Methodenartikel

Het meten van endoplasmatisch reticulumstress en ongevouwen eiwitrespons in HIV-1-geïnfecteerde T-cellen en het analyseren van de rol ervan in HIV-1-replicatie

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66522

⸱

14 juni 2024

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we enkele gevestigde methoden om endoplasmatisch reticulum (ER) stress en activering van ongevouwen eiwitrespons (UPR) te bepalen, met bijzondere nadruk op HIV-1-infectie. Dit artikel beschrijft ook een reeks protocollen om het effect van ER-stress/UPR op HIV-1-replicatie en virion-infectiviteit te onderzoeken.

Samenvatting

Virale infecties kunnen stress bij het endoplasmatisch reticulum (ER) veroorzaken als gevolg van abnormale eiwitophoping, wat leidt tot ongevouwen eiwitrespons (UPR). Virussen hebben strategieën ontwikkeld om de UPR van de gastheer te manipuleren, maar er is een gebrek aan gedetailleerd begrip van UPR-modulatie en de functionele betekenis ervan tijdens HIV-1-infectie in de literatuur. In deze context beschrijft het huidige artikel de protocollen die in ons laboratorium worden gebruikt om ER-stressniveaus en UPR tijdens HIV-1-infectie in T-cellen te meten en het effect van UPR op virale replicatie en infectiviteit.

Thioflavine T (ThT)-kleuring is een relatief nieuwe methode die wordt gebruikt om ER-stress in de cellen te detecteren door eiwitaggregaten te detecteren. Hier hebben we het protocol geïllustreerd voor ThT-kleuring in HIV-1-geïnfecteerde cellen om ER-stress te detecteren en te kwantificeren. Bovendien werd ER-stress ook indirect gedetecteerd door het meten van de niveaus van UPR-markers zoals BiP, gefosforyleerd IRE1, PERK en eIF2α, splitsing van XBP1, splitsing van ATF6, ATF4, CHOP en GADD34 in HIV-1-geïnfecteerde cellen, met behulp van conventionele immunoblotting en kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR). We hebben ontdekt dat de ThT-fluorescentie correleert met de indicatoren van UPR-activering. Dit artikel demonstreert ook de protocollen om de impact van ER-stress en UPR-modulatie op HIV-1-replicatie te analyseren door knockdown-experimenten, evenals het gebruik van farmacologische moleculen. Het effect van UPR op HIV-1-genexpressie/replicatie en virusproductie werd geanalyseerd door respectievelijk Luciferase reporter-assays en p24-antigeen-capture ELISA, terwijl het effect op de infectiviteit van virionen werd geanalyseerd door kleuring van geïnfecteerde reportercellen. Gezamenlijk biedt deze reeks methoden een uitgebreid begrip van de ongevouwen eiwitresponsroutes tijdens HIV-1-infectie, waardoor de ingewikkelde dynamiek ervan wordt onthuld.

Inleiding

Verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS) wordt gekenmerkt door een geleidelijke vermindering van het aantal CD4+ T-lymfocyten, wat leidt tot het progressieve falen van de immuunrespons. Humaan immunodeficiëntievirus-1 (HIV-1) is de veroorzaker van aids. Het is een omhuld, positief sense, enkelstrengs RNA-virus met twee kopieën van RNA per virion en behoort tot de familie retroviridae. De productie van hoge concentraties virale eiwitten in de gastheercel legt overmatige druk op de eiwitvouwmachine van de cel1. ER is het eerste compartiment in de secretoire route van eukaryote cellen. Het is verantwoordelijk voor het produceren, veranderen en afleveren van eiwitten aan de secretoire route en de extracellulaire ruimtedoellocaties. Eiwitten ondergaan tal van posttranslationele veranderingen en vouwen zich in hun natuurlijke conformatie in het ER, waaronder asparagine-gekoppelde glycosylering en de vorming van intra- en intermoleculaire disulfidebindingen2. Daarom zijn er hoge concentraties eiwitten aanwezig in het ER-lumen en deze zijn zeer vatbaar voor aggregatie en misvouwing. Verschillende fysiologische omstandigheden, zoals hitteshock, microbiële of virale infecties, die een verbeterde eiwitsynthese of eiwitmutatie vereisen, leiden tot ER-stress als gevolg van verhoogde eiwitaccumulatie in het ER, waardoor de homeostase van het ER-lumen wordt verstoord. De ER-stress activeert een netwerk van sterk geconserveerde adaptieve signaaltransductieroutes, de Unfolded Protein Response (UPR)3. UPR wordt gebruikt om de normale fysiologische toestand van het ER terug te brengen door de ongevouwen eiwitbelasting en het vouwvermogen op elkaar af te stemmen. Dit wordt veroorzaakt door het vergroten van de ER-grootte en ER-residente moleculaire chaperonnes en foldasen, wat resulteert in een verhoging van het vouwvermogen van de ER. UPR verlaagt ook de eiwitbelasting van het ER door wereldwijde verzwakking van de eiwitsynthese op translationeel niveau en verhoogt de klaring van ongevouwen eiwitten uit het ER door ER-geassocieerde afbraak (ERAD) te reguleren4,5.

ER-stress wordt waargenomen door drie ER-residente transmembraaneiwitten: proteïnekinase R (PKR)-achtig endoplasmatisch reticulumkinase (PERK), activerende transcriptiefactor 6 (ATF6) en inositol-vereisend enzym type 1 (IRE1). Al deze effectoren worden inactief gehouden door zich te binden aan het chaperonne Heat shock eiwit familie A (Hsp70) lid 5 (HSPA5), ook bekend als bindend eiwit (BiP)/78-kDa glucose-gereguleerd eiwit (GRP78). Bij ER-stress en accumulatie van ongevouwen/verkeerd gevouwen eiwitten, dissocieert HSPA5 en leidt dit tot activering van deze effectoren, die vervolgens een reeks stroomafwaartse doelen activeren die helpen bij het oplossen van de ER-stress en, in extreme omstandigheden, celdood bevorderen6. Bij dissociatie van HSPA5 autofosforylaten PERK en wordt de kinase-activiteit geactiveerd7. De kinase-activiteit fosforyleert eIF2α, wat leidt tot translationele verzwakking, waardoor de eiwitbelasting van de ER8 wordt verlaagd. In aanwezigheid van fosfo-eukaryote initiatiefactor 2α (eIF2α) worden niet-vertaalde open leesframes op specifieke mRNA's echter bij voorkeur vertaald, zoals ATF4, waardoor stress-geïnduceerde genen worden gereguleerd. ATF4 en C/EBP homoloog eiwit (CHOP) zijn transcriptiefactoren die door stress geïnduceerde genen reguleren en apoptose en celdoodroutes reguleren 9,10. Een van de doelen van ATF4 en CHOP is het groeistilstand en DNA-schade-induceerbare eiwit (GADD34), dat samen met eiwitfosfatase 1 peIF2α defosforylaat en fungeert als een feedbackregulator voor translationele demping11. Onder ER-stress dissocieert ATF6 van HSPA5 en wordt het Golgi-lokalisatiesignaal blootgesteld, wat leidt tot zijn translocatie naar het Golgi-apparaat. In het Golgi-apparaat wordt ATF6 gesplitst door plaats-1 protease (S1P) en plaats-2 protease (S2P) om de gesplitste vorm van ATF6 (ATF6 P50) vrij te maken. ATF6 p50 wordt vervolgens verplaatst naar de kern, waar het de expressie induceert van genen die betrokken zijn bij eiwitvouwing, rijping en secretie, evenals eiwitafbraak12,13. Tijdens ER-stress dissocieert IRE1 van HSPA5, multimeriseert en autofosforyleert14. Fosforylering van IRE1 activeert zijn RNase-domein, met name door de splitsing van 26 nucleotiden uit het centrale deel van het mRNA van X-box bindend eiwit 1 (XBP1)15,16. Dit genereert een nieuwe C-terminus die een transactiveringsfunctie verleent, waarbij functioneel XBP1s-eiwit wordt gegenereerd, een krachtige transcriptiefactor die verschillende door ER-stress geïnduceerde genen controleert17,18. De gecombineerde activiteit van deze transcriptiefactoren schakelt genetische programma's in die gericht zijn op het herstellen van de ER-homeostase.

Er zijn verschillende methoden om ER-stress en UPR te detecteren. Deze omvatten de conventionele methoden voor het analyseren van de UPR-markers19,20. Verschillende niet-conventionele methoden omvatten het meten van de redoxtoestand van de UPR en de calciumverdeling in het ER-lumen, evenals het beoordelen van de ER-structuur. Elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om te zien hoeveel het ER-lumen toeneemt als reactie op ER-stress in cellen en weefsels. Deze methode is echter tijdrovend en afhankelijk van de beschikbaarheid van een elektronenmicroscoop, die mogelijk niet voor elke onderzoeksgroep beschikbaar is. Ook het meten van de calciumflux en de redoxtoestand van de ER is een uitdaging vanwege de beschikbaarheid van reagentia. Bovendien is de uitlezing van deze experimenten zeer gevoelig en kan deze worden beïnvloed door andere factoren van het cellulaire metabolisme.

Een krachtige en eenvoudige techniek voor het monitoren van de UPR-uitgangen is het meten van de activering van de verschillende signaalroutes van de UPR en wordt al tientallen jaren gebruikt in verschillende stressscenario's. Deze conventionele methoden om UPR-activering te meten zijn economisch, haalbaar en leveren de informatie in minder tijd in vergelijking met andere bekende methoden. Deze omvatten immunoblotting om de expressie van UPR-markers op eiwitniveau te meten, zoals fosforylering van IRE1, PERK en eIF2α en splitsing van ATF6 door het meten van de P50-vorm van ATF6 en eiwitexpressie van andere markers zoals HSPA5, gesplitste XBP1, ATF4, CHOP en GADD34, evenals RT-PCR om de mRNA-niveaus te bepalen, evenals splitsing van XBP1-mRNA.

Dit artikel beschrijft een gevalideerde en betrouwbare reeks protocollen om ER-stress en UPR-activering in HIV-1-geïnfecteerde cellen te monitoren en om de functionele relevantie van UPR bij HIV-1-replicatie en infectiviteit te bepalen. De protocollen maken gebruik van gemakkelijk verkrijgbare en zuinige reagentia en geven overtuigende informatie over de UPR-uitgangen. ER-stress is het resultaat van de ophoping van ongevouwen/verkeerd gevouwen eiwitten, die vatbaar zijn voor de vorming van eiwitaggregaten21. Hierbij beschrijven we een methode om deze eiwitaggregaten te detecteren in HIV-1-geïnfecteerde cellen. Thioflavine T-kleuring is een relatief nieuwe methode die wordt gebruikt om deze eiwitaggregaten te detecteren en te kwantificeren22. Beriault en Werstuck beschreven deze techniek om eiwitaggregaten te detecteren en te kwantificeren en dus ER-stressniveaus in levende cellen. Het is aangetoond dat het kleine fluorescerende molecuul thioflavine T (ThT) selectief bindt aan eiwitaggregaten, met name amyloïde fibrillen.

In dit artikel beschrijven we het gebruik van ThT om ER-stress in HIV-1-geïnfecteerde cellen te detecteren en te kwantificeren en te correleren met de conventionele methode voor het monitoren van UPR door de activering van verschillende signaalroutes van UPR te meten.

Omdat er ook een gebrek is aan uitgebreide informatie over de rol van UPR tijdens HIV-1-infectie, bieden we een reeks protocollen om de rol van UPR bij HIV-1-replicatie en virioninfectiviteit te begrijpen. Deze protocollen omvatten de door lentivirus gemedieerde knockdown van UPR-markers en behandeling met farmacologische ER-stressinductoren. Dit artikel toont ook de soorten uitlezingen die kunnen worden gebruikt om de HIV-1-genexpressie, virale productie en de besmettelijkheid van de geproduceerde virionen te meten, zoals respectievelijk luciferase-test op basis van lange terminale herhaling (LTR), p24-enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) en β-gal reporter-kleuringstest.

Met behulp van de meeste van deze protocollen hebben we onlangs de functionele implicatie van HIV-1-infectie op UPR in T-cellen23 gerapporteerd, en de resultaten van dat artikel suggereren de betrouwbaarheid van de hier beschreven methoden. Daarom biedt dit artikel een reeks methoden voor uitgebreide informatie over de wisselwerking tussen HIV-1 en ER-stress en UPR-activering.

Protocol

OPMERKING: De hier gebruikte cellijnen zijn HEK-293T en Jurkat J6 (een CD4+T-cellijn), die zijn verkregen van de Cell Repository, NCCS, Pune, India; TZM-bl, een van HeLa afgeleide cellijn die kopieën van β-galactosidase- en luciferase-genen heeft geïntegreerd onder de HIV-1 long terminal repeat (LTR) promotor24 en CEM-GFP (een andere CD4+ T-reporter-cellijn)25 werd verkregen uit de NIH AIDS Repository, VS.

1. Voorbereiding en opslag van de voorraad hiv-1-virus

  1. Voorbereiding van de hiv-1-virusvoorraad
    OPMERKING: Het wordt geadviseerd om bioveiligheidsgerelateerde internationale richtlijnen toe te passen, zoals beschikbaar in de handleiding van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) of Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bij alle experimenten met HIV-1. Het hanteren van het virus en elk experiment met het levende virus mag alleen worden gedaan in een geschikte bioveiligheidskast die is gehuisvest in ten minste een inperkingslaboratorium op BSL2-niveau. De productie van infectieuze HIV-1-deeltjes met behulp van een calciumfosfaattransfectiekit voor zoogdieren wordt in dit deel van het protocol beschreven.
    1. Zaad HEK-293T cellen in schaaltjes van 90 mm met 10 ml complete (aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine) DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) in een klasse II type A2 bioveiligheidskast en ongeveer 12 uur bewaren in een weefselkweekincubator bij 37 °C zodat de samenvloeiing van de cellen tussen 50%-60% ligt.
    2. Maak de volgende dag de transfectiemix: bereid oplossing A voor met 25 μg pNL4.3 (een moleculaire kloon van HIV-1) plasmide-DNA in steriele buffer, 86,8 μl 2 M CaCl2 en het resterende steriele water om het uiteindelijke volume 700 μl voor elke plaat te maken. Bereid oplossing B met 700 μl 2x HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) voor 1 plaat. Pas vervolgens de berekening aan voor het totale aantal platen.
    3. Voeg nu druppelsgewijs Oplossing B toe aan Oplossing A terwijl je Oplossing A continu in een werveling gebruikt. Het totale volume van de transfectiemix wordt nu 1,4 ml voor één plaat.
      OPMERKING: Nauwkeurige druppelsgewijze toevoeging van Oplossing B aan Oplossing A terwijl continue vortexen leiden tot de vorming van perfecte transfectiecomplexen.
    4. Incubeer dit mengsel ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur (RT). Voeg vervolgens het mengsel langzaam druppelsgewijs toe aan elk bord met verse 9 ml volledige DMEM en breng de platen over naar de CO2 -incubator. Vervang na 8-10 uur de bestaande media door verse 10 ml volledige DMEM.
    5. Verzamel na 24 uur na het verversen van de media het supernatans (dat de virusdeeltjes bevat) van alle platen in conische buizen. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 600 x g met behulp van een tafelcentrifuge met lage snelheid (materiaaltabel) om celresten te verwijderen.
    6. Breng het supernatans over in polyallomeer ultracentrifugebuisjes en plaats ze in de uitzwenkbare rotor van een ultracentrifuge (Materiaaltabel). Controleer de gewichten van de slanghouders op balans en stel ze indien nodig af met een steriel medium.
    7. Ultracentrifuge bij 1.41.000 x g gedurende 2,5 uur bij 4 °C. Hierna haalt u voorzichtig de buisjes eruit en decanteert u het supernatant langzaam in de bioveiligheidskast.
    8. Voeg aan de pellet (die nu het geconcentreerde virus is) in elke buis 1 ml onvolledig RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium toe en pipetter krachtig om de pellet los te maken.
      OPMERKING: De pellet na ultracentrifuge is bijna onzichtbaar voor het blote oog. Er moet dus voor worden gezorgd dat RPMI 1640 in het midden van de buis wordt toegevoegd, zodat de pellet goed wordt losgemaakt.
    9. Voeg vervolgens 25 μL 1 M HEPES pH 7,4 toe aan de 1 ml virussuspensie. Doe 50 μl van de suspensie in 1,5 ml centrifugebuisjes en bewaar deze onmiddellijk in een vriezer van -80 °C voor langdurige opslag.
  2. Kwantificering van virusconcentratie en virioninfectiviteit
    OPMERKING: Voor het berekenen van de besmettelijkheid van het virus is het essentieel om eerst de concentratie te kwantificeren, wat wordt gedaan door p24 Antigen Capture ELISA (volgens de instructies van de fabrikant en wordt hier dus niet beschreven; zie Tabel met materialen). Dit proces geeft de concentratie van het virus in nanogrammen per microliter (ng/μL) van de voorraad, die vervolgens wordt gebruikt om het infectieuze virionnummer in de voorraad te identificeren door middel van het volgende experiment in TZM-bl-reportercellen26.
    1. Tel en zaai 0,1 x 106 TZM-bl-cellen in een plaat met 24 putjes met 500 μl volledige DMEM voor elk putje en bewaar het 10-12 uur in een celcultuurincubator.
    2. Zorg ervoor dat de cellen voor 50%-60% samenvloeiend zijn voordat u met infectie begint voor viruskwantificering. Vervang de bestaande media met 250 μL verse complete DMEM in elk putje.
      OPMERKING: Houd een positieve controle goed om elke experimentele fout uit te sluiten.
    3. Bereken de hoeveelheid voorraadvirus die nodig is voor infecties van 1 ng, 0,1 ng en 0,01 ng in duplicaten. Voeg de juiste hoeveelheid virus toe aan de putjes en houd de plaat in de incubator gedurende 4 uur op 37 °C.
    4. Was de cellen twee keer met 500 μL onvolledige DMEM en voeg vervolgens 500 μL volledige DMEM toe.
    5. Ga verder met de β-gal kleuringsprocedure na 36 uur mediawissel.
      1. Gooi de bestaande media weg en was de cellen twee keer met 1 ml PBS. Fixeer de cellen door 500 μL van de fixeeroplossing (0,25% glutaaraldehyde in PBS) aan elk putje toe te voegen en incubeer bij RT in de bioveiligheidskast gedurende 5-7 minuten.
      2. Bereid de kleuroplossing zoals aangegeven in tabel 1. Houd het uit de buurt van licht, want X-gal is lichtgevoelig.
      3. Was de cellen één keer met 1 ml PBS. Bedek de cellen met 500 μL vers bereide kleuroplossing en incubeer bij 37 °C in het donker gedurende 2-18 uur.
      4. Om de reactie daarna te stoppen, spoelt u de cellen twee keer met 500 μl 3% dimethylsulfoxide (DMSO) in PBS en houdt u de cellen vervolgens in 500 μl verse PBS.
      5. Tel de blauwe geïnfecteerde cellen (zoals weergegeven in figuur 1A) onder de microscoop in een vergroting van 10x voor 5 willekeurige velden. Neem een gemiddelde telling van de 5 velden en vermenigvuldig deze met de veldfactor en verdunningsfactor. Hiermee worden de infectieuze viriondeeltjes in de virusvoorraad gekwantificeerd.
        OPMERKING: Voor een plaat met 24 putjes is de veldfactor 75.
OnderdelenVoorbereidingBenodigd volume
PBSBereid 1x PBS uit een voorraad van 10x PBS14 ml
Kalium Ferri-ferrocyanideLos 0,82 g kaliumferricyanide en 1,06 g kaliumferrocyanide op in 25 ml 1x PBS0,75 ml
Magnesiumchloride1 M in 1 ml van 1x PBS15 μL
X-galLos 30 mg op in 0,6 ml N,N-dimethylformamide (in het donker)0,3 ml
Totaal = 15 ml

Tabel 1: Lijst van componenten die nodig zijn voor β-galkleuring in TZM-bl-cellen.

2. HIV-1-infectie van T-cellijnen

  1. Ontdooi en kweek een onsterfelijke T-cellijn. In deze studie werd gebruik gemaakt van CEM-GFP-cellijn gekweekt in volledig RPMI 1640-medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 500 μg/ml G418.
  2. Tel en neem 2 miljoen cellen voor elk tijdstip (niet-geïnfecteerd, 24 uur, 48 uur, 72 uur en 96 uur). Oogst de niet-geïnfecteerde cellen onmiddellijk door 5 minuten bij 100 x g te centrifugeren en voeg cellysebuffer toe (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,12 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5 mM NaF, 1 mM DTT), aangevuld met proteaseremmercocktail, 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en 1x fosfataseremmer (50 μL voor 1-3 miljoen cellen) of lyse in Trizol-reagens (1 ml voor 1-3 miljoen cellen) voor RNA-isolatie (zie tabel van Materialen).
  3. Was de cellen eenmaal met 1 ml volledig RPMI 1640-medium dat polybrene bevat (5 μg/ml) op 100 x g gedurende 5 minuten bij RT. Resuspendeer de cellen in 1 ml volledig medium.
    OPMERKING: Polybreen is een kationisch polymeer dat wordt gebruikt om retrovirale infectie in zoogdiercellen te verbeteren.
  4. Resuspendeer de 8 miljoen cellen in 1 ml polybreen dat volledig medium bevat. Bereken nu het volume van de virale voorraad die nodig is voor 4 miljoen viriondeeltjes, voeg de virusvoorraad toe en maak het totale volume tot 2 ml door volledige media toe te voegen. Dit maakt het een MOI van 0,5.
  5. Houd de cellen in de CO2 -incubator gedurende 4 uur op 37 °C, met intermitterend tikken om de 30-45 minuten.
  6. Draai na 4 uur de cellen leeg en gooi het supernatans voorzichtig weg in de bioveiligheidskast met de juiste verwijderingsmethoden.
    OPMERKING: Centrifugeer vanaf deze stap de cellen bij 100 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  7. Was de cellen twee keer met 1 ml onvolledig medium. Resuspendeer de cellen in 8 ml compleet medium, waardoor het 1 miljoen cellen/ml wordt.
  8. Zaai in een weefselkweekplaat met 6 putjes een gelijk aantal cellen in het vereiste aantal putjes en houd de plaat in een CO2 -incubator op 37 °C.
  9. Oogst de cellen de komende 4 dagen elke 24 uur door cellysebuffer toe te voegen. Vang ook het supernatans op en breng het onmiddellijk over naar de vriezer van -80 °C.
  10. Om te controleren of er een infectie is opgetreden, gaat u verder met p24-antigeenvangst ELISA voor alle tijdstippen. Maak de juiste verdunningen voor de tijdstippen, d.w.z. een lagere verdunning voor de beginpunten en een hogere voor latere tijdstippen, variërend van 1:50 tot 1:500. Zet de metingen uit in een grafiek die de progressie van de infectie weergeeft (Figuur 1B).

3. Thioflavine T-kleuring om de ER-spanning te bepalen

  1. Repareer 1 miljoen niet-geïnfecteerde en 0,5 MOI geïnfecteerde CEM-GFP-cellen (72 uur geïnfecteerde cellen genomen) met 200 μL 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 20 minuten bij RT.
  2. Pelleteer de cellen in 100 x g gedurende 5 minuten en behandel met 500 μl 0,1 m glycine gedurende 5 minuten, gevolgd door tweemaal wassen met 500 μl PBS. Resuspendeer de cellen in 100 μL PBS.
  3. Monteer de glasplaatjes, filterkaarten en monsterkamers. Voeg de 100 μL geresuspendeerde cellen toe aan de monsterkamers en draai de cellen gedurende 4 minuten op 1000 x g om de cellen aan de objectglaasjes in een cytocentrifuge te hechten (Materiaaltabel).
    OPMERKING: Er zouden niet genoeg cellen geïmmobiliseerd zijn op het objectglaasje na de cytocentrifugecentrifugatie als de celsuspensie te verdund is. De cellen zullen waarschijnlijk samenklonteren en slecht verdeeld zijn na de cytocentrifuge, als de celsuspensie zeer geconcentreerd is.
  4. Permeabiliseer de cellen gedurende 10 minuten met druppels van 0,1% Triton-X-100 in PBS (genoeg om het gebied te bedekken waar de cellen zich hebben gehecht) en was de cellen twee keer door PBS druppelsgewijs aan te brengen en de PBS met weefsel af te vegen door het glaasje te kantelen.
  5. Incubeer de cellen met 10 μL 5 μM Thioflavin T gedurende 30 minuten.
    LET OP: Niet wassen na incubatie met ThT.
  6. Monteer de objectglaasjes met 5 μl montagemedia (80% glycerol v/v, 20% PBS v/v en 8 mg/ml 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octaan [DABCO]), plaats het dekglaasje en sluit het dekglaasje af met nagellak. Laat de glaasjes drogen.
    OPMERKING: Zorg er bij al deze stappen voor dat de cellen niet opdrogen.
  7. Maak de confocale beelden van vaste cellen met een 63x glycerol-immersielens op een confocale microscoop (zie Tabel met materialen). Pas de volgende excitatie- en emissie-instellingen aan: GFP (Ex. 494 nm, Em. 519 nm) en ThT (Ex. 458 nm, Em. 480-520 nm).
    OPMERKING: Elk fluorescerend kanaal moet opeenvolgend worden afgebeeld, in plaats van gelijktijdig, om overlapping van het kanaal te voorkomen. GFP werd beschouwd als de indicatie van HIV-1-infectie, aangezien CEM-GFP-cellen GFP hebben onder de regulering van de LTR-promotor, die wordt geactiveerd bij HIV-1-infectie25.
  8. Converteer de fluorescerende beelden naar 8-bits voordat u ze kwantificeert door middel van drempelanalyse. Kwantificeer de intensiteit van elke cel handmatig met behulp van software zoals Image J (~50 cellen)27. Plot de grafiek met de intensiteit van elke cel als punten op de Y-as ten opzichte van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde criteria.
  9. Om de effectiviteit van dit protocol aan te tonen, neemt u een positieve controle, bijvoorbeeld Thapsigargin-behandeling (in dit geval bekende ER-stressinductoren)28. Behandel 1 miljoen CEM-GFP-cellen, elk met 1 μL DMSO (voertuigcontrole) en 100 nM Thapsigargin gedurende 12 uur.
  10. Oogst de cellen en verwerk voor ThT-kleuring zoals vermeld voor geïnfecteerde monsters (stappen 3.1-3.8).
    OPMERKING: Voor deze monsters is GFP-fluorescentie niet vereist. Daarom wordt alleen ThT-fluorescentie vastgelegd in confocale microscopie.

4. Bepalen van de activering en expressie van verschillende UPR-markers

OPMERKING: Om de expressie van UPR-markers te bepalen, worden twee methoden gebruikt: Immunoblotting en RT-PCR. Oogst voor immunoblotting de 0,5 MOI HIV-1-geïnfecteerde CEM-GFP-cellen op verschillende tijdstippen na infectie (24 uur, 48 uur, 72 uur en 96 uur na infectie) en resuspendeer de celpellet in lysisbuffer (zoals vermeld in stap 2.2). Als alternatief worden de celpellets voor RT-PCR gelyseerd in Trizol-reagens (1 ml voor 1-3 miljoen cellen) (zie materiaaltabel). De cellen geresuspendeerd in lysisbuffer en Trizol-reagens kunnen tot verder gebruik bij -80 °C worden bewaard.

  1. Immunoblotting voor analyse van UPR-markers.
    1. Houd de geresuspendeerde cellen in de lysisbuffer op ijs gedurende 45 minuten met intermitterend mengen met behulp van een vortex.
    2. Pellet de cellen bij 18000 x g gedurende 15 minuten met behulp van een tafelmodel hogesnelheidscentrifuge (zie Materiaaltabel). Vang het supernatans op in een verse tube.
    3. Kwantificeer de eiwitconcentratie in elk monster met behulp van Bradford of een vergelijkbaar reagens.
    4. Neem voor elk monster een gelijke concentratie eiwit en bereid de eiwitmonsters voor in Laemmli-buffer (6x buffer: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 10% SDS, 30% glycerol en 0,02% broomfenolblauw; 5% β-Mercaptoethanol).
      OPMERKING: Voor immunoblotting voor elke UPR-marker werd minimaal 60-80 μg eiwit gebruikt.
    5. Kook de eiwitmonsters gedurende 5 minuten op 96 °C en draai ze kort.
    6. Los de eiwitmonsters op op een 10%-12% SDS-PAGE-gel en breng de eiwitten over naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan (zie Materiaaltabel).
    7. Blokkeer met 5% magere droge melk of runderserumalbumine (BSA) gedurende 1-2 uur, was tweemaal met TBST (20 mM Tris pH7.4 en 0.137 M NaCl; 0.1% Tween 20) en sonde met eiwitspecifieke primaire antilichamen tegen UPR-markers (zie Materiaaltabel) in een rocker, 's nachts bij 4 °C. De volgende dag na het tweemaal wassen van de vlekken met TBST, sonde met de respectieve secundaire antilichamen gedurende 1,5 uur.
    8. Was de vlekken opnieuw met TBST en visualiseer de eiwitbanden met behulp van een chemiluminescentie-detecterend substraat (zie Materiaaltabel) in een beeldvormingsinstrument voor western blot.
  2. RT PCR
    1. Isoleer het totale RNA van de cellen met behulp van Trizol-reagens (zie Materiaaltabel).
    2. Bereid het cDNA voor uit een gelijke concentratie RNA met behulp van Moloney Murine Leukemie Virus reverse transcriptase (MMLV-RT) (zie Tabel met materialen).
    3. Analyseer de modulatie van de mRNA-expressie van HSPA5, gesplitste XBP1, ATF4, CHOP en GADD34 met behulp van qRT-PCR met genspecifieke primers (tabel 2). Bereid in het kort 10 μL reactiemengsels met cDNA-sjabloon (100 ng), 5 μL SYBR Green-kleurstof (zie Materiaaltabel) en 10 pmol van elk genspecifiek oligonucleotide-primerpaar. Pas het volume aan met behulp van steriele H2O.
    4. Laat de mengsels op een real-time PCR-machine draaien met behulp van het volgende programma: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten en 40 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s, gevolgd door de smeltcurveanalyse. Bereken de vouwverandering in de doelgenexpressie ten opzichte van het huishoudgen (bijvoorbeeld β-Actine) als:
      Vouw verandering = 2-Δ(ΔCT)
      Waarbij ΔCT = CT (doelwit) − CT (huishoudgen)
      en Δ(ΔCT) = ΔCT (behandeld) -ΔCT (controle)
    5. Om de splicing van XBP1 verder te bevestigen, voert u een semi-kwantitatieve RT-PCR uit met niet-geïnfecteerde en 72 uur geïnfecteerde monsters.
      OPMERKING: Splicing van het XBP-1-mRNA wordt bestudeerd met behulp van RT-PCR over de splice-plaats.
    6. Amplificeer het cDNA met XBP1-primers (tabel 2) met behulp van een high-fidelity PCR-mastermix (zie materiaaltabel) onder de volgende omstandigheden: 1 cyclus van 98 °C gedurende 30 s, gevolgd door 5 cycli van 98 °C gedurende 15 s, 65*Δ-5 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s, gevolgd door 30 cycli van 98 °C gedurende 15 s, 55 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s, gevolgd door een laatste verlenging van 72 °C gedurende 10 minuten en vasthouden bij 4 °C.
    7. Scheid de amplicons op een 2,5% agarosegel met 50 ng ethidiumbromide/ml en visualiseer ze in een gel doc-instrument. De gesplitste XBP1-band is 26 nucleotiden kleiner.

5. Knockdown van UPR-markers en analyse van HIV-1 LTR-gedreven genexpressie en virusproductie

  1. Voorbereiding van shRNA-constructen voor het uitschakelen van UPR-markers
    1. Maak shRNA-constructies met behulp van de pLKO.1-TRC-vectorbackbone (lentivirale kloonvector)29.
    2. Construeer twee shRNA-constructen voor elk gen (IRE1, PERK, ATF6 en HSPA5). Sense- en anti-sense-oligonucleotiden die gericht zijn op het mRNA van het respectieve gen zijn ontworpen door RNAi Consortium (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (Tabel 3).
      OPMERKING: Op een vergelijkbare manier kunnen shRNA-constructen worden gemaakt voor andere UPR-markers.
    3. Gloei de primers (100 nM elk van vooruit en achteruit) uit bij 95 °C, gevolgd door geleidelijke afkoeling tot RT.
    4. Verbind het vervolgens met behulp van een T4-DNA-ligase naar de Age1 - en EcoRI-sites van de pLKO.1-vector (zie Tabel met materialen). Bevestig de sequentie door DNA-sequencing.
      OPMERKING: Een shRNA-construct gericht op het LacZ-gen wordt gebruikt als een niet-gerichte controle.
  2. Knockdown van PERK, ATF6, IRE1 en HSPA5 in HEK-293T-cellen, Luciferase-test en p24 ELISA
    1. Bereid een mix van shRNA-construct (0,9 μg) en een transfectiereagens zoals polyethylenimine (PEI) (3 μL PEI voor 1 μg DNA) (zie Materiaaltabel) voor in 50 μL serumvrije media door vortexen en incubeer gedurende 20 minuten.
    2. Van een confluente HEK-293T-cellen met kolf, trypsiniseren en zaad ~ 0,25 x 106 cellen samen met de transfectiemix in een plaat met 24 putjes, waardoor het totale volume 125 μL bedraagt en gedurende 6 uur bij 37 °C incubeert in een CO2 -incubator. Deze methode wordt omgekeerde transfectie genoemd, waarbij de cellen samen met het transfectiemengsel worden gezaaid.
    3. Voeg na 6 uur 125 μL volledig medium toe aan de putjes en resuspendeer de cellen voor een gelijkmatige zaaiing.
      OPMERKING: Voor knockdown-experimenten geeft omgekeerde transfectie (stappen 5.2.1-5.2.3) een betere efficiëntie met zowel shRNA's als siRNA's.
    4. Voer na 24 uur een tweede transfectie uit. Bereid een mix van pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) en pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0.5) constructen met PEI (3 μL PEI voor 1 μg DNA) in 50 μL onvolledige media door vortexen. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij RT. Vervang de bestaande media door 250 μL verse onvolledige media en voeg de mix toe aan de cellen.
      OPMERKING: Een reportervector voor de HIV-1 LTR werd ontwikkeld door LTR eerder in het laboratorium te subklonen van pU3RIII30,31 naar pGL3base. GFP-expressie met behulp van pEGFP-N1 werd gebruikt om de transfectie-efficiëntie te normaliseren32.
    5. Vervang de media na 6 uur na transfectie door 500 μL volledige DMEM. Oogst de cellen na 36 uur voor immunoblotting en luciferase-test.
    6. Voor de luciferasebepaling worden de cellen gepelleteerd en geresuspendeerd in een in de handel verkrijgbaar luciferasesubstraat (50 μl) (zie materiaaltabel). Voeg het geresuspendeerde cellysaat toe aan een ondoorzichtige plaat met 96 putjes en incubeer gedurende 10-15 minuten. Verkrijg de luciferase-meting in een luminometer. Meet ook de GFP-fluorescentie in dezelfde monsters om de luciferase-meting in een microplate micromode-plaatlezer te normaliseren (bijv.: 494 nm, Em: 519 nm).
    7. Plot de grafiek als de Luciferase-eenheid/GFP op de Y-as.
      OPMERKING: De knockdown van de respectieve UPR-markers moet worden gecontroleerd en kan worden gedaan door immunoblotting of qRT-PCR met behulp van respectievelijk genspecifieke antilichamen of primers.
    8. Verzamel de supernatanten om te verwerken voor p24 ELISA zoals hierboven vermeld.
  3. Creatie van stabiele cellen met knockdown van UPR-markers en HIV-1-infectie.
    1. Bereid de Lentivirus-deeltjes voor door HEK-293T-cellen te transfecteren die zijn gezaaid in een plaat met 6 putjes, met de respectieve shRNA (1 μg) constructen samen met pMD2.G (VSV-G-envelopvector) (0.75 μg) en psPAX2 (lentivirale verpakkingsplasmide) (0.25 μg) (zie Materiaaltabel) met behulp van PEI in de verhouding 1 μg DNA: 3 μL PEI. Bereid het mengsel voor in 100 μL onvolledige DMEM en incubeer gedurende 20 minuten bij RT. Voeg het mengsel toe aan 1,8 ml volledige media in de gezaaide HEK-293T-cellen.
      OPMERKING: Zaad HEK-293T-cellen in een plaat met 6 putjes ten minste 12 uur voor transfectie totdat ze morfologie krijgen en ongeveer 60-70% confluent zijn.
    2. Voeg na 24 uur transfectie 1 ml volledige DMEM toe aan elk putje.
    3. Verzamel de supernatanten na 48 uur, bewaar ze bij -80 °C in de vriezer en voer p24 ELISA uit om de aanwezigheid van het virus in deze supernatanten te bevestigen. Gebruik dit ruwe lentivirale supernatans voor het transduceren van J6-cellen.
    4. Incubeer 2 miljoen cellen in een plaat met 6 putjes met een gelijk volume lentiviraal supernatans (500 μL) voor elke controle- en genspecifieke knockdown-lentivirus en voeg vers, compleet RPMI 1640-medium toe in aanwezigheid van polybreen (5 μg/ml) om het volume aan te vullen tot 2 ml.
    5. Voeg na 24 uur Puromycine (1 μg/ml) toe aan elk putje om stabiele cellen te selecteren. Na het toevoegen van Puromycine, pellet de cellen elke 24 uur en voeg 2 ml verse media met Puromycin toe.
    6. Doe dit totdat er geen celdood meer is (~1 week). De overlevende cellen zijn de stabiele cellen met de gewenste gen-knockdown.
      OPMERKING: De knockdown van de respectieve genen kan met regelmatige tussenpozen worden gecontroleerd en, ten slotte, wanneer alleen overlevende cellen zichtbaar zijn in Puromycine-bevattende media met behulp van immunoblotting of qRT-PCR.
    7. Infecteer de LacZ en genspecifieke knockdown-cellen met 0,5 MOI van HIV-1 zoals beschreven in sectie 2 en oogst de cellen 48 uur na infectie.
    8. Verzamel het supernatans van elk monster en verwerk voor p24-ELISA zoals eerder beschreven en verwerk de cellen om het knockdown-niveau te controleren door middel van immunoblotting.

6. Behandeling met ER-stressinductor en analyse van het effect ervan op HIV-1-replicatie

OPMERKING: Om het effect van overstimulatie van UPR tijdens HIV-1-replicatie te bepalen, kan het farmacologische inductormolecuul, Thapsigargin, worden gebruikt.

  1. Bepaling van het percentage cellevensvatbaarheid bij behandeling met Thapsigargin.
    OPMERKING: De cytotoxiciteit van Thapsigargin wordt bepaald door het MTT-reagens (zie Materiaaltabel).
    1. Zaad 25.000-30.000 CEM-GFP-cellen per putje in een plaat met 96 putjes die 100 μL volledige RPMI 1640 bevat. Voeg 100 nM Thapsigargin toe aan de media en incubeer bij 37 °C in een incubator.
      OPMERKING: Cellen behandeld met 1 μL DMSO werden genomen als voertuigcontrole.
    2. Voeg na 48 uur 10 μl MTT (5 mg/ml) toe aan elk putje en incubeer gedurende 4 uur in het donker voor de vorming van formazankristallen bij 37 °C met 5% CO2.
    3. Los na 4 uur de kristallen op met 100 μL isopropanol om een paarse kleur te vormen en meet de absorptie bij 570 nm met behulp van een spectrofotometer.
    4. Bereken het percentage levensvatbaarheid van de cel op basis van de onderstaande vergelijking
      % levensvatbaarheid van de cel = (ControleOD570 - BehandelingOD570)/ ControleOD570 x 100
  2. Voorbehandeling van Thapsigargin en analyse van de progressie van HIV-1-infectie door p24 ELISA.
    1. Zaai 1 miljoen CEM-GFP-cellen in een plaat met 12 putjes die 1 ml volledig RPMI 1640 bevat en behandel de cellen met 100 nM Thapsigargin of 1 μL DMSO (voertuigcontrole) gedurende 12 uur in een CO2 -incubator die op 37 °C wordt gehouden. Was na 12 uur de cellen met volledige RPMI 1640 en infecteer met 0,5 MOI van HIV-1 zoals eerder beschreven.
    2. Oogst de cellen op verschillende tijdstippen, zoals 24 uur, 48 uur en 72 uur na infectie, voor immunoblotting.
    3. Verzamel de supernatanten van elk monster en voer p24 ELISA uit zoals eerder beschreven.
    4. Plot de grafiek met de p24-concentratie in het monster als de Y-as en de respectievelijke tijdstippen als de X-as.
    5. Analyseer met behulp van immunoblotting de ER-stressinductie als gevolg van behandeling met Thapsigargin door het niveau van eventuele UPR-markers te meten. In deze studie werd HSPA5 als marker gebruikt.

7. TZM-bl β-gal infectiviteitstest om het effect van UPR op virion-infectiviteit te bepalen

OPMERKING: Om de rol van UPR in de virion-infectiviteit te begrijpen, kan het supernatans van de knockdown en de behandeling met Thapsigargin worden gebruikt voor de TZM-bl-β-gal-infectiviteitstest zoals beschreven in rubriek 1.2, op basis van de p24-concentratie bepaald door p24 ELISA.

  1. Infecteer TZM-bl-cellen met een gelijke concentratie p24 van elk monster en voer β-galkleuring uit. Tel de blauwe geïnfecteerde cellen onder de microscoop in een vergroting van 10x voor 5 willekeurige velden.
  2. Neem een gemiddelde van het aantal van de 5 velden voor elk monster uit de bovenstaande stappen.
  3. Bereken de vouwverandering zoals hieronder vermeld:
    Vouwverandering = Gemiddeld aantal blauwe bloedcellen in de testmonsters/Gemiddeld aantal blauwe bloedcellen in het controlemonster.

Resultaten

In dit werk hebben we een gedetailleerd protocol beschreven om in vitro ER-stress en UPR-activering bij HIV-1-infectie in T-cellen te bestuderen (Figuur 2). Deze studie beschrijft ook methoden om de functionele relevantie van UPR bij HIV-1-replicatie en virion-infectiviteit te analyseren (Figuur 3).

Daartoe analyseerden we de ER-stress veroorzaakt door HIV-1-infectie door de eiwitaggregaten in de cel te observeren door te kleuren met Thioflavine T. Zoals te zien is in figuur 4A, vertegenwoordigt de intensiteit van ThT de eiwitaggregaten in de niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen. Evenzo, als positieve controle, geeft figuur 4B de ThT-kleuring weer in met Thapsigargin behandelde cellen. De verhoogde ThT-intensiteit suggereert de aanwezigheid van meer eiwitaggregaten, wat gecorreleerd is met verhoogde ER-stress.

Om deze waarneming te valideren, werd verder een meer conventionele methode gebruikt, waarbij UPR-markers werden geanalyseerd. De UPR-activering werd in eerste instantie geanalyseerd door de activering van primaire effectoren -IRE1, ATF6 en PERK. De activering van IRE1 werd gemeten door de fosfo-IRE1-niveaus te analyseren door immunoblotting van de lysaten van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen die op verschillende tijdstippen na infectie waren geoogst, zoals weergegeven in figuur 5A. De toename van de pIRE1/Total IRE1-niveaus suggereert de activering van IRE1. Evenzo werd de activering van PERK gemeten aan de hand van de niveaus van fosfo-PERK in niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen (Figuur 5B). De activering van ATF6 werd gekwantificeerd door het expressieniveau van de ATF6 P50-vorm door immunoblotting (Figuur 5C). Een andere belangrijke marker van UPR is de hoofdregulator en een ER-chaperonne, HSPA5. Het niveau van HSPA5 werd ook geanalyseerd door middel van immunoblotting, zoals weergegeven in figuur 5D. Een soortgelijk protocol werd gevolgd voor andere UPR-markers, zoals sXBP1, peIF2α, ATF4, CHOP en GADD34, met behulp van hun specifieke antilichamen (aanvullende figuur 1). De splicing van XBP1-mRNA kan worden geanalyseerd door zowel kwantitatieve RT-PCR (Fig 5E) als semi-kwantitatieve RT-PCR. Omdat kwantitatieve RT-PCR splicing niet specifiek kon identificeren, werd het gekoppeld aan de splicing-test, waarbij semi-kwantitatieve RT-PCR werd gebruikt (Figuur 5F). Met het bovengenoemde protocol hebben we vastgesteld dat de qRT-PCR-gegevens overeenkomen met de semi-qRT-PCR-gegevens. Net als de qRT-PCR die werd uitgevoerd voor sXBP1, werd het protocol gebruikt voor de analyse van andere markers van UPR, zoals HSPA5, ATF4, CHOP en GADD34 op mRNA-niveau (aanvullende figuur 2)

Om de rol van UPR in HIV-1-replicatie en virion-infectiviteit te onderzoeken, hebben we vervolgens een knockdown uitgevoerd van bepaalde UPR-markers: PERK en HSPA5. Met behulp van de genoemde protocollen hebben we de knockdown van deze markers tot een significant niveau bereikt in zowel HEK-293T-cellen (Figuur 6A) als J6-cellen (Figuur 6B). Met behulp van deze knockdown-cellen onderzochten we het effect van knockdown van HIV-1 LTR-gedreven genactiviteit (Figuur 6A), die wordt weergegeven als Luc/GFP-expressieverhouding in de respectieve monsters. De virusproductie werd gemeten met p24 ELISA van de supernatant, zoals weergegeven in figuur 6B. De infectiviteit van de geproduceerde virionen kan ook worden geanalyseerd met behulp van het β-gal kleuringsprotocol op dezelfde manier als weergegeven in figuur 1A.

Verder kan met behulp van een chemische inductor van ER-stress, Thapsigargin, het effect van overstimulatie van UPR op HIV-1-replicatie, virusproductie en virion-infectiviteit worden bestudeerd. De cytotoxiciteit van Thapsigargin bij de gegeven concentratie werd geanalyseerd met behulp van een MTT-test (Figuur 7A), waaruit blijkt dat de cytotoxiciteit bij de gewenste concentratie niet significant is. De immunoblotting voor HSPA5 werd uitgevoerd om het effect van het medicijn op ER-stress te analyseren (Figuur 7B). De resultaten tonen aan dat 12 uur voorbehandeling van 100 nM Thapsigargin de expressie van HSPA5 op alle tijdstippen induceerde. De p24 ELISA toont het effect op de virusproductie en de besmettelijkheid van de geproduceerde virionen, die kunnen worden geanalyseerd zoals eerder beschreven.

figure-results-1
Figuur 1: Kwantificering van de infectiviteit van virionen en analyse van de progressie van de infectie. (A) Kwantificering van de infectiviteit van virionen door middel van een TZM-bl-test op basis van β-gal. De besmettelijkheid van het virus werd bepaald door 1 ng, 0,1 ng en 0,01 ng van het virus toe te voegen aan de TZM-bl-cellen, gevolgd door β-galkleuring en het tellen van het aantal blauwe bloedcellen. Vergroting: 10x. (B) Analyse van infectieprogressie in 0,5 MOI HIV-1 geïnfecteerde CEM-GFP-cellen op basis van p24-antigeenvangst-ELISA van de kweeksupernatanten. CEM-GFP-cellen werden geïnfecteerd met 0,5 MOI van HIV-1 en de supernatanten werden verwerkt voor p24 ELISA. De foutbalken worden weergegeven als gemiddelde ± SE-waarden. Sterretjes geven het significantieniveau aan, dat in de figuren wordt aangegeven als ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 en ****=p ≤ 0,0001 zoals geanalyseerd door de t-toets van Student. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schematische weergave van de te volgen stappen om het effect van HIV-1-infectie op ER-stress en UPR te analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Stroomschema van de te volgen stappen om het effect van UPR op HIV-1-replicatie, virusproductie en virioninfectiviteit te analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Analyse van het ER-stressniveau in T-cellen als gevolg van HIV-1-infectie met behulp van ThT-kleuring. (A) CEM-GFP-cellen werden geïnfecteerd met 0,5 MOI van HIV-1 en 72 uur na infectie geoogst. Cellen werden gefixeerd en gekleurd met Thioflavine T. GFP-expressie duidt op geïnfecteerde CEM-GFP-cellen. De grafiek toont de intensiteit van Thioflavine T in het geval van niet-geïnfecteerde en HIV-1-geïnfecteerde cellen. Gegevens van ~50 cellen van n = 3 biologische replicaten worden in de grafiek gepresenteerd. (B) CEM-GFP-cellen werden gedurende 12 uur behandeld met DMSO en TG. Cellen werden gefixeerd en gekleurd met Thioflavine T. De grafiek toont de intensiteit van Thioflavine T in het geval van met DMSO en TG behandelde cellen. Gegevens van ~50 cellen van n = 3 biologische replicaten worden in de grafiek gepresenteerd. De foutbalken worden weergegeven als gemiddelde ± SE-waarden. Sterretjes geven het significantieniveau aan, dat in de figuren wordt aangegeven als ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 en **** = p ≤ 0,0001 zoals geanalyseerd door de t-toets van Student. VN: Niet geïnfecteerd; IN: Geïnfecteerd; TG: Thapsigargin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Analyse van de expressie van verschillende UPR-markers in HIV-1 geïnfecteerde T-cellen. (A-E) HIV-1 (0,5 MOI) geïnfecteerde CEM-GFP-cellen werden elke 24 uur tot dag 4 geoogst en werden verwerkt voor verschillende analyses zoals hieronder beschreven. (A) Activering van IRE1 werd geanalyseerd door immunoblotting van pIRE1. (B) Activering van PERK werd geanalyseerd door immunoblotting van pPERK. (C) De activering van ATF6 werd geanalyseerd door immunoblotting van de ATF6 P50-vorm. (D) De expressie van ER-chaperonne HSPA5 werd geanalyseerd door immunoblotting HSPA5. (E) Splicing van XBP1 werd geanalyseerd door qRT-PCR van sXBP1 met behulp van specifieke real-time primers. (F) Om de splicing van XBP1 door semi-qRT-PCR te analyseren, werd XBP-1-mRNA geamplificeerd met behulp van RT-PCR over de splice-plaats en werden de banden gevisualiseerd. De foutbalken worden weergegeven als gemiddelde ± SE-waarden. VN: Niet geïnfecteerd. IN: Geïnfecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Analyse van de rol van UPR op HIV-1-replicatie en virusproductie. (A) PERK (linkerpaneel) en HSPA5 (rechterpaneel) werden uitgeschakeld in HEK-293T-cellen en een luciferase-test werd uitgevoerd om de HIV-1 LTR-gedreven genactiviteit te analyseren. De immunoblots tonen de knockdown-niveaus van de respectieve eiwitten. (B) PERK (linkerpaneel) en HSPA5 (rechterpaneel) werden neergehaald in J6-cellen en p24 ELISA werd uitgevoerd met het supernatans verzameld om de virusproductie te analyseren. De immunoblots tonen de knockdown-niveaus van de respectieve eiwitten. De foutbalken worden weergegeven als gemiddelde ± SE-waarden. Sterretjes geven het significantieniveau aan, dat in de figuren wordt aangegeven als ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 en ****=p ≤ 0,0001 zoals geanalyseerd door de t-toets van Student. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Analyse van het effect van de chemische ER-stressinductor, Thapsigargin, op de progressie van HIV-1-infectie. (A) Cellevensvatbaarheid van CEM-GFP-cellen na behandeling met 100 nM Thapsigargin. De levensvatbaarheid van de cellen wordt geanalyseerd door middel van een MTT-test. (B) CEM-GFP-cellen die gedurende 12 uur waren voorbehandeld met 100 nM TG, waren geïnfecteerd met 0,5 MOI HIV-1 en werden 24 uur, 48 uur en 72 uur na infectie geoogst. De immunoblot toont het effect van TG op de expressie van HSPA5, terwijl de grafiek de virusproductie toont zoals geanalyseerd door p24 ELISA. De foutbalken worden weergegeven als gemiddelde ± SE-waarden. Sterretjes geven het significantieniveau aan, dat in de figuren wordt aangegeven als ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 en ****= p ≤ 0,0001 zoals geanalyseerd door de t-toets van Student. TG: Thapsigargin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Analyse van de expressie van verschillende stroomafwaartse markers van UPR. Expressie van (A) sXBP1, (B) fosforylering van eIF2α, (C) ATF4, (D) CHOP en (E) GADD34 zoals geanalyseerd door immunoblotting. (A-E) CEM-GFP-cellen geïnfecteerd met 0,5 MOI HIV-1 werden 24 uur, 48 uur, 72 uur en 96 uur na infectie geoogst en werden gebruikt voor immunoblotting. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Analyse van verschillende UPR-markers op mRNA-niveau door qRT-PCR. (A-D) CEM-GFP-cellen geïnfecteerd met 0,5 MOI van HIV-1 werden elke 24 uur geoogst tot dag 4 en werden gebruikt voor qRT-PCR van (A) HSPA5, (B) ATF4, (C) CHOP en (D) GADD34. De foutbalken worden weergegeven als gemiddelde ± SE-waarden. Sterretjes geven het significantieniveau aan, dat in de figuren wordt aangegeven als ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 en **** = p ≤ 0,0001 zoals geanalyseerd door Student's t-toets. Klik hier om dit bestand te downloaden.

BouwenPrimer sequentie 5' tot 3'
XBP1 PLAKKENDE TEST FTTACGAGAGAAAACTCATGGCC
XBP1 PLAKKEN TEST RGGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC
GEKRUID XBP1 FCTGAGTCCGAATCAGGTGCAG
GEKRUIDE XBP1 RATCCATGGGGAGATGTTCTGG
HSPA5 FCACAGTGGTGCCTACCAAGA
HSPA5 RTGATTGTCTTTGTCAGGGGT
ATF4 FAGTCCCTCCAACAACAGCAA
ATF4 RGAAGGTCATCTGGCATGGTT
Hak FCAGTGTCCCGAAGGAGAAAG
HAK RCAGAGCTGGAACCTGAGGAG
GADD34 FATGGACAGTGACCTTCTCGG
GADD34 RCTGGGCTCCTCCTAGGCT
ACTINE FAGAAAATCTGGCACCACACC
ACTIN RGGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

Tabel 2: Lijst van primers die worden gebruikt voor RT-PCR-analyse. F: Vooruit; R: Achteruit

shRNA-constructiePrimer sequentie 5' tot 3'
PERK SH1 FCCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG
PERK SH1 RAATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTATCGAGATTACTAATGACCTGCCG
PERK SH2 FCCGGGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG
PERK SH2 RAATTCAAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC
ATF6 SH1 FCCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAAAGTCTTGATTCTGGGTTTTTG
ATF6 SH1 RAATTCAAAAACCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG
ATF6 SH2 FCCGGCCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCGAACTCTTCGCTTTGGACTAGGTTTTTG
ATF6 SH2 RAATTCAAAAACCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCGAACTCTCTGCTTTGGACTAGG
IRE1 SH1 FCCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTAGACTGACATTAAGCAGGTTTTTG
IRE1 SH1 RAATTCAAAAACCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTAGACTGACATTAAGCAGG
IRE1 SH2 FCCGGCCCATCAACCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGGTTGATGGGTTTTTG
IRE1 SH2 RAATTCAAAAACCCATCAACCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGGTTGATGGG
HSPA5 SH1 FCCGGGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTCTTTTTG
HSPA5 SH1 RAATTCAAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTC
HSPA5 SH2 FCCGGGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG
HSPA5 SH2 RAATTCAAAAAGTGAGTGATGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC
LacZ FCCGGTCGTATTACAACGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTTTG
LacZ RAATTCAAAAATCGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGA

Tabel 3: Lijst van primers die worden gebruikt voor het genereren van shRNA-constructen. F: Vooruit; R: Achteruit

Discussie

Het toepassingsgebied van dit protocol omvat (i) de omgang met HIV-1-virusvoorraden en de meting van de virusconcentratie en virioninfectiviteit, (ii) infectie van T-cellen met HIV-1 en de beoordeling van het effect ervan op ER-stress en verschillende markers van UPR, (iii) Effect van knockdown van UPR-markers en hun effect op HIV-1 LTR-gestuurde genactiviteit, virusproductie en virion-infectiviteit en (iv) overstimulatie van de UPR met behulp van farmacologische moleculen en analyse van het effect ervan op HIV-1-replicatie. Met behulp van de huidige set protocollen kan uitgebreide informatie worden verkregen over de wisselwerking tussen HIV-1 en UPR. De protocollen die in deze studie worden vermeld, zijn eenvoudig uit te voeren, kosteneffectief en zeer betrouwbaar.

Aangezien UPR een stressgevoelige signaalroute is, omvat het werken hieraan nogal delicate stappen. Voor alle experimenten raden we aan om cellen met lange passages te vermijden om consistentie in de resultaten te verkrijgen. Het is ook belangrijk om steriele omstandigheden te handhaven in alle celkweektechnieken om bacteriële en gistbesmettingen te voorkomen, omdat deze de experimenten en de bijbehorende resultaten kunnen belemmeren. Bovendien moet u bij het hanteren van cellen tijdens experimenten, inclusief hun daaropvolgende kweek, harde of langdurige temperatuurveranderingen voorkomen en ervoor zorgen dat de cellen om te beginnen gezond en niet-gestrest zijn. Anders kunnen de veranderingen extra stress voor de cellen veroorzaken, wat de resultaten kan veranderen. Probeer de tijdstippen zo vast mogelijk te houden, aangezien UPR een gevoelige signaalroute is en een kleine verandering in de tijdstippen de resultaten kan variëren.

De ThT-kleuringsmethode die eiwitaggregaten detecteert en wordt gebruikt voor het bepalen van ER-stress22, toont de ER-stressniveaus in de met HIV-1 geïnfecteerde cellen heel duidelijk. ThT-kleuring is gebaseerd op de detectie van eiwitaggregaten, die gecorreleerd is met ER-stress. Er moet echter worden opgemerkt dat de UPR-activering niet altijd kan worden gecorreleerd met eiwitaggregaten, aangezien de individuele UPR-signaleringsroutes direct kunnen worden geactiveerd zonder de betrokkenheid van eiwitaggregaten. Dus hoewel deze ThT-kleuringsmethode een idee geeft van de ER-stressniveaus, moet deze voor een diepgaande analyse van UPR-activering altijd worden gevalideerd met verdere analyse van UPR-markers. Om de subcellulaire lokalisatie van ThT-kleuring verder te definiëren, kunnen markers zoals KDEL in het geval van markering van de ER worden gebruikt. Bovendien resulteert ER-stress in veel gevallen in een verandering in celgrootte en -vorm, zodat men ook rekening kan houden met het gebied van cellen bij het kwantificeren van de ThT-intensiteit. De beschikbaarheid van zeer gevoelige, betrouwbare en kosteneffectieve commerciële genspecifieke antilichamen heeft een revolutie teweeggebracht in vele aspecten van de levenswetenschappen, waardoor de analyse van eiwitniveaus in de cellen gemakkelijker kan worden gemaakt. Ook zijn er tegenwoordig zeer gevoelige soorten apparatuur beschikbaar om de eiwitbanden op de vlekken te visualiseren en de kwantificering snel en gemakkelijker te maken. De activering van UPR-markers kan dus gemakkelijk worden geanalyseerd door immunoblotting. Omdat de expressie van UPR-markereiwitten echter relatief laag is, moet men een aanzienlijke eiwitconcentratie gebruiken om hun expressie te analyseren. Bovendien moet de verdunning van de primaire antilichamen goed worden geoptimaliseerd op basis van de eiwitexpressie in de gebruikte cellen om niet-specifieke binding en achtergrondruis in de blots te voorkomen. Ook, zoals te zien is in Figuur 4C, is het ATF6-antilichaam polyklonaal en geeft het een aantal niet-specifieke banden. De juiste optimalisatie van het wassen en de concentratie van antilichamen is nodig om deze niet-specifieke banden tot op zekere hoogte te verminderen. De vlekken moeten na incubatie goed worden gewassen in blokkeringsoplossing, primair antilichaam en secundair antilichaam om de achtergrond- en niet-specifieke banden te verminderen. Tijdens de ontwikkeling van de blots moet oververzadiging van de banden worden vermeden om een goede visualisatie van het patroon in de verkregen resultaten te verkrijgen. Kijkend naar de brede focus van dit methodeartikel, hebben we ons niet gericht op gedetailleerde methoden en probleemoplossing voor algemene immunoblottingtechnieken; men kan echter verwijzen naar methode-artikelen van Mahmood en Yang33 evenals Ghosh et al.34 voor hetzelfde. Aangezien RT-PCR tegenwoordig een zeer veelgebruikte methode is, leveren de gemakkelijk verkrijgbare primers en RT-PCR-machines gegevens om bepaalde UPR-markers te analyseren. Er moeten echter voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het voorbereiden van het RNA en cDNA voor RT-PCR, aangezien het een zeer gevoelige methode is en kleine variaties in de kwaliteit van monsters en pipetteren kunnen leiden tot enorme variaties in de uitlezing. Elke DNA- of eiwitcontaminatie moet uit de RNA-monsters worden verwijderd. Neem de monsters ook altijd in drievoud voor qRT-PCR, zodat de pipetteerfout kan worden verminderd. De concentratie van het DNA dat voor qRT-PCR wordt gebruikt, moet zo worden geoptimaliseerd dat de CT-waarde voor elk monster lager is dan 30, aangezien alles boven de 30 als niet ideaal wordt beschouwd. Voor qRT-PCR moet altijd een negatieve controle worden aangehouden om vals-positieve uitlezing te voorkomen. De splicing van XBP1 kan zowel door qRT-PCR als semi-qRT-PCR worden geanalyseerd. Aangezien qRT-PCR de splicing niet nauwkeurig zou weergeven, moet semi-qRT-PCR altijd apart van qRT-PCR worden uitgevoerd om de gegevens te valideren en om de relatieve gesplitste XBP1 tot niet-gesplitste XBP1-verhouding te bepalen. Aangezien het verschil tussen de grootte van gesplitst en niet-gesplitst XBP1 slechts 26 nt is, moet een hoger percentage agarosegel worden gebruikt om de gel op te lossen. Ook moeten de banden worden opgelost in laagspanning en een langere duur voor een betere scheiding. Een andere methode die tegenwoordig populairder is om de splicing van XBP1 waar te nemen, is de splicing-test die gebruik maakt van de Pst1 beperking enzymvertering van het cDNA en zorgt voor een betere visualisatie van XBP1-splicing35. Deze methode kan ook worden gebruikt om de splicing van XBP1 in HIV-1-geïnfecteerde monsters te visualiseren. De resultaten verkregen uit immunoblotting en RT-PCR kunnen worden gebruikt om de ThT-kleuringsresultaten te valideren.

De representatieve resultaten in figuur 5 suggereren dat de UPR-activering bij HIV-1-infectie correleert met de verbeterde ThT-kleuring zoals weergegeven in figuur 4. De beperkingen van het gebruik van immunoblotting en RT-PCR om UPR te analyseren zijn echter dat ze rigoureus zijn en dat men meerdere genproducten moet controleren, aangezien de individuele UPR-genen onafhankelijk kunnen worden gewijzigd door niet-ER-stressfactoren. Ook meten deze methoden indirect de ER-stress door naar de verschillende UPR-markers te kijken. Dat is de reden waarom de ThT-kleuring en de analyse van UPR-markers door immunoblotting en RT-PCR samen kunnen worden gebruikt om het effect van HIV-1-infectie op ER-stress en UPR-activering in T-cellen te analyseren.

Het tweede deel van dit artikel gaat in op de protocollen die betrokken zijn bij het begrijpen van de impact van UPR op HIV-1-replicatie. De omgekeerde transfectiemethode die wordt gebruikt voor het neerhalen van UPR-markers die in dit artikel wordt beschreven, bleek een significante vermindering van de expressie van UPR-markers te geven. Zoals vermeld in het protocol, werd GFP-fluorescentie gebruikt om de luciferase-meting voor luciferase-test te normaliseren. In veel gevallen kan de GFP-meting echter ook worden beïnvloed door de specifieke gentransfectie36, dus in dat geval kan men andere fluorescerende markers gebruiken, zoals RFP, YFP of de totale eiwitconcentratie om de luciferase-meting te normaliseren. Ook kan in sommige gevallen waarin de cellen moeilijk te lyseren zijn, zoals TZM-bl-cellen, extra lysisreagens worden toegevoegd voordat het luciferasesubstraat wordt toegevoegd. Zoals weergegeven in de resultaten, zijn de luciferase-resultaten (Figuur 6A Linkerpaneel) overeenkomen met de p24 ELISA-resultaten in het geval van PERK (Figuur 6B Linkerpaneel), waar PERK knockdown de HIV-1-genactiviteit en virusproductie aanzienlijk vermindert. Terwijl in het geval van HSPA5 de knockdown van HSPA5 geen invloed heeft op de LTR-gestuurde genactiviteit (Figuur 6A Rechterpaneel) volgens de resultaten van de luciferase-test, terwijl het de virusproductie beïnvloedt volgens p24 ELISA (Figuur 6B Rechterpaneel). Op deze manier suggereren deze resultaten dat verschillende UPR-markers verschillende effecten kunnen hebben op HIV-1 LTR-gedreven genactiviteit en virusproductie. Het p24-antigeen dat door ELISA in het supernatans wordt gemeten, is voornamelijk een indicatie van de concentratie van virusdeeltjes die vrijkomen in het kweeksupernatant. Daarom hebben onderzoekers routinematig de resultaten van p24-antigeenvangst ELISA gebruikt als een indirecte indicatie van de virusproductie in het celsupernatans37. De luciferase-test in cellen en p24-ELISA van het supernatans kunnen dus samen worden gebruikt om het effect op HIV-1 LTR-gestuurde genactiviteit en de virusproductie te bepalen. Dit protocol kan ook worden gebruikt om het effect van andere UPR-markers op HIV-1 LTR-gestuurde genactiviteit en virusproductie te analyseren door genspecifieke shRNA's te gebruiken. Voor al die experimenten met uitlezingen van p24 ELISA- en luciferase-assay, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de juiste verdunningen en incubatietijd worden gehandhaafd en dat waarden die onder de categorie van de uitbijter vallen, niet in aanmerking worden genomen. Bijvoorbeeld, tijdens het doen van p24 ELISA, een OD450 waarde tussen 0,1-2 wordt als ideaal beschouwd. De tweede benadering om de rol van UPR bij HIV-1-replicatie te onderzoeken, is het gebruik van farmacologische moleculen zoals Thapsigargin, een ER-stressinductor of TUDCA, een ER-stressremmer. Deze medicijnen worden heel vaak gebruikt om UPR in verschillende contexten te bestuderen38,39,40,41. In dit artikel hebben we het protocol voor de behandeling met Thapsigargin gedemonstreerd en het effect ervan op de progressie van HIV-1-infectie in T-cellen geanalyseerd. Alvorens het medicijn voor een experiment te gebruiken, wordt het sterk aanbevolen om de levensvatbaarheid van de cel te testen voor een reeks doses voor het medicijn in de cellijn die moet worden gebruikt. De concentratie die minder dan ~80% cellevensvatbaarheid in de gegeven cellijn geeft, moet worden vermeden. Bovendien moeten voor tests op de levensvatbaarheid van cellen altijd gezonde cellen worden genomen, omdat cellen die al gestrest zijn niet de juiste uitlezing zullen vertonen, en celresten kunnen troebelheid veroorzaken en valse uitlezingen geven. Het protocol dat in deze studie wordt genoemd, toont het effect van Thapsigargin op virale replicatie gedurende 72 uur na infectie, wat een beter begrip geeft van het effect van het medicijn op virale replicatie gedurende een tijdsverloop. Men kan ook kortere tijdsintervallen nemen, zoals 12 uur, 24 uur, 36 uur, 48 uur, 60 uur en 72 uur na infectie om het vroegste tijdstip waarop het medicijn zijn effect op de virale replicatie begint te vertonen, verder te analyseren.

Aangezien UPR ook betrokken is bij eiwitafbraak en membraandynamiek42,43, is het mogelijk dat UPR een rol kan spelen bij de infectiviteit van virionen. De besmettelijkheid van de virionen die door de cellen worden geproduceerd, kan ook worden geanalyseerd met behulp van het gegeven protocol. De bovengenoemde protocollen kunnen ook worden gebruikt om het effect van HIV-1-infectie op ER-stress en UPR te bepalen en de functionele relevantie ervan in menselijke PBMC's voor meer biologisch relevante studies. Inzicht in de functie van ER-UPR bij HIV-1-infectie is essentieel vanwege het toenemende bewustzijn van de betrokkenheid ervan bij de ontwikkeling van tal van ernstige ziekten. De informatie die met behulp van deze reeks methoden wordt verkregen, zal bijdragen aan dit onontgonnen gebied door een belangrijk begrip te bieden van de interactie tussen HIV-1 en UPR.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

We danken het National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of India, voor de intramurale ondersteuning. AT en AD zijn dankbaar voor de Ph.D. onderzoeksondersteuning ontvangen van het National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of India. DM is dankbaar voor de JC Bose National Fellowship van SERB, de regering van India.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcrylamamideBiorad, USA1610107
AgaroseG-Biosciences, USARC1013
Ammonium persulphateSigma-Aldrich, USAA3678
anti-ATF4 antibodyCell Signaling Technology, USA11815Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibodyAbcam, UKab122897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibodyCell Signaling Technology, USA2897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western blot detection Dilution-1:2000 
anti-GADD34 antibodyAbcam, UKab236516Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western blot detection Dilution-1:3000 
anti-HSPA5 antibodyCell Signaling Technology, USA3177Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibodyCell Signaling Technology, USA3294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody Biorad, USA1706516Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibodyInvitrogen, USA44-728GWestern blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibodyCell Signaling Technology, USA5683Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibodyAbcam, UKab243665Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibodyInvitrogen, USAPA5-40294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibodyBiorad, USA1706515Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibodyAbcam, UKab37152Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifugeEppendorf, USA5804RRotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifugeEppendorf, USA5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, USA1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)MP biomedicals, USA160069
Bradford reagentBiorad, USA5000006
CalPhos mammalian Transfection kitClontech, Takara Bio, USA631312Virus stock preparation
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL substrateBiorad, USA1705061chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrateBiorad, USA1705062chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscopeOlympus, JapanModel:FV3000
Cytospin centrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen, USA`15585011
Fetal Bovine SerumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyde 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infectivity assay
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Inverted microscopeNikon, JapanModel: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, USAM8266Infectivity assay
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT reagentSigma-Aldrich, USAM5655Cell viability assay
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255Infectivity assay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24 antigen capture ELISA kitABL, USA5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
Phosphatase InhibitorSigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Lentiviral cloning vector
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope vector
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
Potassium ferricyanideSigma-Aldrich, USA244023Infectivity assay
Potassium ferrocyanideSigma-Aldrich, USAP3289Infectivity assay
Protease InhibitorSigma-Aldrich, USA 5056489001
psPAX2Addgene, USA12260Lentiviral packaging plasmid
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Selection of stable

Referenties

  1. Levy, J. A. HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , ASM Press. (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307(2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855(1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374(2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4(2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536(2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156(2021).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

T celinfectieThioflavine T kleuringUPR markersimmunoblottingRT PCRluciferase reporterassayP24 ELISA
Het meten van endoplasmatisch reticulumstress en ongevouwen eiwitrespons in HIV-1-geïnfecteerde T-cellen en het analyseren van de rol ervan in HIV-1-replicatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.