meebrengen. In een innovatieve benadering heeft ons onderzoek het gebruik van een gedecellulariseerde miltmatrix (DSM) als basis voor BAL's 8,9,10,11 verkend. Milten zijn gemakkelijker beschikbaar in verschillende medische situaties, zoals portale hypertensie, traumatische ruptuur, idiopathische trombocytopenische purpura en donatie na hartdood. Daarom zijn milten op grotere schaal beschikbaar dan levers voor onderzoeksdoeleinden. Patiënten die splenectomieën hebben ondergaan, lijden niet aan ernstige aandoeningen, wat de overbodigheid van de milt verder bevestigt. De micro-omgeving van de milt, met name de extracellulaire matrix en sinusoïden, is vergelijkbaar met die van de lever. Dit maakt de milt een geschikt orgaan voor celadhesie en proliferatie in onderzoek naar hepatocyttransplantatie. Op basis van deze bevindingen hebben onze eerdere onderzoeken aangetoond dat DSM's vergelijkbare microstructuren en componenten delen met DLM's en de overleving en functie van hepatocyten kunnen ondersteunen, waaronder de productie van albumine en ureum. Bovendien is aangetoond dat DSM's de leverdifferentiatie van mesenchymale stamcellen in het beenmerg verbeteren, wat leidt tot een verbeterde en consistente functionaliteit.
Door gebruik te maken van DSM's die met heparine zijn behandeld, hebben we functionele BAL's ontwikkeld die in staat zijn om effectieve antistolling op korte termijn en gedeeltelijke compensatie van de leverfunctie aan tetonen11. Bijgevolg is deze driedimensionale DSM veelbelovend voor de vooruitgang van leverweefselmanipulatie en celtherapie. In dit werk presenteren we de gedetailleerde methoden voor het oogsten van rattenmilten en het bereiden van DSM die de microstructuren en componenten van de ECM behouden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie is goedgekeurd door de Commissie voor de Ethiek van Dierproeven van de Xi'an Jiaotong Universiteit en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Milt oogsten
- Gebruik mannelijke Sprague Dawley-ratten met een gewicht van 250-280 g. Huisvest de ratten in kamers met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid en geef ze ad libitum voedsel en water, behalve voor het vasten voor de operatie.
- Subcutaan buprenorfine (0,05 ml/kg) als pijnstiller injecteren 1 uur voor de operatie. Verdoof de rat door inhalatie van isofluraan. Gebruik een debiet van 1,5 l/min 5% isofluraan voor inductie-anesthesie in een plexiglazen doos en handhaaf anesthesie met een stroomsnelheid van 0,6-0,8 l/min 2% isofluraan door een masker. Bevestig de diepte van de anesthesie door in de tenen te knijpen.
- Gebruik een elektrisch scheerapparaat om de huid over de hele buik te scheren. Zet de rat in rugligging op de operatietafel vast. Injecteer 2 ml gehepariniseerde zoutoplossing (1.000 U heparine) via de dorsale ader van de penis om systemische antistolling te bereiken. Desinfecteer de geschoren huid met een povidonjodiumoplossing en dek af met een steriele gordijn.
- Maak een kruisvormige incisie met een chirurgische schaar in de buik, leg de buikholte bloot door uit te rekken met de hemostatische tang en draai de lever naar het middenrif. Exterioriseer het maagdarmkanaal naar de rechterkant van de buik en bedek het met vochtig gaas.
- Scheid en snijd voorzichtig het miltrische ligament door om het milttilum bloot te leggen.
OPMERKING: De milt, die eruitziet als een roodachtige langwerpige structuur, ongeveer 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm groot, is te herkennen in de linkerbuik. - Scheid geleidelijk en leg de gemeenschappelijke leverslagader, de gastroduodenale slagader en de miltslagader bloot door langs het milthilum te ontleden. Ligate en snijd de gastroduodenale slagader en de gemeenschappelijke leverslagader door terwijl het omliggende weefsel geleidelijk wordt gedissocieerd.
- Draai de milt naar de rechterkant om de abdominale aorta bloot te leggen. Voer voorzichtig een stompe dissectie uit en leg de abdominale aorta en coeliakiestam bloot met wattenstaafjes. Plaats een 3-0 zijden hechtdraad, ongeveer 3 cm lang, boven en onder de takken van de coeliakiestam, en plaats een 6-0 zijden hechtdraad, ongeveer 10 cm lang, aan de tak van de coeliakiestam.
- Ligatuur: de abdominale aorta onder en boven de takken van de coeliakiestam. Maak een kleine incisie bij de arteriële tak. Til de 6-0 zijden hechting voorzichtig op, breng een veneuze katheter van 24 G in de miltslagader langs de coeliakiestam en bevestig deze.
- Gebruik een spuitpomp met een snelheid van 4 ml/min, infusereer gehepariniseerde normale zoutoplossing (25 E/ml) met een volume van 50 ml. Snijd tegelijkertijd de poortader door als een uitstroomkanaal om de geïnfuseerde vloeistof uit de milt te laten stromen. Het dier wordt geëuthanaseerd door verbloeding.
- Ontleed voorzichtig het omringende weefsel van de milt, vermijd schade aan de alvleesklier, terwijl de belangrijkste accessoire vaten behouden blijven.
- Controleer op eventuele lekkage rond de milt, verwijder vervolgens de milt en alvleesklier en spoel ze af met normale zoutoplossing.
OPMERKING: De milt en alvleesklier van ratten zijn nauw met elkaar verbonden, waarbij de alvleesklier zich om de miltslagader wikkelt. Als de milt afzonderlijk wordt verwijderd, kan het een uitdaging zijn om talloze kleine bloedvaten te ligateren. Bij deze procedure wordt de milt samen met de alvleesklier verwijderd. Na decellularisatie worden de milt en alvleesklier transparant en is de microvasculatuur zichtbaar, wat het behoud van de milt met intacte bloedvaten vergemakkelijkt. - Breng de milt over in een centrifugebuis van 50 ml gevuld met normale zoutoplossing en bewaar deze in een vriezer van -80 °C.
OPMERKING: De milt en de veneuze katheter die in de miltslagader wordt ingebracht, worden samen gecryopreserveerd voor een gemakkelijke verbinding tijdens de perfusie-experimenten.
2. Milt decellularisatie
- Herhaal de vries-dooicyclus 3x in een steriel bakje om de miltcellen te lyseren.
OPMERKING: De vries-dooicyclus is een fysische methode die wordt gebruikt voor decellularisatie van de steiger. Het miltweefsel wordt een nacht in een vriezer van -80 °C geplaatst om in te vriezen, vervolgens uit de omgeving met lage temperatuur te worden verwijderd en in een waterbad op kamertemperatuur of 37 °C te worden geplaatst om te ontdooien. Dit invries- en dooiproces wordt 3-6 keer herhaald, wat de celmembranen verstoort en leidt tot cellyse. - Plaats een perfusiesysteem in een schone bank, bestaande uit een peristaltische pomp, een reservoir van 2 liter, een siliconenslang met een binnendiameter van 2,4 mm en een bellenvanger (Figuur 1).
- Vul het perfusiesysteem met gedeïoniseerd water (ddH2O) en laat het 10 minuten draaien.
- Breng de geoogste milt voorzichtig over in de ddH2O-gevulde container.
- Sluit de siliconenslang aan op de veneuze katheter die in de miltslagader is ingebracht.
- Start de perfusie met ddH2O met een snelheid van 2 ml/min gedurende 30 minuten.
- Ga door met de perfusie met ddH2O met een snelheid van 4 ml/min gedurende 30 minuten.
- Perfuseer met 0,1% (w/v) SDS-oplossing gedurende 4 uur.
- Perfuseer met 1% (v/v) Triton X-100 oplossing gedurende 2 uur.
- Perfuseer met PBS met een snelheid van 4 ml/min gedurende 4 uur om de DSM te wassen.
NOTITIE: Gebruik van de peristaltische pomp voor unidirectionele perfusie van alle vloeistoffen. - Nadat de perfusie is voltooid, ligate en transect u de vasculaire takken tussen de alvleesklier en de milt en verwijdert u vervolgens de alvleesklier. Bewaar de DSM in een schone en afgesloten centrifugebuis van 50 ml gedrenkt in PBS met 10% penicilline-streptomycine bij -20 °C tot het klaar is voor gebruik voor toekomstige experimenten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol maakte gebruik van een combinatie van herhaalde vries-dooicycli en perfusie met decellularisatiereagentia voor de decellularisatie van de milt van ratten. De volledige decellularisatie van de milt werd bereikt in ongeveer 11 uur (figuur 2A). Tijdens het decellularisatieproces ging de kleur van de milt geleidelijk over van dieprood naar een gevlekt, lichtrood en uiteindelijk een wit doorschijnend uiterlijk (Figuur 2B). De algehele morfologie bleef re...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De BAL's vertegenwoordigen een effectieve aanpak voor de behandeling van leverziekte in het eindstadium, met name in gevallen waarin levertransplantatie wordt belemmerd door het huidige tekort aan donororganen6. Een veelbelovende optie voor het maken van BAL's is het gebruik van DLM, dat de natuurlijke ECM en vasculaire structuur van de natuurlijke lever behoudt. De schaarste aan humane DLM en de potentiële risico's van infectie en immunogeniciteit geassocieerd met DLM bij dieren vormen echter aan...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben verklaard dat er geen sprake is van belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82000624), Natural Science Basic Research Program of Shaanxi (2022JQ-899 & 2021JM-268), Shaanxi Province Innovation Capability Support Program (2023KJXX-030), Shaanxi Province Key R&D Plan University Joint Project-Key Project (2021GXLH-Z-047), Institutional Foundation of The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University (2021HL-42 & 2021HL-21).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | dierdier anesthesie |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | luchtbellen voorkomen |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | een pijnstiller | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | chirurgisch gereedschap |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | vorming van trombose voorkomen | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anestheticum: voor de inductie en het onderhoud van anesthesie | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotica in vitro om microbiële besmetting te voorkomen |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | fosforzuur bufferzout oplossing |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 en 3-0 | bloedvaten ligatureren |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionogene detergent, lost zowel cel- en kernmembranen op |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intraveneuze infusie |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | niet-ionogene detergent, verstoort lipide-lipide, lipide-eiwit en DNA-eiwit interacties |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | het inbrengen van de milslagader |
Referenties
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285(2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972(2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36(2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003(2019).
- Somuncu, Ö Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299(2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786(2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
