Dit protocol schetst de gedetailleerde stappen van het pre-embedden van immuno-elektronenmicroscopie, met een focus op het verkennen van synaptische circuits en eiwitlokalisatie in het netvlies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Onderzoek naar retinale circuits en moleculaire lokalisatie door pre-embedding immuno-elektronenmicroscopie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het netvlies bestaat uit talrijke cellen die verschillende neuronale circuits vormen, die de eerste fase van het visuele pad vormen. Elk circuit wordt gekenmerkt door unieke kenmerken en verschillende neurotransmitters, die de rol en functionele betekenis ervan bepalen. Gezien de ingewikkelde celtypen in zijn structuur, vormt de complexiteit van neuronale circuits in het netvlies een uitdaging voor exploratie. Om retinale circuits en overspraak beter te onderzoeken, zoals het verband tussen kegel- en staafpaden, en nauwkeurige moleculaire lokalisatie (neurotransmitters of neuropeptiden), zoals de aanwezigheid van substantie P-achtige immunoreactiviteit in het netvlies van muizen, gebruikten we een pre-embedding immuno-elektronenmicroscopie (immuno-EM) methode om synaptische verbindingen en organisatie te onderzoeken. Deze benadering stelt ons in staat om specifieke intercellulaire synaptische verbindingen en nauwkeurige moleculaire lokalisatie te lokaliseren en zou een leidende rol kunnen spelen bij het onderzoeken van de functie ervan. Dit artikel beschrijft het protocol, de gebruikte reagentia en gedetailleerde stappen, waaronder (1) voorbereiding op de netvliesfixatie, (2) pre-embedding immunokleuring en (3) post-fixatie en embedding.
Inleiding
De complexiteit van neuronale circuits in het netvlies vormt een uitdaging voor exploratie, gezien de diverse celtypen binnen de structuur 1,2. De eerste stap omvat het identificeren van synaptische verbindingen tussen verschillende cellen en het bepalen van de cellulaire lokalisatie van specifieke neurotransmitters of neuropeptiden. Naarmate de moleculaire biologie vordert en nieuwe eiwitten introduceert, wordt nauwkeurige lokalisatie in het netvlies cruciaal voor het begrijpen van hun functies en het analyseren van netvliescircuits en synaptische verbindingen 3,4,5.
Vanwege de beperkte resolutie van lichtmicroscopie wordt elektronenmicroscopie (EM) vaak gebruikt om de subcellulaire structuren van zenuwcellen te detecteren. EM heeft verschillende classificaties, waarbij conventionele transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt gebruikt voor het observeren van ultrastructuren van cellen 6,7,8,9. Immuno-elektronenmicroscopie (immuno-EM), die de ruimtelijke resolutie van EM combineert met het chemische identificatievermogen van antilichamen die specifiek aan eiwitten binden10, onderscheidt zich als de optimale en exclusieve methode voor het onderzoeken van synaptische verbindingen en subcellulaire eiwitlokalisatie in het netvlies11,12.
Immuno-EM-technieken kunnen worden onderverdeeld in pre-embedding en post-embedding methoden op basis van de volgorde van inbedding en antilichaamincubatie. Vergeleken met de post-embedding methode is de pre-embedding benadering in staat tot grootschalige en langeafstandsidentificatie 13,14,15, wat een optimale aanpak biedt voor het bestuderen van celprocessen zoals axonen en dendrieten. Bovendien biedt deze techniek een sterk signaal en een breed gezichtsveld, waardoor het voordelig is voor uitgebreid onderzoek naar eiwitexpressie en moleculaire lokalisatie in het cytoplasma. Deze methode blijkt bijzonder waardevol te zijn om ervoor te zorgen dat chemisch geïdentificeerde structuren zichtbaar zijn in het hele cytoplasma, de cellen of het netvlies.
De post-inbeddingsmethode heeft echter een lagere penetratie of diffusie in vergelijking met de pre-inbeddingsmethode, maar is niet zo gevoelig16,17. In eenvoudige bewoordingen, als het doel is om de lokalisatie van specifieke neurotransmitters in het cytoplasma of de synaptische terminals te onderzoeken, is de pre-embedding immuno-EM de voorkeursmethode. Omgekeerd wordt voor het identificeren van de lokalisatie van membraanreceptoren meer aanbevolen om post-embedding immunogold EM te gebruiken.
Gezien deze overwegingen kiezen we voor de pre-embedding immuno-EM-methode om ons te verdiepen in retinale circuits, inclusief de interactie tussen kegel- en staafroutes, en moleculaire lokalisatie, zoals de distributie en synaptische organisatie van substantie P-achtige immunoreactiviteit (SP-IR) in het netvlies van muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De verzorging en behandeling van dieren werden goedgekeurd door het reglement van de ethische commissie van de Wenzhou Medical University in overeenstemming met de ARVO-richtlijnen. Volwassen muizen (C57BL/6J, mannetje en vrouwtje, 8 tot 12 weken oud) werden in dit onderzoek gebruikt. De apparatuur en reagentia die nodig zijn voor het onderzoek staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Voorbereiding op retina-fixatie
- Monteer de volgende materialen en gereedschappen: een ontleedmicroscoop, twee pincetten met zeer fijne punten, een schaar, een injectiespuitnaald van 1 ml (naalddikte: G26) en filtreerpapier.
- Verdoof muizen diep door intraperitoneale injectie van 2,2,2-tribroomethanol met 0,25 mg/g lichaamsgewicht. Onthoofd vervolgens de muizen en snijd hun hoofden16.
- Ontdoe hun ogen met een elleboogschaar en plaats ze in een glazen schaal met 4% paraformaldehyde-0,2% picrinezuur in 0,1 M fosfaatbuffer (PB; pH 7,4).
- Prik onder de ontleedmicroscoop een gat in de limbus van het hoornvlies met behulp van een spuitnaald van 1 ml en knip het voorste segment af met een schaar, volg het gat. Verwijder vervolgens de lens met een pincet van het binnenste netvliesoppervlak.
- Gebruik twee tangen om de sclera voorzichtig af te pellen totdat het netvlies volledig is geïsoleerd van de oogschelp (het cuppy netvliesweefsel is volledig gescheiden van het vaatvlies). Snijd vervolgens het netvlies in vier stukken.
- Fixeer deze secties in 4% paraformaldehyde-0,2% picrinezuur in 0,1 M PB (pH 7,4) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) en breng het weefsel vervolgens over in 4% paraformaldehyde in 0,1 M PB (pH 10,4) 's nachts bij 4 °C.
2. Immunokleuring vooraf inbedden
- Na zesmaal 10 minuten wassen in 0,01 M PBS (pH 7,4), incubeer u de retinale weefsels in 1% natriumboorhydride (NaBH4) in 0,01 M PBS (pH 7,4) gedurende 30 min.
- Was de retinale secties minstens zes keer in 0,01 M PBS (pH 7,4). Verwijder intussen het glasvocht met filtreerpapier en snijd het netvlies vervolgens met een tweesnijdend scheermesje in kleine plakjes tussen 100-300 μm.
- Na blokkering met 5% normaal geitenserum (NGS) in 0,1 M PB (pH 7,4) gedurende 1 uur bij RT, incubeer de plakjes netvlies met primaire antilichamen (Anti-konijn PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) samen met 2% NGS in 0,01 M PBS (pH 7,4) gedurende 2 uur bij RT op een shaker. Vervolgens 96 uur (5 dagen) bij 4 °C op een shaker incuberen.
- Na zes keer wassen gedurende 10 minuten elk in 0,01 M PBS (pH 7,4), incubeer de plakjes netvlies met het secundaire antilichaam op 1:200, zoals geit anti-konijn IgG, samen met 2% NGS in 0,01 M PBS (pH 7,4) gedurende 2 uur bij RT op een shaker. Vervolgens 48 uur (2 dagen) bij 4 °C incuberen op een shaker.
OPMERKING: Secundaire antilichamen werden alleen toegepast in controle-experimenten. - Was de netvliesstrepen in 0,01 M PBS (pH 7,4) zesmaal gedurende 10 minuten voordat u ze incubeert met reagens A en reagens B uit de ABC-kit op 1:100 in 0,01 M PBS (pH 7,4) gedurende 2 dagen bij 4°C. (Zowel reagens A als reagens B werden verdund met 0,01 M PBS. Bijvoorbeeld: Een oplossing: 6 μl; B-oplossing: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, totaal 600 μl).
- Was de netvliesstrepen in 0,05 M Tris-buffer (pH 7,2) driemaal gedurende 10 minuten elk. Broed vervolgens de netvliesstrepen voor met 5% reagens 1 en 5% reagens 3 uit de DAB-kit in gedestilleerd water gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. (De verhouding bijvoorbeeld: reagens 1: 50 μl; reagens 3: 50 μl; gedestilleerd water: 900 μl, totaal 1000 μl).
- Kleur de netvliesstrepen met DAB. Voeg achtereenvolgens dezelfde hoeveelheid oplossing uit drie buisjes in de DAB-kit toe (reagens 1-reagens 2-reagens 3). Observeer de kleuringstoestand met behulp van de dissectiemicroscoop. Stop de kleuring wanneer de cellen bruin worden; Dit proces duurt 10-20 minuten.
- Was de netvliesstrepen met 0,05 M Tris-buffer (pH 7,2) driemaal gedurende 10 minuten en was vervolgens zesmaal gedurende 10 minuten in 0,01 M PBS.
3. Postfixatie en inbedding
- Fixeer de netvliesstrepen in 2% glutaaraldehyde gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur (RT) en was vervolgens zes keer gedurende 10 minuten in 0.01 M PBS (pH 7.4).
- Incubeer de netvliesstrepen met 1% osmiumtetroxide (OsO4) in 0,1 M PB gedurende 1 uur bij RT en bewaar ze op een donkere plaats.
- Na zes keer wassen in gedestilleerd water (ddH2O) gedurende 10 minuten elk, incubeer de retinale weefsels met uranylacetaat gedurende 1 uur bij RT en bewaar ze op een donkere plaats om deze weefsels te bevlekken.
- Doe de retinale weefsels in acetonoplossingen (50%, 70%, 80% en 90%) gedurende elk 10 minuten en vervolgens tweemaal 10 minuten in 100%.
- Dompel de netvliesweefsels gedurende 1 uur in een mengsel met hetzelfde volume uranylacetaat en epoxyhars in een droogoven van 37 °C, gevolgd door een mengsel van uranylacetaat en de hars (1:4) een nacht in een droogoven van 37 °C.
- Breng de netvliesweefsels voorzichtig met een tandenstoker over in de nieuwe hars gedurende 1 uur bij 45 °C in een droogoven, en vervolgens wordt de georiënteerde netvliesstreep met de hars in de inbeddingsplaat ingebed.
- Zet het monster 3 uur in een droogoven van 45 °C en 48 uur in een droogoven van 65 °C.
- Vorm de inbeddingsblokken tot trapeziums en snijd het blok in secties van 1 μm dik met een ultramicrotoom, kleur deze secties met toluïdineblauw en screen de interessante gebieden vooraf onder een lichtmicroscoop.
- Verzamel ultradunne secties (70-90 nm) op koperen roosters en bekijk ze onder een elektronenmicroscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont voorbeelden van controle-experimenten zonder de incubatie van primaire antilichamen tegen proteïnekinase C-alfa (PKCα) of SP, waarin geen immunoreactiviteit (IR) werd gevonden.
Figuur 2 toont de PKCα-IR in het netvlies van de muis. PKCα dient als een marker voor alle staafbipolaire cellen (RBC) in het netvlies18. Op het niveau van elektronenmicroscopie (EM) kan R...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel heeft drie cruciale stappen beschreven voor de succesvolle observatie van synaptische circuits en eiwitlokalisatie: (1) snelle en zwakke fixatie, (2) pre-embedding immunokleuring, en (3) post-fixatie en embedding.
We stellen voor dat fixatie de belangrijkste stap is voor een succesvolle pre-embedding immuno-EM-aanpak. Daarom wordt hier het belang van vers fixeermiddel en snelle fixatie benadrukt, waarbij dit principe het "4F-principe" wordt genoemd...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen openbaarmakingen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China (2022YFA1105503), het State Key Laboratory of Neuroscience (SKLN-202103), Zhejiang Natural Science Foundation of China (Y21H120019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL-seringnaald | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Electron Microscopy Science | 19100 | |
| 2,2,2-Tribroomethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Aceton | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| Anti-konijn PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Konijn SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB-substraatkit | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
| Ellboogschaar | Suzhou66 vision company | 54010 | |
| Elektronenmicroscoop | Phillips | CM120 | |
| Eponhars | Electron Microscopy Science | 14910 | |
| Pincet | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Millipore filterpapier | Merck Millipore | PR05538 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | Een component van fosfaatbuffer |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | Een component van fosfaatbuffer |
| Picrinezuur | Electron Microscopy Science | 19550 | |
| Natriumborohydrid (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramicrotoom | Leica | ||
| Uranylacetaat | Electron Microscopy Science | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC-kit, Peroxidase (Konijn IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 |
Referenties
- Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
- Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , JN-RM-0910-23 (2023).
- Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
- Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022(2023).
- Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
- Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
- Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599(2024).
- Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189(2023).
- Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
- Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371(2022).
- Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
- Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526(2019).
- Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525(2023).
- Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
- Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873(2023).
- Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547(2016).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
- Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
- Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
- van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687(2022).
- Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381(2023).
- Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
- Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
- Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
- Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
- Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
- Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
- Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
- Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).
- Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
- Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
