Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Samenvatting

We demonstreren een methode die gebruik maakt van snelle confocale scanscopie om live beeldvorming uit te voeren van microgliacellen in het zich ontwikkelende optische tectum van zebravissen, waardoor de dynamiek van deze cellen in vivo kan worden geanalyseerd.

Samenvatting

Microglia zijn zeer dynamische cellen en hun migratie en kolonisatie van het hersenparenchym is een cruciale stap voor een goede ontwikkeling en functie van de hersenen. Uitwendig ontwikkelende zebravisembryo's bezitten optische transparantie, die samen met goed gekarakteriseerde transgene reporterlijnen die microglia fluorescerend labelen, zebravissen tot een ideaal model voor gewervelde dieren maken voor dergelijke studies. In dit artikel maken we gebruik van de unieke kenmerken van het zebravismodel om de dynamiek van microgliacellen in vivo en onder fysiologische omstandigheden te visualiseren. We gebruiken confocale microscopie om een timelapse van microgliacellen in het optische tectum van het zebravisembryo vast te leggen en vervolgens trackinggegevens te extraheren met behulp van de IMARIS 10.0-software om het migratiepad, de gemiddelde snelheid en de verdeling van de cellen in het optische tectum in verschillende ontwikkelingsstadia te verkrijgen. Dit protocol kan een nuttig hulpmiddel zijn om de fysiologische betekenis van microglia-gedrag in verschillende contexten op te helderen, wat bijdraagt aan een diepere karakterisering van deze zeer beweeglijke cellen.

Inleiding

Als residente macrofagen in het centrale zenuwstelsel (CZS) vertegenwoordigen microglia een afzonderlijke niet-neuronale populatie die tot 15% van alle gliacellen in de volwassen hersenen vertegenwoordigt. Het bestuderen van de biologie van microglia heeft de laatste jaren steeds meer aandacht gekregen vanwege hun gevestigde belang in ontwikkeling, fysiologie^{en ziekte.} Onder fysiologische omstandigheden zijn microgliacellen zeer dynamisch en onderzoeken ze continu het hersenparenchym ^2,3. Dit gedrag stelt microglia in staat om de hersenen te koloniseren en een cruciale rol te spelen in de ontwikkeling ervan, zoals het vormgeven van neuronale circuits⁴, synaptisch snoeien⁵ en vasculogenese⁶. Bovendien stelt deze inherente dynamische aard microglia in staat om het CZS constant te controleren op tekenen van infectie, letsel of afwijkingen van de homeostase⁷. Om deze ingewikkelde celdynamiek te ontleden, is live beeldvorming van microglia in ruimte en tijd onmisbaar. Gelukkig positioneert de optische transparantie van uitwendig ontwikkelende zebravisembryo's, in combinatie met de beschikbaarheid van goed gekarakteriseerde transgene reporterlijnen die microglia fluorescerend labelen, zebravissen als een ideaal gewerveld model voor dergelijk onderzoek. Live beeldvorming in zebravisembryo's biedt een niet-invasieve benadering die geen operatie of uitgebreide weefselmanipulatie vereist, waardoor mogelijke verstoringen van de CZS-status tot een minimum worden beperkt. Dit is een cruciale overweging bij het bestuderen van microgliacellen, omdat ze zeer gevoelig zijn voor zelfs subtiele veranderingen in de extracellulaire omgeving⁸.

Hier bieden we een richtlijn om met succes 3D-microgliacelbewegingen in het zebravisembryo te volgen, waardoor een ongekend beeld ontstaat van het gedrag van microglia binnen de intacte architectuur van het zich ontwikkelende hersenparenchym (zie figuur 1 voor een grafisch overzicht van het protocol). Dit stap-voor-stap protocol beschrijft hoe zebravismicroglia in verschillende ontwikkelingsstadia kunnen worden opgezet en afgebeeld en hoe gegevens met hoge resolutie over de beweeglijkheid van microgliacellen kunnen worden geëxtraheerd om waardevolle inzichten te bieden in hun migratiepatronen en reacties op omgevingssignalen. We tonen ook aan dat dit protocol kan worden aangepast om live meerkleurige beeldvorming uit te voeren, waardoor de toepasbaarheid ervan wordt uitgebreid tot het bestuderen van microglia in combinatie met transgene lijnen die naburige cellen markeren, waaronder neuronen³, oligodendrocyten⁹ en endotheelcellen¹⁰ (zoals weergegeven in figuur 2). Door toe te voegen aan de gereedschapskist die het mogelijk maakt om de dynamiek van microglia-gedrag in realtime en in hun natuurlijke omgeving direct te observeren en te karakteriseren, zal dit protocol waarschijnlijk bijdragen aan een betere opheldering van de microglia-functionaliteit tijdens de vroege ontwikkeling, zowel in de fysiologie als in de ziekte.

Protocol

Zebravissen werden onder standaardomstandigheden gehouden, volgens FELASA42 en institutionele (Université Libre de Bruxelles, Brussel, België; ULB) richtlijnen en reglementen. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het Ethisch Comité voor Dierenwelzijn (CEBEA) van de ULB van de ULB.

1. Kweek van zebravissen en voorbereiding van embryo's

OPMERKING: De transgene lijn Tg(mpeg1:eGFP)^gl22 van de zebravis die het fluorescerende eGFP-eiwit tot expressie brengt in macrofagen, waaronder microglia, werd gebruikt om de volggegevens te genereren die in dit protocol worden weergegeven. Andere macrofaag reporter lijnen zijn verkrijgbaar bij ZIRC en kunnen ook gebruikt worden. Bij het kiezen van de transgene lijn is het belangrijk om te bedenken dat een hoge signaalintensiteit de beeldacquisitie en celsegmentatie zal vergemakkelijken.

1. Houd de zebravis (Danio rerio) op een temperatuur van 28 °C en beheer ze volgens de vastgestelde protocollen¹¹.
2. Stimuleer de paring door vrouwelijke en mannelijke vissen in de late namiddag voor de geboortedatum van de gewenste embryo's samen in een kweekbak te plaatsen, met een gaasbodem en een scheider. Verwijder de separator de volgende ochtend om het paren van de vissen te timen.
3. Verzamel de bevruchte eieren met behulp van een gaas en breng ze over naar een petrischaal van 100 mm met E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄) met 0,01% methyleenblauw. Afhankelijk van de genetische achtergrond van de gebruikte transgene lijn van de zebravis, als de pigmentvorming moet worden geremd om beeldvorming te vergemakkelijken, voeg dan 0,003% N-fenylthiourea (PTU) toe aan de E3-buffer waarin embryo's zich ontwikkelen, beginnend 6 uur na de bevruchting (hpf) en ververs de oplossing elke 2 dagen totdat het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt.
   OPMERKING: Om langdurige blootstelling aan PTU te voorkomen die de embryonale ontwikkeling zou kunnen beïnvloeden¹², wordt aangeraden om, indien beschikbaar, een transgene lijn te gebruiken op een pigmentdeficiënte achtergrond, zoals Casper^w2, die een heldere beeldvorming mogelijk maakt zonder de noodzaak om embryo's gedurende een langere periode aan PTU bloot te stellen¹³.
4. Als de af te beelden embryo's jonger zijn dan 3 dagen na de bevruchting (dpf), dechorioneer ze dan bij 24 hpf. Gebruik een stereomicroscoop om te bevestigen dat alle embryo's zijn gedechorioneerd en onbeschadigd zijn door de enzymatische behandeling (zie stap 1.4.2).
   1. In het geval van een beperkt aantal eieren, doe dit dan handmatig door met een fijne ontleedtang het chorion samen te knijpen en naar buiten te trekken, waarbij elk embryo voorzichtig uit zijn chorion wordt losgemaakt.
   2. In het geval van een groter aantal eieren, voer de dechorionatie enzymatisch uit door de eieren in bulk bij kamertemperatuur (RT) uit te broeden in een 1 mg/ml Pronase-oplossing in E3-medium gedurende een korte periode (meestal 5-10 minuten, totdat de chorionen openbreken onder zachtjes zwiepen). Vervolgens wordt de Pronase-oplossing weggegooid en worden de embryo's 3x grondig gespoeld met verse E3 om eventueel achtergebleven chorion en resterend enzym te verwijderen.

2. Zebravis montage

1. Bereid een agarose-oplossing met een laag smeltpercentage van 1% in E3-buffer. Koel de agarose af tot 37 °C in een tafelverwarmingsblok en voeg vers gemaakte Tricaïne-methaansulfonaatoplossing (160 mg/L) toe, waardoor de embryo's tijdens de beeldvorming verdoofd blijven. Draai de oplossing om het grondig te homogeniseren.
2. Verdoof de embryo's door 160 mg/L Tricaïne methaansulfonaat toe te voegen aan de petrischaal met de embryo's in E3-buffer. Controleer of de beweging is gestopt en selecteer de zebravisembryo's met de gewenste fluorescentie. Controleer de gezondheid van het embryo door de hartslag te visualiseren met behulp van een helderveldstereomicroscoop. Gebruik een transferpipet met brede punt om één of maximaal drie van de geselecteerde embryo's op te zuigen en over te brengen naar een glazen beeldvormingsplaat aan de onderkant.
3. Gebruik onder een stereomicroscoop een pipet om zoveel mogelijk medium te verwijderen en zorg ervoor dat u de embryo's niet aanraakt of beschadigt; Vervang vervolgens het medium door de eerder bereide 1% laagsmeltende agarose-oplossing. Gebruik vervolgens een plastic dunne, taps toelopende punt die aan het uiteinde van een plagernaald is bevestigd om elk embryo voorzichtig naar de bodem van de beeldvormingsplaat te duwen en het zo te oriënteren dat de dorsale zijde naar het glas is gericht om een goed zicht op het optische tectum en een minimale hoeveelheid agarose met een laag smeltpunt tussen het embryo en het glas te garanderen.
4. Stel het gemonteerde embryo onmiddellijk in beeld met behulp van een omgekeerde confocale microscoop met een hoogwaardig Plan Apo-objectief (10x/0.45 Plan Apo of een 20x/0.75 Plan Apo die hier wordt gebruikt). Als de timelapse gedurende een langere periode (meer dan een uur) wordt uitgevoerd, voeg dan een of twee druppels E3-buffer met tricaïnemethaansulfonaat (160 mg/l) toe aan de onderste glazen beeldvormingsplaat om te voorkomen dat de agarose met een laag smeltpunt te veel uitdroogt.
   OPMERKING: Het is van cruciaal belang om te wachten tot de agarose volledig is gestold voordat u E3-buffer en tricaïne-methaansulfonaatmedia aan de beeldvormingsschijf toevoegt; Anders zou de vis langzaam lateraal en axiaal kunnen bewegen, waardoor een monsterdrift in de timelapse ontstaat.
5. Ga verder met het instellen van de timelapse-acquisitie voor de gewenste tijd: stel de beeldresolutie in op 1.024 x 1.024, met een pixelgrootte van 0,49 μm. Verzamel optische plakjes in stappen van 2-3 μm om een acceptabele resolutie op de z-as te garanderen. In het zebravisembryo omsluit u het optische tectum in een z-stack van 100-150 μm, afhankelijk van het gebruikte ontwikkelingsstadium. Om een succesvolle celtracering te garanderen, houdt u het tijdsinterval tussen frames tussen 30 s en 60 s.

3. Tracking-analyse en gegevensexport

1. Converteer het timelapse-bestand naar IMS-indeling met behulp van de Imaris-bestandsconversiesoftware (zie Materiaaltabel). Bij het starten van de software sleept u de bestanden naar het invoergebied of gebruikt u de knop Bestanden toevoegen... knop om ze handmatig te selecteren. Geef in het menu Uitvoer de locatie aan voor de geconverteerde bestanden, kies voor dezelfde map als de invoerbestanden of geef een bepaalde map op. Zorg ervoor dat de afmetingen van de weergegeven voxelgrootte correct zijn door op de knop Voxelgrootte instellen te klikken en zodra de voxelgrootte is geverifieerd, drukt u op de knop Alles starten om de bestandsconversie te starten (zie Aanvullend bestand 1 voor een stapsgewijze handleiding van alle gegevensanalyse).
   OPMERKING: Als de timelapse parallel op twee of meer embryo's is uitgevoerd, wordt het bestand automatisch opgesplitst in enkele posities, waarbij elk embryo in verschillende bestanden wordt gescheiden. Het is mogelijk om de software in batchmodus te gebruiken en meerdere bestanden tegelijkertijd te uploaden en te converteren. IMS-bestanden worden gemaakt en opgeslagen in de geselecteerde doelmap of de map waarin de invoerbestanden zich bevinden.
2. Eenmaal gestart, laat je de analysesoftware starten in de Arena; klik op Map observeren om het eerder geconverteerde bestand te openen. Zodra het bestand in de software is geladen, gebruikt u de Slice-weergave om door de z-stapel te scrollen, met behulp van de schuifregelaar in de Slice-werkbalk aan de linkerkant van het weergavegebied, en meet u enkele celdiameters door de diameter van de geselecteerde cellen te tekenen met de aanwijzer. Klik en sleep met de muis om een segment te tekenen dat de celkern overspant; let op de lengte van het segment dat is getekend in de werkbalk Meten, die zich rechts van het weergavegebied bevindt.
   OPMERKING: Met behulp van de beeldvormingsinstellingen in stap 2.5 kan worden verwacht dat de diameter van het cellichaam tussen 6 μm en 8 μm ligt.
3. Als u de cellen automatisch wilt detecteren, gaat u terug naar de 3D-weergave en klikt u op het spotpictogram in de objectwerkbalk om een nieuw Spots-object toe te voegen aan de objectlijst en opent u de wizard voor het automatisch maken van Spots. Vink in de eerste stap van de wizard de optie aan om alleen een interessegebied te segmenteren. Schakel vervolgens de optie Hotspots volgen (in de loop van de tijd) in om de trackinggegevens te berekenen, evenals de Object-objectstatistieken om vergelijking tussen spots mogelijk te maken en het bereik van gegevens uit te breiden die later in de analyse beschikbaar zullen zijn. Ga ten slotte verder in de wizard door op de knop Volgende rechtsonder in het wizardvenster te klikken.
4. Ga in de tweede stap verder met het specificeren van een interessegebied (ROI) dat het optische tectum van het embryo omsluit. Wijzig de grootte van de ROI door op de kleine witte pijlen op elke zijde ervan te klikken en deze te slepen. Zodra de ROI-grootte is gedefinieerd, breidt u deze uit naar alle opgenomen frames door het tijdsinterval aan te passen.
5. Selecteer vervolgens als bronkanaal het kanaal dat wordt gebruikt om de cellen te detecteren en stel de celdiametermeting, eerder verkregen in stap 3.2, in als de geschatte XY-diameter. Schakel de optie Achtergrond aftrekken in en klik op Volgende.
6. Op dit punt in de wizard voor het maken van spots bevat de software een kwaliteitsfilterstap waarin spots worden gefilterd op basis van de signaalintensiteit die in het midden van elke spot wordt gemeten; in het kanaal waar de vlekken zijn gedetecteerd. Pas de intensiteitsdrempel aan door de waarde rechtstreeks in het gegevensveld voor de onderste en bovenste drempelvakken in te voeren of door de corresponderende gekleurde lijnen in het histogram te slepen dat onder aan de creatiewizard wordt weergegeven, zodat alle cellen worden gedetecteerd, inclusief de cellen die dieper in het weefsel zijn gelokaliseerd en die meestal een lagere signaalintensiteit vertonen. Al deze wijzigingen zijn tegelijkertijd zichtbaar in het weergavegebied.
   OPMERKING: Het is mogelijk om op dit punt meerdere vlekken te observeren die een enkele cel labelen, maar dit kan later in de analyse worden gecorrigeerd.
   Als er bij langere time-lapses wat fotobleking wordt gezien, controleert u het weergavegebied van meerdere frames voordat u de drempel instelt om er zeker van te zijn dat alle cellen ook worden gedetecteerd in de meest recente en dus zwakkere frames.
7. Als u tevreden bent, klikt u op Volgende om de geselecteerde kwaliteitsdrempel te valideren. Alle spots die voldoen aan de parameter voor kwaliteitsdrempels en een diameter hebben die overeenkomt met de geschatte XY-diameter, worden gelabeld als een spot. Visualiseer dit als een voorbeeld in het weergavegebied, waar plekken die aan deze twee parameters voldoen, over het bronkanaal worden gelegd.
8. Selecteer in de volgende stap de Autoregressieve beweging als het volgalgoritme om cellen te volgen die een min of meer continue beweging hebben. Beoordeel de langste afstand die een cel tussen twee tijdstippen aflegt door de beweging van de vlekken tussen twee frames zorgvuldig te observeren en een geschat getal in te voeren in het veld Maximale afstand . Dit is de afstand die een plek mag afwijken van de voorspelde toekomstige positie.
9. Stel de maximale tussenruimtegrootte in op het minste aantal tijdstippen waarop de plek mag verdwijnen zonder de baan te onderbreken. Als het interval tussen de frames minder dan 60 s is, gebruik dan een maat van 3. Als het tijdsinterval tussen de frames langer is, vergroot dan de maximaal toegestane tussenruimte om spoorfragmentatie te verminderen.
10. Schakel de optie Gaten opvullen met alle gedetecteerde objecten in om de detectiedrempel te verlagen tot dicht bij de verwachte positie die wordt voorspeld door het volgalgoritme en om sporen te verbinden die worden onderbroken door een storing in de spotdetectie. Klik ten slotte op Volgende en laat de software automatisch tracks genereren voor alle eerder gegenereerde spots.
11. Als de verkregen sporen te talrijk of gefragmenteerd lijken te zijn, ga dan terug in de creatiewizard, door op de knop Vorige te klikken, en pas de eerder gedefinieerde maximale afstand aan, waarbij u het aantal verhoogt of verlaagt totdat de meeste van de verkregen sporen representatief zijn voor de celbewegingen.
    OPMERKING: Het aantal sporen moet ongeveer overeenkomen met het aantal microgliacellen, dus tussen 30 en 50, afhankelijk van de leeftijd van het embryo. Vóór voltooiing van de analyse wordt echter een hoger aantal verwacht als gevolg van foutieve sporen.
12. Zodra de tracks zijn berekend, bevat de software een filterstap om alle zeer korte tracks uit te filteren, omdat ze vaak onnauwkeurig of niet informatief zijn. Sluit tracks korter dan 3-8 minuten (min) uit door de waarde rechtstreeks in het gegevensveld in te voeren voor de ondergrens van het trackduurfilter, of door de corresponderende gekleurde lijnen te slepen in het histogram dat onder aan de creatiewizard wordt weergegeven. Klik op Volgende om het filter te valideren en verder te gaan in de aanmaakwizard.
    OPMERKING: Zoals eerder vermeld, is het mogelijk om door het wijzigen van de maximale (max) en minimale (min) drempel voor de trackduur een voorbeeld te bekijken van de tracks die worden gefilterd en uitgesloten van de analyse. De gefilterde tracks kunnen vervolgens worden gedupliceerd in een nieuw object voor verdere analyse. De exacte tijdsdrempel voor het filteren kan variëren, afhankelijk van de resultaten van de vorige stap van de wizard voor het maken van gegevens. We raden u aan deze filterinstellingen te verfijnen door het voorbeeld in het weergavegebied te bekijken voor optimale resultaten.
13. Aangezien de Tg (mpeg1:eGFP) transgene lijn alle mononucleaire fagocyten labelt, zullen huidmacrofagen naast microglia ook worden gedetecteerd in timelapse-films. Verwijder handmatig de sporen die zijn gegenereerd door huidmacrofagen uit de analyse om u te concentreren op parenchymale microglia in de hersenen (Figuur 3).
14. Corrigeer handmatig andere mogelijke fouten in de tracks in de trackeditor, waarbij elk gegevenspunt wordt weergegeven als een object in de track. Activeer de knop voor de cirkelselectiemodus aan de rechterkant van het weergavegebied en markeer tracks die moeten worden gewijzigd of aangepast. Zodra het problematische nummer is geselecteerd, bewerkt u het met behulp van de knoppen voor verbinden en verbreken om de celbewegingen correct weer te geven. Gebruik de trackeditor om ook dubbele afzonderlijke spots of kleine trackfragmenten te selecteren en te verwijderen die ten onrechte dezelfde cel vertegenwoordigen door ze te selecteren met de cirkelselectiemodus en op Canc of Delete te drukken om ze te verwijderen.
    OPMERKING: Als de instellingen van de tracking correct zijn, zou deze stap slechts voor een klein percentage van de gevolgde cellen nodig moeten zijn.
15. Als de microglia-reporterlijn wordt gebruikt in combinatie met fluorescerende transgenen die andere celtypen in het parenchym labelen, voer dan segmentatie uit als een nieuw oppervlakteobject of spotobject om ze te visualiseren. Om dit te doen, herhaalt u de bovenstaande stappen (van stap 3.2 tot 3.14), wijzigt u de invoer van het bronkanaal in stap 3.5, zodat dit degene is die wordt gebruikt om de tweede celpopulatie af te beelden, en zorgt u ervoor dat de beschrijvende parameters die specifiek zijn voor de cellen van belang, zoals geschatte XY-diameter (stap 3.5), maximale afstand (stap 3.8) aan de nieuwe celpopulatie worden aangepast. Andere stappen kunnen zonder wijzigingen worden herhaald.
    OPMERKING: In het geval van een nieuwe oppervlaktecreatie wordt de geschatte XY-diameter vervangen door een drempeloptie op basis van achtergrondaftrekking, waarbij de te geven invoer de diameter is van de grootste bol die in het object past. Deze waarde kan worden geschat vanuit de Segment-weergave met behulp van de werkbalk Meten , zoals uitgelegd in stap 3.2.
16. Als u tevreden bent met de verkregen tracks, extraheert u de gewenste trackingstatistieken van het tabblad Statistiek . Klik op de instellingenknop en selecteer welke statistieken worden berekend voor elk eerder gemaakt spotobject of oppervlakteobject. Als er meer objecten zijn gemaakt in dezelfde analyse, twee spotobjecten of een spot- en een oppervlakteobject, zijn statistieken die de relatieve positie van het ene object ten opzichte van het andere weergeven, zoals de kortste afstand tussen de twee, ook beschikbaar om te exporteren.
    OPMERKING: Alle gewenste waarden kunnen specifieke of gemiddelde waarden zijn, en alle onbewerkte gegevens kunnen worden gedownload als een CSV-bestand (Comma Separated Values) met behulp van de knoppen onder aan het tabblad Statistieken . Op voorwaarde dat de analyse ook andere celtypen omvat, zullen ook aanvullende statistieken over de relatieve afstand van het ene object tot het andere beschikbaar komen.

Resultaten

Microgliacellen die groen fluorescerend eiwit (eGFP) tot expressie brengen en endotheelcellen die DsRed tot expressie brengen in Tg (mpeg1: eGFP^gl22; kdrl:cre^S898; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRed^express,sd5) drievoudige transgene embryo's¹⁴ werden afgebeeld bij 3 dpf, volgens het beschreven protocol. Een enkel zebravisembryo werd gemonteerd in agarose met een laag smeltpunt van 1% op een glazen bodemplaat en het beeldvormingsproces belemmerde de groei van het embryo niet tijdens de acquisitietijd. De timelapse werd opgenomen met behulp van een commercieel confocaal microscopiesysteem voor puntscannen dat was uitgerust met een 10x 0,45 NA droge objectieflens, en 488 nm en 561 nm excitatielasers werden gebruikt voor het afbeelden van respectievelijk microglia en endotheelcellen. Bovendien waren het tijdsinterval, de beeldresolutie, de pixelgrootte en de z-stap respectievelijk 30 seconden (s), 1024x1024, 0,49 μm en 2,5 μm. De timelapse-opname duurde 3,5 uur (h).

Het verkregen gezichtsveld besloeg het hele hoofd van het embryo, maar de analyse was specifiek gericht op het optische tectum, aangezien microglia tijdens de eerste week van de ontwikkeling voornamelijk beperkt zijn tot de neuronale soma-laag van dit gebied van de dorsale middenhersenen, waardoor onderzoekers de hele populatie tegelijkertijd kunnen visualiseren¹⁵. De 3D-trackinganalyse is uitgevoerd met behulp van Imaris 10.0, zoals hierboven uitgelegd. Zoals te zien is in figuur 4, was de tracking succesvol, wat resulteerde in 25 sporen, wat overeenkomt met het verwachte aantal microgliacellen dat aanwezig is in het optische tectum op 3 dpf¹⁶. Er was een minimale handmatige correctie van de sporen nodig. Figuur 5 toont een voorbeeld van de gegevens die kunnen worden geëxtraheerd uit een succesvol volgexperiment. De gelijktijdige labeling van macrofagen en endotheelcellen maakt het mogelijk om de positie van microglia ten opzichte van de laatste te kwantificeren, waardoor onderzoekers de relatieve afstand van elke cel tot de dichtstbijzijnde endotheelcel in de tijd kunnen visualiseren en de frequentie en het aantal mogelijke interacties kunnen onderzoeken (Figuur 5).

Figuur 1: Overzicht van de experimentele procedure. (A) Voorbereiding en anesthesie van zebravisembryo's. (B) Montage en positionering van het monster. (C) Beeldacquisitie. (D) Beeldverwerking en extractie van motiliteitsgegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Microglia beeldvorming en interacties met de cellulaire omgeving van de hersenen in het zebravisembryo. (A) Helderveldbeeld van een 3 dpf embryonale zebraviskop en hersenen (dorsaal aanzicht), waarbij het optische tectum en de achterhersenen worden gelabeld. De hersenen van de embryonale zebravis kunnen in dit stadium in zijn geheel in beeld worden gebracht vanwege hun kleine formaat en optische transparantie. (B-D) De locatie en het gedrag van microglia kunnen worden gevisualiseerd door het gebruik van transgene lijnen zoals (B,C) Tg (mpeg1: eGFP) ^gl22 en (D) Tg (mpeg1: mcherry) ^gl23, en door te focussen op de OT. (B) Neuronen en hun cellichamen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de reporterlijn Tg(XlTubb:D sRed)^zf148 en microglia-neuroninteracties kunnen worden gevisualiseerd door de twee kanalen samen te voegen in lijnen die beide transgenen samen tot expressie brengen. Gezien is een samensmelting van de groene (microglia) en rode (neuronen, in magenta) signalen. (C,D) Reporterlijnen kunnen ook licht werpen op microglia (in groen) interacties met endotheelcellen, hier in rood gelabeld met de (C) dubbele Tg(kdrl:cre^s898; actb2:LOXP-STOP-LOXP-Dsred^{express, sd5}) transgenen, of met gliacellen zoals oligodendrocyten en hun voorlopers, met behulp van de (D) dubbele Tg(olig2:EGFP; MPEG1:McRy) transgene lijn. 1: oligodendrocyten en voorlopercellen in de OT, 2: eurydendroïde neuronen in het cerebellum. Schaal balken = 50 μm. Afkortingen: dpf = dagen na de bevruchting; OT = optisch tectum; HB = achterhersenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Morfologische en ruimtelijke ongelijkheid tussen huidmacrofagen en microglia in een zebravisembryo van 3 dpf. (A,B) Dorsaal aanzicht van een Tg(mpeg1:eGFP)^gl22 zebravisembryo bij 3 dpf, met (A) parenchymale microgliacellen (gemarkeerd met magenta sterretjes) versus huidmacrofagen (witte sterretjes), geïdentificeerd op basis van hun relatieve positie langs de z-as, zoals te zien is in (B), waarin het monochrome 3D-beeld wordt weergegeven dat wordt weergegeven met kleurcodering op de z-as. (C,D) Zijaanzicht van (C) A en (D) B, waarbij de z-diepten van mpeg1:eGFP^+- cellen in het hoofd van het embryo worden getoond en de oppervlakkige lokalisatie van huidmacrofagen wordt benadrukt in vergelijking met microgliacellen. (E-K) Hoge vergroting van elke cel aangegeven met een asterisk in A en B, wat een gedetailleerde visualisatie biedt van de verschillende morfologieën tussen (E-G) amoeboïde microglia en (H-K) langwerpige huidmacrofagen. Schaal balken = 30 μm. Afkorting: dpf = dagen na de bevruchting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Traceren van microgliacellen in een zebravisembryo van 3 dpf. (A) Hoofd dorsaal aanzicht van een 3 dpf Tg(kdrl:cre^s898; actb2: LOXP-STOP-LOXP-Dsred^{uitdrukkelijk, SD5}; ^mpeg1:eGFP^gl22) drievoudig transgeen embryo, met microglia (groen) en de oppervlakteweergave van de bloedvaten (magenta). (B-D) Representatief volgen van microglia-bewegingen gedurende een (B) tijdvenster van 3,5 uur. Individuele cellen worden gezien om complexe trajecten te volgen. (C) Detail van timelapse, met een vergrote weergave van het gebied in B omsloten door het gestippelde vierkant. Zes frames uit de film (met een tussenpoos van 45 minuten) worden gepresenteerd, waarin microglia worden gedocumenteerd die voorbijgaande contacten leggen met endotheelcellen in hun micro-omgeving. (D) Trajecten van individuele microgliacelmigratie binnen het optische tectum, waarbij de X-, Y- en Z-assen ruimtelijke dimensies vertegenwoordigen. Schaal balk = 50 μm. Afkorting: dpf = dagen na de bevruchting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Visualisatie van de verkregen gegevens. Voorbeeld van de ruimtelijke gegevens die kunnen worden verkregen met behulp van het beschreven protocol. De grafieken tonen (A) de gemiddelde snelheid van microgliacellen, (B) de gemiddelde afstand die ze afleggen in 1 uur, (C) hun gemiddelde vierkante verplaatsing en (D) hun verdeling in de ruimte op verschillende tijdstippen. De oppervlakteweergave van het vat maakte het ook mogelijk om de kortste afstand tussen microglia en endotheelcellen op een bepaald moment te meten, zowel op (E) enkelvoudig celniveau als als een (F) wereldwijd gemiddelde. Voor A, B en D vertegenwoordigt elke stip een individuele cel. N = één embryo. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het huidige protocol maakt in vivo beeldvorming van de dynamiek van microglia in een embryo van gewervelde dieren en visualisatie van de verworven beweeglijkheidsgegevens mogelijk. Microglia-kolonisatie van de zich ontwikkelende hersenen vindt zeer vroeg plaats tijdens de embryogenese en gaat vooraf aan kritieke gebeurtenissen zoals pieken in neurogenese, astrogliogenese, oligodendrogenese en vele andere cellulaire processen¹⁷. Het is daarom niet verwonderlijk dat microglia een belangrijke rol spelen bij het vormgeven van specifieke aspecten van de ontwikkeling van de hersenen¹⁸, bijvoorbeeld door de regulatie van neuronale differentiatie, migratie en overleving 19,20,21, evenals synaptisch snoeien⁵ en myelinisatie 22,23,24.

De bijdrage van disfunctionele microglia aan de pathogenese en/of progressie van neurologische ontwikkelingsstoornissen wordt ook steeds meer erkend²⁵. Inderdaad, de vroege aanwezigheid van microglia in de vormende hersenen stelt deze cellen bloot aan verschillende fysiologische toestanden²⁶ en veranderingen in de omgeving. Dit kan een aanzienlijke impact hebben, aangezien microglia langlevende cellen zijn bij zowel knaagdieren als mensen, die gedurende de levensduur in stand worden gehouden door zelfvernieuwing van lokale voorlopercellen 27,28,29. Wij geloven dat dit protocol kan dienen als een krachtig hulpmiddel om het gedrag van microglia in deze verschillende fysiologische toestanden beter te karakteriseren, terwijl ze zich ontwikkelen, rijpen en hun netwerk vestigen tijdens de opeenvolgende stappen van hersenmorfogenese.

Met behulp van de hier beschreven opstelling hebben we met succes gegevens in beeld gebracht en gegevens verkregen over zebravislarven van wel 6 dpf oud. Het uitbreiden van de analyse naar latere ontwikkelingsstadia zal waarschijnlijk slagen, maar vereist aanpassing van de beeldvormingsopstelling om rekening te houden met de toegenomen steekproefomvang, vooral langs de z-as. Bij dit proberen raden we aan om ons te concentreren op het handhaven van een lage signaal-ruisverhouding en een snelle scantijd, aangezien dit de belangrijkste parameters zijn voor een succesvolle analyse.

We raden een minimale beeldvormingstijd van 1 uur aan om microglia-tracking mogelijk te maken; Het langste beeldvormingsvenster dat met dit protocol is getest, is 8 uur. Bovendien is het belangrijk voor de trackinganalyse om het tijdsinterval tussen frames zo kort mogelijk te houden, idealiter tussen 30 s en 60 s. Dit zal nauwkeurigere en gedetailleerdere trackinggegevens mogelijk maken in stroomafwaartse analyses. Daarom is het, vooral als er meer dan één fluorofoor wordt gedetecteerd, van fundamenteel belang om spectrale overlapping te vermijden en te zorgen voor voldoende scheiding tussen de twee fluorofooremissiespectra om een gelijktijdige acquisitie mogelijk te maken, zonder doorbloeding van het signaal.

Er zijn³⁰ andere protocollen beschikbaar voor hoogwaardige timelapse-opnames van het brein van de zebravis, maar dit is de eerste die laat zien hoe alle bewegingen van microglia tijdens de embryonale ontwikkeling gedurende een langere periode met succes kunnen worden gevolgd. Hoewel de hier gepresenteerde workflow gericht was op het volgen van microglia in een fysiologische context, kan deze gemakkelijk worden toegepast op de analyse van microglia in de pathologie. Inderdaad, verschillende modellen van neurologische ontwikkelingsstoornissen, zoals autisme³¹, epilepsie³² en schizofrenie³³, maar ook neurodegeneratie³⁴ en kanker³⁵, zijn vastgesteld in zebravissen die unieke mogelijkheden bieden voor het bepalen van microgliale respons en gedrag bij ziektetoestanden.

Dit volgprotocol is met name zeer veelzijdig en kan ook een belangrijke rol spelen bij het werpen van licht op de migratiepatronen van verschillende celtypen in verschillende anatomische regio's van het zebravisembryo, waardoor mogelijk wegen worden geopend voor aanvullende toepassingen, buiten de reikwijdte van het microgliale onderzoek dat in dit artikel wordt beschreven. Bovendien krijgen we, door gebruik te maken van het vermogen om meerdere fluorescerende transgene lijnen te combineren, het vermogen om de ruimtelijke relatie tussen microglia en andere celtypen van de micro-omgeving van de hersenen te onderscheiden, met het potentieel om cellulaire interacties en overspraak tijdens timelapse-opnames op een niet-invasieve manier te visualiseren. Dit zou een belangrijke rol kunnen spelen bij het ontrafelen van de fysiologische betekenis van het gedrag van microglia en kunnen bijdragen aan een diepere karakterisering van deze zeer beweeglijke cellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 L Fokkerijtanks	Tecniplast	ZB10BTE
1-fenyl-2-thioureum (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	Verdund tot 0,2 mM in E3 om embryopigmentatie te voorkomen
Onderste glazen beeldvormingsschaal	FluoroDish	FD3510-100
Weggeef gegradueerde overdrachtspijp	avantor	16001-188
Droge blokverwarming	Novolab	Grant QBD4	Om lage smelt agarose op 37 °C te houden
Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Imaris 10.0	Oxford Instruments		analysesoftware
Imaris File Converter	Oxford Instruments		https://imaris.oxinst.com/big-data
Laser-scanning confocale microscoop	Nikon	Eclipse Ti2-E
Methyleenblauw	Sigma-Aldrich	M9140-25G
microloader tips	Eppendorf	5242956003
NuSieve GTG Agarose	Lonza	50081
Petrischalen (90 mm)	avantor	391-0559
Pronase	Sigma-Aldrich	11459643001
Roestvrijstalen pincetten Dumont nr. 5	FineScienceTools	11254-20
Stereomicroscoop	Leica	Leica M80	Om de embryo's te monteren
Prikpriknaald	avantor	76549-024