Dit artikel biedt een procedure voor de affiniteitszuivering van een humaan recombinant eiwit, flap endonuclease 1 (FEN1), dat is gelabeld met een 6X-histidine-tag. Het protocol omvat het gebruik van twee afzonderlijke geïmmobiliseerde metaalionkolommen voor de zuivering van het gelabelde eiwit.
Methodenartikel
Affiniteitszuivering van een 6X-His-gelabeld eiwit met behulp van een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Functionele karakterisering van eiwitten vereist dat ze tot expressie worden gebracht en gezuiverd in substantiële hoeveelheden met een hoge zuiverheid om biochemische tests uit te voeren. Het Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)-systeem maakt scheiding met hoge resolutie van complexe eiwitmengsels mogelijk. Door verschillende parameters in FPLC aan te passen, zoals het selecteren van de juiste zuiveringsmatrix, het reguleren van de temperatuur van het eiwitmonster en het beheren van de stroomsnelheid van het monster op de matrix en de elutiesnelheid, is het mogelijk om de stabiliteit en functionaliteit van het eiwit te garanderen. In dit protocol zullen we de veelzijdigheid van het FPLC-systeem demonstreren om 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) eiwit, geproduceerd in bacterieculturen, te zuiveren. Om de efficiëntie van de eiwitzuivering te verbeteren, zullen we ons concentreren op meerdere overwegingen, waaronder de juiste kolomverpakking en -voorbereiding, monsterinjectie met behulp van een monsterlus, stroomsnelheid van monstertoepassing op de kolom en monsterelutieparameters. Ten slotte zal het chromatogram worden geanalyseerd om fracties te identificeren die hoge eiwitopbrengsten bevatten en overwegingen voor een goede langdurige opslag van recombinant eiwit. Het optimaliseren van eiwitzuiveringsmethoden is cruciaal voor het verbeteren van de precisie en betrouwbaarheid van eiwitanalyse.
Inleiding
Er zijn tal van strategieën beschikbaar om de cellulaire biologie te begrijpen. De ene benadering omvat een top-downstrategie, waarbij genetische mutaties in een gen worden geïntroduceerd, gevolgd door de evaluatie van de resulterende fenotypische veranderingen in een modelorganisme. Omgekeerd houdt een reductionistische benadering de eerste opheldering in van moleculaire mechanismen en enzymatische functies van een bepaald eiwit, vergezeld van de karakterisering van de interacties met andere cellulaire componenten. Vervolgens wordt de impact van dit eiwit op een biologische route beoordeeld. Hoewel elke onderzoeksbenadering zijn inherente voordelen en beperkingen heeft, vereist het bereiken van een alomvattend begrip van een biologische route interdisciplinair onderzoek.
Omdat DNA de genetische blauwdruk van het leven is, is het begrijpen van de mechanismen van DNA-duplicatie en genoomonderhoud al meer dan zeven decennia een gebied van actieve interesse. Studies op het gebied van DNA-replicatie hebben uitgebreide gegevens opgeleverd over de individuele structuren en functies van talrijke replicatie-eiwitten. Deze onderzoeken, die mechanistische aspecten en biochemische activiteitstests omvatten, zijn mogelijk gemaakt door de zuivering van deze eiwitten, waardoor ze nauwgezet kunnen worden onderzocht in een in vitro omgeving. Bijgevolg komt eiwitzuivering naar voren als een onmisbare en alomtegenwoordige techniek in de meeste onderzoeksinspanningen die gericht zijn op het ontrafelen van mechanistische inzichten in DNA-replicatie.
Dit artikel presenteert een methodologie voor het isoleren van een DNA-replicatie-eiwit gelabeld met 6X-histidine, dat tot overexpressie is gebracht in bacteriële cellen. Het eiwit van belang is humaan flap endonuclease 1 (FEN1), een structuurspecifieke nuclease die een cruciale rol speelt bij achterblijvende strengreplicatie en ook een cruciale deelnemer is aan DNA-herstelroutes zoals base excision repair (BER)1,2,3. De primaire functie van FEN1 is het splitsen aan de basis van een 5'-verplaatste flapstructuur, een tussenproduct dat ontstaat tijdens DNA-replicatie of BER. Aanvankelijk suggereerden biochemische onderzoeken die de enzymatische activiteit van FEN1 beoordeelden een "volgmechanisme", waarbij de nuclease het vrije 5'-fosfaatuiteinde van een flapstructuur zou herkennen en vervolgens langs de flap naar de basis zou volgen voordat deze werd gesplitst4. Uit daaropvolgend onderzoek bleek dat FEN1 werkt via een "draadmechanisme", waarbij het zich eerst bindt aan de basis van de flap en vervolgens het vrije 5'-uiteinde door zijn actieve plaats rijgt voorafgaand aan de splitsing (Figuur 1)5. Het vermogen om recombinant FEN1 tot overexpressie te brengen en te isoleren heeft deze doorbraken mogelijk gemaakt, waardoor onderzoekers het kunnen gebruiken in biochemisch en structureel onderzoek.
Affiniteitschromatografie is een veelgebruikte scheidingsmethode om DNA te zuiveren. Deze techniek maakt gebruik van de omkeerbare bindingsaffiniteit van doeleiwitten naar liganden die op een hars zijn geïmmobiliseerd om specifiek het eiwit van belang te vangen. Een van de meest gebruikte bio-affiniteiten is de robuuste interactie tussen het aminozuur, histidine en metaalionen zoals nikkel en kobalt en kan daarom worden opgevangen op een hars geladen met Ni2+ of Co2+.
De DNA-sequentie die codeert voor een reeks van 6-9 histidineresiduen (His) wordt vaak opgenomen in het plasmideconstruct dat codeert voor het eiwit van belang (bij de N-terminus of C-terminus), waarbij het eiwit wordt gelabeld met een 6X-His-tag of een poly-His-tag. Het His-gelabelde eiwit kan vervolgens gemakkelijk worden gezuiverd door geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC), een subtype van affiniteitschromatografie waarbij metaalionen op de hars eiwitten vangen met een affiniteitslabel, die later kunnen worden geëlueerd met behulp van geschikte elutiemiddelen. Overgangsmetaalionen zoals Ni2+ en Co2+ kunnen worden geïmmobiliseerd op agarose- of silicagelmatrices die zijn afgeleid van N,N,N'-tris-(carboxymethyl)-ethyleendiamine of nitrilotriazijnzuur (NTA) groepen6.
Van metaalliganden is bekend dat ze robuust zijn tegen degradatie door fysische, chemische en biologische factoren en dit voordeel hebben ten opzichte van andere soorten liganden 6,7. Bovendien is de His-tag een relatief kleine tag en heeft deze geen significante invloed op de eiwitstructuur of -functie7. In een bacterieel expressiesysteem hebben veel chromosomaal tot expressie gebrachte eiwitten echter affiniteit met metaalionen en kunnen ze samen met het doeleiwit zuiveren. Nikkel en kobalt zijn de typische metaalionen die in IMAC-matrices worden gebruikt. De Ni-NTA-hars en de TALON-hars op kobaltbasis worden vaak gebruikt voor de zuivering van His-gelabelde eiwitten.
Ni-NTA versus TALON
De respectievelijke metaalionen van zowel Ni-NTA als TALON worden geïmmobiliseerd op de hars door middel van NTA-liganden. Ni-NTA wordt verondersteld een hogere bindingscapaciteit te hebben, tot 100 mg/ml eiwit. Dit kan resulteren in een hogere eiwitopbrengst, met het voorbehoud dat verontreinigende eiwitten mede gezuiverd kunnen worden. Daarentegen heeft de hars een hogere bindingsspecificiteit ten opzichte van His-gelabelde eiwitten en kan het mogelijk fracties van hogere zuiverheid produceren. In deze studie willen we de zuiveringsefficiëntie van beide harsen vergelijken met behulp van het geautomatiseerde snelle eiwitvloeistofchromatografiesysteem waarnaar wordt verwezen, het NGC-systeem (zie de materiaaltabel).
Buffers en compatibiliteit
Tijdens de eiwitzuivering zijn buffers nodig voor cellyse, monstervoorbereiding, harsevenwicht en elutie van het gevangen eiwit uit de hars. Tris-, MOPS- en HEPES-buffers tot een concentratie van 100 mM zijn de bekende compatibele buffers voor de Ni-NTA-hars. Buffers bevatten vaak reductiemiddelen om de oxidatie van eiwitten en eiwitaggregatie te voorkomen. Boven een drempelwaarde kunnen reductiemiddelen de hars echter van metaalionen ontdoen. De aanbevolen concentratie van reductiemiddelen zoals bèta-mercaptoethanol (BME) of dithiothreitol (DTT) ligt onder 1 mM voor de bovengenoemde harsen op basis van nikkel en kobalt.
De buffers voor de zuivering van hFEN1 zijn Tris-buffers die NaCl, BME, fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), EDTA en glycerol bevatten. NaCl houdt het eiwit in oplosbare vorm en verstoort moleculaire interacties zoals DNA-binding. BME vermindert geoxideerde eiwitten en voorkomt daardoor eiwitaggregatie. PMSF) is een proteaseremmer die protease-gemedieerde afbraak van doeleiwit voorkomt. EDTA elimineert tweewaardige kationen uit het monster, waardoor hun toegang tot nucleasen en proteasen wordt voorkomen. Glycerol verbetert de stabiliteit van het eiwit in waterige vorm. Bovendien bevat de lysisbuffer complete proteaseremmertabletten om maximale bescherming van het doeleiwit te garanderen tegen afbrekende proteasen tijdens cellyse. De evenwichts- en elutiebuffers bevatten imidazol, waarbij de elutiebuffer grotere hoeveelheden bevat voor de imidazol om het gebonden eiwit van de hars tijdens de elutie te verplaatsen.
Chromatografie van de volgende generatie (NGC) systeem
Dit geautomatiseerde medium-druk chromatografiesysteem, ontworpen voor fast-flow protein liquid chromatography (FPLC), maakt gebruik van twee pompen om tegelijkertijd twee verschillende buffers te pompen en is in staat om een breed scala aan monstervolumes van 250 μl tot 100 ml te injecteren. De monsterlus (in dit systeem bekend als de Dynaloop) maakt het mogelijk om grotere monstervolumes te injecteren. Het systeem kan worden bediend met behulp van de Chromlab-software, die het mogelijk maakt om op maat gemaakte methoden te maken, zuiveringsruns te manipuleren en UV-pieken en eiwitfracties te analyseren.
Protocol
1. Voorbereiding van het monster
- Om recombinant FEN1 te zuiveren, brengt u het construct (pET-FCH-FEN1) tot expressie in BL21(DE3)-cellen zoals eerder beschreven door Ononye et al.8.
- Inoculeer LB-media (tabel 1) met 1% nachtcultuur en laat de cellen groeien bij 37 °C tot de OD 0,6 bereikt.
- Induceren met 0,4 M isopropyl-bèta-D-thiogalactoside (IPTG) en de cultuur nog 3 uur laten groeien.
- Oogst de cellen door de cultuur gedurende 15 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 5.000 × g . Bewaar de pellet in een vriezer van -80°C.
- Haal op de dag van de zuivering de celpellet uit de vriezer van -80 °C, laat deze op ijs ontdooien en resuspendeer de pellet in 100 ml lysisbuffer (tabel 1).
OPMERKING: Het cellysaat moet tijdens het hanteren altijd op ijs worden geplaatst om proteolyse te voorkomen. Eenmaal ontdooid, moet het hele zuiveringsproces op dezelfde dag worden voltooid. Het cellysaat mag niet 's nachts in de koelkast worden bewaard.
- Breng de suspensie over in een bekerglas van 250 ml en sonificeer op ijs met 30 s AAN en 30 s UIT bij 35% amplitude gedurende 15 minuten.
NOTITIE: Raadpleeg de instellingen van de fabrikant om de amplitude te bepalen. - Breng het gesoniseerde monster over in een centrifugebuis en draai het gedurende 30 minuten bij 4 °C bij 27.000 × g om een helder lysaat te verkrijgen. Plaats het cellysaat op ijs in de koelkast van 4 °C tot het monster wordt geïnjecteerd.
2. Affiniteitskolommen voorbereiden
- Monteer de kolommen (één voor de Ni-NTA-hars en één voor de hars op kobaltbasis) op een klemstandaard zodat de kolommen zo recht mogelijk worden gehouden en schuine kolommen worden vermeden. Zorg ervoor dat de onderkant van de kolommen is aangesloten met een stop en voeg 1-2 ml startbuffer toe aan de onderkant van elke kolom om luchtbellen tijdens het inpakken van de kolommen te voorkomen.
- Schud de harsflessen voorzichtig totdat de hars volledig is geresuspendeerd. Open de bovenkant van de kolommen en giet er continu 10 ml van elke slurry in om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Giet de hars tegen een metalen spatel of glazen staaf die aan de rand van de kolom wordt gehouden om luchtbellen in de kolom te voorkomen.
3. Kolomverpakking met behulp van een stroomadapter
- Koppel de stop los van de kolom en sluit de onderkant aan op het ene uiteinde van de slang. Sluit het andere uiteinde van de slang aan op de UV-poort van het FPLC-systeem.
- Zorg ervoor dat de behuizing van de bedsteun in de stroomadapterbehuizing is getrokken en schuif de stroomadapterbehuizing op de bovenkant van de kolom (Figuur 2A). Met de nokkenvergrendeling in positie 1, laat u de stroomadapter zakken en zorgt u ervoor dat u deze niet in de buffer steekt (Figuur 2B). Zet de nokkenvergrendeling in stand 2 (Figuur 2B). Sluit de slang aan op het systeem en start de stroom van de startbuffer gedurende 1-2 minuten om de slang van lucht te ontdoen en luchtbellen tijdens het verpakken te voorkomen.
- Zet de vergrendeling terug in stand 1 en laat de stroomadapter in één vloeiende beweging in de buffer zakken, vermijd het insluiten van luchtbellen, en zet de vergrendeling terug naar stand 2. Dit zorgt ervoor dat er wat buffer in de stroomadapter kan komen en verwijdert eventuele resterende luchtbellen.
- Zet de vergrendeling in stand 3 en draai de nokkenbasis en borgring vast (Figuur 2B).
- Start de bufferstroom bij 10 ml/min om de kolom in te pakken. Ga door met deze stap gedurende 3 minuten of totdat de hars goed is verpakt.
4. Voorbereiden van de monsterlus van het FPLC-systeem
- Sluit de slang vanaf de bovenkant van de samplelus aan op lus E op het FPLC-systeem (Figuur 3).
- Sluit de slang vanaf de onderkant van de monsterlus aan op afval 2 op het FPLC-systeem.
- Steek het ene uiteinde van de slang in de kolompoort van het FPLC-systeem en plaats het andere uiteinde in de afvalfles.
- Plaats de slang van pomp A in gefilterd dubbel gedestilleerd water (ddH2O).
- Dubbelklik op de pompinstellingen met behulp van de software (Figuur 4A, gelabeld 2) en selecteer de systeempompinjecteerlus (Figuur 4C).
- Klik op de instellingen voor het debiet (Figuur 4A, gelabeld 1) en wijzig het debiet in 10 ml/min. Voer 0% in het vak %B in (Figuur 4B).
- Start de stroom om de monsterlus met water door te spoelen, waardoor de glijdende afdichting naar beneden wordt geduwd.
- Zodra de glijdende afdichting de bodem van de monsterlus bereikt, stopt u de stroom. Schakel pomp A van ddH2O naar de startbuffer. Sluit de slang vanaf de bovenkant van de monsterlus aan op Waste 2 en die van de onderkant op Loop E. Laat de slang van de kolompoort in de waste.
- Start de stroom bij 10 ml/min. Zodra de schuifafdichting die door de inkomende startbuffer naar boven wordt geduwd, de bovenkant van de monsterlus bereikt, stopt u de stroom. De monsterlus is nu klaar voor monsterinjectie.
5. Steekproefinjectie
- Dubbelklik op de pompinstellingen en selecteer Handmatige belastingslus (Figuur 4C).
- Schroef de slang los van lus E en plaats deze in de afvalcontainer.
- Sluit de slang van de kolompoort aan op de slang bovenop de stroomadapter.
- Zuig het monster op met een spuit van 30 ml; Sluit vervolgens de spuit aan op de adapter van de injectiepoort.
- Schroef de spuit in de injectiepoort en injecteer het monster, zorg ervoor dat het zichtbaar in de monsterlus wordt geïnjecteerd. Bewaar 100 μL van het monster ( lysaat op het etiket) in een microcentrifugebuis bij -20 °C voor SDS-PAGE-analyse
OPMERKING: Afhankelijk van het totale monstervolume kunnen 2-3 injecties nodig zijn. - Sluit de injectiepoort af met de kolomdop.
- Sluit de slang vanaf de onderkant van de monsterlus terug aan op de Loop E-poort.
- Plaats de slang van pomp B in de elutiebuffer.
6. Creatie en analyse van methoden met behulp van de FPLC-systeemgekoppelde software
- Navigeer naar het tabblad Start en selecteer Nieuwe methode.
- Selecteer het tabblad Methode-instellingen in de linkerkolom, navigeer naar het vervolgkeuzemenu Kolomtype en selecteer Aangepast (Afbeelding 5).
- Voer het kolomvolume in (5 ml).
- Voer het vereiste debiet voor de run in (1 ml/min).
- Navigeer naar Eenheidsselectie en selecteer CV (kolomvolumes) als de basiseenheid van de methode.
- Zorg ervoor dat inlaat A is ingesteld op Buffer A en inlaat B is ingesteld op buffer B (de standaardinstelling).
- Selecteer het tabblad Methodeoverzicht in het menu aan de linkerkant. Voeg de stappen van de zuivering toe in de volgende volgorde: evenwicht, monstertoepassing, kolomwas en elutie.
- Stel onder equilibratie het equilibratievolume in op 10 CV. Zorg ervoor dat de bufferinstelling op 0% B wordt gehouden.
- Stel onder het tabblad Voorbeeldtoepassing het monstervolume in door de monsterlus te observeren. De positie van de glijdende afdichting geeft het monstervolume aan.
- Stel onder kolomwas het wasvolume in op 5 CV. Schakel het verzamelen van breuken uit voor deze stap; Verzamel het wasgoed in zijn geheel in een bekerglas tijdens de run, in plaats van als fracties te verzamelen.
- Stel voor elutie het gradiëntvolume in op 14 CV , beginnend bij 0% Buffer B tot 100% Buffer B.
- Sla de methode op en start de run.
- Zorg ervoor dat de fractieverzamelaar begint op de positie van de eerste fractie.
- Voer de naam van de uitvoering in en klik op Start.
- Bewaak tijdens de evenwichtsfase de real-time UV-curve. Zorg ervoor dat alle verbindingen goed vastzitten en niet leken; Bevestig een volledig circuit door te zoeken naar de buffer die in de afvalcontainer stroomt. Als de UV-curve niet is gestabiliseerd tijdens de laatste minuten van het evenwicht, verleng dan de evenwichtsstap totdat stabilisatie is bereikt (Figuur 6) .
- Vervang op het moment van het aanbrengen van het monster de buisjes die in de afvalcontainer gaan door een schone beker. Verzamel tijdens deze stap de ongebonden eiwitten die uit de afvalbuizen stromen als de doorstroom (label als FT).
- Zoek naar een sterke toename van de UV-curve die waarschijnlijk de maximaal mogelijke waarde van 3.000 maU bereikt (Figuur 6).
OPMERKING: Een typische curve bereikt een plateau van 3.000 maU gedurende het grootste deel van de toepassingsstap van het monster. - Tijdens het wassen van de kolom, terwijl resterende ongebonden eiwitten worden weggespoeld en alleen gebonden eiwitten op de hars achterblijven, moet u letten op een scherpe daling van de UV-curve (Figuur 6). Als de UV-curve aan het einde van de wasstap niet is gedaald, verlengt u de stap door op de vasthoudstap te klikken totdat de UV voldoende is gedaald. Breng aan het begin van deze stap de afvoerbuizen over van het FT-bekerglas naar een ander schoon bekerglas met het label Wash.
- Wanneer de elutiestap begint, zorgt u ervoor dat de fractieverzamelaar in positie beweegt en begint met het verzamelen van breuken. Visualiseer de elutie van eiwit door te zoeken naar pieken in de UV-curve (Figuur 6).
- Navigeer na voltooiing van de uitvoering naar het tabblad Start en selecteer Uitvoeren openen. Open de run om het chromatogram te bekijken en selecteer piekintegratie in het hoofdmenu om de pieken te markeren die tijdens de run zijn verkregen.
- Selecteer het tabblad Breuken om de fracties te visualiseren die geëlueerd eiwit bevatten.
7. Analyse van SDS-PAGINA'S
- Meng 15 μL van elke fractie die eiwit bevat met 5 μL SDS-monsterlaadbuffer (tabel 1). Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 95 °C.
- Laad monsters in geprefabriceerde gels en laat ze 45 minuten op 160 V draaien, samen met de voorgekleurde eiwitmarker.
- Kleur de gels gedurende 30 minuten in Coomassie briljantblauwe kleuroplossing (tabel 1).
- Was de gel in ddH2O (3x herhalen).
- Ontkleur de gel in een ontkleuringsoplossing gedurende 1 uur (tabel 1).
- Let op eiwitbanden; FEN1 detecteren op 42 kDa.
- Poolfracties die FEN1 bevatten en concentreer het zwembad met behulp van een centrifugaalfilter van 10 kDa. Aliquot en bewaren in de vriezer bij -80° C.
Resultaten
BL21 (DE3) cellysaten die hFEN1 tot expressie brengen, werden door evenwichtige Ni-NTA- en TALON-harsen geleid. De Ni-NTA hars is geladen met Ni2+ ionen en heeft een hoog bindingsvermogen. De resultaten laten zien dat de Ni-NTA-hars een hogere hoeveelheid FEN1 oplevert in vergelijking met de TALON-hars (Figuur 7). Van de Ni-NTA-hars is ook bekend dat het niet-specifiek bindt aan andere chromosomaal tot expressie gebrachte eiwitten. Cellysaat passeerde de op kobalt gebaseerde hars, werd gezuiverd met een hoge zuiverheid maar een lagere opbrengst in vergelijking met de Ni-NTA. Net als veel andere DNA-bindende eiwitten, werd FEN1 verder door hars geleid om de onzuiverheden te verwijderen. hFEN1 kan worden geïdentificeerd bij de 43 kDa-markering.
Figuur 1: Flap splijtingsmechanisme door hFEN1: tracking versus threading. Aanvankelijk werd gedacht dat FEN1 (afgebeeld in geel) zich zou binden aan het 5'-uiteinde van de flapstructuur en er doorheen zou lopen naar de flapbasis (links). Latere studies toonden aan dat FEN1 zich eerst bindt aan de basis van de flap en de 5'-flap door zijn actieve plaats rijgt (rechts). Afkorting: hFEN1 = human flap endonuclease 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stroomadapter. (A) Onderdelen van de stroomadapter die wordt gebruikt voor het verpakkings- en zuiveringsproces van kolommen; (B) de drie standen van de nokvergrendeling die wordt gebruikt om de O-ring vast/los te draaien en de adapter op zijn plaats te bevestigen. De ingezoomde afbeelding toont de toestand van de O-ring (los/strak) op posities 1,2 en 3 van boven naar beneden. Foto's zijn gemaakt met toestemming van 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Injectiemodule van het Fast protein liquid chromatography-systeem. De verschillende poorten van de injectiemodule verbinden het snelle eiwitvloeistofchromatografiesysteem met de kolom, de monsterlus en het afval. De foto is gemaakt met toestemming van 10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Systeembesturing. (A) Tabblad Systeembeheer waarin debietinstellingen kunnen worden gemanipuleerd en het stroompad kan worden gezien; (B) venster met instellingen voor het debiet; (C) venster met pompinstellingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Venster met methode-instellingen. Een venster waarin u zuiveringsdetails kunt invoeren, zoals het kolomtype, het kolomvolume, de methodebasiseenheid en het debiet voor de uitvoering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Schema van de UV-curve tijdens FPLC: De UV-curve stijgt en daalt volgens de zuiveringsfase. Aan het begin van de equilibratie kan de UV-curve vervormd raken door de aanwezigheid van luchtbellen of verontreinigingen in de slang. Naarmate het evenwicht voortduurt, zou de curve zich moeten stabiliseren als een vlakke lijn; Tijdens de injectie van het monster, als eiwitten die niet aan de hars zijn gebonden naar buiten stromen, stijgt de UV-curve totdat een maximale drempel is bereikt. De wasstap, die resterende ongebonden eiwitten wegspoelt, vertoont een geleidelijke afname van de UV-metingen. Ten slotte wordt tijdens de elutiefase, wanneer het doeleiwit wordt geëlueerd, een piek gezien in de UV-curve. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: SDS PAGE gel afbeelding. Baan 1 - Markering van moleculair gewicht; Lane: 2-1% Ni-NTA-invoer (cellysaat); Baan 3-1% doorstroming van de Ni-NTA-hars; Lane 4-hFEN1 gezuiverd van Ni-NTA-hars; Rijstrook 5-1% invoer (cellysaat); Baan 6-1% doorstroming van de op kobalt gebaseerde hars; Lane 7-hFEN1 gezuiverd van hars op basis van kobalt; de zwarte pijl stelt FEN1 voor bij 42,5 kDa. Afkortingen: SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat; MW = molecuulgewicht; hFEN1 = menselijke flap endonuclease 1; NTA = nitrilatriazijnzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Buffers en oplossingen | Onderdelen |
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl [pH 8,0] |
| 500 mM NaCl | |
| 1 mM bèta-mercaptoethanol (BME) | |
| 1 mM fenyl-methylsulfonylfluoride (PMSF) | |
| 1 mM EDTA | |
| 1 tablet volledige proteaseremmer | |
| 10 mM imidazol | |
| 10% glycerol | |
| Evenwicht/Was buffer | 50 mM Tris-HCl [pH 8,0] |
| 500 mM NaCl | |
| 1 mM BME | |
| 1 mM PMSF | |
| 10 mM imidazol | |
| 10% glycerol | |
| Elutie buffer | 50 mM Tris-HCl [pH 8,0] |
| 500 mM NaCl | |
| 1 mM BME | |
| 1 mM PMSF | |
| 1 M imidazol | |
| 10% glycerol | |
| Buffer voor het laden van SDS-monsters | 900 μL 4x Laemmli monster buffer |
| 100 μL BME | |
| Coomassie briljant blauwe kleuroplossing | 50% ddH2O |
| 40% Methanol | |
| 10% Azijnzuur | |
| 0.1% Coomassie briljant blauw R-250 | |
| Ontkleuringsoplossing | 50% ddH2O |
| 40% Methanol | |
| 10% Azijnzuur |
Tabel 1: Samenstelling van de buffer.
Discussie
Affiniteitschromatografie is een veelgebruikte techniek om DNA-bindende eiwitten te zuiveren. Geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC) is een specifiek type affiniteitschromatografie waarbij metaalionen worden gebruikt om de histidineresiduen van een peptidesequentie vast te leggen. Dit is de reden waarom de "6X-His tag" of "poly-His tag" wordt bevestigd aan de N-terminus of de C-terminus van te zuiveren eiwitten. Nikkel en kobalt zijn de meest gebruikte metaalionen en variëren in hun compatibiliteit met reagentia zoals BME en DTT die normaal gesproken bij zuivering worden gebruikt. Hoewel zuiveringen zijn uitgevoerd in concentraties van 1 mM BME of DTT, kan het gebruik van deze reagentia nog steeds onbetrouwbaar zijn. Onverenigbaarheid kan worden waargenomen tijdens het evenwicht. Als de buffer die door de hars stroomt bruin van kleur lijkt, duidt dit op oxidatie van de metaalionen en kan het de metaalionen van de hars strippen. Dit zou het bindende vermogen van de hars drastisch kunnen verminderen.
Om een hoge zuiverheid en opbrengst van het eiwit te garanderen, moet de voorkeur worden gegeven aan affiniteitsinteracties tussen metaalionen en de His-tag boven andere mogelijke op lading gebaseerde interacties. Dit zorgt ervoor dat al het eiwit in één keer wordt geëlueerd in plaats van te elueren over verschillende fasen van de elutie. Om dit te bereiken, moet het eiwit tijdens de zuivering een zeer lage lading hebben. Als de pH-waarden van de buffers dichter bij het iso-elektrische punt van het doeleiwit liggen, kan de lading van het eiwit laag worden gehouden. Aangezien het iso-elektrische punt van FEN1 ongeveer 8,8 is, worden onze buffers op pH 8 gehouden.
De Ni-NTA-hars, geladen met Ni-ionen, wordt verondersteld een groter eiwitbindend vermogen te hebben en zal naar verwachting een grotere hoeveelheid eiwit opleveren in vergelijking met de op kobalt gebaseerde hars TALON. Dit betekent ook dat er een groter potentieel is voor de binding van niet-specifieke eiwitten en dus een lagere zuiverheid. De lagere bindingscapaciteit van TALON wordt aangevuld met een hogere specifieke binding en de opbrengst van zeer zuiver eiwit. Dit komt overeen met onze resultaten die een hogere opbrengst van eiwit gezuiverd uit Ni-NTA laten zien in vergelijking met de TALON.
Ongeacht de hars worden de zuiverheid en opbrengst aanzienlijk beïnvloed door de kolomverpakking. Efficiënte verpakking kan worden bereikt met behulp van de flowadapter die is aangesloten op het NGC geautomatiseerde chromatografiesysteem9. Bij voldoende hoge stroomsnelheden kan de stroomadapter de hars effectief inpakken en de ophoping van buffer in de kolom voorkomen. De stroomadapter samen met de NGC zorgt voor een nauwkeurige vergelijking van beide harsen dankzij de regulering van het debiet, de druk en de elutiegradiënt, evenals de efficiënte verzameling van eiwitfracties.
Via de Chromlab-software kunnen de bedrijfsomstandigheden in realtime worden bewaakt10. Het debiet kan op elk moment tijdens de run worden gewijzigd. Tijdens het aanbrengen van het monster kan de systeemdruk de drempel (600 psi) overschrijden. In dit geval kan het verlagen van het debiet tijdens de stap van het aanbrengen van het monster de druk verminderen. De software beschikt ook over een Hold step-functie waarmee elke stap naar wens kan worden verlengd. Deze functie is vooral handig tijdens de stappen voor het wassen en elutie van de kolom. Tijdens het wassen van de kolom wordt verwacht dat de UV-grafiek naar beneden daalt en bijna 0 bereikt - dit betekent dat de meeste ongebonden eiwitten uit de hars zijn weggespoeld. In het geval dat de UV-lijn blijft stijgen of niet daalt, kan de wasstap worden verlengd totdat de verwachte grafiek wordt weergegeven. Op dezelfde manier kan tijdens de elutie de elutie van het doeleiwit worden gevisualiseerd door middel van pieken in de UV-grafiek. Als er onverwacht geen pieken zichtbaar zijn, kan de elutiestap worden verlengd totdat de verwachte pieken worden waargenomen.
Tips en trucs
Tijdens de evenwichtsstap moet de buffer in de kolom worden geïnjecteerd en moet de afvalbuffer continu in de afvalfles worden geloosd; Dit zorgt ervoor dat alle verbindingen strak en lekvrij zijn. In het geval van een lek vanaf een locatie van de NGC, moeten alle poorten rond het gebied worden gecontroleerd, aangezien de oorsprong van het lek kan verschillen van waar het lek wordt opgemerkt. Als de stroom is gestart maar er geen buffer in de kolom komt, is het waarschijnlijk dat er lucht in de slang zit. Leeg het systeem voordat u verder gaat.
Als de tegendruk van het systeem tijdens de injectie weerstand biedt aan de injectie, moet de slang uit lus E worden losgeschroefd en voor de duur van de injectie in de afvalfles worden geplaatst. Het is belangrijk om het terug in lus E te schroeven voordat u het programma start. Als de evenwichtsbuffer of het monster tijdens de run in de kolom wordt verzameld, moet de run worden onderbroken en moet de flowadapter worden verwijderd. De slang moet van de onderkant van de kolom worden losgeschroefd en de buffer of het monster moet erdoorheen kunnen stromen. Als het monster doorstroomt, zorg er dan voor dat u het verzamelt als de doorstroom.
Als fracties die op SDS PAGE-gel worden uitgevoerd hoge niveaus van verontreinigende eiwitten vertonen, kunnen fracties aan weerszijden van de pieken die op het chromatogram worden gezien, worden uitgevoerd. Voor eiwitten met een lage expressie vertonen zuivere fracties vaak geen significante pieken in de UV.
Door de verschillen tussen de eigenschappen van de op nikkel gebaseerde hars en de op kobalt gebaseerde hars te begrijpen, kan de hars worden geselecteerd die het meest geschikt is voor de toekomstige toepassingen van het gezuiverde eiwit. Van eiwitten die in in-vitro biochemische tests worden gebruikt, wordt bijvoorbeeld verwacht dat ze de hoogst mogelijke zuiverheid hebben, een situatie waarin de op kobalt gebaseerde hars geschikt is. Als het eiwit echter wordt gebruikt voor de productie van antilichamen, is een aanzienlijke opbrengst van gezuiverd eiwit vereist voor het proces. De Ni-NTA-hars zou in dit geval een betere optie kunnen zijn. Dit artikel was bedoeld om de verschillen in deze harsen naar voren te brengen door de zuivering van FEN1.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Science Foundation (1929346) en de American Cancer Society (RSG-21-028-01). We willen ook de leden van het Balakrishnan-laboratorium bedanken voor de nuttige discussies.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4x Laemmli sample buffer | BioRad | 1610747 | |
| Azijnzuur | Merck | UN2789 | |
| Beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M-6250 | |
| Chromlab software versie 6.1.27.0 | BioRad | bedient het NGC-systeem | |
| Complete MINI-proteaseremmer tablet | Roche | 11836153001 | |
| Coomassie Briljantblauw R | Sigma | B0149 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Dot Scientific | DSD11000 | |
| Econo-Column glas | BioRad | 7371512 | |
| Ethyleen diamine tetraazijnzuur (EDTA) | Dot Scientific | DSE57020 | |
| Stroomadapter | BioRad | 7380014 | |
| Glycerol | Dot Scientific | DSG22020 | |
| Imidazool | Dot Scientific | DSI52000 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mini PROTEAN TGX-gels | BioRad | 4561084 | |
| NGC Chromatografiesysteem | BioRad | geautomatiseerd vloeistofchromatografiesysteem | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018244 | |
| Fenyl-methyl-sulfonylfluoride | Dot Scientific | DSP20270 | |
| PreScission Plus Protein Dual Color Standards | BioRad | 1610374 | |
| Natriumchloride | Dot Scientific | DSS23020 | |
| TALON-metaalaffiniteitshars | Takara | 635502 | |
| Tris-base | DST60040 |
Referenties
- Balakrishnan, L., Bambara, R. A. Flap endonuclease 1. Annu Rev Biochem. 82, 119-138 (2013).
- Asagoshi, K. FEN1 functions in long patch base excision repair under conditions of oxidative stress in vertebrate cells. Mol Cancer Res. 8 (2), 204-215 (2010).
- Lyamichev, V., Brow, M. A., Dahlberg, J. E. Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases. Science. 260 (5109), 778-783 (1993).
- Bornarth, C. J., Ranalli, T. A., Henricksen, L. A., Wahl, A. F., Bambara, R. A. Effect of flap modifications on human FEN1 cleavage. Biochemistry. 38 (40), 13347-13354 (1999).
- Xu, Y., Potapova, O., Leschziner, A. E., Grindley, N. D., Joyce, C. M. Contacts between the 5' nuclease of DNA polymerase I and its DNA substrate. J Biol Chem. 276 (32), 30167-30177 (2001).
- Wen-Hui, K., Kuo, K., Chase, H. A. Exploiting the interactions between poly-histidine fusion tagsand immobilized metal ions. Biotechnol Lett. 33 (6), 1075-1084 (2011).
- Charlton, A., Zachariou, M. Immobilized metal ion affinity chromatography of native proteins. Methods Mol Biol. 421, 25-35 (2008).
- Ononye, O. E., Njeri, C. W., Balakrishnan, L. Analysis of DNA processing enzyme FEN1 and its regulation by protein lysine acetylation. Methods Mol Biol. 1983, 207-224 (2019).
- Econo-column flow adaptor instruction manual. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M7380014.pdf (2015).
- NGC Chromatography systems and ChromLab software instrument guide version 3.3. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10026252.pdf (2015).
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen