Methodenartikel

Onderzoek naar retinale circuits en moleculaire lokalisatie door pre-embedding immuno-elektronenmicroscopie

DOI:

10.3791/66543

⸱

12 juli 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst de gedetailleerde stappen van het pre-embedden van immuno-elektronenmicroscopie, met een focus op het verkennen van synaptische circuits en eiwitlokalisatie in het netvlies.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het netvlies bestaat uit talrijke cellen die verschillende neuronale circuits vormen, die de eerste fase van het visuele pad vormen. Elk circuit wordt gekenmerkt door unieke kenmerken en verschillende neurotransmitters, die de rol en functionele betekenis ervan bepalen. Gezien de ingewikkelde celtypen in zijn structuur, vormt de complexiteit van neuronale circuits in het netvlies een uitdaging voor exploratie. Om retinale circuits en overspraak beter te onderzoeken, zoals het verband tussen kegel- en staafpaden, en nauwkeurige moleculaire lokalisatie (neurotransmitters of neuropeptiden), zoals de aanwezigheid van substantie P-achtige immunoreactiviteit in het netvlies van muizen, gebruikten we een pre-embedding immuno-elektronenmicroscopie (immuno-EM) methode om synaptische verbindingen en organisatie te onderzoeken. Deze benadering stelt ons in staat om specifieke intercellulaire synaptische verbindingen en nauwkeurige moleculaire lokalisatie te lokaliseren en zou een leidende rol kunnen spelen bij het onderzoeken van de functie ervan. Dit artikel beschrijft het protocol, de gebruikte reagentia en gedetailleerde stappen, waaronder (1) voorbereiding op de netvliesfixatie, (2) pre-embedding immunokleuring en (3) post-fixatie en embedding.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De complexiteit van neuronale circuits in het netvlies vormt een uitdaging voor exploratie, gezien de diverse celtypen binnen de structuur 1,2. De eerste stap omvat het identificeren van synaptische verbindingen tussen verschillende cellen en het bepalen van de cellulaire lokalisatie van specifieke neurotransmitters of neuropeptiden. Naarmate de moleculaire biologie vordert en nieuwe eiwitten introduceert, wordt nauwkeurige lokalisatie in het netvlies cruciaal voor het begrijpen van hun functies en het analyseren van netvliescircuits en synaptische verbindingen 3,4,5.

Vanwege de beperkte resolutie van lichtmicroscopie wordt elektronenmicroscopie (EM) vaak gebruikt om de subcellulaire structuren van zenuwcellen te detecteren. EM heeft verschillende classificaties, waarbij conventionele transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt gebruikt voor het observeren van ultrastructuren van cellen 6,7,8,9. Immuno-elektronenmicroscopie (immuno-EM), die de ruimtelijke resolutie van EM combineert met het chemische identificatievermogen van antilichamen die specifiek aan eiwitten binden10, onderscheidt zich als de optimale en exclusieve methode voor het onderzoeken van synaptische verbindingen en subcellulaire eiwitlokalisatie in het netvlies11,12.

Immuno-EM-technieken kunnen worden onderverdeeld in pre-embedding en post-embedding methoden op basis van de volgorde van inbedding en antilichaamincubatie. Vergeleken met de post-embedding methode is de pre-embedding benadering in staat tot grootschalige en langeafstandsidentificatie 13,14,15, wat een optimale aanpak biedt voor het bestuderen van celprocessen zoals axonen en dendrieten. Bovendien biedt deze techniek een sterk signaal en een breed gezichtsveld, waardoor het voordelig is voor uitgebreid onderzoek naar eiwitexpressie en moleculaire lokalisatie in het cytoplasma. Deze methode blijkt bijzonder waardevol te zijn om ervoor te zorgen dat chemisch geïdentificeerde structuren zichtbaar zijn in het hele cytoplasma, de cellen of het netvlies.

De post-inbeddingsmethode heeft echter een lagere penetratie of diffusie in vergelijking met de pre-inbeddingsmethode, maar is niet zo gevoelig16,17. In eenvoudige bewoordingen, als het doel is om de lokalisatie van specifieke neurotransmitters in het cytoplasma of de synaptische terminals te onderzoeken, is de pre-embedding immuno-EM de voorkeursmethode. Omgekeerd wordt voor het identificeren van de lokalisatie van membraanreceptoren meer aanbevolen om post-embedding immunogold EM te gebruiken.

Gezien deze overwegingen kiezen we voor de pre-embedding immuno-EM-methode om ons te verdiepen in retinale circuits, inclusief de interactie tussen kegel- en staafroutes, en moleculaire lokalisatie, zoals de distributie en synaptische organisatie van substantie P-achtige immunoreactiviteit (SP-IR) in het netvlies van muizen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De verzorging en behandeling van dieren werden goedgekeurd door het reglement van de ethische commissie van de Wenzhou Medical University in overeenstemming met de ARVO-richtlijnen. Volwassen muizen (C57BL/6J, mannetje en vrouwtje, 8 tot 12 weken oud) werden in dit onderzoek gebruikt. De apparatuur en reagentia die nodig zijn voor het onderzoek staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding op retina-fixatie

  1. Monteer de volgende materialen en gereedschappen: een ontleedmicroscoop, twee pincetten met zeer fijne punten, een schaar, een injectiespuitnaald van 1 ml (naalddikte: G26) en filtreerpapier.
  2. Verdoof muizen diep door intraperitoneale injectie van 2,2,2-tribroomethanol met 0,25 mg/g lichaamsgewicht. Onthoofd vervolgens de muizen en snijd hun hoofden16.
  3. Ontdoe hun ogen met een elleboogschaar en plaats ze in een glazen schaal met 4% paraformaldehyde-0,2% picrinezuur in 0,1 M fosfaatbuffer (PB; pH 7,4).
  4. Prik onder de ontleedmicroscoop een gat in de limbus van het hoornvlies met behulp van een spuitnaald van 1 ml en knip het voorste segment af met een schaar, volg het gat. Verwijder vervolgens de lens met een pincet van het binnenste netvliesoppervlak.
  5. Gebruik twee tangen om de sclera voorzichtig af te pellen totdat het netvlies volledig is geïsoleerd van de oogschelp (het cuppy netvliesweefsel is volledig gescheiden van het vaatvlies). Snijd vervolgens het netvlies in vier stukken.
  6. Fixeer deze secties in 4% paraformaldehyde-0,2% picrinezuur in 0,1 M PB (pH 7,4) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) en breng het weefsel vervolgens over in 4% paraformaldehyde in 0,1 M PB (pH 10,4) 's nachts bij 4 °C.

2. Immunokleuring vooraf inbedden

  1. Na zesmaal 10 minuten wassen in 0,01 M PBS (pH 7,4), incubeer u de retinale weefsels in 1% natriumboorhydride (NaBH4) in 0,01 M PBS (pH 7,4) gedurende 30 min.
  2. Was de retinale secties minstens zes keer in 0,01 M PBS (pH 7,4). Verwijder intussen het glasvocht met filtreerpapier en snijd het netvlies vervolgens met een tweesnijdend scheermesje in kleine plakjes tussen 100-300 μm.
  3. Na blokkering met 5% normaal geitenserum (NGS) in 0,1 M PB (pH 7,4) gedurende 1 uur bij RT, incubeer de plakjes netvlies met primaire antilichamen (Anti-konijn PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) samen met 2% NGS in 0,01 M PBS (pH 7,4) gedurende 2 uur bij RT op een shaker. Vervolgens 96 uur (5 dagen) bij 4 °C op een shaker incuberen.
  4. Na zes keer wassen gedurende 10 minuten elk in 0,01 M PBS (pH 7,4), incubeer de plakjes netvlies met het secundaire antilichaam op 1:200, zoals geit anti-konijn IgG, samen met 2% NGS in 0,01 M PBS (pH 7,4) gedurende 2 uur bij RT op een shaker. Vervolgens 48 uur (2 dagen) bij 4 °C incuberen op een shaker.
    OPMERKING: Secundaire antilichamen werden alleen toegepast in controle-experimenten.
  5. Was de netvliesstrepen in 0,01 M PBS (pH 7,4) zesmaal gedurende 10 minuten voordat u ze incubeert met reagens A en reagens B uit de ABC-kit op 1:100 in 0,01 M PBS (pH 7,4) gedurende 2 dagen bij 4°C. (Zowel reagens A als reagens B werden verdund met 0,01 M PBS. Bijvoorbeeld: Een oplossing: 6 μl; B-oplossing: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, totaal 600 μl).
  6. Was de netvliesstrepen in 0,05 M Tris-buffer (pH 7,2) driemaal gedurende 10 minuten elk. Broed vervolgens de netvliesstrepen voor met 5% reagens 1 en 5% reagens 3 uit de DAB-kit in gedestilleerd water gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. (De verhouding bijvoorbeeld: reagens 1: 50 μl; reagens 3: 50 μl; gedestilleerd water: 900 μl, totaal 1000 μl).
  7. Kleur de netvliesstrepen met DAB. Voeg achtereenvolgens dezelfde hoeveelheid oplossing uit drie buisjes in de DAB-kit toe (reagens 1-reagens 2-reagens 3). Observeer de kleuringstoestand met behulp van de dissectiemicroscoop. Stop de kleuring wanneer de cellen bruin worden; Dit proces duurt 10-20 minuten.
  8. Was de netvliesstrepen met 0,05 M Tris-buffer (pH 7,2) driemaal gedurende 10 minuten en was vervolgens zesmaal gedurende 10 minuten in 0,01 M PBS.

3. Postfixatie en inbedding

  1. Fixeer de netvliesstrepen in 2% glutaaraldehyde gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur (RT) en was vervolgens zes keer gedurende 10 minuten in 0.01 M PBS (pH 7.4).
  2. Incubeer de netvliesstrepen met 1% osmiumtetroxide (OsO4) in 0,1 M PB gedurende 1 uur bij RT en bewaar ze op een donkere plaats.
  3. Na zes keer wassen in gedestilleerd water (ddH2O) gedurende 10 minuten elk, incubeer de retinale weefsels met uranylacetaat gedurende 1 uur bij RT en bewaar ze op een donkere plaats om deze weefsels te bevlekken.
  4. Doe de retinale weefsels in acetonoplossingen (50%, 70%, 80% en 90%) gedurende elk 10 minuten en vervolgens tweemaal 10 minuten in 100%.
  5. Dompel de netvliesweefsels gedurende 1 uur in een mengsel met hetzelfde volume uranylacetaat en epoxyhars in een droogoven van 37 °C, gevolgd door een mengsel van uranylacetaat en de hars (1:4) een nacht in een droogoven van 37 °C.
  6. Breng de netvliesweefsels voorzichtig met een tandenstoker over in de nieuwe hars gedurende 1 uur bij 45 °C in een droogoven, en vervolgens wordt de georiënteerde netvliesstreep met de hars in de inbeddingsplaat ingebed.
  7. Zet het monster 3 uur in een droogoven van 45 °C en 48 uur in een droogoven van 65 °C.
  8. Vorm de inbeddingsblokken tot trapeziums en snijd het blok in secties van 1 μm dik met een ultramicrotoom, kleur deze secties met toluïdineblauw en screen de interessante gebieden vooraf onder een lichtmicroscoop.
  9. Verzamel ultradunne secties (70-90 nm) op koperen roosters en bekijk ze onder een elektronenmicroscoop.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont voorbeelden van controle-experimenten zonder de incubatie van primaire antilichamen tegen proteïnekinase C-alfa (PKCα) of SP, waarin geen immunoreactiviteit (IR) werd gevonden.

Figuur 2 toont de PKCα-IR in het netvlies van de muis. PKCα dient als een marker voor alle staafbipolaire cellen (RBC) in het netvlies18. Op het niveau van elektronenmicroscopie (EM) kan RBC worden geïdentificeerd via PKCα-IR, gevisualiseerd door het diaminobenzidine (DAB) reactieproduct met hoge elektronendichtheid. Figuur 2A illustreert een PKCα-positieve RBC-dendriet die een synaps vormt met een staafuiteinde in de buitenste plexiforme laag (OPL), terwijl figuur 2B een kegel-RBC-synaps toont waarbij een PKCα-positieve RBC-dendriet post-synaptisch is ten opzichte van een kegelterminal. Bovendien helpt het DAB-reactieproduct bij het identificeren van RBC-terminals (Figuur 2C) en axonale processen (Figuur 2D) in de binnenste plexiforme laag (IPL).

Figuur 3 toont de expressie van substantie P (SP) in zowel pre- als postsynaptische verbindingen in de IPL van het netvlies van de muis. SP-IR amacriene cellen zijn presynaptisch voor SP-negatieve amacriene cellen (Figuur 3A) en SP-IR amacriene processen (gegevens niet getoond). Bovendien zijn SP-IR-amacriene cellen postsynaptische tot bipolaire uiteinden in respectievelijk de sublaag 3 (S3) en sublaag 5 (S5) niveaus van IPL (Figuur 3B, C). Ons eerdere onderzoek beschrijft de analyse van synapsen waar SP-IR amacriene celprocessen synaptische outputs vormen op andere processen in de IPL19. Met name de subcellulaire lokalisatie van SP wordt meestal gevonden in synaptische blaasjes in de presynaptische uiteinden (Figuur 3).

figure-results-1
Figuur 1: Immuno-elektronenmicrofoto's van controle-experimenten. Zowel de kegelsteel (CP) met twee linten (pijlpunt) (A) als de staafbol (RS) met één lint in de OPL (B) vertoonden geen vlekken. Schaal balken: 500 nm (A), 200 nm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Immuno-elektronenmicrofoto's gelabeld met PKCα-antilichaam in het netvlies van de muis. (A) RS verbindt met één PKCα-positieve RBC (pijlen geven immunoreactiviteit aan) en twee horizontale cellen (H) in de OPL. (B) CP verbindt met PKCα-positieve RBC in de OPL. (C) en (D) tonen respectievelijk de PKCα-positieve RBC-terminal en de axonale processus in de IPL. Schaal balken: 200 nm (A), 500 nm (B), 500 nm (C), 500 nm (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Immuno-elektronenmicrofoto's gelabeld met SP-antilichaam in de IPL van het netvlies van muizen. (A) SP-IR amacriene cel (A+) is presynaptisch voor een SP-negatieve amacriene cel (A-). SP-IR-amacriene cellen ontvingen input van bipolaire terminals in respectievelijk de S3 (B) en S5 (C) niveaus van IPL. Schaal balken: 200 nm (A), 200 nm (B), 200 nm (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel heeft drie cruciale stappen beschreven voor de succesvolle observatie van synaptische circuits en eiwitlokalisatie: (1) snelle en zwakke fixatie, (2) pre-embedding immunokleuring, en (3) post-fixatie en embedding.

We stellen voor dat fixatie de belangrijkste stap is voor een succesvolle pre-embedding immuno-EM-aanpak. Daarom wordt hier het belang van vers fixeermiddel en snelle fixatie benadrukt, waarbij dit principe het "4F-principe" wordt genoemd, dat cruciaal is bij de voorbereiding van weefsel. Het bereiken van zowel een verbeterde penetratie van antilichamen als effectieve fixatie vormt echter een uitdaging20. Om dit aan te pakken, werd glutaaraldehyde tijdens de eerste fixatie vervangen door picrinezuur om de penetratie van antilichamen te verbeteren, aangezien glutaaraldehyde antigene determinanten kan verstoren en de immunokleuring kan beïnvloeden21. Picrinezuur daarentegen behoudt de membraanstructuur en weefselintegriteit beter22, zij het met een compromis in de fixatie-efficiëntie. In de derde stap werd 2% glutaaraldehyde gebruikt voor postfixatie om de weefselfixatie te optimaliseren.

De belangrijkste punten van het hier gepresenteerde protocol omvatten vijf stappen: (1) Vroege fixatie: picrinezuur in een vroeg stadium gebruiken voor een betere penetratie van antilichamen, terwijl de verstoring van antigene determinanten tot een minimum wordt beperkt. (2) Postfixatie: gebruik van 2% glutaaraldehyde om de weefselfixatie na immunokleuring te verbeteren. (3) Reductiebehandeling: Incubatieweefsel in 1% NaBH4 in 0,1 M PB (pH 7,4) gedurende 30 minuten om een groot deel van de immunoreactiviteit te herstellen en de immuunreactiviteit van antigenen en antilichamen te verbeteren, waardoor positieve signalen worden geïntensiveerd23. (4) Weefselvoorbereiding: Het verwijderen van glasvocht en het snijden van netvliesweefsel in kleine reepjes om een effectieve incubatie van antilichamen te vergemakkelijken en uniforme signalen te garanderen. (5) Bovendien is het absoluut noodzakelijk om het netvliesweefsel met de grootste zorg te behandelen en schade te vermijden die latere waarnemingen gedurende de hele procedure in gevaar zou kunnen brengen. Deze maatregelen dragen gezamenlijk bij aan het succes van de pre-embedding immuno-EM-methode, waardoor men diverse aspecten kan bestuderen, zoals kegel-RBC-synapsen24, SP-IR moleculaire lokalisatie19 en de precieze expressie van α-Syn in het netvlies van de muis25.

Voordat het eerste antilichaam wordt geïncubeerd, is het essentieel om netvliesstrips met 2% NGS te blokkeren om niet-specifieke signaalinterferentie te elimineren. De concentratie van het eerste antilichaam moet worden bepaald op basis van het antilichaam zelf, doorgaans hoger dan het antilichaam dat wordt gebruikt voor kleuring van bevroren secties, en moet vooraf worden geoptimaliseerd. Tijdens de incubatieperiode van de primaire antilichamen is continue rotatie van de microcentrifugebuis nodig om volledig contact van de gestapelde netvliesstrips met het antilichaam te garanderen, waardoor onvolledige penetratie van gestapelde delen wordt voorkomen. Om het signaal te versterken, werd DAB voorgeïncubeerd vóór de standaard DAB-kleuring, waarbij de specifieke kleuringstijd doorgaans varieerde van 10-20 minuten. Als de tijd te kort is, kan het signaal te zwak zijn voor observatie, en als het te lang is, kan dit leiden tot vals-positieve signalen, wat het nauwkeurige oordeel beïnvloedt. Over het algemeen is de incubatietijd van kleurstoffen direct afhankelijk van de oppervlaktekleur van het weefsel (bruin tot donkerbruin).

Hoewel er experimenten werden uitgevoerd met het invriezen van weefsel in vloeibare stikstof om het signaal te versterken, zoals eerder vermeld 18,26,27, versterkte deze methode positieve signalen, maar resulteerde in een slechte membraanstructuur van netvliescellen (gegevens niet getoond). Deze structurele degradatie maakte het een uitdaging om de celtypen nauwkeurig te identificeren. Gezien dit werd het netvliesweefsel niet herhaaldelijk bevroren. Om het positieve signaal te versterken, werd de incubatietijd van antilichamen op passende wijze verlengd. Het voorgestelde protocol combineert eerdere voordelen en vereenvoudigt de stappen in vergelijking met agar-inbedding. Dit beschermt niet alleen de antigene determinanten van eiwitten, maar behoudt ook de integriteit van celmembranen. Het overkoepelende doel is om synaptische verbindingen en cellulaire lokalisatie van neurotransmitters gedurende het hele pad te onderzoeken. Daarom hebben de DAB-reactieproducten in het protocol geen zilverintensiveringsbehandeling ondergaan, waardoor het meer geschikt is voor het onderzoeken van neurotransmitter-specifieke synaptische verbindingen en routes28.

Momenteel zijn er beperkte methoden voor de chemische identificatie van routes of neurotransmitters op ultrastructureel niveau. Een van die methoden is gecorreleerde licht- en elektronenmicroscopie (CLEM)29,30, die echter beperkt is tot een zeer klein gebied en niet in staat is om verbindingen over de hele route te identificeren. De sterke punten van het vooraf inbedden van immuno-EM liggen in het robuuste signaal, het brede bereik en de mogelijkheid voor analytische positionering en tracking op lange afstand 13,14,15. Deze methode heeft echter ook zijn beperkingen, zoals diffuse signalen, waardoor ze minder specifiek zijn. Voor de precieze lokalisatie van membraanreceptoren, met name die op het membraan, kan het geschikter zijn om post-embedding immunogold EM te gebruiken. Deze techniek maakt het mogelijk om gouddeeltjes direct te tellen, waardoor de analyse van het aantal en de variabiliteit van deze membraanreceptoren wordtvergemakkelijkt16.

In de toekomst is de integratie van pre-embedding immuno-EM met volume EM veelbelovend als een effectieve methode voor de langetermijnexploratie van geïdentificeerde neurale circuits, die de toekomstperspectieven vertegenwoordigt voor de verdere ontwikkeling van deze methode. Deel EM richt zich op structuurreconstructie, waarbij het vertrouwt op morfologie voor de identificatie van specifieke structuren, zonder nauwkeurige chemische identificatie31,32. Door pre-embedding immuno-EM te combineren met volume-EM, kunnen specifieke structuren of stoffen worden geïdentificeerd tijdens driedimensionale reconstructie, wat een meer uitgebreide en visueel intuïtieve benadering biedt voor de identificatie van neurale circuits.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen openbaarmakingen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China (2022YFA1105503), het State Key Laboratory of Neuroscience (SKLN-202103), Zhejiang Natural Science Foundation of China (Y21H120019).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL-seringnaaldkangdelai
1% OsO4Electron Microscopy Science19100
2,2,2-TribroomethanolSigma-AldrichT48402
8% GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
8% ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
AcetonElectron Microscopy Science10000
Anti-konijn PKCSigma-AldrichP4334
Anti-Konijn SPAbcamab67006
DAB-substraatkitMXB BiotechnologiesKIT-9701/9702/9703
EllboogschaarSuzhou66 vision company54010
ElektronenmicroscoopPhillipsCM120
EponharsElectron Microscopy Science14910
PincetSuzhou66 vision companyS101A
Millipore filterpapierMerck Millipore PR05538
Na2HPO4· 12H2OSigma71650Een component van fosfaatbuffer
NaH2PO4· H2OSigma71507Een component van fosfaatbuffer
PicrinezuurElectron Microscopy Science19550
Natriumborohydrid (NaBH4) Sigma215511
TrisSolarbio917R071
UltramicrotoomLeica
UranylacetaatElectron Microscopy Science22400
VACTASTAIN ABC-kit, Peroxidase (Konijn IgG)Vector LaboratoriesPK-4001

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
  2. Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , JN-RM-0910-23 (2023).
  3. Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
  4. Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022(2023).
  5. Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
  6. Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
  7. Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599(2024).
  8. Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189(2023).
  9. Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
  10. Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371(2022).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526(2019).
  13. Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525(2023).
  14. Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
  15. Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873(2023).
  16. Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547(2016).
  17. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
  18. Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
  19. Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
  20. van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687(2022).
  21. Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381(2023).
  22. Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
  23. Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
  24. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  25. Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  26. Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
  27. Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
  28. Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
  29. Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
  30. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).
  31. Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
  32. Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Synaptic ConnectionsPre Embedding ImmunostainingRetinal Neuronal CircuitsSubstance P ImmunoreactivityRod Bipolar CellsOuter Plexiform LayerDAB Staining

Gerelateerde artikelen