Methodenartikel

Ontwarren van glycaan-eiwitinteracties: nucleaire magnetische resonantie (NMR) om te redden

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66530

⸱

17 mei 2024

 ,  ,  ,  , 
1CIC bioGUNE, Basque Research and Technology Alliance (BRTA), 2lkerbasque, Basque Foundation for Science, 3Centro de Investigacion Biomedica En Red de Enfermedades Respiratorias

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol waarin de verwerving, verwerking en analyse van een reeks NMR-experimenten wordt beschreven die gericht zijn op het karakteriseren van eiwit-glycaaninteracties in oplossing. De meest voorkomende op liganden gebaseerde en op eiwitten gebaseerde methodologieën worden geschetst, die ongetwijfeld bijdragen aan de gebieden van structurele glycobiologie en moleculaire herkenningsstudies.

Samenvatting

De interacties van glycanen met eiwitten moduleren veel gebeurtenissen die verband houden met gezondheid en ziekte. In feite zijn het vaststellen van deze herkenningsgebeurtenissen en hun biologische gevolgen nauw verbonden met de driedimensionale structuren van beide partners, evenals met hun dynamische kenmerken en hun presentatie op de overeenkomstige celcompartimenten. NMR-technieken zijn uniek om deze kenmerken te ontwarren en er zijn inderdaad diverse op NMR gebaseerde methodologieën ontwikkeld en toegepast om de bindingsgebeurtenissen van glycanen met hun geassocieerde receptoren te volgen. Dit protocol schetst de procedures voor het verwerven, verwerken en analyseren van twee van de krachtigste NMR-methodologieën die worden gebruikt op het gebied van NMR-glycobiologie, 1H-Saturation Transfer Difference (STD) en 1 H,15N-Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) titratie-experimenten, die complementair informatie bieden vanuit respectievelijk het glycaan- en eiwitperspectief. Sterker nog, wanneer ze worden gecombineerd, bieden ze een krachtige toolkit voor het ophelderen van zowel de structurele als de dynamische aspecten van moleculaire herkenningsprocessen. Deze alomvattende aanpak vergroot ons begrip van glycaan-eiwitinteracties en draagt bij aan het bevorderen van onderzoek op het gebied van chemische glycobiologie.

Inleiding

Moleculaire herkenning van glycanen is essentieel voor veel processen die verband houden met gezondheid en ziekte. De specificiteit en selectiviteit van biologische receptoren (lectines, antilichamen, enzymen) voor glycanen hangen sterk af van het aanpassen van het precaire evenwicht tussen de diverse componenten van enthalpie (CH-π en van der Waals, waterstofbruggen, elektrostatica) en entropie (hydrofobiciteit, dynamica, solvatie-desolvatie)1.

Gezien de grote chemische diversiteit en dynamische aard van glycanen, worden NMR-methoden al meer dan 25 jaar op grote schaal gebruikt om glycaaninteracties te ontleden2, aangezien deze methodologieën uitstekende informatie verschaffen over moleculaire herkenningsgebeurtenissen met nauwkeurige details, bij atomaire resolutie 3,4, zelfs wanneer het vereiste interactiebewijs niet kan worden verkregen door andere methodologieën te gebruiken. Als belangrijk punt is NMR veelzijdig en maakt het mogelijk om dynamische gebeurtenissen te bestuderen, op atomair niveau, op verschillende tijdschalen, wat verreweg de beste techniek is voor het bestuderen van de structuur, conformatie en dynamiek van glycanen in oplossing. Desalniettemin kan het ontrafelen van deze informatie een vrij complex proces zijn dat het gebruik van goed gedefinieerde strategieën vereist, in combinatie met een zorgvuldige gegevensanalyse5.

NMR-technieken zijn divers en er zijn inderdaad veel methodologieën die kunnen worden gebruikt om glycaan-eiwitinteracties te ontrafelen6. Hierin beschrijven we twee basisbenaderingen van NMR die momenteel worden gebruikt om glycaan-receptorinteracties te ontcijferen 7,8, waarbij de nadruk ligt op het ontwarren van de presentatie van het belangrijkste glycaanepitoop en de eiwitbindingsplaats9.

Bij elke moleculaire herkenningsgebeurtenis, wanneer een receptor zich bindt aan een bepaald ligand, is er een chemisch uitwisselingsproces dat veel NMR-parameters van de deelnemers aan de binding beïnvloedt10. Daarom kan de interactie vanuit het NMR-perspectief worden gevolgd vanuit het oogpunt van het glycaanligand of vanuit dat van de eiwitreceptor11. Over het algemeen is de eiwitreceptor een groot biomolecuul (langzame rotatiebeweging, met snelheden in de ns-tijdschaal, en dus snelle transversale relaxatie), terwijl het interagerende glycaan kan worden beschouwd als een klein tot middelgroot molecuul (snelle rotatiebeweging, met snelheden in de ps-tijdschaal en langzame transversale relaxatie)12. Vanuit een standaardperspectief zijn de NMR-signalen van het glycaan smal, terwijl die van de receptor breed zijn13.

Op ligand gebaseerde NMR-methoden zijn gebaseerd op de dramatische verandering die veel glycaan NMR-parameters ervaren bij het overgaan van de vrije naar de gebonden toestand14. STD-NMR is de meest gebruikte experimentele NMR-techniek om diverse glycaanbindingskenmerken15 te beoordelen, van het afleiden van het bestaan van binding in de oplossingstoestand tot de bepaling van het glycaanbindende epitoop; Dat wil zeggen, de atomen van het ligand die in contact staan met de eiwitreceptor16.

Als alternatief monitoren op receptoren gebaseerde NMR-methoden de veranderingen die plaatsvinden in de signalen van de eiwitreceptor in aanwezigheid van het glycaan ten opzichte van die geregistreerd voor de apo-toestand17. Deze zijn voornamelijk gericht op het screenen van de chemische verschuivingsverstoringen van de eiwitsignalen tussen beide toestanden. Het meest gebruikte experiment is 1 H-15N HSQC, of de TROSY-alternatieven18.

De combinatie van beide benaderingen maakt het mogelijk om NMR toe te passen op veel uiteenlopende systemen die een breed scala aan affiniteiten vertonen. Voor de receptorgebaseerde NMR-methoden moet echter, in tegenstelling tot die op basis van het ligand, een relatief grote hoeveelheid oplosbaar, niet-geaggregeerd, stabiel isotoop-gelabeld (15N) eiwit beschikbaar zijn.

Hierin beschrijven we beide methoden, waarbij we hun sterke en zwakke punten benadrukken. Merk op dat de basisstappen die in het protocol worden beschreven, als voorbeeld dienen voor het gebruik van Bruker-spectrometers. Bijgevolg komen de namen van commando's en parameters overeen met die welke worden gebruikt in TopSpin (de besturingssoftware voor spectrometers van Bruker).

Protocol

1. Verschil in verzadigingsoverdracht NMR (STD-NMR)

OPMERKING: De volgende regels schetsen fundamentele procedures voor het verwerven, verwerken en analyseren van STD-NMR-experimenten. Deze stappen dienen om het nut van de techniek te illustreren voor het detecteren van ligandbinding en voor het ophelderen van het ligandbindingsepitoop. Voor een beter begrip van het ontwerp en de verwerving van NMR-experimenten verwijzen wij u naar de bijbehorende handleiding van de fabrikant die bij het NMR-instrument is geleverd.

  1. Aanwinst
    1. Bereid het monster voor met het eiwit-ligandcomplex. Gebruik glycaan:lectine molaire verhoudingen tussen 10:1 en 100:1 met eiwitconcentraties tussen 0,01 en 0,2 mM. Gebruik voor de interactie van hGalectine-7 met LacNAc de 50:1 eiwit: ligandverhouding in gedeutereerde fosfaatgebufferde zoutoplossing bij pH 7,4.
      OPMERKING: De eiwitreceptor moet zuiver zijn en oplosbaar zijn in de buffer van keuze (in het geval van STD-NMR-experimenten hebben gedeutereerde versies van de overeenkomstige buffer de voorkeur om de mogelijke interferentievan het 1 H NMR-signaal te verminderen). De concentratie van het eiwit wordt vooraf gecontroleerd met behulp van een spectrofotometer om de absorptie bij 280 nm te meten.
    2. Breng uit de bereide oplossing een totaal volume van 0,6 ml over in een NMR-buisje van 5 mm met behulp van een pipet.
    3. Bereid het NMR-instrument voor op de gewenste temperatuur (gebruikelijke experimenttemperaturen liggen tussen 10 °C en 45 °C). Open de temperatuurregelmonitor met het commando edte en stel de gewenste temperatuur in. Voor de hGalectin-7/LacNAc-studie werd de temperatuur ingesteld op 25 °C.
    4. Genereer een nieuwe dataset met de zg-pulssequentie.
      1. Voor een eenvoudige bewerking opent u een bestaand experiment en typt u de opdracht edc . Er verschijnt een dialoogvenster waarin u de titel, de kenmerken (monsterspecificaties, oplosmiddel) en enkele parameters van het experiment definieert.
      2. Als een wijziging van de oorspronkelijke pulssequentie vereist is, navigeert u door de vensters ased (parameters) en AcquPars (acquisitieparameters). Kies nu het gewenste pulsprogramma uit de bibliotheek van de spectrometer.
      3. Voor een standaard 1H NMR-spectrum selecteert u de zg-pulssequentie uit de beschikbare lijst.
        OPMERKING: In het geval van monsters met een verhoogd watergehalte kan het gebruik van wateronderdrukkingsschema's nodig zijn om de signaal-ruisverhouding te verhogen. Het gebruik van pulssequenties zoals zgesgp, die exciterende sculptingmodules die een uitstekende onderdrukking leveren maar de fase van de resterende signalen beheersen, is wenselijk. Raadpleeg de NMR-tutorial van de fabrikant voor meer informatie over soorten wateronderdrukkingsschema's en hun belangrijkste kenmerken.
    5. Plaats het NMR-monster in de sonde door de monsterliftlucht te activeren. Gebruik het ej-commando, plaats het monster op de bovenkant van de magneet en deactiveer de monsterlift met behulp van het ij-commando.
      OPMERKING: Om het monster in de magneet te injecteren met behulp van een autosampler, gebruikt u het commando sx gevolgd door het positienummer, n, dat overeenkomt met de positie van de NMR-buis in de autosampler-tray.
    6. Vergrendel het oplosmiddelsignaal door het commando lock te typen en vervolgens het juiste oplosmiddel in het menu te selecteren.
    7. Zodra het monster in de sonde is geplaatst, voltooit u het afstemmings- en matchingproces met behulp van de automatische module atma of de handmatige module atmm.
    8. Start het automatische shimmen via het topshim gui commando. Dit opent een grafische interface waar shim-dimensie 1D wordt geselecteerd en gestart.
      OPMERKING: Om instabiliteiten van de opvulplaatjes als gevolg van subtiele veld- of temperatuurvariaties tot een minimum te beperken, kan autoshim worden geactiveerd voor het verwerven van het experiment. Dit kan worden gedaan door het BSMS-bedieningsvenster te openen en op autoshim te klikken. Het veranderen in een groene markering geeft aan dat autoshim is geactiveerd. Houd er rekening mee dat bij het gebruik van autoshim mogelijke problemen met de instabiliteit van het monster onopgemerkt moeten blijven. Daarom is voorzichtigheid geboden bij het gebruik van autoshim.
    9. Bepaal de polsslag van 1uur en 90°. Dit kan automatisch worden uitgevoerd door middel van het pulserende commando.
    10. Wijzig verschillende parameters in het AcquPars-venster. Voor een regelmatig 1uur NMR-spectrum stelt u het aantal scans (NS) in op 32 en het gewenste spectrale venster (SW) op ca. 12 persm.
      OPMERKING: De zgesgp-pulssequentie bevat een module voor oplosmiddelonderdrukking om het resterende HDO-signaal te elimineren, dat in het midden van het spectrum moet worden gecentreerd. Hiervoor moet O1 nauwkeurig worden gedefinieerd in AcquPars.
    11. Stel de versterking van de ontvanger in om overlopen te voorkomen met het automatische commando-rga.
    12. Verkrijg nu het standaard 1H NMR-spectrum met behulp van het zg-commando.
    13. Zodra de acquisitie is voltooid, verwerk je het spectrum via de efp-opdracht. Pas de basislijn- en fasecorrecties toe met behulp van de TopSpin-menubalk.
      OPMERKING: 1uur NMR-signalen afkomstig van het glycaan en het eiwit worden waargenomen (Figuur 1). De gedetailleerde analyse van het verworven NMR-spectrum wordt aanbevolen voor de uitvoering van het SOA NMR-experiment, zoals uiteengezet in punt 1.1.14.
    14. Maak een nieuwe dataset en upload de STD NMR-pulssequentie die op dezelfde manier moet worden gebruikt als beschreven voor het 1H NMR-experiment in paragraaf 1.1.4. In Bruker-instrumenten zijn verschillende pulssequenties beschikbaar in de catalogus van pulsprogramma's, allemaal met de naam stddiffXXX. De eenvoudigste (stddiff) bevat geen wateronderdrukkingsschema of eiwitonderdrukkingsfilter.
      1. Voor monsters met een significant H2O-gehalte selecteert u de stddiffgp19- of stddiffesgp-sequenties, die een watergate- of excitatiesculptingmodule bevatten. In het geval van een spectrum met intense proteïne NMR-signalen als achtergrond, selecteert u de stddiffXXX.3-sequenties. Optimaliseer in elk geval de overeenkomstige specifieke parameters voor elke wateronderdrukkingsmodule (d.w.z. d19 in watergate-schema's).
    15. Definieer de uit- en aan-resonantiefrequenties voor het STD NMR-experiment. Zoek de frequentielijst in de AcquPars-parameters van het ased-venster onder de FQ2LIST-invoer. De gedefinieerde on-resonantie- en off-resonantiefrequenties in Hertz moeten handmatig in de lijst worden geschreven en onder een nieuwe naam worden opgeslagen. Deze nieuwe lijst zal worden gebruikt in het SOA-NMR-experiment.
      1. Kies de on-resonantiefrequentie in een spectraal gebied zonder glycaansignalen, meestal rond δ (1uur) 0 of 6,6 ppm, voor typische glycanen (Figuur 1). Stel de off-resonantiefrequentie in op een gebied dat geen ligand of eiwitproton vertoont. Het kan veilig worden ingesteld op +18000 of -18000 Hz.
    16. Definieer de gevormde puls die moet worden gebruikt tijdens de verzadigingstijd in de AcquPars-parameters van het ased-venster .
      LET OP: Er zijn veel mogelijkheden. De Gauss- of Eburp-vormen kunnen veilig worden gebruikt, met een breedte van 90° van de selectieve puls van 50 ms.
    17. Stel de bijbehorende parameters in de sectie AcquPars in.
      1. Stel de pulsduur van 1uur en 90° in.
      2. Stel de vermogenswaarde in voor de gevormde puls (geschat met het vormgereedschap).
      3. Stel de totale verzadigingstijd in. Waarden tussen 1 s en 4 s kunnen regelmatig worden gebruikt.
      4. Stel de ontspanningsvertraging in op 3 s.
      5. Stel het aantal scans (NS) in op een veelvoud van 8. Meestal wordt het ingesteld op 256, 512 of 1024 om de juiste signaal-ruisverhouding te krijgen in sets van 2 op elke frequentie.
      6. Stel het aantal dummyscans (DS) in op 8.
      7. Stel het aantal punten in F2 in op 16k, 32k of 64k.
        OPMERKING: Een verhoogd aantal punten in F2 zal resulteren in een verbeterde resolutie en signaal-ruisverhouding. Om die reden is het sterk aan te raden om minimaal 16k datapunten te gebruiken.
      8. Stel het aantal punten in F1 in. Dit is het aantal te gebruiken frequenties, in dit geval 2 (de aan-resonantie en de uit-resonantie).
        OPMERKING: Volgens afspraak verwijst F2 naar de directe dimensie, de dimensie waarlangs het vrije inductieverval (FID) rechtstreeks wordt bemonsterd, terwijl F1 de indirecte dimensie aangeeft.
      9. Stel de versterking van de ontvanger (RG) in om overlopen te voorkomen met het automatische commando rga.
    18. Bereken de tijd van het totale experiment met behulp van het commando expt.
    19. Verzend het experiment voor acquisitie via de zg-opdracht.
    20. Controleer altijd of het experiment na een paar minuten goed wordt uitgevoerd.
  2. Verwerking
    OPMERKING: Een pseudo-2D-spectrum wordt verkregen na toepassing van het hierboven beschreven protocol. Het aantal rijen komt overeen met het aantal gebruikte frequenties, meestal twee: de aan-resonantie en de uit-resonantie.
    1. Verwerk de fid voor het eerste experiment.
      1. Maak de Fouriertransformatie van het fid-nummer 1 (via het efp-commando) en selecteer de bestemming van de verwerkte spectra (selecteer procno-nummer). U kunt ook het commando rser 1 gebruiken om de eerste fid te lezen.
      2. Pas vervolgens de lijnverbredingsfactor aan via het lb-commando (meestal 3-5 Hz) en de fase. Om handmatig te faseren, klikt u op het tabblad Proces en vervolgens op het submenu fase aanpassen . Voer nul- en eerste-ordecorrecties uit door op de bijbehorende knop te klikken en te slepen. Sla de faseringsresultaten op. Voer daarnaast basislijncorrectie uit via het commando abs.
    2. Lees de fid voor het tweede experiment, en maak de Fouriertransformatie (via het efp-commando) met dezelfde lijnverbredingsfactor. Pas de fase aan met dezelfde faseparameters en basislijncorrectie en sla het verwerkte spectrum op met een andere code.
    3. Lees de twee bewerkte spectra af met de meervoudige functie (commando: .md) en trek ze af (off-resonantie - on-resonantie) met behulp van de knop die beschikbaar is in de meervoudige visualisatie (Δ). Het nieuwe spectrum is het STD NMR-spectrum, dat met een andere code wordt opgeslagen.
    4. Maak een superpositie van het STD NMR-spectrum met het off-resonantiespectrum.
      1. Open het off-resonantiespectrum (fid 1) en typ de .md-opdracht om het venster met meerdere displays te openen. Upload vervolgens het SOA-spectrum.
      2. Vergelijk de frequenties en intensiteiten (automatisch weergegeven in de rechterbovenhoek) van de signalen in het STD NMR-spectrum. Dit geeft de gewenste informatie over die protonen die dicht bij het eiwit staan en hun relatieve nabijheid. Hoe hoger de relatieve intensiteit, hoe dichter ze bij het eiwit staan (figuur 2).
    5. Meet de intensiteiten (integralen) in het off-resonantie-experiment met behulp van de bijbehorende software. Ga in TopSpin naar Analyseren > integreren. Definieer de regio's en schrijf de integralen in een bestand (I0).
    6. Meet de intensiteiten (integralen) in het STDNMR-experiment met dezelfde parameters en schrijf ze in een bestand (I STD).
    7. Bereken de STD-waarde voor elk protonsignaal met behulp van de volgende vergelijking:
      SOA = (ISOA)/I0.
      OPMERKING: OPMERKING: Het gebruik van signaalintegratie voor het berekenen van STD-waarden vereist dat protonsignalen voldoende gescheiden zijn. Wanneer signaaloverlap optreedt, zoals bij oligosachariden, kunnen STD-waarden worden bepaald door de signaalintensiteitsverhouding tussen de SOA- en off-resonantiespectra te beoordelen.
    8. Bereken de relatieve SOA als een percentage. Om dit te doen, geeft u een waarde van 100% aan het proton dat het maximale verschil vertoont tussen de intensiteiten in de off-resonantie en het STD NMR-spectrum. Bereken de relatieve SOA-intensiteiten voor de andere protonen dienovereenkomstig.
      OPMERKING: Een goede analyse van STD-gegevens, vooral voor het bepalen van ligandbindend epitoop, vereist de volledige toewijzing van 1H-signalen van het ligand. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om deze taak te voltooien vóór de verwerving van de SOA-spectra.

2. 1 H-15N HSQC-experimenten

OPMERKING: De volgende regels beschrijven het gebruik van 1 H-15N HSQC-experimenten om de veranderingen in de chemische verschuivingen van de 1H en 15N NMR-resonanties van de receptor (lectine) te volgen als reactie op de aanwezigheid van toenemende hoeveelheden van de ligand (oligosacharide)19. De Chemical Shift Perturbation (CSP) analyse op basis van de geëxtraheerde data is zeer waardevol voor het identificeren van bindingspartners, maar ook voor het in kaart brengen van de eiwitbindingsinterface en het bepalen van bindingsaffiniteiten. Voor een beter begrip van het ontwerp en de verwerving van NMR-experimenten verwijzen wij u naar de bijbehorende handleiding van de fabrikant die bij het NMR-instrument is geleverd.

  1. Acquisitie en verwerking
    1. Bereid het monster voor met de lectine van interesse. Zorg ervoor dat de receptor volledig 15N gelabeld is in elk aminozuurresidu, zowel in de ruggengraat als in de zijketens. Om de wateruitwisselbare HN-kruispieken in het spectrum te detecteren, gebruikt u doorgaans een 90:10 mengsel van H2O: D2O om de gebufferde oplossing te bereiden. De benodigde lectineconcentraties liggen tussen 0,05 en 0,2 mM, afhankelijk van de beschikbaarheid van de 15N-gelabelde receptor en de benodigde signaal-ruisverhouding.
      OPMERKING: Het eiwit moet gedurende de gehele experimentele tijd stabiel zijn zonder zichtbare vorming van precipitaat in de NMR-buis. Bovendien moet het zuiver en oplosbaar zijn in de geselecteerde buffer. De volledige toewijzing van 1uur en 15N van de HSQC-kruispieken had eerder moeten worden uitgevoerd, zodat elke kruisklep in het HSQC-spectrum wordt geïdentificeerd met een label dat overeenkomt met het specifieke aminozuurresidu.
    2. Breng vanuit dit preparaat een totaal volume van 0,6 ml over in een NMR-buis van 5 mm.
    3. Stel het NMR-instrument in op de gewenste temperatuur. Zie stap 1.1.3 en volg dezelfde handelingen.
    4. Maak een nieuwe gegevensset. Zie stap 1.1.4 en herhaal de handelingen.
    5. Plaats het NMR-monster in de sonde zoals beschreven in stap 1.1.5.
    6. Vergrendel het oplosmiddelsignaal. Om de vergrendelingsprocedure te starten, gebruikt u de opdrachtvergrendeling en selecteert u het juiste oplosmiddel in het menu. Het sluitsignaal kan worden getraceerd in het vergrendelingsvenster. Stel de vergrendelingsversterking zo in dat het vergrendelingssignaal zichtbaar is in het vergrendelingsvenster.
    7. Voltooi het afstemmings- en matchingproces automatisch (via het commando atma) of handmatig (het atmm-commando opent het ATM-bedieningsvenster om de wiebelcurve aan te passen).
    8. Stel de optimale vulplaatjes in met behulp van de TopShim-tool. Gebruik het commando topshim gui. Zie de instructies in stap 1.1.8.
    9. Bepaal de pulslengte van 1H 90° (zoals beschreven in stap 1.1.9) en de offsetfrequentie (het commando o1calib voert een interactieve O1-kalibratieroutine uit en haalt de offsetfrequentie op). Deze laatste parameter is uiterst belangrijk wanneer experimenten met oplosmiddelonderdrukkingsschema's worden gebruikt.
    10. Maak een nieuwe gegevensset zoals beschreven in paragraaf 1.1.4. Om de interferentie van het H2O-signaal te verminderen of te elimineren, gebruikt u de pulssequentie zgesgp.
    11. Stel het experiment in door verschillende parameters in het AcquPars-venster te wijzigen.
      1. Introduceer de pulslengte en offset (o1) van 1H 90° zoals eerder bepaald, en stel het aantal scans (NS) in op 32 en het spectrale venster (SW) op ongeveer 12 ppm.
      2. Bepaal het vermogensniveau van de gevormde puls met behulp van het vormgereedschap dat beschikbaar is in de Topspin-menubalk.
      3. Stel de versterking van de ontvanger in met het automatische commando rga.
    12. Verkrijg het experiment met behulp van het zg-commando en verwerk de resulterende FID om het 1H NMR-spectrum te verkrijgen.
    13. Maak een nieuwe dataset die moet worden gebruikt voor het verkrijgen van het 1 H-15N HSQC NMR-experiment. Selecteer op het tabblad AcquPars het pulsprogramma hsqcetfpf3gp dat beschikbaar is in de catalogus van pulsprogramma's.
    14. Stel het experiment in. Laad de standaardvormen, bevoegdheden en tijden met behulp van de opdracht getprosol. Werk vervolgens de waarden van de pulslengte en offset van 1H 90° bij.
    15. Definieer de volgende parameters.
      1. Stel de ontspanningsvertraging in op 1-5 s.
      2. Stel het aantal scans in op een veelvoud van 4. Meestal is het ingesteld op 8, 16, 32 of 64 om de juiste signaal-ruisverhouding te krijgen.
      3. Stel het aantal dummyscans in op 128.
      4. Stel het aantal punten in F2 in op 1k, 2k of 4k.
      5. Stel het aantal punten in F1 in: het aantal t1 stappen dat moet worden gebruikt. Afhankelijk van het spectrale venster ligt dit tussen 128 en 256.
      6. Pas het midden van het spectrale venster in de dimensie 15N aan op δ 117 ppm en stel de bijbehorende spectrale breedte in op 36 ppm. Deze waarden moeten voor elk specifiek systeem worden geoptimaliseerd.
      7. Stel de versterking van de ontvanger in om overloop te voorkomen (met behulp van het rga-commando )
    16. Bereken de tijd van het totale experiment. Een typische experimentele tijd is ongeveer 1 uur.
    17. Typ zg om het experiment ter acquisitie te verzenden.
      OPMERKING: Controleer altijd of het experiment na een paar minuten goed wordt uitgevoerd.
    18. Verwerk de FID met behulp van het commando xfb. Voer de basislijncorrectie uit met behulp van het commando abs2 en fasecorrecties op het tabblad Proces. Om handmatig te faseren, klikt u op het submenu fase aanpassen en selecteert u vervolgens verschillende dwarspieken van de 2D-spectra. Pas vervolgens achtereenvolgens nul- en eerste-ordecorrecties toe op zowel rijen als kolommen door op de bijbehorende knop te klikken en te slepen. Sla de faseringsresultaten op.
    19. Sla het resulterende 2D-spectrum op.
    20. Bereid een sterk geconcentreerde stockoplossing van de ligand voor. Typische waarden zijn 50-100 mM.
    21. Breng vanuit de sterk geconcentreerde voorraadoplossing van het glycaan het overeenkomstige volume (enkele microliters) over naar de NMR-buis met de receptor om de gewenste eiwit-ligandmolaire verhouding te krijgen en de spectra vast te leggen.
      OPMERKING: Met deze stap wordt de titratiereeks gestart, waarbij de ligand in het eiwitmonster wordt getitreerd. Voor elk afzonderlijk geval moeten de juiste eiwit-ligandverhoudingen worden bepaald. Als de bindingsaffiniteit volledig onbekend is, wordt aanbevolen om substoichiometrische hoeveelheden van het ligand in de beginpunten te gebruiken.
    22. Voer de stappen 2.1.1 tot en met 2.1.19 uit voor het nieuw voorbereide monster.
    23. Herhaal stap 2.1.21 en 2.1.22 voor monsters met toenemende eiwit-ligandverhoudingen.
      OPMERKING: Voor een nauwkeurige aanpassing van de gegevens van de titratiereeks is het noodzakelijk om meerdere 1 H-15N-HSQC-experimenten uit te voeren, die een breed scala aan eiwit-ligandverhoudingen bestrijken, inclusief de factoren die nodig zijn om eiwitverzadiging te bereiken.
  2. Analyse
    1. Visualiseer het verwerkte 2D HSQC-spectrum voor de apo-soorten met behulp van de juiste software: TopSpin, MestReNova en CCPNMR zijn allemaal geschikte programma's voor het verwerken van NMR-gegevens.
      OPMERKING: Dit is het vingerafdrukspectrum van het eiwit. De waargenomen chemische verschuivingen van 1H en 15N zijn afhankelijk van de overeenkomstige chemische omgeving van elk aminozuur, die sterk afhankelijk is van de 3D-structuur van het eiwit. Dit spectrum wordt het eiwitvingerafdrukspectrum genoemd. Een goed verspreid 2D 1 H-15N HSQC-spectrum waarin alle kruispieken uniforme intensiteiten vertonen, suggereert sterk de aanwezigheid van een goed gevouwen eiwit19.
    2. Genereer de lijst met frequenties van 1uur en 15N voor alle dwarspieken. Het gebruik van aanvullende software, zoals het CCPNMR-programma20, kan daarbij helpen.
    3. Leg het spectrum voor de eerste of tweede titratiepunten op dat voor het apo-eiwit.
      1. Om dat te doen, opent u het 2D-spectrum dat overeenkomt met de apo-toestand, klikt u op het tabblad Meerdere weergaven en voegt u vervolgens het tweede 2D-spectrum toe. De visuele inspectie van beide spectra geeft informatie over het bestaan van interactie tussen het ligand en het eiwit.
        OPMERKING: Vanuit het perspectief van het eiwit zorgt het bestaan van binding voor veranderingen in de chemische omgeving van de aminozuren die direct betrokken zijn bij de herkenningsgebeurtenis, met de bijbehorende chemische verschuivingsverstoringen (CSP).
    4. Herhaal de stappen 2.2.2 en 2.2.3 voor elk titratiepunt en genereer lijsten met defrequenties 1 H en 15N voor alle kruispieken in de verschillende spectra, die overeenkomen met verschillende eiwit-ligand molaire verhoudingen.
      OPMERKING: De chemische verschuivingen op elk titratiepunt kunnen worden gemeten zonder dat er een nieuwe cross-peak-toewijzing hoeft te worden uitgevoerd. In het geval van een snel uitwisselingsregime, dat vaak wordt waargenomen bij interacties tussen lectine en glycaan, kan men eenvoudigweg de progressieve beweging van pieken tijdens de titratie volgen.
    5. Controleer of er voor het laatste titratiepunt in principe geen chemische verschuivingsverstoringen zijn ten opzichte van de vorige toevoeging. Dit feit is een indicatie dat de eiwitbindingsplaats verzadigd is met het ligand, dat in hoge mate is.
    6. Bereken de maximale chemische verschuivingsverstoringen (maxCSP) met behulp van de onderstaande vergelijking:
      figure-protocol-1
      ΔH en ΔδN zijn de chemische verschuivingsverschillen in de frequenties 1H en 15N tussen respectievelijk de apotoestand en het laatste titratiepunt.
    7. Plot de maximale chemische verschuivingsverstoringen (maxCSP) in de verticale y-as van een 2D-plot versus het bijbehorende aminozuurresidu (in de horizontale x-as).
    8. Voer een visuele inspectie uit van de aminozuurresiduen die de maximale CSP weergeven tussen de gebonden en de apo-toestanden van het eiwit. Het is zeer waarschijnlijk dat ze tot de bindingsplaats behoren of er buren van zijn.
    9. Als de 3D-structuur van het eiwit beschikbaar is, open dan de bijbehorende PDB met de juiste software zoals PyMOL of BIOVIA Discovery studio. Deze moleculaire visualisatieprogramma's worden veel gebruikt in toepassingen in de structurele biologie. Selecteer de residuen die de hoogste maxCSP vertonen (meer dan tweemaal de standaarddeviatie) met een bepaalde kleur om de vermeende bindingsplaats te lokaliseren.
    10. In het geval van een sneluitwisselingsregime, schat de dissociatieconstante (KD) op basis van een niet-lineaire kleinste-kwadratenpasvorm van de waargenomen CSP voor de 1 H-15N HSQC-kruispieken op elk punt (Δδ obs) versus de specifieke eiwitconcentratie [P] en ligand [L] op dat punt:
      figure-protocol-2
      OPMERKING: Deze vergelijking kan worden toegepast op die dwarspieken die duidelijke geïsoleerde signalen weergeven. De verkregen waarden worden gemiddeld om de schatting van KD te geven.

Resultaten

Hierin presenteren we een protocol voor de exploitatie van 1H-STD NMR en 1 H-15N HSQC-experimenten om de details van de bindingsinteractie tussen lectines en kleine oligosachariden te ontrafelen. De resultaten verkregen in de analyse van de moleculaire herkenning van LacNAc door hGalectin-7 (hGal-7) zijn opgenomen en dienen als een illustratief voorbeeld van de succesvolle implementatie van het protocol en de effectiviteit van deze NMR-methodologieën om de fijne details van het moleculaire herkenningsproces te bestuderen. Figuur 3 toont het 1H-STD NMR-spectrum voor de interactie van LacNAc met hGal-7. Het bestaan van STD NMR-signalen duidt op binding (Figuur 3A). Bovendien verschijnen alleen die signalen die behoren tot protonen die in nauw contact staan met het eiwit, waardoor het bindende epitoop kan worden afgebakend (Figuur 3B). Figuur 4 laat zien hoe het 1 H-15N HSQC-spectrum van een eiwit als vingerafdruk kan worden gebruikt, en figuur 5 illustreert de toepassing van 1 H-15N heteronucleaire enkele kwantumcoherentie (HSQC) titratie-experimenten om de chemische verschuivingsverstoring van hGalectine-7-ruggengraatamidegroepen bij LacNAc-binding te definiëren. Deze gegevens onthullen niet alleen het bestaan van interactie, maar schetsen ook de bindingsinterface van het lectine. Figuur 6 laat zien hoe de analyse van de titratiegegevens het mogelijk maakt om de bindingsaffiniteit van LacNAc te schatten door hGalectine-7, dat in het hoge micromolaire bereik valt. Deze bevinding komt overeen met resultaten die zijn verkregen met behulp van alternatieve technieken.

figure-results-1
Figuur 1: De selectie van de on-resonantiefrequentie. 1H-NMR-spectrum van LacNAc:hGal-7 50:1 verhouding in gedeutereerde fosfaatgebufferde zoutoplossing bij pH 7,4 wordt weergegeven. Signalen van de ligand (LacNAc) zijn beperkt in het gebied tussen 2,0-5,2 ppm. De verzadigingsfrequentie is zorgvuldig geselecteerd om de afwezigheid van ligandprotonen binnen een bereik van 1-2 ppm te garanderen, waardoor de protonen van het eiwit selectief kunnen worden bestraald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Het SOA NMR experiment. Schematische weergave van het SOA-experiment: het eerste spectrum (off-resonantie) dient als referentie, terwijl in het tweede (on-resonantie) eiwitverzadiging wordt uitgevoerd. De verzadiging wordt efficiënt verspreid over het hele eiwit en overgebracht naar de ligandprotonen die in nauw contact staan met het eiwit. Het resulterende verschilspectrum (STD-spectrum) levert alleen die resonanties op die verzadiging hebben ervaren. De analyse van het SOA-experiment maakt het mogelijk om de epitoop van de bindende suiker in kaart te brengen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Bindingsanalyse vanuit het perspectief van de ligand. (A) Superpositie van de off-resonantie en 1H STD-NMR spectra voor de interactie van LacNAc met hGal-7. In het SOA-spectrum verschijnen alleen die signalen die behoren tot protonen die in nauw contact staan met het eiwit. De annotatie van de 1H-resonanties van de ligand wordt gerapporteerd in het off-resonantiespectrum. (B) De relatieve SOA-intensiteiten werden gekleurd in kaart gebracht in de chemische structuur van LacNAc. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Het 1 H-15N HSQC-spectrum van een eiwit vertegenwoordigt zijn vingerafdruk. (A) 1 H-15N HSQC-spectrum van 100 μM van hGal-7 in de apo-vorm. Het spectrum werd geregistreerd bij 25 °C. Sommige NH-kruispieken werden geannoteerd met het label van hun overeenkomstige aminozuur. (B) Elk NH-paar vertoont een unieke chemische verschuiving die afhangt van de chemische omgeving en bijgevolg van de 3D-structuur van het eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Bindingsanalyse vanuit het perspectief van het eiwit. (A) Superpositie van de 1 H-15N HSQC-spectra die zijn opgenomen voor de titratie van LacNAc in hGal-7-oplossing wordt getoond. Inspectie van de spectra, waar verschillende kruispieken chemische verschuivingsveranderingen ondergaan, geeft duidelijk interactie aan. (B) De grafiek van de maximale chemische verschuivingsverstoringen (maxCSP) van de ruggengraatamidesignalen afgeleid uit de titratie van LacNAc (15 equivalenten) met hGal-7. (C) De meest verstoorde aminozuren van hGal-7, volgens de CSP-analyse, worden in kaart gebracht in de 5gal PDB-structuur. In het 3D-model verwijst de rode kleur naar een CSP-waarde van meer dan 2σ, terwijl de roze naar waarden tussen 1σ en 2σ verwijst. Het gekleurde gebied vertegenwoordigt waarschijnlijk de bindingsplaats. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6:K-D-bepaling op basis van 1 H-15N HSQC-titratie-experimenten. (A) Weergave van het patroon van 1 H-15N HSQC-gebaseerde titratie afhankelijk van de chemische wisselkoers in de NMR-tijdschaal van het systeem in het onderzoek (snel, gemiddeld of langzaam). Een snel uitwisselingsregime werd waargenomen in het geval van LacNAc/hGal-7-interactie. (B) Fittingcurve en KD-schatting verkregen uit de CSP-analyse bij variërende ligandconcentraties voor het modelsysteem van hGal-7 en LacNAc-disacharide. De geschatte KD wordt gerapporteerd met de bijbehorende fout als een gemiddelde van de gegevens voor 20 verschillende aminozuren; (C) Fragmenten van de 1 H,15N-HSQC-spectra die de verschuiving van geselecteerde dwarspieken tijdens de titratie weergeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Verschil in verzadigingsoverdracht NMR (STD-NMR) is de meest gebruikte en veelzijdige NMR-methode geworden voor het bestuderen van ligand-eiwitinteracties. Zoals hierboven aangetoond, is het gebaseerd op het fenomeen van de verzadigingsoverdracht, en de experimentele opzet omvat de verwerving van twee eendimensionale (1D) 1H-spectra: de on-resonantie- en de "off-resonantie"-spectra. Tijdens het resonantie-experiment wordt verzadiging van specifieke protonen van het eiwit bereikt door gedurende een bepaalde periode een reeks radiofrequente pulsen met een laag vermogen toe te passen (de verzadigingstijd varieert doorgaans van 1-3 s). Om directe verzadiging van het ligand te voorkomen, worden de frequentie en lengte van de verzadigingspulsen geoptimaliseerd voor het selectief bestralen van specifieke protonen van het eiwit; d.w.z. ze moeten worden aangebracht op een frequentie die vrij is van ligandsignalen en met een passende lengte (Figuur 1). Als vuistregel geldt dat voor verzadigingspulsen van 50 ms een verschil van 1 ppm moet worden aangehouden tussen het verzadigingsgebied en de dichtstbijzijnde ligandsignalen. Over het algemeen zorgen selectieve verzadigingspulsen die op het alifatische gebied van het eiwit worden aangebracht voor verhoogde verzadigingseffecten. Als alternatief kunnen aromatische protonen (6-7 ppm) ook worden bestraald als het ligandmolecuul geen aromatische signalen bevat. Dit is erg handig voor natuurlijk voorkomende glycanen, omdat ze geen aromatische groepen dragen. Zodra een bepaald gebied van het eiwit selectief wordt bestraald, plant de verzadiging zich langs het eiwit voort via dipolaire 1 H-1H kruisontspanning (spindiffusie). Uiteindelijk bereikt de verzadiging de eiwitprotonen op de bindingsplaats, die vervolgens wordt overgebracht naar de suikerprotonen die in nauw contact staan (r < 5 Å) met de receptor via intermoleculaire 1 H-1H NOE's. Het is duidelijk dat de intensiteit van de signalen van de verzadigde ligandprotonen afneemt. Na ontvangst van de verzadiging dissociëren de tijdelijk gebonden liganden (snelle uitwisseling is vereist) als gevolg van de bindingskinetiek en wordt de verzadigingsinformatie geaccumuleerd in de vrije toestand. Als gevolg van dit proces vertonen de NMR-on-resonantiespectra verminderde signalen (Figuur 2).

Om deze intensiteitsverstoring van de 1H-kernen van een bindend glycaan duidelijk aan te tonen, wordt een NMR-spectrum van controleprotonen (off-resonantie) verkregen waarin de verzadiging ver weg van een receptor of koolhydraatsignaal wordt toegepast (meestal tussen 40-100 ppm), onder dezelfde omstandigheden. Het afgetrokken 1D-spectrum tussen de off-resonantie en de on-resonantie toont uitsluitend de signalen van de 1H-kernen van de ligand die gewijzigde intensiteiten hebben: die welke dicht genoeg bij de receptorbindingsplaats waren om de magnetisatie te ontvangen (Figuur 2).

Desalniettemin krijgen niet alle 1H-kernen van het gebonden koolhydraat dezelfde hoeveelheid verzadiging. Theoretisch is de magnetisatieoverdracht van de receptor naar het gebonden ligand afstandsafhankelijk (1/r6). Dit betekent dat de intensiteiten van de overgedragen verzadiging tussen de glycaan 1H-kernen informatie bevatten over de ruimtelijke nabijheid tussen de protonen van de ligand en die van de receptor, en dat de SOA NMR-intensiteiten groter zijn voor die protonen die zich dichter bij de receptor bevinden. Dienovereenkomstig maakt het STD NMR-experiment het ook mogelijk om het bindingsepitoop van het koolhydraat te bepalen (Figuur 2 en Figuur 3), aangezien protonen van het ligand die dichter bij het eiwitoppervlak zitten, hogere intensiteiten vertonen dan protonen die niet direct deelnemen aan de binding.

Het experiment kan worden toegepast op systemen met een zwak-gemiddelde affiniteit, zelden op systemen met sterke affiniteiten in het lage μM- of nM-bereik. Het vereist inderdaad dat de dissociatiesnelheid snel is in de ontspanningstijdschaal. Anders gaat de informatie over de verzadigingsoverdracht verloren door ontspanning voordat het ligand dissocieert.

Aan de andere kant zijn op eiwitten gebaseerde NMR-experimenten uniek voor het ontrafelen van ligand-eiwitinteractie met nauwkeurigheid op aminozuurniveau zonder de atomaire resolutiestructuren op te lossen. Het onderzoekt direct moleculaire herkenningsverschijnselen in oplossing zonder de noodzaak van co-kristallisatie. Het in kaart brengen van CSP-analyse is uitzonderlijk krachtig voor het ontdekken van liganden en het in kaart brengen van de eiwitbindingsplaats (Figuur 4 en Figuur 5). Deze methode is van toepassing op elk bereik van affiniteiten tussen het mM- en nM-bereik, zelfs voor systemen waar de wisselkoers traag is in de chemische verschuivingstijdschaal21.

Toch zal deze aanpak waarschijnlijk niet werken voor eiwitten met een molecuulgewicht boven 30-40 kDa vanwege relaxatieproblemen. Het TROSY-alternatief18 kan dan worden gebruikt, dat bijzonder krachtig is in combinatie met eiwitdeuteratie. Bovendien moet het eiwit uniform worden gelabeld met 15N (en een ander monster dubbel gelabeld met 13C en 15N om de vereiste ruggengraattoewijzing te kunnen voltooien). Daarom moeten de condities voor eiwitexpressie, inclusief het bijbehorende expressiesysteem, worden geoptimaliseerd om milligrammen eiwit te kunnen verkrijgen. Eiwitten die de neiging hebben om te oligomeriseren of te aggregeren, zijn ook niet geschikt voor deze analyse. Het instrument dat hierin wordt gebruikt om de NMR-gegevens vast te leggen, is een Bruker 800 MHz-spectrometer die is uitgerust met een TCI-cryoprobe. Het zou een grote uitdaging zijn om deze methodologie te gebruiken met behulp van instrumenten onder de 600 MHz of zonder een cryogene sonde.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Agencia Estatal de Investigación uit Spanje voor de Severo Ochoa Center of Excellence Accreditation CEX2021-001136-S, gefinancierd door MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, en CIBERES, een initiatief van Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madrid, Spanje). We danken ook de Europese Commissie voor het GLYCOTWINNING-project.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5 mm Shigemi microtube set matCortecNet SASS30BMS-005B
Alpha-Lactose-AgaroseSigma-Aldrich Química S.L.7634-5ML
Ammonium chloride (15 N, 99%)LC-0179-N-50GTracer Tecnologías Analíticas S.L
Ampicillin (Sodium Salt) Melford Laboratories LTDA40040
BIOVIA Discovery studio BIOVIA, Dassault Systèmes
BL21(DE3) Chemically Competent Cells Merck Life Science, S.L.U.CMC0014-40X40UL
CentrifugeBeckman CoulterAllegra X-22R
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-1000
IncubatorEppendorfInnova 42
IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside)VWR International Eurolab S.L.VW437144N
LacNAcElicitylGLY008
Luria Bertani (LB) BrothMerck Life Science, S.L.U.3397-1KG
Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC VWR International Eurolab S.L.214-1137
PBS 10xBio-Rad1610780
PyMOLPyMOL Molecular Graphics SystemVersion 2.0 Schrödinger
SonicatorSonics & Materials, Inc.VC 505
Superconducting NMR magnetBruker600 MHz AVANCE III
Superconducting NMR magnetBruker800 MHz AVANCE III

Referenties

  1. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  2. Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution. Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).
  3. Kogelberg, H., Solís, D., Jiménez-Barbero, J. New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).
  4. Widmalm, G. Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy. JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).
  5. Marchetti, R., et al. 34;Rules of Engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).
  6. Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy. Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).
  7. Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).
  8. Cañada, F. J., et al. Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR. Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).
  9. Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans. ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).
  10. Jiménez-Barbero, J., Asensio, J. L., Cañada, F. J., Poveda, A. Free and protein-bound carbohydrate structures. Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).
  11. Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
  12. Roldós, V., Cañada, F. J., Jiménez-Barbero, J. Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR. Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).
  13. Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J., Millet, O. NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions. Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).
  14. del Carmen Fernández-Alonso, M., Díaz, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Cañada, J., Jiménez-Barbero, J. Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).
  15. Angulo, J., Nieto, P. M. STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach. Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).
  16. Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
  17. Williamson, M. P. Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).
  18. Fernández, C., Adeishvili, K., Wüthrich, K. Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).
  19. Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. Solution NMR in structural genomics. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).
  20. Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis. J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).
  21. Gimeno, A., et al. Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).

Herprints en machtigingen

Tags

NMR spectroscopieverzadigingsoverdrachtsdifferentiechemische verschuivingsperturbatieeiwit ligandcomplexmoleculaire herkenningglycobiologieHSQC titratiegalectinebindingstructurele dynamiek
Ontwarren van glycaan-eiwitinteracties: nucleaire magnetische resonantie (NMR) om te redden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.