Methodenartikel

Productie van Adeno-geassocieerde vectorbatches met hoog rendement met behulp van HEK293-suspensiecellen

DOI:

10.3791/66532

⸱

26 april 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Regeneration of Sensorimotor Systems, Netherlands Institute for Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), 2Centre for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol gepresenteerd, wat resulteert in minder tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie met behulp van componenten die beschikbaar zijn voor onderzoeksdoeleinden van commerciële leveranciers.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV's) zijn een opmerkelijk hulpmiddel voor het onderzoeken van het centrale zenuwstelsel (CZS). Innovatieve capsiden, zoals AAV. PHP.eB, demonstreren uitgebreide transductie van het CZS door intraveneuze injectie bij muizen. Om een vergelijkbare transductie te bereiken, is een 100 keer hogere titer (minimaal 1 x 1011 genoomkopieën/muis) nodig in vergelijking met directe injectie in het CZS-parenchym. In onze groep, AAV-productie, inclusief AAV. PHP.eB vertrouwt op adherent HEK293T cellen en de drievoudige transfectiemethode. Het bereiken van hoge opbrengsten van AAV met aanhangende cellen brengt een arbeids- en materiaalintensief proces met zich mee. Deze beperking leidde tot de ontwikkeling van een protocol voor celkweek op basis van suspensie in conische buizen. AAV's gegenereerd in aanhangende cellen werden vergeleken met de productiemethode van de suspensie. Cultuur in suspensie met behulp van transfectiereagentia polyethylenimine of transit werd vergeleken. AAV-vectoren werden gezuiverd door ultracentrifugatie met jodixanolgradiënt, gevolgd door bufferuitwisseling en concentratie met behulp van een centrifugaalfilter. Met de adherente methode bereikten we een gemiddelde van 2,6 x 1012 genoomkopieën (GC) in totaal, terwijl de suspensiemethode en polyethylenimine in totaal 7,7 x 1012 GC opleverden en TransIt in totaal 2,4 x 1013 GC opleverde. Er is geen verschil in in vivo transductie-efficiëntie tussen vectoren geproduceerd met adhesief in vergelijking met het suspensiecelsysteem. Samenvattend wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol geïntroduceerd, wat resulteert in een verminderde hoeveelheid tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie, terwijl 3 tot 9 keer hogere opbrengsten worden bereikt met behulp van componenten die beschikbaar zijn bij commerciële leveranciers voor onderzoeksdoeleinden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adeno-geassocieerd virus (AAV) werd ontdekt in 1965 en is sindsdien gebruikt in een groot aantaltoepassingen1. AAV's zijn toegepast in neurowetenschappelijk onderzoek om gen- en neuronale functies te bestuderen, neurocircuits in kaart te brengen of diermodellen voor ziekte2 te produceren. Traditioneel wordt dit gedaan door rechtstreeks op de plaats van belang te injecteren, aangezien de meeste natuurlijke serotypen de bloed-hersenbarrière niet passeren of een hoge dosis nodig hebben om dit te doen 1,2,3.

Met de ontdekking van AAV. PHP.B4 en capsiden van de volgende generatie, zoals AAV. PHP.eB5 en AAV. CAP-B106, is het mogelijk om het centrale zenuwstelsel (CZS) aan te pakken met behulp van een eenvoudige systemische injectie. Ruimtelijke toewijzing onthult de cellen waarop AAV zich richt. PHP.eB op cellulair niveau 6,7. In combinatie met specifieke promotors/enhancers bieden deze capsiden uitgebreide mogelijkheden voor neurowetenschappers om genen en hersenfunctie te bestuderen door middel van niet-invasieve AAV-afgifte 4,8.

Terwijl een lagere dosis nodig is voor AAV. PHP.eB (typisch 1 tot 5 x 1011 genoomkopieën (GC)/muis) in vergelijking met AAV9 (4 x 1012 GC/muis)7, moet er nog meer vector worden geproduceerd in vergelijking met directe injectiestrategieën (meestal 1 x 109 GC/μL injectie). De meeste natuurlijke serotypen kunnen worden geproduceerd met behulp van het klassieke aanhangende celkweeksysteem in combinatie met jodixanolzuivering 9,10,11,12. Voor AAV. PHP.eB dit houdt een arbeidsintensief proces in om cellen te kweken en te transfecteren om voldoende vectoren te verkrijgen voor één experiment8. Daarom werd de productie van AAV in suspensiecelkweek in conische buizen ontwikkeld. Conische buizen, met een capaciteit tot 300 ml, zijn compact, waardoor zowel couveuseruimte als kunststoffen worden bespaard. Suspensiecellen zijn veel gemakkelijker te kweken en in grote hoeveelheden te hanteren dan hechtende cellen op platen van 15 cm. De transfectiecomponenten van het protocol blijven hetzelfde. Daarom kunnen plasmiden die eerder met het aanhangende systeem werden gebruikt, gemakkelijk in dit protocol worden gebruikt op basis van productie in suspensiecellen. Het protocol werd met succes overgedragen aan andere onderzoekers in het laboratorium en met succes gebruikt voor verschillende capsiden en constructen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik van de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen (KNAW) en waren in overeenstemming met de Nederlandse Wet op de dierproeven onder projectnummer AVD8010020199126. In figuur 1 wordt een schematisch overzicht gegeven van het volledige protocol. Van het zaaien van cellen tot AAV-zuivering, het protocol duurt 6 dagen om te voltooien.

1. Bereiding van reagens

  1. Plasmide zuivering
    1. Voer plasmide-extractie uit zoals beschreven door de fabrikant met een paar aanpassingen om de steriliteit van de plasmiden te garanderen.
    2. Bereid 70% ethanol met steriel gedestilleerd water en absolute ethanol.
    3. Droog na de isopropanolcentrifugatiestap de plasmiden in de kap van de stroomkast en voeg steriele 70% ethanol toe aan de buisjes. Droog de plasmiden na het neerslaan van de ethanol in de kap van de stroomkast en resuspendeer het plasmide in steriel gedestilleerd water. Zorg ervoor dat u gesteriliseerde microcentrifugebuisjes gebruikt.
    4. Neem een aliquot voor kwantificering, restrictieanalyse en, indien nodig, sequencing. Het wordt aangeraden om de integriteit van de omgekeerde terminale herhalingen (ITR's) te controleren, aangezien mutaties een negatieve invloed kunnen hebben op de opbrengst. Stel de monsterconcentratie in op 1 μg/μL.
  2. Bereiding van 10x Tween lysis buffer
    1. Los 30,3 g Tris-buffer en 2,033 g MgCl2,6H 2O op in 400 ml steriel gedestilleerd water, stel de pH in op 8,0 en verhoog het totale volume tot 450 ml.
    2. Houd Tween 20 steriel, voeg 50 ml Tween 20 toe aan de bufferoplossing in de kap en filter steriliseer met een vacuümfilter van 0.2 μM.
  3. Verdunningen van jodixanol
    1. Iodixanol-oplossing wordt geleverd in een concentratie van 60%. Gebruik de startoplossing om oplossingen van 15%, 25% en 40% te maken.
    2. Verdun voor 15% oplossing 60 ml 60% oplossing met 48 ml 5 M NaCl en 48 ml PBS-MK (5x PBS met 5 mM MgCl2 en 12,5 mM KCl) en voeg gedestilleerd water toe tot 240 ml.
    3. Verdun voor 25% oplossing 67 ml 60% oplossing en 32 ml PBS-MK. Voeg gedestilleerd water toe tot 160 ml. Meng goed en voeg 1,6 ml fenolrode oplossing toe.
    4. Verdun voor 40% oplossing 160 ml 60% oplossing met 48 ml PBS-MK en voeg gedestilleerd water toe tot 240 ml. Voeg voor 60% oplossing 1 ml fenolrood toe aan 100 ml 60% oplossing.
  4. PBS 5% sucrose-oplossing
    1. Voeg 25 g sucrose toe aan een fles DPBS van 500 ml zonder calcium of magnesium. Goed schudden en filteren met een vacuümfilter van 0,2 μM.
  5. Polyethyleenglycol (PEG) 8000-oplossing
    1. Los 400 g PEG 8000 en 24 g NaCl op in steriel gedestilleerd water en stel in op een eindvolume van 1000 ml. Roer met verwarming tot het volledig is opgelost. Stel de pH in op 7,4 met behulp van pH-papier.
    2. Filter steriliseer met een vacuümfilter van een fles van 0,2 μM om een 40% PEG 8000-oplossing te verkrijgen. Houd er rekening mee dat de filtratie enige tijd zal duren vanwege de viscositeit van de oplossingsopslag bij 4 °C.

2. Kweek van HEK293-suspensiecellen

  1. Gebruik doekjes gedrenkt in 70% ethanol voor het schoonmaken. Reinig de bioveiligheidskap, bereid en reinig alle materialen die nodig zijn voor het kweken van cellen.
  2. Verwarm 30 ml suspensiecelmedium voor tot 37 °C in een conische kweekbuis van 50 ml. Haal virale productiecellen uit vloeibare stikstof. Ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37 °C. Vlak voordat de injectieflacon volledig is ontdooid, reinigt u deze met een doekje gedrenkt in 70% ethanol en brengt u de injectieflacon over in de bioveiligheidskap.
    OPMERKING: De details van de virale productiecellen die hier worden gebruikt, staan in de materiaaltabel.
  3. Breng de cellen snel over naar de voorverwarmde conische kweekbuis van 50 ml. Kweekcellen in een schudincubator bij 37 °C, 80% luchtvochtigheid, 8% CO2, 200 omwentelingen per minuut (RPM) en een schuddiameter van 50 mm. Doorgangscellen, zodra de levensvatbaarheid hoger is dan 90% en de celdichtheid hoger is dan 1-3 x 106 cellen/ml.
    OPMERKING: De gebruikte incubator heeft een schuddiameter van 50 mm; De kweekomstandigheden moeten worden aangepast voor een andere schuddiameter.
  4. Passage cellen 3-4 dagen na ontdooien. Controleer de kweekbuis(jes) om er zeker van te zijn dat er geen tekenen van besmetting zijn; Schimmel verschijnt bijvoorbeeld als een verkleurde (zwarte of groene) ring.
  5. Bereid 400 μl 0,4% trypanblauwe oplossing per monster met behulp van een strip van 1 ml.
  6. Haal snel suspensiecellen uit de couveuse. Onmiddellijk 500 μL uit de buis extraheren met behulp van een stripette van 1 ml. Zachtjes op en neer spuiten.
  7. Voeg 100 μL celsuspensie toe aan de voorbereide blauwe trypanbuis. Keer de buis voorzichtig om om te mengen; Pipt niet om te mengen, omdat dit zal leiden tot celdood. Breng de cellen terug naar de incubator.
  8. Neem 50 μL trypanblauw-behandelde celsuspensie en breng deze aan op het hemocytometerglaasje. Tel het totale aantal levensvatbare cellen en bereken de hoeveelheid celsuspensie en medium die nodig is voor passage of transfectie de volgende dag.
  9. Verwarm medium in de incubator gedurende 10-15 min. Voeg celsuspensie toe aan het verwarmde medium en keer terug naar de incubator. Voor passerende cellen gedurende 3 dagen (d.w.z. maandag-donderdag), ingesteld op 0,5 x 106 cellen/ml; voor passaging-cellen gedurende 4 dagen (d.w.z. donderdag-maandag), ingesteld op 0,3 x 106 cellen/ml.
    OPMERKING: Volgens de fabrikant verdubbelen de virale productiecellen elke 26 uur en moeten ze tussen 3,5 x 106 en 5,5 x 106 zijn voordat ze passeren. Cellen kunnen tot doorgang 20 worden bewaard.

3. Transfectie

  1. Dag 1
    1. Kweek 24 uur voor transfectie 1 x 106 cellen per/ml in 300 ml media.
  2. Dag 2
    1. Verwarm medium, plasmiden en transfectiereagens tot kamertemperatuur. Voor de op te stellen bedragen, zie tabel 1.
    2. Kort vortex plasmiden en reagentia. Voeg plasmiden toe aan het voorbereide medium, vortex. Voeg kort transfectiereagens en vortex toe. Roer het mengsel na deze stap niet meer om. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Tel in de tussentijd de cellen die op dag 1 zijn voorbereid. Cellen moeten tussen de 2 en 2,5 x 106 cellen per ml zijn en > 95% levensvatbaar.
    4. Voeg na de incubatie druppelsgewijs het transfectiemengsel toe aan de cellen terwijl u de buis voorzichtig ronddraait. Incubeer gedurende 72-96 uur.

4. Oogsten van de cellen

  1. Dag 5
    1. Voeg 33 ml 10x cellysisbuffer (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2) toe, meng door voorzichtig te schudden en incubeer bij 37 °C gedurende 1,5 uur met schudden.
    2. Centrifugeer op 3428 x g bij 4 °C gedurende 60 min. Filtreer door een 0.45 μM PES-vacuümfilter om het cellysaat te zuiveren, waarbij het geklaarde lysaat in de container van het filter blijft.
      OPMERKING: Optioneel na filtratie: neem 50 μL monster voor kwantitatieve-PCR (Q-PCR).
    3. Voeg 90 ml 40% PEG 8000-oplossing toe aan 360 ml gefilterd cellysaat.
    4. Reinig de roerstaaf met 70% ethanol en voeg toe aan het monster. Roer op ijs of in de koelcel op 300 RPM gedurende 1 uur. Incubeer bij 4 °C zonder een nacht te roeren.
      OPMERKING: Incubatietijden van 1 uur tot 72 uur zijn getest. Langere incubatietijden hebben een negatief effect op de totale eiwitprecipitatie.

5. Reiniging van jodixanol

  1. Dag 6
    1. Breng het volledige PEG-geprecipiteerde kweekvolumemonster over in een schone, grote conische buis en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2820 x g en 4°C.
    2. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de PEG-pellet in 15 ml DPBS met calcium en magnesium. De pellet is moeilijk te resuspenderen; Neem de tijd om dit zorgvuldig te doen.
    3. Breng het geresuspendeerde deel over in een schone buis van 50 ml. PEG blijft aan de zijkanten van de bioreactorbuis. Voeg 10 ml extra toe en zorg ervoor dat al het PEG-neerslag wordt verzameld. Breng alles over in een container van 50 ml voor een totaal volume van 25-30 ml.
    4. Voeg 40 μL DNaseI (10 E/μL) toe. Zet 1 uur 37°C in de couveuse.
      OPMERKING: Optioneel na incubatie van DNase: neem 50 μL monster voor Q-PCR.
    5. Reinig roerstaven die werden gebruikt voor PEG-neerslag goed met chloride-oplossing gevolgd door 70% ethanol. Laat roerrepen in 70% ethanol staan voor het volgende experiment.
    6. Vul een polyallomeerbuisje van 25 mm x 89 mm met behulp van een glazen pasteurpipet met 15,5 ml geconcentreerd cellysaat in elk buisje. Vervang na het toevoegen van cellysaat de glazen pasteurpipet voor een nieuwe.
    7. Voeg jodixanoloplossingen van 15%-60% toe: laat 9 ml van de 15% jodixanoloplossing voorzichtig onder het cellysaat trekken. Voeg vervolgens 5 ml van de 25% en 40% jodixanoloplossingen toe en voeg ten slotte 5 ml van de 60% jodixanoloplossing toe.
    8. Vul de tube af met een spuit met DPBS +/+ om de meeste luchtbellen te verwijderen, zorg ervoor dat de jodixanollagen niet worden verstoord. Sluit de buis af met een elektrische buistopper.
    9. Centrifugeer in een niet-zwenkende rotor gedurende 1 uur en 10 minuten bij 490.000 x g bij 16 °C in een ultracentrifuge. Haal uit de ultracentrifuge, monteer de buizen in een metalen sluiting en bereid verzamelbuizen voor. Open de rotor in de kap in geval van morsen tijdens het centrifugeren.
    10. Bereid een slang van 50 ml (voor het weggooien van de rotorbuis), een buis van 15 ml (voor het opvangen van virus), een spuit van 5 ml en een naald van 30 g en 19 g per gradiënt voor.
    11. Prik met een 30G-naald een gaatje in de bovenkant van de buis. Laat de naald op zijn plaats. Plaats een naald van 19 G op de spuit.
    12. Prik voorzichtig in de buis net onder de 40%/60%-interface, die te zien is aan de fenolrode indicator. Zorg ervoor dat de afschuining van de naald naar de 40%-laag wijst.
    13. Verwijder de 30G-naald van de bovenkant van de buis met de niet-dominante hand. Met de naald afgeschuind, zuigt u langzaam het virus/jodixanol op. Het doel is om tussen de 3 ml en 4,5 ml te extraheren. Ongeveer halverwege en ver in de 40%/heldere laag, draai de naald zodat de afschuining naar beneden wijst en blijf extraheren om te voorkomen dat de eiwitlaag zich verzamelt.
    14. Bereid de slang van 50 ml voor met de niet-dominante hand, trek de naald voorzichtig uit terwijl u de buis in de buis van 50 ml plaatst en gooi deze weg. Verdun de AAV/iodixanol suspensie 5x in DPBS door tot 15 ml te vullen.
    15. Breng over naar een centrifugaalfilterbuis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3428 x g, 4 °C. Gooi de doorstroming weg; Verwijder voorzichtig de houder van het filter en kiep de onderste container in een afvalfles. Voeg 15 ml PBS-5% sucrose toe om te filtreren en te resuspenderen.
    16. Centrifugeer bij 3428 x g bij 4 °C gedurende 20 min. Bufferwissel minimaal 3x herhalen. Bewaar virus (~150-250 μL) bij 4 °C (PHP. B-varianten maximaal 3 maanden) of aliquot in aliquots van 50 μl en langdurig bewaren bij -80 °C.
      LET OP: PHP. B-capside-varianten zijn gevoelig voor bevriezing/dooi, dus dit moet worden vermeden.
    17. Voer titratie uit zoals beschreven in een eerder protocol10.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meeste academische laboratoria gebruiken adherent HEK293T cellen voor AAV-productie 8,9. Hoewel dit relatief goed werkt wanneer kleine hoeveelheden AAV nodig zijn voor directe injectie, is een 100 keer hogere titer (minimaal 1 x 1011 GC/muis) nodig om een vergelijkbare transductie te bereiken met systemische capsiden zoals AAV. PHP.eB.

In dit protocol werd de productie van AAV vastgesteld met behulp van suspensiecellen van HEK293 gekweekt in conische buizen. Kleinschalige culturen kunnen worden gedaan in buisjes van 50 ml en grootschalig in buisjes van 600 ml. Voor specifieke shakers (zie Materiaaltabel) kan een rek worden gebruikt waarin tot 16 grote buizen tegelijkertijd kunnen worden gekweekt. Dit rek wordt gebruikt in combinatie met speciale inzetstukken voor slangen van 50 ml (Figuur 2A). Dit systeem biedt een aanzienlijke tijdswinst voor het kweek- en transfectiesegment van dit protocol. De eerste opzet van de productie werd gedaan met reporterconstructen voor luciferase en groen fluorescerend eiwit (GFP)10,11. Tegelijkertijd werd de GFP-constructie geproduceerd in platen van 12, 15 cm2 zoals beschreven in een eerder gepubliceerd protocol12. Gemiddeld werd een opbrengst van 7,7 x 1012 GC totaal bereikt met polyethylenimine (PEI) en 2,4 x 1013 GC met TransIt (Figuur 2B). Voor PEI is dit een bijna 3-voudige verbetering; voor TransIt is het een 9,2-voudige verbetering ten opzichte van titers verkregen met adherente cultuur (2,6 x 1012). Wanneer TransIt wordt gebruikt om suspensiecellen te transfecteren, geeft het ongeveer een 3-voudige verbetering van de opbrengst in vergelijking met PEI (Figuur 2B).

Vervolgens werden de prestaties van de AAV-vectoren in vivo getest. GFP-vectoren werden geproduceerd met PEI en TransIt en vergeleken met GFP-vectoren geproduceerd met het klassieke aanhangende systeem. 4 weken na injectie werden muizen (6 weken C57BL/6 vrouwelijke muizen met een gewicht van 20-25 g) geofferd en werd de GFP-expressie in de hersenen van muizen geëvalueerd door middel van histologie (Figuur 3A). Vergelijkende analyse werd uitgevoerd op sagittale hersensecties. Er werd geen verschil waargenomen in het transductiepatroon van het virus dat met behulp van deze productiemethoden werd geproduceerd (figuur 3B). De luciferase-activiteit van de vectoren die met behulp van beide methoden werden geproduceerd, werd ook beoordeeld. Transductie werd gedurende 3 weken in vivo gemeten; het expressiepatroon in de loop van de tijd is vergelijkbaar, ongeacht welk transfectiereagens wordt gebruikt (figuur 4).

Vervolgens werd het protocol getest en geïmplementeerd door andere leden van het team (tabel 2). De productie van andere capsiden met PEI was succesvol en leverde een gemiddelde opbrengst op van 3,5 x 1012 GC-vectoren. Voor de productie van capside B10 kan een 3-voudige verbetering worden bereikt door gebruik te maken van TransIt versus PEI. Voor een ander project gaven verschillende constructen verpakt in AAv.PHP.eB een gemiddelde opbrengst van 3,7 x 1012, wat voldoende is om 7 muizen intraveneus te injecteren met een dosis van 5 x 1011 GC per muis. Deze resultaten illustreren dat het protocol door verschillende onderzoekers met succes kan worden gebruikt voor verschillende capsiden- en constructcombinaties.

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch overzicht van de productie. Op dag 1 (D1) worden cellen gekweekt in buisjes van 300 ml. Op dag 2 (D2) worden cellen getransfecteerd met de relevante plasmiden. Op dag 5 (D5) worden cellen geoogst en gelyseerd met behulp van een 10x tween lysisbuffer. Na lysis worden celresten verwijderd door centrifugeren. Vervolgens wordt het cellysaat gefilterd om grote eiwitten te verwijderen en wordt het AAV-virus neergeslagen met behulp van polyethyleenglycol (PEG) 8000. Op dag 6 (D6) worden de jodixanolzuivering en -concentratie uitgevoerd. Het PEG-concentraat van de vorige dag wordt behandeld met DNase en daarna door een jodixanolgradiënt geplaatst. De gezuiverde vectoren worden vervolgens ontzouten en geconcentreerd met behulp van een centrifugaalfilter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Incubatoropstelling en AAV-opbrengsten. (A) Virale productiecellen worden gekweekt in een schudincubator met een schuddiameter van 50 cm. Deze incubator is uitgerust met een adapterplaat voor slangen van 600 ml en speciale inzetstukken voor slangen van 50 ml geproduceerd door de afdeling mechatronica. (B) Na de eerste opzet construeert de reporter met behulp van polyethyleenimine (PEI; 7,7 x 1012 GC totaal, n=5) of TransIt (2,4 x 1013 GC totaal, n=5) als transfectiemethode en vergeleken met de opbrengsten die worden behaald met de klassieke aanhankelijke methode (2,6 x 1012 GC totaal, n=5) zoals beschreven in Verhaagen et al.12. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: GFP-expressiepatroon na in-vivo-evaluatie . (A) Schematische weergave van een typisch AAV-vectorconstruct met de alomtegenwoordige promotor CMV immediate-early enhancer, chicken β-actine promoter en rabbit β-Globine splice acceptor site (CAG) gevolgd door groen fluorescerend eiwit (GFP), het Woodchuck Hepatitis Virus (WHV) Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE) en een polyadenylatiestaart (pA)13. Hier kregen vrouwelijke muizen van 6 weken oud (n=3) een staartaderinjectie met 5 x 1011 totale genomische kopieën (gc)/muis. 4 weken na injectie werden muizen geofferd en werden de hersenen geanalyseerd door middel van histologie. (B) Representatieve weergave van het transductiepatroon in sagittale secties, waarbij gebruik wordt gemaakt van aderende HEK293T-cellen en suspensiecellen met polyethyleenimine (PEI) of TransIt-transfectiereagens, waarbij een soortgelijk transductiepatroon wordt waargenomen, ongeacht de gebruikte productiemethode. Schaalbalk = 1000 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Vergelijkbare luciferase-activiteit, ongeacht de transfectiemethode. (A) Schematische weergave van het gebruikte construct met de alomtegenwoordige promotor CMV immediate-early enhancer, chicken β-actine promoter en rabbit β-Globine splice acceptor site (CAG) luciferase (LUC) met een V5-tag en een boviene groeihormoon polyadenylatiestaart (BGHpA), 5 x 1011 GC totaal/muis (n=3) werd geïnjecteerd via de staartader, luciferase-activiteit in het schedelgebied (rood omcirkeld, in voorbeeldafbeelding) als bioluminescent beeld werd wekelijks gemeten. (B) Bioluminescente activiteit werd gemeten als relatieve luminescentie-eenheden (RLU) afgebeeld als een blauwe balk voor PEI-productie en een bruine balk voor TransIt. Er werd geen significant verschil in luciferase-activiteit in het geselecteerde hersengebied waargenomen tussen de groepen. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Transfectieparameters. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Opbrengsten van het geïmplementeerde protocol. Suspensieprotocol dat door andere onderzoekers wordt gebruikt om AAV te produceren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemische toediening van AAV is een krachtig hulpmiddel voor genoverdracht naar het CZS; de productie van AAV is echter een duur en arbeidsintensief proces. Door gebruik te maken van suspensiecellen worden arbeid en kunststoffen verminderd in vergelijking met de hechtende cultuur van HEK293T op platen van 15cm2 . Bovendien zijn de hier geïmplementeerde conische buizen gemakkelijk te hanteren en maximaliseren ze het gebruik van de laboratoriumruimte. Het protocol is opgezet door twee onderzoekers en vervolgens toegepast door anderen in het lab. Een reeks producties door drie onafhankelijke onderzoekers leverde gemiddeld genoeg vectoren per batch op om 6-7 muizen te injecteren.

Het gebruik van HEK293 suspensiecellen is eerder beschreven 13,14. De beschreven suspensiecellijn is echter niet vrij beschikbaar voor onderzoeksdoeleinden. Dit is een knelpunt voor academische onderzoekers bij het toepassen van de beschreven methoden. De in dit protocol beschreven suspensiecellijn is vrij beschikbaar voor onderzoeksdoeleinden. De kweek van suspensiecellen werd gedaan in conische buizen in plaats van erlenmeyers om ruimte en tijd te besparen. Met Erlenmeyer's kunnen tot 4 producties tegelijkertijd worden gekweekt, tegenover 12 producties met conische buizen. Conische buizen kunnen direct naar de centrifuge worden overgebracht om te oogsten.

Een alternatieve mogelijkheid voor een suspensiecelkweeksysteem is het baculovirale systeem. Een voordeel van het baculo-systeem is dat deze cellen en media openbaar beschikbaar zijn en gemakkelijk kunnen worden toegepast. Voor academici zijn repositories zoals Addgene beschikbaar, die een grote bibliotheek van kant-en-klare AAV-transferplasmiden12 bevatten. Hoewel deze ook kanttekeningen kunnen hebben, zoals defecte ITR's, dienen ze als een goede bron voor plug-and-play-experimenten. Er is gekozen voor een op HEK293 gebaseerd productiesysteem, omdat beschikbare plasmiden direct kunnen worden gebruikt voor productie zonder de overdracht van het construct naar het baculovirus.

Voor transfectie is polyethyleenimine relatief goedkoop en is daarom het transfectiereagens bij uitstek. Als alternatief werd een nieuwe transfectiemethode (TransIt) geëvalueerd om de opbrengst van vectoren te verhogen. Een drievoudige verbetering werd waargenomen bij gebruik van de helft van de hoeveelheid plasmiden. Dit maakt TransIt een interessant alternatief transfectiereagens wanneer grotere voorraden nodig zijn. Een beperking hiervan zijn de kosten, waardoor het voor kleine batches minder interessant is.

Samengevat wordt hier een protocol gepresenteerd dat kan worden gebruikt om AAV met een hoog rendement te produceren in suspensiecellen in een academische laboratoriumomgeving. Er worden hulpmiddelen beschreven die in een academische laboratoriumomgeving kunnen worden gebruikt om AAV met een hoge opbrengst te produceren.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een gratis sample van TransIT werd door Mirus ter beschikking gesteld voor de eerste test, waarna het reagens werd aangeschaft voor verder gebruik. De auteurs hebben geen andere concurrerende financiële belangen te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het onderzoeksfonds van de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen (KNAW) en een subsidie van Start2Cure (0-TI-01). Wij danken Leisha Kopp voor haar inbreng en advies bij het opzetten van het protocol. Figuren zijn gemaakt met behulp van Biorender.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50PkBeckman Coulter342414
Adapter 600 mL conische buizen, voor rotor S-4x1000, eppendorf5920701002
Adapter Plate past op 16 bioreactoren van 600 mlInfors HT/ TPP587633
Aerosol-dichte doppen, voor ronde emmers van 750 mLeppendorf5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, ronde emmers en adapter 15 mL/50 mL conische buizeneppendorf5948000315
Gedestilleerde waterGibco15230147
DNase I recombinant, RNase-vrijRoche4716728001
DNase I recombinant, RNase-vrijRoche4716728001
DPBS, calcium, magnesiumGibco14040091
DPBS, geen calcium, geen magnesiumGibco14190144
Fisherbrand Wegwerp PES-filtereenheden 0,2FisherFB12566504
Fisherbrand Wegwerp PES-filtereenheden 0,45FisherFB12566505
Houder voor 50 ml kweekbuisjes past ook op falconbuisInfors HT/ TPP31362
Houder voor 600 ml celkweekbuisInfors HT/ TPP66129
Incubator Minitron 50 mmInfors HT500043
LV-MAX Productie MediumGibcoA3583401
N-Tray UniversalInfors HT/ TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk bernburg1893
PEI MAX - Transfectiekwaliteit Lineair Polyethyleeniminewortelchloride (MW 40.000)Poly-sciences24765-100
Fenol rood oplossing Sigma-Aldrich72420100
Poly(ethyleenglycol) 8000Sigma-Aldrich89510
TransIT-VirusGENMirusMir 6706
Trypan Blue-oplossing, 0,4%Gibco5250061
TubeSpin Bioreactors-50mlTTP87050
TubeSpin Bioreactors-600mlTTP87600
Virale ProductiecellenGibcoA35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000Cytvia28932363

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).
  2. Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483(2021).
  3. Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
  4. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
  5. Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
  6. Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
  7. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
  8. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
  9. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960(2019).
  10. Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
  11. Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
  12. Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
  13. Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  14. Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

AAV productieadeno geassocieerde vectorenhoge AAV opbrengsttriple transfectieiodixanolgradi ntpolyethylenimine transfectiecentrifugale filtratiecentraal zenuwstelselzuivering van virale vectoren

Gerelateerde artikelen