Real-time evaluatie van absolute, cytosolische, vrije Ca2+ en overeenkomstige contractiliteit in geïsoleerde, onder druk staande lymfevaten

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode om tegelijkertijd cytosolisch, vrij calcium [Ca²⁺]_i en vaatdiameter in samentrekkende lymfevaten in realtime te meten en vervolgens absolute Ca^2+- concentraties te berekenen, evenals contractiliteits-/ritmiekparameters. Dit protocol kan worden gebruikt om Ca²⁺ en contractiele dynamiek te bestuderen in verschillende experimentele omstandigheden.

Samenvatting

Het lymfevatuur, nu vaak 'de derde circulatie' genoemd, bevindt zich in veel vitale orgaansystemen. Een belangrijke mechanische functie van het lymfevaculatuur is het terugvoeren van vloeistof uit extracellulaire ruimtes terug naar de centrale veneuze kanalen. Lymfetransport wordt gemedieerd door spontane ritmische samentrekkingen van lymfevaten (LV's). LV-contracties worden grotendeels gereguleerd door de cyclische stijging en ondergang van cytosolisch, vrij calcium ([Ca²⁺]_i).

Dit artikel presenteert een methode om gelijktijdig veranderingen in absolute concentraties van [Ca²⁺]_i en vatcontractiliteit/ritmiek in realtime te berekenen in geïsoleerde, onder druk staande LV's. Met behulp van geïsoleerde mesenteriale LV's van ratten hebben we veranderingen in [Ca²⁺]_i en contractiliteit/ritmiek bestudeerd als reactie op toevoeging van geneesmiddelen. Geïsoleerde LV's werden geladen met de ratiometrische Ca²⁺-detectie-indicator Fura-2AM, en videomicroscopie in combinatie met randdetectiesoftware werd gebruikt om [Ca²⁺]_i en diametermetingen continu in realtime vast te leggen.

Het Fura-2AM-signaal van elke LV werd gekalibreerd op het minimum- en maximumsignaal voor elk schip en gebruikt om de absolute [Ca²⁺]_i te berekenen. Diametermetingen werden gebruikt om contractiele parameters (amplitude, einddiastolische diameter, einde systolische diameter, berekende stroom) en ritmiek (frequentie, contractietijd, relaxatietijd) te berekenen en gecorreleerd met absolute [Ca²⁺]_i metingen.

Inleiding

Het lymfevasstelsel wordt aangetroffen in veel orgaansystemen, waaronder de hersenen, het hart, de longen, de nieren en het mesenterium 1,2,3,4,5,6, en werkt door vloeistof (lymfe) van de interstitiële ruimtes naar de centrale veneuze kanalen te stuwen om de vloeistofhomeostase te behouden ^7,8,9,10. Het begint met blinde lymfatische capillairen in de vasculaire capillaire bedden die uitmonden in verzamelende lymfevaten (LV's). Verzamelende LV's zijn gemaakt van twee lagen cellen: een laag endotheelcellen omgeven door een laag lymfespiercellen (LMC's)^10,11. Het transport van lymfevocht wordt bereikt door zowel extrinsieke krachten (bijv. nieuwe lymfevorming, arteriële pulsaties, centraal veneuze drukschommelingen) als intrinsieke krachten¹².

De intrinsieke kracht voor lymfetransport is de spontane ritmische samentrekking van verzamelende LV's, wat de focus is van de meeste onderzoeken naar de lymfefunctie. Deze intrinsieke lymfepomp wordt voornamelijk gereguleerd door de cyclische stijging en daling van cytosolische, vrije Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). Spontane depolarisatie van het plasmamembraan in LMC's activeert spanningsafhankelijke "L-type" Ca²⁺ (Ca_v1.x) kanalen, waardoor Ca²⁺ instroom en daaropvolgende LV ritmische^{contractie 8,9,10} wordt geactiveerd. Deze rol werd aangetoond door Ca_{v 1.x}te blokkeren met specifieke middelen, zoals nifedipine, die LV-contracties remden en vaatverwijding veroorzaakten^13,14. De voorbijgaande stijging van [Ca^2+]_i of "Ca²⁺ spike" in de LMC's gemedieerd door Ca_v1.x-kanalen kan ook intracellulaire Ca^2+-voorraden mobiliseren door inositoltrifosfaat (IP₃)-receptoren en ryanodinereceptoren (RyR's) op het sarcoplasmatisch reticulum (SR) te activeren15,16,17,18. Huidig bewijs suggereert dat IP 3-receptoren meer bijdragen aan Ca²⁺ die nodig is voor normale LV-contracties in vergelijking met RyRs 15,16,19,20,21; RyRs kunnen echter een rol spelen tijdens pathologie of als reactie op farmaceutische interventie^17,18. Bovendien kan de activering van Ca²⁺-geactiveerde K⁺-kanalen²² en ATP-gevoelige kalium (K_ATP) kanalen^23,24 het LMC-membraan hyperpolariseren en spontane contractiele activiteit remmen.

Er zijn veel andere ionenkanalen en eiwitten die de dynamiek van Ca²⁺ kunnen reguleren bij het verzamelen van LV's. Het gebruik van methoden om veranderingen in Ca²⁺ en vatcontractiliteit als reactie op farmacologische middelen in realtime te bestuderen, is belangrijk om deze potentiële regulatoren te begrijpen. Een eerdere methode waarbij Fura-2 werd gebruikt om relatieve veranderingen in LV [Ca²⁺]_i te meten, is beschreven²⁵. Omdat de dissociatieconstante voor Fura-2 en Ca²⁺ bekend is²⁶, is het mogelijk om de werkelijke concentraties van Ca²⁺ te berekenen, wat de toepassing van deze methode verbreedt en extra inzicht geeft in Ca²⁺ -signalering, membraanprikkelbaarheid en contractiliteitsmechanismen²⁷, en die basislijnvergelijkingen tussen experimentele groepen mogelijk maakt. Deze laatste benadering is gebruikt bij cardiomyocyten²⁸ en kan daarom worden aangepast aan LV's. Dit artikel presenteert een verbeterde methode die deze twee benaderingen combineert om veranderingen in absolute [Ca²⁺]_i en vatcontractiliteit/ritmiek continu in realtime te meten en te berekenen in geïsoleerde, onder druk staande LV's. We bieden ook representatieve resultaten voor LV's die met nifedipine zijn behandeld.

Protocol

Negen tot 13 weken oude mannelijke Sprague-Dawley-ratten werden gekocht bij een commerciële verkoper. Na aankomst werden alle ratten gehuisvest en onderhouden in de faciliteit van de University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Division of Lab Animal Medicine (DLAM) op een standaard laboratoriumdieet en blootgesteld aan 12 uur licht:donkercyclus bij 25 ^°C. Alle procedures werden uitgevoerd volgens het goedgekeurde protocol voor diergebruik #4127 door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van UAMS.

1. Dissectie en canulatie van mesenteriale LV's

OPMERKING: Het is belangrijk om de perfusiekamer op te zetten voorafgaand aan de isolatie van de mesenteriale LV's om ervoor te zorgen dat er geen onderbreking van de stroom of lek is die het experiment zou verstoren.

1. Bereiding van het perfusiebad
   1. Koop micropipetten van borosilicaatglas (1,2 mm buitendiameter, 0,68 mm binnendiameter en getrokken tot een buitentipdiameter van 75-100 μm) bij een commerciële verkoper. Snijd en polijst micropipetten (ook wel canules genoemd) tot een lengte van ongeveer 1-2 cm voor montage in de perfusiekamer van het geïsoleerde vat.
   2. Sluit elke gemonteerde glazen canule in de perfusiekamer van het vat aan op onafhankelijke drukopnemers die zich in lijn bevinden met onafhankelijke door zwaartekracht gevoede drukregelaars met behulp van polyethyleenslangen.
      OPMERKING: Dit maakt onafhankelijke manipulatie van de instroom- en uitstroomdruk mogelijk, afhankelijk van de onderzoeksopzet. Figuur 1 toont deze opstelling in detail.
   3. Vul de perfusiekamer (5 ml), glazen micropipetten en onafhankelijke door zwaartekracht gevoede drukregelaar samen met polyethyleen slangen met fysiologische zoutoplossing (PSS; 119 mM NaCl; 24 mM NaHCO₃; 1,17 mM NaH₂PO₄; 4,7 mM KCl; 1,17 mM MgSO₄; 5,5 mM C₆H₁₂O₆ (glucose); 0,026 mM C₁₀H₁₆N₂O₈ (EDTA); en 1,6 mM CaCl₂) vrij van luchtbellen. Klem vervolgens de druk vast zodat de canules niet onder druk komen te staan.
      OPMERKING: De pH van deze oplossing is ~7,5. In het perfusiebad wordt een pH van 7,4 gehandhaafd met behulp van CO₂ dat borrelt om in te werken op het bicarbonaatbuffersysteem in het PSS, zoals beschreven in stap 1.3.7. EDTA wordt hier gebruikt om overtollige Ca^2+- ionen te cheleren.
2. Voorbereiding van knopen
   1. Bind dubbele platte knopen onder de microscoop met behulp van gevlochten zijden hechtdraad (maat 8-0). De belangrijkste stappen worden geïllustreerd in figuur 2.
      1. Scheid een enkel filament.
      2. Gebruik twee Dumont #5 pincetten met microstompe punten en maak met één pincet een dubbele lus rond de punt van de andere pincet.
      3. Pak met de tang met lus het losse uiteinde van de hechtdraad vast en trek deze door beide lussen, zorg ervoor dat de knoop niet volledig dichttrekt en er een kleine opening overblijft.
      4. Gebruik de Vanna-veerschaar om overtollige hechting aan beide kanten af te knippen. Gebruik deze knopen later om de LV op de canules te bevestigen.
         OPMERKING: Gebruik niet dezelfde pincet waarmee u gaat ontleden of cannuleren, omdat er meer kans is op beschadiging van de uiteinden van de pincet tijdens het leggen van de knoop.
3. Isolatie en canulatie van mesenteriale LV's
   1. Dieren diep verdoven door een overdosis van 5% isofluraan toe te dienen met een overdosis van 1,5 l/min O₂ en bloedverbloeden door onthoofding.
   2. Isoleer hele mesenteriums voor dissectie van mesenteriale LV's door eerst een snede in de lengte te maken langs de middellijn van de buikwand, het mesenterium naar buiten te halen en vervolgens de verbinding net onder de pylorussluitspier en ~2-3 cm boven de blindedarm en de verbinding met het rectum door te knippen.
   3. Was de ontlede hele mesenteriën in 200 ml ijskoud PSS en breng ze vervolgens over naar en speld ze vast in een met siliconen beklede (8-10 mm) petrischaal (100 mm) met ijskoud PSS.
   4. Ontleed mesenteriale LV's van de tweede orde uit het omliggende vet en bindweefsel met behulp van een stereomicroscoop, dissectie Dumont #5 Inox fijne pincet en Vanna veerschaar. Om de uiteinden van de LV's te helpen identificeren nadat ze uit het weefsel zijn verwijderd, laat u een klein stukje vet achter aan het proximale uiteinde van de LV.
   5. Breng de ontlede LV's over naar de perfusiekamer van het vat voor canulatie op glazen canules.
   6. Gebruik twee voorgeslepen Dumont #5 Inox fijne pincetten, met een rechte punt (0,05 x 0,01 mm) om LV's te cannuleren met het distale uiteinde van de LV op de P1-canule (instroom) en het proximale uiteinde van het vat op de P2-canule (uitstroom) om de richting van de lymfestroom na te bootsen.
      OPMERKING: P1- en P2-canules zijn identiek en verschillen alleen door welk uiteinde van de LV is aangesloten. Het is belangrijk om een tang te gebruiken die perfect aansluit aan de punt en zonder schade om het grijpen van de dunne vaatwand te vergemakkelijken.
      1. Schuif een enkele voorgebonden knoop op elke glazen canule om het vat later op de canules te bevestigen.
      2. Gebruik het kleine stukje vet om de LV-richting te helpen oriënteren en kanuneer eerst het distale uiteinde op P1.
      3. Schuif de knoop langs de canule naar beneden en draai deze vast om de LV vast te zetten. Zorg ervoor dat u de canulepunt niet te strak aandraait en breekt.
      4. Breng de LV onder druk tot 4-5 mm Hg in de perfusiekamer.
         OPMERKING: Voor onze doeleinden stellen we de P1- en P2-druk zo in dat deze gelijk is; Afhankelijk van de experimentele omstandigheden kan de druk echter bij elke canule worden aangepast om schuifspanning of terugstroming te induceren.
      5. Herhaal stap 1.3.6.1-1.3.6.4 om het proximale uiteinde van de LV op P2 te cannuleren.
   7. Plaats de borrelsteen met 7% kooldioxide (CO₂)/93% zuurstof (O₂) in de badkamer om de fysiologische pH op peil te houden.
   8. Sluit de kamer aan op de temperatuurregelaar en stel deze in op 37 ^°C voor LV's om in evenwicht te komen en stabiele, spontane weeën te ontwikkelen (ongeveer 30 min).
      OPMERKING: Figuur 1 toont deze opstelling in detail.

2. Meting van absolute concentraties van [Ca²⁺]_i in LV's

1. Fura-2AM-kleuring van gecanuleerde LV's
   1. Nadat er spontane weeën zijn ontstaan (vanaf stap 1.3.8), incubeer LV's met Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2AM; 2 μM of 10 μL/5 ml) en pluronzuur (PA; 0,02% W/V of 5 μL/5 ml 20% PA) gedurende 30 minuten in het donker.
      OPMERKING: Na de toevoeging van Fura-2AM moeten alle resterende stappen in het donker worden uitgevoerd.
   2. Vervang de oplossing na 30 minuten 3x in de perfusiekamer door het volledige badvolume te legen met een onderdrukvacuüm en te vervangen door op temperatuur afgestemde (37 ^oC) reagensvrije PSS.
      NOTITIE: Dit moet snel worden gedaan om de tijd dat de LV in de lucht hangt tot een minimum te beperken. Gebruik beide handen, bijvoorbeeld de rechterhand voor vacuüm en de linkerhand voor het vervangen van nieuw reagensvrij PSS.
   3. Na het wassen LV's 15 minuten in het donker incuberen om overtollige indicator te verwijderen en ontestering mogelijk te maken.
2. Het vastleggen van Ca²⁺ fluorescentie en vatdiameter
   1. Breng de kamer over naar de omgekeerde fluorescentiemicroscooptafel die is uitgerust met een LED-lichtbron, een 20x S Fluor-objectief, een celframing-adapter en een snel CMOS-videocamerasysteem, dat frame-voor-frame fluorescentie-opname bij 15 Hz mogelijk maakt.
      OPMERKING: Een schema van deze workflowinstelling wordt weergegeven in afbeelding 3. Het Ca^2+- signaal kan worden vastgelegd met een CCD-camera met ten minste 15 fps.
   2. Sluit de microscoop aan op de computer die is uitgerust met beeldvormingssoftware om fluorescentie en randdetectie vast te leggen.
      OPMERKING: De software waarnaar wordt verwezen, maakt ook gelijktijdige drukregistratie mogelijk; Dat is hier echter niet opgenomen.
   3. Schakel de LED-lichtbron en de interface van het fluorescentiesysteem in.
      OPMERKING: De hier beschreven software-instructies zijn voor de software waarnaar wordt verwezen, maar andere software kan worden gebruikt om deze gegevens te verkrijgen.
   4. Open software (IonWizard).
   5. Selecteer onder het tabblad Bestand de optie Nieuw.
   6. Selecteer op het tabblad Verzamelen de optie Experiment.
   7. Laad het gewenste experimentele sjabloon en klik op OK.
      OPMERKING: U moet een experimenteel sjabloon instellen met de parameters die moeten worden gemeten. Instructies voor het instellen van sjablonen zijn te vinden in de softwarehandleiding²⁹.
   8. Pas de sporen op het scherm aan om de diameter van het vat, de teller (signaal 340), de noemer (signaal 380) en de verhouding in aflopende volgorde te zien.
   9. Pas de schaal van de y-as indien nodig aan om de sporen te visualiseren.
      1. Selecteer onder Traces de optie Gebruikerslimieten bewerken. Zorg ervoor dat Automatische limieten niet is ingeschakeld.
      2. Selecteer de parameter die u wilt aanpassen, voer de minimum- en maximumwaarden voor de as in en selecteer vervolgens OK.
   10. Als u het experiment wilt starten, klikt u op START (onder aan het scherm).
   11. Om de LV-diameter tegelijkertijd te meten, gebruikt u de randdetectiesoftware die in het beeldvormingssysteem is ingebouwd en die contractiele sporen van LV's genereert bij 3 Hz. Gebruik deze metingen om contractiele en ritmische parameters te analyseren die worden beschreven in sectie 3 en weergegeven in figuur 4.
       1. Zorg ervoor dat u de verlichting zo aanpast dat de LV-muur als donkere lijnen wordt weergegeven.
       2. Selecteer een interessegebied (ROI) dat vrij is van vet en puin. Zodra het experiment is gestart, mag u deze ROI niet verplaatsen.
       3. Zorg ervoor dat de drempelwaarde zo is ingesteld dat de rand van de tankwand gedurende de gehele contractiecyclus wordt gedetecteerd.
   12. Voor fluorescentiemetingen zet u de Photomultiplier Tube (PMT) aan.
   13. Prikkel Fura-2, een ratiometrische indicator, door afwisselend 340 en 380 nm golflengten te gebruiken in blootstellingen van 50 ms met behulp van LED-verlichting, en leg de emissiespectra vast bij 510 nm bij 15 Hz over het hele beeldvormingsveld.
       OPMERKING: Het is belangrijk om alle optische parameters (excitatie-instellingen, emissiefilters, objectieflens en dichroïsche spiegels) hetzelfde te houden voor een hele reeks experimenten om reproduceerbare Ca^2+- metingen te verkrijgen.
   14. Meet de signaal-achtergrondverhouding door eerst de 340 en 380 fluorescentie te verkrijgen met de LV in het midden van het gezichtsveld (signaal) en vervolgens met behulp van de podiummanipulatoren het gezichtsveld naar de rand van het bad te verplaatsen zonder vat (zorg ervoor dat de met siliconen beklede rand wordt vermeden en/of door vuil uit het bad te verwijderen) om de achtergrond vast te leggen.
       OPMERKING: Het is belangrijk om elke keer terug te navigeren naar het oorspronkelijke gedeelte van het vaartuig voor Ca²⁺ metingen.
   15. Vervang de badoplossing door op temperatuur afgestemde reagensvrije PSS om de overtolligheidsindicator in het bad te verwijderen. Er kunnen meerdere badwisselingen nodig zijn om overtollig Fura-2 te verwijderen, dus herhaal deze uitwisseling totdat de signaal-achtergrondverhouding ongeveer 10:1 is.
   16. Registreer het baseline Fura-2-fluorescentiesignaal en spontane contracties gedurende ongeveer 30 minuten, gevolgd door een cumulatieve concentratierespons van nifedipine (NIF; 0,1-100 nM), een spanningsafhankelijke Ca_v1.x-antagonist. Verkrijg achtergrondmetingen voor elke geneesmiddelconcentratie.
   17. Was aan het einde van elk experiment LV's met temperatuurafgestemde Ca²⁺-vrije PSS om het minimale Fura-2-fluorescentiesignaal (R_min) en de maximale diameter van de LV's te verkrijgen in afwezigheid van Ca²⁺. Zorg ervoor dat u de achtergrond meet.
       OPMERKING: De Ca²⁺-vrije PSS heeft dezelfde samenstelling als PSS maar zonder CaCl₂, en EDTA is vervangen door 1 mM EGTA (C₁₄H₂₄N₂O₁₀) (pH ~7,5).
   18. Vervang de badoplossing door op temperatuur afgestemde PSS die 10 mM^{Ca 2+} en ionomycine (10 μM IONO), een Ca²⁺ ionofoor, bevat om het maximale Fura-2-fluorescentiesignaal (R_max) en de minimale diameter van de LV's te verkrijgen in omstandigheden van verzadiging van Ca²⁺. Zorg ervoor dat u de achtergrond meet.
3. De formule voor het meten van absoluut [Ca²⁺]_i
   1. Gebruik R_min en R_max om de verhouding van 340 en 380 nm golflengten te kalibreren en de absolute cytosolische vrije Ca²⁺ concentratie ([Ca²⁺]_i) te berekenen.
   2. Bereken de absolute cytosolische vrije Ca^2+- concentratie ([Ca²⁺]_i) met behulp van vergelijking (1)²⁶:
      (1)
      Waarbij K_d = 225 nM (dissociatieconstante voor Fura-2)²⁶, R = 340/380 verhouding, R_min = 340/380 verhouding in afwezigheid van Ca²⁺, R_max = 340/380 verhouding met verzadiging Ca²⁺ voorwaarden, S_vrij = 380 signaal in afwezigheid van Ca²⁺, S_gebonden = 380 signaal met verzadiging Ca²⁺ voorwaarden
      OPMERKING: Alle fluorescerende signalen zijn gecorrigeerd voor achtergrondfluorescentie.
   3. Figuur 5 is een voorbeeld van een Ca^2+- trace waarin wordt aangegeven welke parameters worden geregistreerd. Definieer basislijn Ca²⁺ als de laagste rustende Ca²⁺ voorafgaand aan de Ca²⁺ piek en piek Ca²⁺ als de hoogste Ca²⁺ bereikt tijdens de Ca²⁺ piek. Amplitude is het verschil tussen piek en basislijn Ca²⁺. Exporteer alle parameters rechtstreeks vanuit de beeldvormingssoftware, behalve de frequentie van de Ca²⁺ piek die offline moet worden berekend als het aantal Ca²⁺ pieken/s. Hieronder staan de belangrijkste stappen binnen de software waarnaar wordt verwezen om deze parameters te verkrijgen.
      OPMERKING: Volledige sporen kunnen worden geëxporteerd naar een .txt bestand en alle parameters kunnen worden geanalyseerd of berekend in de software van uw keuze.
   4. Markeer voor R_min het gedeelte van de Numerator-trace dat overeenkomt met de achtergrond tijdens Ca²⁺-vrije PSS. Er wordt een dialoogvenster geopend waarin de waarden voor dit gedeelte van de tracering worden opgegeven.
   5. Selecteer onder Bewerkingen de optie Constanten.
   6. Selecteer Calcium-Numerieke achtergrond en voer de achtergrondnummers in voor de teller en noemer uit de vorige stap. Klik op OK.
   7. Markeer het gedeelte van de Ratio-trace dat overeenkomt met de laagste ratio tijdens Ca²⁺-vrije PSS. Dit is R_min. Let ook op de noemerwaarde voor dit gedeelte; dit is S_vrij.
   8. Herhaal stap 2.3.4 tot en met 2.3.7 voor R_max en S_gebonden met het gedeelte van de tracering dat overeenkomt met hoge Ca²⁺ vrije PSS en hoogste verhouding.
   9. Selecteer onder Bewerkingen de optie Constanten.
   10. Selecteer Calcium-calciumkalibratie en voer de waarden in die worden vermeld in vergelijking 1. Klik op OK.
   11. Pas een van de traceringen op het scherm aan zoals beschreven in stap 2.2.8, zodat u Calcium-numeriek afgetrokken calcium kunt zien.
   12. Voer een monotone transiëntanalyse uit om de resterende parameters te verkrijgen. Instructies hiervoor zijn te vinden in de softwarehandleiding³⁰.
   13. U kunt ook onder Exporteren de optie Huidige tracering selecteren.
   14. Selecteer de locatie waarnaar u het .txt bestand wilt exporteren en klik op OK.
       OPMERKING: Zorg ervoor dat u op de individuele trace klikt die u wilt exporteren. U kunt de hele tracering of geselecteerde secties van de tracering exporteren.

3. Meting van LV-contractiliteit en ritmiek

1. De randdetectiesoftware die in het beeldvormingssysteem is ingebouwd, genereert contractiele sporen voor LV-diametermetingen zoals hierboven beschreven. Gebruik deze metingen om contractiele en ritmische parameters te analyseren. Figuur 4 is een voorbeeld van een contractiel spoor dat aangeeft welke contractiele parameters moeten worden vastgelegd. Exporteer alle parameters rechtstreeks vanuit de beeldvormingssoftware met behulp van de functie Monotonic Transient Analysis op het diameterspoor³⁰, behalve de frequentie van de samentrekkingen, de berekende stroom en het interval, die offline moeten worden berekend.
   OPMERKING: Volledige sporen kunnen worden geëxporteerd naar een .txt bestand en alle parameters kunnen worden geanalyseerd of berekend in de software van uw keuze met behulp van de onderstaande vergelijkingen.
2. EDD-, ESD-, amplitude-, frequentie- en berekende debietmetingen
   1. Meet de maximale en minimale diameters (respectievelijk einddiastolische diameter [EDD] en eindsystolische diameter [ESD]) die de LV's kunnen bereiken tijdens hun ritmische en spontane samentrekkingen.
   2. Bereken de amplitude van contracties (AMP) als het verschil tussen EDD en ESD.
   3. Bereken de frequentie als het aantal weeën per meetperiode (in s).
   4. Bereken het berekende debiet per μm met behulp van vergelijking (2):
      Berekend debiet = π/4(EDD²- ESD²)F (2)
      Waarbij EDD² = dwarsdoorsnede van het vat tijdens ontspannen toestand, ESD² = maat van de dwarsdoorsnede van het vat tijdens vernauwing, F = frequentie van contracties/s
3. Ritmiek: samentrekking en ontspanningstijd:
   1. Andere maten voor LV-ritmiek zijn contractietijd en ontspanningstijd.
   2. Definieer de contractietijd als de tijd die de LV nodig heeft om bij elke contractie ESD te bereiken.
   3. Definieer de ontspanningstijd als de tijd die de LV nodig heeft om de EDD te bereiken voor elke ontspanning, wat een algemene indicatie geeft van de ritmiek gecorreleerd met absolute [Ca²⁺]_i binnen een bepaald tijdsbestek.
   4. Bereken de intervaltijd (ΔT) uit vergelijking (3).
      Δt = t2 _(ESD2)-t1 _(ESD1) (3)

Resultaten

Contractiliteit van LV's en overeenkomstige veranderingen in cytosolische, vrije Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) werden beoordeeld in geïsoleerde mesenteriale LV's van ratten bij blootstelling aan variërende concentraties nifedipine (NIF; 0,1-100 nM) (Figuur 6). De parameters, waaronder Ca²⁺ piekamplitude, baseline Ca²⁺ en piek Ca²⁺, vertoonden een concentratie-afhankelijke reductie met de incrementele toevoeging van NIF aan de perfusiekamer (Figuur 7A). Tegelijkertijd vertoonden contractiele parameters zoals contractieamplitude en berekend debiet ook een stapsgewijze afname (Figuur 7B). Er was een kleine toename van de EDD-diameter met NIF (Figuur 7B). Ca²⁺ piekfrequentie en contractiefrequentie lijken een alles-of-niets-reactie te zijn. Dit effect trad echter op bij 10 nM voor één LV, terwijl alle LV's de contracties met 100 nM hadden gestaakt. De gecombineerde gegevens genereren dus grafieken die lijken op een graduele concentratierespons. Dit effect komt overeen met eerdere publicaties die NIF gebruikten op LV's in andere preparaten (draad- en drukmyografie^13,14). Manhattan-grafieken tonen de individuele LV-responsen voor metingen van ritmiek, inclusief interval, contractietijd en ontspanningstijd (Figuur 7C). Dit type gegevensrepresentatie stelt de onderzoeker in staat om deze alles-of-niets-reacties of variabiliteit in contractieritmes te plagen om extra inzicht te geven in onderliggende mechanismen. Uiteindelijk resulteerden de dalingen in contractie-amplitude en frequentie in een vermindering van de berekende stroom door deze geïsoleerde LV's, die dient als een surrogaatindicator voor in vivo functie. Over het algemeen correleerde de afname van de LV-contractiliteit met de afname in [Ca²⁺]_i. Onze bevindingen leveren direct bewijs dat binnen het bereik van 100 nM, NIF contracties en [Ca²⁺]_i oscillaties in LV's effectief stopte door Ca_{v 1.x-kanalen}aanwezig in lymfespiercellen (LMC's) te antagoniëren.

Figuur 1: Afbeelding van de opstelling van de geïsoleerde vatkamer. Bij onderzoek naar de perfusie van bloedvaten werd gebruik gemaakt van een geïsoleerde bloedvatkamer die was uitgerust met een thermoregulator. De zwaartekracht werd gebruikt om de druk te regelen via een PSS-reservoir. De druk werd bewaakt door transducers die waren aangesloten op zowel instroom- (P1) als uitstroomcanules (P2). Afkorting: PSS = fysiologische zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbereiding van de knoop in één oogopslag. (A) Voorbereiding van dubbele lus onder de dissectiemicroscoop met behulp van een enkel filament van 3-laags zijden hechtdraad, (B) het losse uiteinde vastpakken en door beide lussen trekken, (C) de knoop aan beide uiteinden trekken om een kleine opening te behouden, en (D) het overtollige filament aan beide kanten afknippen en de blauwe doos met een gebruiksklare volledige dubbele bovenhandse knoop. Schaalbalk = 1,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Schema van de experimentele workflow voor gegevensverzameling. Een gezonde rat werd verdoofd met 5% isofluraaninductie en onthoofding werd uitgevoerd om rompbloed te verwijderen. Er werd een incisie in de middellijn uitgevoerd om het mesenterium bloot te leggen en te isoleren. Het geïsoleerde mesenterium werd uitgespreid in een ijskoude PSS-oplossing en een LV werd vetvrij ontleed voor canulatie in een geïsoleerde vatperfusiekamer. Het bad werd op de tafel van de omgekeerde microscoop geplaatst met behulp van een 20x objectieflens. Het schip werd afwisselend opgewonden met licht met een golflengte van 340 en 380 nm en de emissiespectra van fluorescerende spectra werden verzameld met behulp van een CCD-camera op 510 nm. De computer die op de microscoop was aangesloten, genereerde de contractiele en Ca^2+- sporen met behulp van software voor fluorescentie-opname en randdetectie. Schaal balk = 1 mm. Afkortingen: PSS = fysiologische zoutoplossing; LV = lymfevat; CCD = charge-coupled device. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatief LV-contractiel spoor. (A) Voorbeeldopname van veranderingen in diameter van gecanuleerde LV's geladen met Ca²⁺ beeldvormingsindicator Fura 2 AM in PSS en (B) een ingezoomd spoor om alle parameters met betrekking tot de contractiliteit van het vat weer te geven: EDD, ESD, AMP en frequentie. Deze waarden werden gebruikt om ritmiek en stroming te berekenen. Afkortingen: PSS = fysiologische zoutoplossing; LV = lymfevat; EDD = einddiastolische diameter; ESD = diameter van de eindsystolische lijn; AMP = amplitude. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatief LV Ca²⁺ beeldvormingsspoor. (A) Voorbeeldopname van veranderingen in absolute [Ca²⁺]_i in gecanuleerde LV's geladen met Fura-2 in PSS en (B) een ingezoomd spoor om alle parameters (piek, amplitude en basislijn) te tonen die verband houden met [Ca²⁺]_i (niet achtergrondgecorrigeerd). Afkorting: PSS = fysiologische zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: LV-contractiliteit en Ca²⁺ beeldvorming in één oogopslag. Representatieve sporen die overeenkomen met (A) diameter, (B) 340/380 verhouding, en (C) absolute [Ca²⁺]_i van PSS baseline, nifedipine, een Ca_v1.x (Ca²⁺) kanaalantagonist, concentratierespons, inclusief R_min en R_max. Afkortingen: PSS = fysiologische zoutoplossing; LV = lymfevat; NIF = nifedipine; R_min = minimaal Fura-2 fluorescentiesignaal; R_max = maximaal Fura-2 fluorescentiesignaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Ca²⁺ oscillatie en bijbehorende contractiliteit geblokkeerd door nifedipine in LV's. (A) Ca²⁺ (n = 3) en (B) contractiele (n = 3) parameters daalden op een concentratie-afhankelijke manier met de toevoeging van nifedipine, een spanningsafhankelijke Ca_v1.x (Ca²⁺) kanaalantagonist. (C) Representatieve Manhattan-grafieken tonen het gemiddelde tijdsinterval (Δt) tussen weeën en contractie- en relaxatietijden. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Afkortingen: PSS = fysiologische zoutoplossing; LV = lymfevat; NIF = nifedipine; EDD = einddiastolische diameter; AMP = amplitude. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Vanwege de fragiele en kleine aard van LV's, is het absoluut noodzakelijk om de grootste zorg te betrachten tijdens zowel dissectie- als canulatieprocessen. Zelfs kleine schade aan het vat kan leiden tot de ontwikkeling van een niet-levensvatbare LV of aanleiding geven tot afwijkingen in [Ca^2+]_i transiënten. Consistentie in excitatie-instellingen is even cruciaal gedurende de gehele experimentele reeks om vergelijkbaarheid in [Ca²⁺]_i metingen tussen controle- en behandelde groepen te garanderen. Het niet handhaven van uniforme instellingen brengt een aanzienlijk risico met zich mee van over- of onderschatting van [Ca²⁺]_i voor schepen binnen een experimentele serie. Evenzo is het net zo belangrijk om tijdens elk experiment hetzelfde vaatgebied nauwkeurig te identificeren en te controleren.

Het gebruik van de ratiometrische indicator Fura-2AM normaliseert fluorescentievariaties die worden veroorzaakt door ongelijke weefseldikte, fluorofoorverdeling/lekkage of fotobleken, problemen die vaak voorkomen bij kleurstoffen met één golflengte. ³¹ Dit maakt de in dit protocol beschreven continue monitoring mogelijk. Aangezien Fura-2 echter werkt door Ca²⁺ te cheleren, is het mogelijk om de LV's te overbelasten en de [Ca^2+]_i die beschikbaar is voor contractie of geneesmiddelrespons te verminderen. In deze gevallen kunnen Ca²⁺ pieken nog steeds worden waargenomen terwijl ritmische contracties afwezig zijn. Variërende LV-lengte kan ook bijdragen aan dit fenomeen. Hoewel deze Ca²⁺-metingen waarschijnlijk nog steeds geldig zijn, kan het nodig zijn om de concentratie van Fura-2AM in gerepliceerde opstellingen te verminderen om zowel Ca²⁺- als diametermetingen met succes te bereiken. Onze resultaten omvatten alleen LV's waarvoor zowel Ca²⁺ pieken als ritmische contracties aanwezig waren bij baseline.

Het meten van R_min en R_max zijn cruciale stappen bij het berekenen van absolute [Ca²⁺]_i. Omdat R_min de Fura-2 verhouding zou moeten zijn bij afwezigheid van Ca²⁺, is een hoge concentratie EGTA toegevoegd aan de Ca²⁺-vrije PSS om de chelatie van eventueel achtergebleven Ca²⁺ te garanderen. De eerste studies werden uitgevoerd met EDTA in de Ca²⁺-vrije PSS, en dit resulteerde in sporadische vaatcontracties met overeenkomstige Ca²⁺ pieken. Voor R_max is een hoge concentratie Ca²⁺ toegevoegd aan de PSS samen met een ionofoor, ionomycine, om het [Ca^2+]_i-signaal te maximaliseren. De oplossing met een hoog^Ca-2+-gehalte kan neerslaan, waardoor de EDTA uit de PSS moet worden verwijderd. Belangrijk is dat deze aanvullende metingen van R_min en R_max de mogelijkheid bieden om fysiologisch relevante veranderingen in [Ca²⁺]_i te evalueren, wat informatie kan opleveren over membraanprikkelbaarheids- en contractiliteitsmechanismen²⁷ en ook basislijnvergelijkingen tussen experimentele groepen mogelijk kan maken in vergelijking met protocollen die alleen een 340/380-verhouding voor Fura-2 rapporteren. Het niet bereiken van adequate R_min- en R_max-waarden sluit de mogelijkheid uit om absolute [Ca²⁺]_i te berekenen.

Vanwege de contractiele aard van de LV's kan deze methode alleen een maat bieden voor globale Ca^2+-niveaus in plaats van lokale Ca^2+-afgiftegebeurtenissen die kunnen worden gemeten in verlamde vaten³². Deze methode is echter voordelig om veranderingen in de absolute [Ca²⁺]_i dynamiek te correleren met contractiliteit in vergelijking met methoden die gebruik maken van verlamde vaten of individuele cellen^28,32. Voor deze benadering wordt aangenomen dat het merendeel van de gemeten Ca²⁺ afkomstig is van de lymfespiercellen. Endotheelcellen, die ook aanwezig zijn in deze geïsoleerde LV's, kunnen echter bijdragen aan het totale Ca^2+-signaal dat is waargenomen³³. Deze bijdrage kan worden geschat met behulp van LV's die zijn ontdaan van endotheel³⁴. LV-contracties kunnen er ook toe leiden dat de vaatwand tijdens de contractiecyclus iets in en uit focus verschuift. Daarom is het belangrijk om korte vaatsegmenten te gebruiken die strak kunnen worden getrokken, maar zonder het vat uit te rekken.

Naast de toepassing in LV's, kan deze methode worden gebruikt om geïsoleerde vaten van andere vasculaire bedden, waaronder arteriolen en aders, te bestuderen en is veelbelovend voor mogelijk gebruik in de neurobiologie en andere takken van de vasculaire biologie. Het onderzoeken van de effecten van verschillende agonisten of antagonisten die zich richten op verschillende signaaltransductieroutes is een andere manier om de onderliggende Ca^2+- dynamiek te onderzoeken. Bovendien kan deze techniek ook worden gebruikt voor vergelijkend onderzoek met controle- en behandelde monsters van de respectievelijke dieren. Bovendien is deze aanpak aanpasbaar voor implementatie op cellulair niveau, zoals in geïsoleerde lymfespiercellen, waarvoor minimale aanpassingen aan de perfusiekamer en microscoopobjectieven nodig zijn. Samenvattend biedt deze methode fysiologisch relevant inzicht in de globale^{Ca 2+-} dynamiek, aangezien deze correleert met contractiliteit en ritmiek in LV's en biedt het een robuuste beoordeling van potentiële regulatoren van Ca^2+- dynamiek bij het verzamelen van LV's.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
20x S Fluor objectief	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Verenigde Staten)	UPlanSApo
Borosilicaat glazen micropipetten	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Verenigde Staten)	GCP-75-100
Calciumchloride (CaCl2)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Verenigde Staten)	BP510-500
Koolstofdioxide (CO2)	nexAir (Memphis, TN, Verenigde Staten)	UN3156
Dissectiepincetten	Fine Science Tools (Foster City, CA, Verenigde Staten)	11254-20
EDTA (C10H16N2O8)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Verenigde Staten)	BP118-500
EGTA (C14H24N2O10)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Verenigde Staten)	O2783-100
Fura-2AM	Invitrogen (Waltham, MA, Verenigde Staten)	F1221
Glucose (C6H12O6)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Verenigde Staten)	D16-500
Graviteitsvoedingsdrukregelaar	Op maat gemaakt in het laboratorium
Verwarmingseenheid	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Verenigde Staten)	TC-09S
Beeldvormingssoftware	IonOptix (Westwood, MA, Verenigde Staten)
Omgekeerde fluorescentiemicroscoop	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Verenigde Staten)	IX73
Ionomycine	Invitrogen (Waltham, MA, Verenigde Staten)	I24222
IonOptix Cell Framing Adaptor	IonOptix (Westwood, MA, Verenigde Staten)	665 DXR
Isofluraan	Piramal Critical Care (Telangana, India)	NDC 66794-017-10
Geïsoleerde vaatperfusiekamer	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Verenigde Staten)	CH-1
Knoopvoorbereidingstang	Fine Science Tools (Foster City, CA, Verenigde Staten)	11253-20
LED-lichtbron	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Verenigde Staten)	TL4
Magnesiumsulfaat (MgSO4)	Acros Organics (New Jersey, NJ, Verenigde Staten)	213115000
MyoCam-S3 Fast CMOS-videosysteem	IonOptix (Westwood, MA, Verenigde Staten)	MCS300
Nifedipine	Sigma (St. Louis, MO, Verenigde Staten)	N7634
Oogheelkundige hechtingen
Zuurstof (O2)	nexAir (Memphis, TN, Verenigde Staten)	UN1072
Pluroniczuur	Sigma (St. Louis, MO, Verenigde Staten)	P2443
Kaliumchloride (KCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Verenigde Staten)	BP366-500
Drukbewakingssysteem	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Verenigde Staten)	PM-4
Druktransducer	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Verenigde Staten)	PT-F
Silicoongevoerde petrischaal	Op maat gemaakt in het laboratorium
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Verenigde Staten)	BP328-500
Natriumchloride (NaCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Verenigde Staten)	BP358-212
Natriumfosfaat (NaH2PO4)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Verenigde Staten)	BP329-500
Sprague-Dawley-ratten	Envigo RMS (Indianapolis, IN, USA)	Mannelijk	9-13 weken oud
Stereomicroscoop	Leica Microsystems (Wetzlar, Duitsland)	S9D
Vannas-veerknippers	Fine Science Tools (Foster City, CA, Verenigde Staten)	15000-03