Methodenartikel

Monochrome Multiplex kwantitatieve PCR-telomeerlengtemeting

DOI:

10.3791/66545

⸱

22 maart 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Tulane University, 2Native American Center for Health Professions, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, 4Department of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison, 5School of Science and Engineering, Tulane University, 6Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Boston Children’s Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de relatieve telomeerlengte (TL) met behulp van de monochrome multiplex kwantitatieve polymerasekettingreactie (MMqPCR) assay. De MMqPCR-test is een herhaalbare, efficiënte en kosteneffectieve methode voor het meten van TL uit menselijk DNA in populatiestudies.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomeren zijn ribonucleoproteïnestructuren aan het einde van alle eukaryote chromosomen die DNA beschermen tegen schade en de chromosoomstabiliteit behouden. Telomeerlengte (TL) is in verband gebracht met verschillende blootstellingen, biologische processen en gezondheidsresultaten. Dit artikel beschrijft het monochrome multiplex kwantitatieve polymerasekettingreactie (MMqPCR) testprotocol dat routinematig in ons laboratorium wordt uitgevoerd voor het meten van relatief gemiddelde TL van menselijk DNA. Er zijn verschillende op PCR gebaseerde TL-meetmethoden, maar het specifieke protocol voor de MMqPCR-methode dat in deze publicatie wordt gepresenteerd, is herhaalbaar, efficiënt, kosteneffectief en geschikt voor populatiestudies. Dit gedetailleerde protocol bevat alle informatie die onderzoekers nodig hebben om deze test in hun laboratorium vast te stellen. Bovendien biedt dit protocol specifieke stappen om de reproduceerbaarheid van TL-meting te verhogen door deze test, gedefinieerd door de intraklasse-correlatiecoëfficiënt (ICC) over herhaalde metingen van hetzelfde monster. De ICC is een kritische factor bij het evalueren van het verwachte vermogen voor een specifieke onderzoekspopulatie; als zodanig is het rapporteren van cohortspecifieke ICC's voor elke TL-test een noodzakelijke stap om de algehele nauwkeurigheid van populatiegebaseerde studies van TL te verbeteren. Voorbeeldresultaten met behulp van DNA-monsters die zijn geëxtraheerd uit perifere mononucleaire bloedcellen tonen de haalbaarheid aan van het genereren van zeer herhaalbare TL-gegevens met behulp van dit MMqPCR-protocol.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomeren zijn beschermende complexen die aan het einde van alle eukaryote chromosomen worden aangetroffen en zijn samengesteld uit sterk geconserveerde, repetitieve DNA-sequenties en bijbehorende eiwitten. De telomeer beschermt de integriteit van DNA en behoudt de chromosoomstabiliteit. Progressieve verkorting van telomeren treedt op in delende cellen als gevolg van onvolledige DNA-synthese van achterblijvende strengen, DNA-schade en andere factoren 1,2. Verhoogd bewijs ter ondersteuning van telomeerlengte (TL) als biomarker van veroudering en ouderdomsziekten gedurende de menselijke levensduur ging gepaard met een toename van de soorten TL-meettesten die worden gebruikt om de rol van TL te evalueren in onderzoeken naar menselijke blootstelling, ziekte en gezondheid 3,4,5. Meta-analyses hebben associaties van TL gerapporteerd met algehele mortaliteit, blootstelling aan het milieu en gezondheidsresultaten, waaronder kanker, hart- en vaatziekten en diabetes 6,7,8,9,10,11,12,13 . Deze meta-associaties komen voort uit studies die gebruik maken van een van de meer dan twee dozijn verschillende TL-meetmethodologieën, waarbij de sterke punten van associaties de neiging hebben te variëren tussen verschillende methodologieën 14,15,16. Het selecteren van de optimale TL-meetmethode voor een onderzoek is een cruciale stap om nauwkeurige resultaten te garanderen, aangezien elke methode zijn eigen voor- en nadelen heeft 5,17.

Vanwege de relatief lage kosten van reagentia, de snelle doorlooptijd van de test, de schaalbaarheid en de lagere initiële DNA-vereiste, worden PCR-gebaseerde TL-meettechnieken vaak bij voorkeur gebruikt bij het uitvoeren van onderzoeken met grote steekproefpopulaties, onderzoeken met beperkte toegang tot monsters met hoge DNA-concentraties of onderzoeken die prioriteit geven aan een hoge doorvoer. De eerste op PCR gebaseerde TL-meetmethode, de singleplex kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), oorspronkelijk ontwikkeld door Richard Cawthon, maakt gebruik van de verhouding van de fluorescentiesignalen van telomeer (T) en amplificatie van een enkel kopiegen (S), uitgevoerd op afzonderlijke PCR-platen18. In deze benadering worden primers die complementair zijn aan de herhaalde telomeer-DNA-sequenties (T) gebruikt om het totale telomeer-DNA-gehalte in het monster te amplificeren en gekwantificeerd door detectie van de fluorescerende reporter SYBR green. Evenzo worden primers die complementair zijn aan een intergeen gebied van een geconserveerd gen voor één kopie (S) gebruikt om het aantal genoomkopieën te kwantificeren. Deze twee schattingen worden gekwantificeerd ten opzichte van een genomische DNA-standaardcurve die in alle assays in een project wordt gebruikt om plaat-tot-plaatvariatie te beheersen. Door het totale telomeer-DNA (T) te delen door het aantal kopieën van één genoom (S) wordt de T/S-verhouding verkregen, een eenheidsloze, relatieve meting die het gemiddelde telomeergehalte per cel vertegenwoordigt voor een individueel DNA-monster18,19. De T/S-verhouding is dus geen specifieke maat voor functionele lengte; in overeenstemming met de literatuurnormen gebruiken we echter in dit protocol de term gemiddelde TL per steekproef.

Deze methode werd in 2009 verder ontwikkeld toen Richard Cawthon de monochrome multiplex qPCR (MMqPCR)-test beschreef als een benadering om de variabiliteit in de T/S-verhouding ten opzichte van de oorspronkelijke singleplex qPCR-methode19 mogelijk te verminderen. De MMqPCR-test heeft de voordelen van de qPCR-test met als bijkomend voordeel dat T- en S-signalen binnen dezelfde reactieput worden gemeten met behulp van één rapporterende fluorofoor, waardoor de fout ten opzichte van singleplex qPCR wordt verminderd en een hogere precisie en reproduceerbaarheid wordt bereikt19. Bovendien verlaagt deze multiplexmethode mogelijk de kosten en verbetert het de doorvoer, aangezien er half zoveel reacties nodig zijn in vergelijking met de singleplex-test19.

Gezien de voordelen van MMqPCR TL-meting, is deze methode zeer geschikt voor populatiegebaseerde studies van TL-associaties met blootstellingen, gezondheidsresultaten en biologische processen. Het initiëren van de methode kan echter een uitdaging zijn. Om deze uitdagingen aan te pakken, beschrijven we in detail het MMqPCR TL-meetprotocol dat in ons laboratorium wordt gebruikt, waarbij we de belangrijkste stappen benadrukken die zijn geïmplementeerd om de analyseprecisie te vergroten, het risico op besmetting te verminderen en de herhaalbaarheid te verbeteren.

Bovendien schetst dit protocol stappen voor het opschonen van gegevens en het berekenen van de intraclass-correlatiecoëfficiënt (ICC), een belangrijke statistische maat voor de reproduceerbaarheid van TL-metingen2. Met onze representatieve resultaten tonen we aan dat het mogelijk is om hoge ICC's te genereren met behulp van dit protocol. Daarnaast identificeren we stappen voor kwaliteitscontrole (QC) en probleemoplossing die naar verwachting de variatie in de TL-metingen zullen verminderen en de resulterende ICC zullen verhogen. Vanwege de hoge herhaalbaarheid, efficiëntie en kosteneffectiviteit van deze methode is de MMqPCR TL-meting ideaal voor epidemiologisch TL-onderzoek. Figuur 1 geeft een visueel overzicht van de MMqPCR-methode zoals beschreven in dit protocol.

figure-introduction-1
Figuur 1: Overzicht van de methode. Een breed overzicht van de monochrome multiplex kwantitatieve polymerasekettingreactiemethode voor het meten van telomeerlengte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling. Dit protocol beschrijft de MMqPCR-test die wordt uitgevoerd op een meetdiepte van dubbele drievouden, d.w.z. drievoudige metingen van elk monster herhaald over dubbele platen, geïmplementeerd met behulp van twee thermocyclers tegelijk om de doorvoer te verbeteren. Het gebruik van duplicaatplaten is een belangrijke overweging die is gemaakt bij de implementatie van dit protocol om een hoge reproduceerbaarheid te bereiken, zoals aangegeven door hoge ICC's. Hoewel het mogelijk is om minder replicaten te gebruiken, moet de impact op ICC, en vervolgens de kracht en de benodigde steekproefomvang, zorgvuldig worden overwogen en gemeten met elk cohort door elk laboratorium 20,21. Als er slechts één thermocycler beschikbaar is, raden we aan om de meetdiepte (d.w.z. dubbele drievouden) aan te houden en 2 platen achter elkaar te laten lopen.

1. Bereiding en opslag van de voorraad

  1. Voor alle materialen en apparatuur die voor dit protocol worden gebruikt, zie Tabel met materialen. Zie bovendien tabel 1 voor de specifieke reagentia en hoeveelheden die voor de MMqPCR-test worden gebruikt. Als twee platen achter elkaar worden gebruikt, halveert u het volume van het hoofdmengsel terwijl de concentratie behouden blijft, en zorgt u ervoor dat dezelfde reagensaliquots worden gebruikt op opeenvolgende platen van dezelfde test.
    OPMERKING: Alle voorraadreagentia moeten van tevoren worden bereid en gealiquoteerde reagentia moeten voor gebruik volledig worden ontdooid.
  2. Aliquot en bewaar 1x Tris-EDTA, pH 7,6 (TE) in buisjes van 5 ml in volumes van 3 ml bij kamertemperatuur gedurende maximaal 2 jaar.
  3. Aliquot en bewaar 5 M Betaïne in tubes van 5 ml in volumes van 1.280 μL bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
  4. Aliquot en bewaar SYBR Green in volumes van 3 μL in individuele PCR-stripbuisjes bij -20 °C gedurende maximaal 2 jaar, afgedekt met folie en minimaal blootgesteld aan licht.
  5. Bewaar DNA-polymerase in originele buisjes bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
  6. Aliquot en bewaar 10x polymerasebuffer in buisjes van 1,5 ml in volumes van 660 μl bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
    1. Voor 1x bufferverdunningen van 10x polymerasebuffer voegt u 9,9 μL 10x buffer toe aan 89,1 μL PCR-klasse H2O in buisjes van 0,5 ml; Bewaren bij -20 °C voor maximaal 1 jaar.
  7. Aliquot en bewaar 1 M MgCl2 in buisjes van 0,5 ml in volumes van 70 μl bij 4 °C uit de buurt van licht gedurende maximaal 1 jaar.
  8. Bewaar de voorwaartse en achterwaartse telomeer (T) en enkelvoudige (S) kopie gen oligonucleotide gevriesdroogde primers bij kamertemperatuur, uit de buurt van licht. De vier specifieke oligonucleotide-primersequenties worden weergegeven in Tabel 2.
    OPMERKING: Het gen voor één kopie in dit protocol is albumine; als u een ander gen voor één kopie kiest, moeten de primerconcentraties mogelijk worden aangepast om een acceptabele PCR-efficiëntie te garanderen.
    1. Reconstitutie van de primer: Draai elke gevriesdroogde primerbuis gedurende 10 s en plaats vervolgens de buizen gedurende 5 s in een minicentrifuge om ervoor te zorgen dat de gevriesdroogde pellet zich op de bodem van de buis bevindt voordat u 1x TE-buffer toevoegt.
    2. Controleer elke afzonderlijke primerbuis op nM-concentratie ([nM]= alfa) en rehydrateer elke primerbuis door 1x TE toe te voegen die gelijk is aan 10x van de alfawaarde in μL (bijv. als de nM-concentratie op de buis 24,6 nM aangeeft, voeg dan 246 μL van 1x TE toe aan de primerbuis) om een 100 μM-oplossing van elke primer te creëren.
    3. Aliquot voorwaartse en achterwaartse telomeerprimers afzonderlijk in volumes van 16 μL en voorwaartse en omgekeerde albumineprimers afzonderlijk in volumes van 11 μL. Bewaar alle vier de soorten primeraliquots bij -20 °C voor maximaal 6 maanden.
  9. dNTP-mengsel: Vortex 4-8 buizen van elk van de vier dNTPS-typen van 25 mM voorraadoplossingen (d.w.z. 16-32 buizen in totaal) gedurende 10 s, gevolgd door een snelle centrifuge bij kamertemperatuur. Plaats de buisjes in een gelijkmatige verdeling in de buisposities in de minicentrifuge en sluit vervolgens het deksel zodat de machine op volle snelheid kan draaien gedurende ongeveer 5 s.
    1. Voeg in een buisje van 5 ml 200-250 μl uit elk buisje toe, zorg ervoor dat gelijke delen van elk van de vier dNTP-typen worden toegevoegd en draai het dNTP-mengsel in een draaikolf.
    2. Aliquot 210 μL mengsel in buisjes van 0,5 ml en maximaal 1 jaar bewaren bij -20 °C.
  10. Bewaar voorraad DTT bij -20 °C en voorraad 3 M natriumacetaat bij kamertemperatuur.
    1. DTT-oplossing: Meet 0,1545 g DTT af in een getarreerde weegboot op een weegschaal met behulp van een roestvrijstalen spatel.
      LET OP: Dithiothreitol (DTT) is een gevaarlijk reagens. DTT is schadelijk bij inslikken, veroorzaakt huidirritatie en kan ernstig oogletsel veroorzaken. Personen moeten beschermende handschoenen, oogbescherming en gezichtsbescherming dragen bij het hanteren van DTT. Bovendien moeten personen het inademen van DTT-dampen vermijden, in de PCR-kap werken bij het hanteren van DTT en langdurige of herhaalde blootstelling vermijden.
    2. Maak 10 ml 0,01 M natriumacetaat door 33,33 μL 3 M natriumacetaat en 9,967 μL PCR-klasse H2O toe te voegen aan een buis van 15 ml en een draaikolkput. Voeg afgemeten DTT toe aan de tube van 15 ml met 0,01 M natriumacetaat. Breng ongeveer 100 μl van de 0,01 M natriumacetaatoplossing over in de weegboot om de resterende DTT op te vangen. Pipeteer de 100 μL terug in de buis van 15 ml. Zodra alle DTT in de oplossing zit, draai je de buis rond totdat deze volledig is opgelost.
    3. Giet de inhoud van de slang van 15 ml in een vulbak, zuig de hele oplossing op in een plastic spuit van 10 ml vanaf het ene uiteinde van de vulbak. Bevestig een steriel 0,2 μm celluloseacetaatfilter 25 mm aan het uiteinde van de gevulde spuit, laat volledig verzadigen gedurende 1 minuut en druppel de oplossing langzaam in een nieuwe slang van 15 ml door de zuiger van de spuit lichtjes naar beneden te duwen, zorg ervoor dat de hele oplossing door het filter in de nieuwe slang van 15 ml druppelt.
    4. Aliquot DTT-oplossing in volumes van 200 μl in tubes van 0,5 ml en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 weken.

Tabel 1: Eindvolumes en concentraties van de reagentia. Volumes en concentraties van reagentia in individuele aliquots, mastermix en in PCR-putjes. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Telomeer en enkelvoudige kopie gen oligonucleotide primer sequenties. Lijst van de telomeer- en albumine-single-copy genprimersequenties die in de methodologie worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

2. Genomische DNA-extractie en monstervoorbereiding

  1. Extractie van analytische monsters: Voer een genomische DNA-extractie uit voor monsters in overeenstemming met de richtlijnen van de fabrikant met behulp van kits of gevestigde methoden in het laboratorium.
    1. Controleer de kwaliteit van het DNA-monster met een spectrofotometer en dubbelstrengs DNA (dsDNA) met behulp van een fluorometer. Monsters met een onaanvaardbare gemiddelde verhouding van 260/280 en 260/230 of een concentratie dsDNA onder detectie (<0,20 ng/μL) mogen niet worden geanalyseerd op TL22,23. Bovendien, als de dsDNA-concentratie te hoog is om een meting te genereren met behulp van de fluorometer (>1000 ng/μL), verdun dan het monster en herhaal de test.
      OPMERKING: Voor de hier gepresenteerde resultaten waren de aanvaardbare waarden voor de zuiverheid van nucleïnezuren een 260/280-verhouding tussen 1,6 en 2,0 en een 260/230-verhouding tussen 2,0 en 2,2.
  2. Extractie van controlemonsters: Voer een genomische DNA-extractie uit op een controlemonster dat is afgeleid van hetzelfde biologische materiaal als de proefpersonen die voor een bepaald project worden getest. Zorg ervoor dat er voldoende controle-DNA wordt geëxtraheerd voor alle platen die naar verwachting voor het hele cohort zullen worden uitgevoerd, zodat een enkele DNA-standaard wordt gebruikt voor alle tests.
    1. Controleer de kwaliteit van het controle-DNA-monster met een spectrofotometer en fluorometer. Het controlemonster moet een aanvaardbare gemiddelde verhouding van 260/280 en 260/230 hebben en detecteerbare concentraties van dsDNA22,23.
    2. Aliquot controle-DNA bij een concentratie van 2 ng/μL in hoeveelheden van 150 μL in buisjes van 0,5 ml die zijn gelabeld met het monstertype en de datum. Bewaar controle-DNA-aliquots bij -20 °C gedurende maximaal 5 jaar. Gebruik één controle-DNA-monster voor alle platen van alle monsters uit hetzelfde cohort of onderzoeksproject. Bereid deze voorraadaliquots van tevoren voor.
  3. Bereiding van analytische monsters: Voor monsters met een startconcentratie van >5 ng/μl, maakt u verdunningsaliquots met behulp van een verdunningsfactor van een geheel getal, waarbij de juiste hoeveelheid geëxtraheerd DNA-monster (aanvullend bestand 1 MMqPCR set-up sheet, kolom F) en PCR-klasse H2O (aanvullend bestand 1 MMqPCR set-up sheet, kolom G) wordt toegevoegd om de concentratie te verdunnen tot tussen 2,5 - 5,0 ng/μl (aanvullend bestand 1 MMqPCR instelblad, kolom K). Verdun geen monsters met een concentratie <5 ng/μL, maar zorg ervoor dat het voldoende volume is om het monster 3x te testen met behulp van dit protocol.
    OPMERKING: Verdunningsaliquots moeten worden gemaakt tijdens de voorbereiding van het monster, zodat 15 ng DNA kan worden toegevoegd aan de overeenkomstige PCR-stripbuis van elk monster. Met de monsteraliquots kunnen technici voorkomen dat onnodige vries-dooicycli de DNA-integriteit van het voorraadmonster aantasten als het monster niet aan de kwaliteitscriteria voldoet en opnieuw moet worden uitgevoerd. Het MMqPCR-voorbeeldsjabloon in het aanvullende bestand 1 kan helpen bij het identificeren van de juiste verdunningsfactor en volumes om verdunningsaliquots op te stellen (aanvullend bestand 1, MMqPCR Set Up Sheet, kolommen E-I).
    1. Vul PCR-strips met monsters A1-8 in PCR-strip A, monsters B1-8 in PCR-strip B en monsters C1-8 in PRC-strip C, zoals beschreven in het MMqPCR-opstellingsformulier van aanvullend bestand 1 en vermeld in tabel 3 met op de juiste manier verdunde monsterhoeveelheden (aanvullend bestand 1 MMqPCR-opstellingsblad, kolom L) en hoeveelheden van PCR-klasse H2O (aanvullend bestand 1 MMqPCR Set Up Sheet, Kolom M) voor een totale hoeveelheid van 15 ng DNA per PCR-buisje en een totaal volume van 75 μL. Zet het opzij.
      OPMERKING: Monsters in PCR-strips kunnen 's nachts bij 4 °C worden bewaard om de volgende dag te worden geplateerd.
  4. Voorbereiding van de standaardcurve: Ontdooi een controle-DNA-aliquot, vortex gedurende 30 s, centrifugeer gedurende 5 s en zuig het volledige volume (150 μL) op in de eerste buis in de standaardcurve (SC) PCR-buisstrip.
    1. Pipetteer 70 μL PCR-klasse H2O in de tweede tot en met achtste buisjes van de SC PCR-strip. Resuspendeer het controle-DNA grondig in de eerste buis voordat 70 μl wordt opgezogen en in de tweede PCR-buis wordt gedoseerd. Wacht 30 s en resuspendeer de oplossing vervolgens grondig in de tweede PCR-buis voordat u 70 μl opzuigt en in de derde PCR-buis doseert. Herhaal dit voor buisjes drie tot en met zeven om een 2-voudige seriële verdunning van zeven standaarden te creëren. De uiteindelijke buis mag alleen PCR-klasse H2O bevatten om te functioneren als een niet-sjablooncontrole (NTC). Leg de SC PCR-strip opzij.

Tabel 3: Organisatie van de monsters en controlenorm in de plaat. Locatie van alle monsters en normen op een PCR-plaat met 96 putjes. Klik hier om deze tabel te downloaden.

3. Voorbereiding van de MMqPCR-mastermix

  1. Verzamel de aliquots van het mastermix-reagens die in tabel 1 worden vermeld, met uitzondering van DNA-polymerase, en laat ze in de PCR-kap op kamertemperatuur komen. Voeg 1 μL van de SYBR Green aliquot toe aan de 1x buffer aliquot.
    OPMERKING: Deze exacte hoeveelheid is nodig om de juiste concentratie SYBR te genereren vanwege de beperkingen van de pipetnauwkeurigheid tijdens de test, dus zelfs als er slechts één plaat tegelijk wordt uitgevoerd, moet deze hoeveelheid ongewijzigd blijven.
  2. Draai alle aliquots gedurende 10 s, centrifugeer gedurende 5 s en voeg vervolgens de volgende hoeveelheden reagentia toe aan de buis van 5 ml met de 5 M betaïne (nu de hoofdmixbuis): 1.235,2 μL PCR-klasse H2O, 640 μL van de 10x buffer, 204,8 μL van de dNTP's, 192 μL van de DTT, 64 μL van de MgCl2, 48 μL SYBR Green / 1x buffer (uit stap 3.1), 14,4 μL van beide telomeerprimers en 9,6 μL van beide albumineprimers, zoals vermeld in Tabel 1.
  3. Haal DNA-polymerase uit de opslag van -20 °C, draai gedurende 10 s, centrifugeer gedurende 5 s en voeg dan langzaam 128 μL toe aan de mastermix; verplaats DNA-polymerase onmiddellijk terug naar -20 °C opslag.
  4. Vortex de 5 ml master mix tube gedurende 30 s.

4. Bereiding van de plaat met 96 putjes

  1. Plaats twee platen met 96 putjes, een laadbak en meerkanaals pipetpunten in de PCR-kap. Label elk bord met plaatnummer (1 of 2). Draai plaat één (de P1 plaat) 180° zodat de nummers van de kolommen ondersteboven staan. Laat plaat twee (P2) naar de technicus gericht.
  2. Giet de inhoud van de hoofdmengbuis van 5 ml in de laadbak. Gebruik een pipetpunt om eventuele resterende oplossing in de tube op te vangen en te doseren.
  3. Plaats de pipet op de meerkanaalspipet en druk op de onderkant van elke pipetpunt om een goede afdichting te garanderen. Controleer of de tips geen filter hebben in het uitvoergebied waar de mastermix zal worden opgezogen; Als er een stuk filter is, vervang dan de tip.
  4. Gebruik omgekeerd pipetteren om platen te vullen met de stroperige mastermix, draai de laadtrog rond en druk vervolgens de pipetzuiger in tot voorbij de eerste stop, waarbij u meer dan 15 μl in de pipetpunten zuigt, en zorg ervoor dat de tips tegelijkertijd met hetzelfde volume worden gevuld. Wanneer u het mastermengsel in een kolom verwijdert, drukt u de zuiger in tot de eerste stop, zodat het extra mastermengsel in de pipetpunten blijft. Laat de zuiger ingedrukt, dompel de tips terug in de laadbak en laat de zuiger los om de tips te vullen met nog eens 15 μl. Gebruik dezelfde tips om beide platen te vullen.
    1. Vul de platen door het mastermengsel eerst in alle even of alle oneven kolommen te verdrijven, afwisselend tussen de platen (d.w.z. als de technicus ervoor kiest om met oneven kolomnummers te beginnen, wordt eerst kolom 1 op P2 gevuld, gevolgd door kolom 11 op P1, dan kolom 3 op P2, enz.). Nadat de technicus alle putten van de serie (oneven of even) van links naar rechts heeft gevuld, doet u de andere reeksen (even of oneven) kolommen op dezelfde manier. Zie figuur 2 voor een grafiek van dit proces.
      OPMERKING: Deze manier van plaatvullen is bedoeld om te controleren of er positie-effecten over de platen zijn.
  5. Draai de vier gesloten PCR-strips met de monsters en de standaardcurve en draai ze vervolgens elk in een minicentrifuge gedurende 5 seconden.
    1. Lijn de PCR-strips uit in het PCR-buisrek in de volgorde waarin ze op de plaat worden geplaatst. Voor P1 zijn de eerste 3 kolommen monsters (PCR-strip A), kolommen 4-6 zijn de standaard (PCR-strip S), kolommen 7-9 zijn monsters (PCR-strip B) en kolommen 10-12 zijn monsters (PCR-strip C; zie figuur 3 en tabel 3). Aangezien P2 wordt gevuld terwijl het 180° gedraaid is ten opzichte van de technicus, zullen de kolommen het tegenovergestelde zijn.
  6. Draai beide platen 180° zodat de nummers van de kolommen worden omgedraaid ten opzichte van de technicus voor elke plaat (d.w.z. als de technicus eerder naar het label voor P2 keek, zal hij nu naar het label voor P1 op de plaatrand kijken).
  7. Stel de meerkanaalspipet in op 10 μl en plaats de pipetpunten op de meerkanaalspipet zoals beschreven in stap 4.3.
    1. Gebruik de meerkanaalspipet om de oplossingen te resuspenderen en voer vervolgens omgekeerd pipetteren uit zoals beschreven in stap 4.4 om 10 μl van de monsters en standaardoplossingen op te zuigen en te doseren, te beginnen met de PCR-strip A.
    2. Vul de eerste 3 kolommen van elke plaat met PCR-strip A door de kolommen af te wisselen op dezelfde manier als de mastermix in de plaat is geplaatst (d.w.z. even of oneven).
    3. Vul de volgende drie kolommen met behulp van de standaard curve PCR-strip. Resuspendeer voor deze strip de7e standaard verdunningsbuis (voorlaatste) met behulp van een pipet van 200 μl die is ingesteld op ~90 μl, grondig voordat u de hele strip opnieuw suspendeert met behulp van de meerkanaalspipet.
      OPMERKING: Het grotere volume en de kleinere DNA-concentratie in deze buis resulteren vaak in gevarieerde metingen over de PCR-plaatputjes als gevolg van slechte menging. Door een groter volume te gebruiken om deze buis te mengen, wordt de DNA-oplossing beter gehomogeniseerd.
    4. Vul de volgende drie kolommen met PCR-strip B en de laatste drie met PCR-strip C. Plaats de pipetpunten terug tussen elke PCR-strip en vul alle 96 putjes op beide platen met de bijbehorende monsters en controlestandaard zoals aangegeven in figuur 3.
  8. Zodra de platen zijn gevuld, tikt u voorzichtig met de plaat op het tafelblad om ervoor te zorgen dat de vloeistof aan de zijkanten van de putten naar de bodem loopt, en bedek u vervolgens de plaatbladen met afdichtingsfolies. Gebruik de vingertoppen om op alle randen van de film te drukken om een goede afdichting te garanderen.
    1. Meng de platen door ze 30 s op de bovenkant van de kap te draaien en plaats de verzegelde platen vervolgens 2 minuten in de platenspinner met de putopeningen naar het midden gericht.
    2. Plaats de platen in een thermocycler, met de nummers van de kolommen van de platen in leesbare volgorde. Gebruik een schone tissue om de bovenkant van elke plaat schoon te maken voordat u de bovenkant van de thermocycler sluit.

figure-protocol-1
Figuur 2: Proces voor het vullen van platen. (A) Als u ervoor kiest om eerst oneven kolommen te vullen, is dit de volgorde waarin putten worden gevuld. (B) Als u ervoor kiest om eerst even kolommen te vullen, is dit de volgorde waarin de putten worden gevuld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-2
Figuur 3: Lay-out van de plaat. PCR-strip A, strip B, strip C en de standaardcurve (SC)-strip moeten allemaal worden gebruikt om drie kolommen op elke plaat te vullen om dubbele drievouden van elk monster en standaardverdunning te produceren. Dit diagram laat zien welke van de kolommen met elke strook moeten worden gevuld. Plaat twee wordt 180° omgedraaid (merk op dat de kolom- en rijkoppen ondersteboven staan) voordat deze wordt geladen, maar de plaat wordt op dezelfde manier gevuld als plaat één, waardoor mogelijke pipetteerfouten worden geëlimineerd terwijl er nog steeds wordt gecontroleerd op positie-effecten over de platen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. MMqPCR thermocylcing

  1. Terwijl de platen in stap 4.8.1 draaien, zet u de computer en de thermocyclers AAN. Open de thermocycler-software. Dit protocol beschrijft het gebruik van CFX Maestro software.
  2. Maak het TL-thermocyclingprotocol in overeenstemming met MMqPCR-thermocyclingprotocol19 (Figuur 4).
    1. Voeg een incubatiestap toe om het DNA-polymerase bij 95 °C gedurende 15 minuten te activeren.
    2. Om binding van primer-dimeer te voorkomen, voert u twee cycli uit van 94 °C gedurende 15 s, 49 °C gedurende 1 minuut, vervolgens 3 cycli van 94 °C gedurende 15 s, 59 °C gedurende 15 s.
    3. Voeg voor telomeerversterking 27 cycli van 85 °C gedurende 15 s toe, 74 °C gedurende 30 s en vervolgens signaalacquisitie.
    4. Voeg voor albumineversterking 31 cycli van 94 °C gedurende 15 s, 84 °C gedurende 30 s toe en vervolgens signaalacquisitie.
    5. Neem een smeltcurve op van 59 °C tot 95 °C met tussenpozen van 5 s voor elke toenemende graad in het thermische cyclusprotocol.
  3. Klik op Start Run voor beide thermocyclers. Geef desgevraagd een titel op voor de analysebestanden.

figure-protocol-3
Figuur 4: Thermocyclisch profiel van de MMqPCR-test. MMqPCR-protocol gemaakt in de software in overeenstemming met het originele thermocycling-protocol19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Analyse van MMqPCR-gegevens

  1. Wanneer de thermocycling is voltooid, analyseert u de gegevens op de volgende manier om TL-waarden te produceren voor de monsters die zijn verwerkt.
  2. Selecteer in de software de functie Plate Setup . Klik in het dropdown-menu op Plaat bekijken/bewerken.
    1. Markeer alle putjes en klik op Fluoroforen selecteren, vink vervolgens het vakje met het label SYBR aan en schakel alle andere vakjes uit. Klik op OK.
    2. Hoewel alle putten nog steeds zijn gemarkeerd, vinkt u naast het woord Load het vakje naast SYBR aan. Nu zou op alle putten SYBR moeten staan.
    3. Markeer vervolgens de drie NTC-putjes aan de boven- of onderkant van de standaard seriële controleverdunning en selecteer NTC in het menu met monstertypen aan de rechterkant. De drie putten zouden nu geel moeten zijn en NTC moeten heten. Figuur 5A laat zien welke putten geselecteerd moeten worden voor P1 en Figuur 5B laat zien welke putten geselecteerd moeten worden voor P2.
      OPMERKING: P2 wordt omgekeerd vanaf P1, dus de NTC staat onderaan de kolommen 4-6 voor P1 en de bovenkant van de kolommen 7-9 voor P2.
    4. Markeer de 21 putjes van de seriële verdunning voor standaardcontrole en selecteer Standaard in het menu met het monstertype. Deze putten moeten groen zijn. Hoewel deze putten nog steeds zijn gemarkeerd, klikt u op Technisch repliceren. Selecteer 3 in het menu Grootte repliceren en selecteer vervolgens Horizontaal > Toepassen. Deze putjes moeten worden gelabeld in sets van drie van Std-1 tot en met Std-7.
    5. Hoewel de standaard nog steeds is gemarkeerd, scrolt u omlaag en selecteert u Verdunningsserie. Voer in het veld Verdunningsfactor 2 in en typ vervolgens de startconcentratie en richting van de verdunning volgens het plaatnummer zoals beschreven in de volgende stappen.
    6. Voer voor de P1-plaat 2.00E-03 in het veld startconcentratie in en vink het vakje voor Afnemend aan en selecteer vervolgens Toepassen. De waarden in de 21 putjes moeten de concentratiewaarden hebben die in elke put zijn geschreven, variërend van 2.00E-03 tot 3.13E-05 van boven naar beneden.
    7. Voer voor de P2-plaat 3.13E-5 in het veld startconcentratie in en vink het vakje voor Verhogen aan en selecteer vervolgens Toepassen. De waarden in de 21 putjes moeten de concentratiewaarden hebben die in elke put zijn geschreven, variërend van 3.13E-05 tot 2.00E-03 van boven naar beneden.
  3. Markeer voor de monsters de kolommen voor PCR-strip A (1-3 voor P1 en P2), selecteer Onbekend in het menu met monstertypen en selecteer vervolgens Technisch repliceren. Selecteer 3 in het menu Grootte repliceren en selecteer vervolgens Horizontaal > Toepassen. De putjes voor deze kolommen moeten blauw zijn en gelabeld per rij in sets van 3 van Unk-1 tot Unk-8.
    1. Herhaal stap 6.3 voor de kolommen voor PCR-strip B (kolommen 7-9 voor P1 en 4-6 voor P2). Ze moeten worden gelabeld als Unk-9 tot en met Unk-16.
    2. Herhaal stap 6.3 voor de kolommen voor PCR-strip C (kolommen 10-12 voor P1 en P2). Ze moeten worden gelabeld als Unk-17 tot en met Unk-24. Wanneer de stappen 6.2-6.3.2 zijn voltooid, moeten de vensters voor het instellen van de plaat lijken op Figuur 5A,B.
  4. Selecteer OK rechtsonder in het venster van de plaateditor. Klik op Ja om wijzigingen toe te passen wanneer daarom wordt gevraagd.
  5. Zorg er voor QC op analyseniveau voor dat de curven op het tabblad Kwantificering geschikt zijn (bijv. geen omgekeerde amplificatiecurves) voor zowel stap 9 als stap 12 van het thermocyclusprofiel, die overeenkomen met respectievelijk de telomeer- en albumine-amplicons. Curven zijn toegankelijk via het vervolgkeuzemenu in het midden rechtsmidden van het softwarevenster. Figuur 6A,B geeft de juiste curven weer.
    1. Zorg ervoor dat de PCR-efficiënties die worden gerapporteerd voor zowel stap 9 als stap 12 tussen 90% en 110% liggen en dat deze twee efficiënties niet meer dan 10% van elkaar verschillen (d.w.z. 92,4% voor stap 9 en 98% voor stap 12 is geschikt, maar 92,4% voor stap 9 en 108% voor stap 12 is niet passend). Zorg er bovendien voor dat de standaard R2-curve > 0,995 is. Als P1 of P2 niet aan deze criteria voldoet, moeten de platen opnieuw worden uitgevoerd.
  6. Selecteer voor P1 stap 9 en markeer de 21 putjes die overeenkomen met de standaardcurve zoals te zien is in figuur 6A,B. Kopieer de Cq-waarden in de rechterbenedenhoek van het softwarevenster. Open de sjabloon voor het telomeergegevensblad dat beschikbaar is als aanvullend bestand 1 en plak deze waarden in het standaardblad 1, kolom B. Selecteer stap 12 en kopieer vervolgens deze Cq-waarden. Plak deze waarden in het standaard 1 vel, kolom I.
    1. Identificeer de hellingswaarde in stap 9 en typ deze in cel C4 op het standaardblad 1. Identificeer de hellingswaarde in stap 12 en typ deze in cel J4 op het standaardblad 1.
      OPMERKING: Het systeem berekent de procentuele efficiëntie van de primers aan de hand van de hellingen van de standaardcurve die in stap 6.6.1 zijn geïdentificeerd. Het percentage efficiëntie kan handmatig worden berekend met behulp van de volgende formule:
      figure-protocol-4
    2. Zorg ervoor dat de variatiecoëfficiënt (CV) voor elk standaardverdunningsdrievoud kleiner is dan 0,1. Indien groter dan of gelijk aan 0,1, sluit dan maximaal drie afzonderlijke putjes in totaal uit van alle concentraties van controlemonsters die zijn opgenomen in de 7-punts standaard seriële verdunningscurve op de plaat. Slechts één put mag worden uitgesloten van een drievoudset.
      OPMERKING: Als u standaardpunten uitsluit van de analyse op de software, verandert de gerapporteerde helling, R, y-interceptie en efficiëntie voor beide primers. Nadat een standaardputje uit de analyse is verwijderd, moeten de stappen 6.5.1-6.6.1 dus worden herhaald.
    3. Herhaal stap 6.6.1 - 6.6.2 voor het P2-analysebestand en het bijbehorende standaard 2-blad.
    4. Alleen wanneer zowel standaard 1 als standaard 2 bladen zijn ingevuld met acceptabele cv's, verzamelt u individuele voorbeeldgegevens uit de analysebestanden. Zorg ervoor dat QC-aanpassingen worden gerapporteerd in kolom L van het P1 v P2-blad, bijvoorbeeld hoeveel putten zijn uitgesloten in het P1-analysebestand.
  7. Zorg ervoor dat alleen de 72 monsterputten in het P1-analysebestand blauw zijn gemarkeerd op het tabblad Kwantificering, zoals te zien is in Figuur 7A,B. Selecteren Stap 9. Kopieer de Cq- en SQ-waarden in de rechterbenedenhoek van het softwarevenster. Plak deze waarden in het voorbeeld P1-blad, te beginnen in cel D3. Selecteren Stap 12 kopieer vervolgens deze Cq- en SQ-waarden en plak ze in het voorbeeldblad P1, te beginnen in cel F3.
    1. Herhaal deze stap voor de monsters in het P2-analysebestand en de bijbehorende P2-monsterplaat. De verhouding tussen telomeer en enkele kopie (T/S) (kolom H) wordt automatisch berekend, maar kan handmatig worden berekend met behulp van de volgende formule:
      figure-protocol-5
      Waarbij ET/S de efficiëntie is van exponentiële amplificatie voor reacties gericht op respectievelijk het telomeer- of single-copy-gen, en CqT/S de cyclus is waarbij een bepaald duploat gericht op telomeerinhoud of het single-copy-gen de kritische drempel van fluorescentiekwantificering bereikt. De gemiddelde T/S-verhoudingen (kolom I) worden berekend op basis van zes metingen per monster.
      OPMERKING: De monster-ID-nummers in CFX komen niet overeen met hetzelfde biologische monster op de twee platen. De sjabloon voor het telomeergegevensblad houdt rekening met dit verschil en lijnt de juiste dubbele drievouden uit.
    2. Controleer in CFX Maestro of de Cq-waarden voor alle analytische monsters tussen de laagste en hoogste Cq-waarde van de standaardcurve vallen, zoals te zien is in figuur 7B. Als een monster zich buiten het bereik bevindt, zoals te zien is in figuur 7A, moet het opnieuw worden uitgevoerd na aanpassing van de concentratie. Een monster met een Cq-waarde die lager is dan de hoogste concentratienorm moet worden verdund met een factor die ongeveer overeenkomt met het aantal amplificatiecycli dat het buiten het bereik ligt, en een monster met een Cq-waarde hoger dan de laagste concentratienorm moet worden geconcentreerd met een factor die ongeveer overeenkomt met het aantal amplificatiecycli boven de drempelwaarde.
      OPMERKING: Grote variatie in de concentratie van analytische monsters introduceert een extra potentieel niveau van variatie en moet met de nodige voorzichtigheid worden gedaan.
    3. Zorg ervoor dat de startconcentratie in de NTC minder was dan 5% van de gemiddelde hoeveelheid DNA die in de monsterputjes aanwezig was. Dit kan worden gecontroleerd door het percentage waterverontreiniging op de monsters P1 en monsters P2-vellen van de MMqPCR te bekijken. Als de NTC vervuiling aangeeft, voer de platen dan opnieuw uit.
      OPMERKING: Vanwege de gevoeligheid van de MMqPCR-test kan een kleine oncontroleerbare besmetting er af en toe voor zorgen dat de NTC-putjes worden versterkt. Deze amplificatie moet echter gering zijn en meerdere cycli na amplificatie van het enkelvoudige kopie-gen plaatsvinden in stap 12 van het thermocycling-protocol.
    4. Controleer voor QC op monsterniveau de standaarddeviaties (SD) (kolom J) en CV's (kolom K) in monsters P1 en monsters P2-vellen. Zorg ervoor dat de intraplate CV's over de drievoud van de steekproef T/S-ratio's minder zijn dan 0,10 (10%). Om intraplate CV's groter dan 0,1 te corrigeren, kan één T/S-verhouding uit een reeks drievouden worden uitgesloten.
      OPMERKING: Slechts één totale replicatie van de zes metingen per monster kan worden uitgesloten, d.w.z. een replicaat voor hetzelfde monster kan niet worden uitgesloten op zowel P1 als P2.
    5. Controleer of de CV's van de afzonderlijke steekproeftussenplaten in de plaat P1 v P2, kolom G, kleiner zijn dan 0,05 (5%). Om CV's groter dan 0,05 te corrigeren, voert u de uitsluiting uit van één T/S-verhouding van de zes metingen per monster over beide platen. Sluit monsters uit na visuele inspectie over intraplaat-drievouden en alle zes metingen indien nodig.
      OPMERKING: Alleen monsters die voldoen aan deze QC-criteria, intraplaat CV < 10% en interplate CV < 5%, mogen worden opgenomen in de uiteindelijke TL-resultaten. Anders moet het monster worden uitgesloten van P1 v P2- en ICC-gegevensbladen voor deze run en moet het monster opnieuw worden beoordeeld op een tweede MMqPCR-test.
    6. Controleer voor QC op plaatniveau of de gemiddelde variatie binnen de plaat over alle monsters op elke plaat, die zich onderaan de monsters P1 en de P2-vellen van de monsters bevindt, minder is dan 0,05 (5%). Controleer voor extra QC op plaatniveau of de totale variatie tussen de platen P1 en P2, cel G29, minder is dan 0,06 (6%). Zorg ervoor dat monsters die niet door de QC zijn gekomen, worden verwijderd uit de CV-berekening tussen de platen in cel G30.
      OPMERKING: Bij het werken met verwante steekproefgroepen (bijv. familieleden, verschillende tijdstippen, enz.), moeten alle steekproeven in een groep op dezelfde plaat worden uitgevoerd. Als één steekproef van de groep niet voldoet aan de QC-criteria, moeten alle steekproeven in de groep daarom opnieuw worden uitgevoerd.
    7. Noteer in een afzonderlijk algemeen cohort- of experimentgegevensbestand de definitieve TL-gegevens voor elk monster dat QC heeft doorstaan (P1 v P2-blad, kolom I), ICC-berekeningen voor elk monster dat QC heeft doorstaan (ICC-gegevensblad, kolommen E-K) en de QC-gegevens van de uiteindelijke testuitvoering van P1 v P2-blad (kolommen J-L)
  8. Gebruik aanvullend bestand 2 gemaakt door het Telomere Research Network (TRN) om de ICC voor het project20 te berekenen.
  9. Ten slotte, om de vergelijkbaarheid tussen TL-onderzoeken te verbeteren, zet u de uiteindelijke TL-gegevens voor elke steekproef in het afzonderlijke totale cohort- of experimentgegevensbestand om in Z-scores met behulp van de volgende vergelijking, waarbij de gemiddelde T/S-verhouding voor alle steekproeven in het cohort wordt afgetrokken van de individuele steekproef T/S-verhouding en vervolgens wordt gedeeld door de SD over alle steekproeven in het cohort.
    figure-protocol-6

figure-protocol-7
Afbeelding 5: Op software gebaseerde plaatinstelling. (A) Softwarematige plaatinstelling voor een P1-plaat na voltooiing van de stappen 6.2-6.4. (B) Op software gebaseerde plaatinstelling voor een P2-plaat na het voltooien van stap 6.2-6.4. Monster- en standaard-ID's zijn niet uitgelijnd tussen de twee CFX-platen vanwege de manier waarop de software monster-ID's toewijst op basis van de putpositie (d.w.z. CFX-monster 1 op P1 is CFX-monster 24 op P2). De Excel-sjabloon in aanvullend bestand 1 houdt hier rekening mee en zorgt ervoor dat de metingen tussen de platen van hetzelfde biologische monster goed op elkaar zijn afgestemd Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-8
Figuur 6: Standaardcurves voor telomere en albumine amplicons. (A) Deze standaardcurve is afkomstig van de P1-telomeeramplicon van de dataset met representatieve resultaten. Eén standaard werd verwijderd omdat deze niet voldeed aan de QC-criteria. (B) Deze standaardcurve is afkomstig van de P2-albumine-amplicon van de dataset met representatieve resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-9
Figuur 7: Telomeer- en enkelkopie-genamplicons. (A) Telomeeramplificatie en (B) albumine-genamplificatie van monsters gerapporteerd in representatieve resultaten die in de software worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Rapportage van MMqPCR-gegevens

  1. Bij het rapporteren van de resultaten van onderzoek met behulp van de TL-gegevens die zijn gemaakt op basis van de MMqPCR, zorg ervoor dat de items worden gerapporteerd die worden beschreven in de TRN-richtlijnen voor minimale rapportage. Deze richtsnoeren zijn te vinden op de TRN-website (https://trn.tulane.edu/resources/reporting-guidelines/) en een sjabloon voor het rapporteren van deze informatie is opgenomen in aanvullend dossier 3. Citeer dit protocol en andere TRN-richtlijnen en -bronnen waar van toepassing.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De resultaten in Tabel 4 en Tabel 5 bieden een voorbeeld van zeer herhaalbare TL-metingen die worden verkregen door het protocol te volgen. Voor deze resultaten werd DNA geëxtraheerd uit 24 monsters van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) met behulp van een commerciële kit volgens de richtlijnen van de fabrikant. Deze 24 monsters werden over twee platen met 96 putjes geleid. Alle DNA-monsters werden gecontroleerd op kwaliteit via spectrofotometer en fluorometer, waarbij de gemiddelde verhouding 260/280, de gemiddelde verhouding 260/230 en de dsDNA-concentratie werden gebruikt om de geschiktheid voor de test en de verdunningsfactor van het monster te bepalen (tabel 6). Tabel 6 benadrukt ook het belang van het kwantificeren van de dsDNA-concentratie, die kan verschillen van de DNA-concentratie die met een spectrofotometer wordt gemeten. Deze variabiliteit is het resultaat van verschillende benaderingen van kwantificering. In het bijzonder leidt de spectrofotometer de DNA-concentratie af op basis van absorptie bij 280 nm en is hij gevoelig voor fluctuaties als gevolg van verontreinigingen (bijv. eiwit, zout, enz.) die van invloed zijn op de absorptiemetingen. Daarentegen worden dsDNA-concentraties gemeten met behulp van een fluorometer bepaald door de fluorescentie van een kleurstof die specifiek bindt aan dsDNA en als zodanig wordt aangenomen een nauwkeurigere weergave van het DNA-gehalte te zijn. De DNA-monsters ondergingen tot drie vries-dooicycli voorafgaand aan MMqPCR TL-analyse. Het controle-DNA werd gemaakt van gepoolde DNA-extracties van PBMC's van één individu, die werd gebruikt om een zevenpunts seriële verdunning te creëren van 2 ng/μL tot 0,0313 ng/μL DNA. De onafhankelijke standaardcurven die zijn gemaakt voor PCR Stap 9 (telomeeramplicon) en Stap 12 (enkelvoudige kopie genamplicon, albumine in dit protocol) worden weergegeven in Figuur 6A,B. De tests werden uitgevoerd op een commercieel Real-Time PCR-detectiesysteem dat een smeltcurve genereerde die laat zien dat de individuele ampliconproducten bij verschillende temperaturen worden geproduceerd, zoals te zien is in figuur 8.

Tabel 4: Outputgegevens van MMqPCR-meting voor optimale representatieve resultaten. Gemiddelde T/S-ratio's, SD's, CV's en Z-gescoorde TL voor 24 steekproeven. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Gegevensuitvoer van telomeerlengte. Onbewerkte gegevens van de MMqPCR-test worden geanalyseerd in de software en vervolgens toegevoegd aan de spreadsheetsjabloon die is bijgevoegd als aanvullend bestand 1 voor verdere analyse en QC. Dit uitvoerblad van de TL-sjabloon geeft een samenvatting van de gegevens, met voorbeeld-ID's, gemiddelde TL's, SD's en CV's voor elk monster op beide platen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6: Spectrofotometer en fluorometer DNA-kwaliteitsmetriek voor monsterresultaten. QC-gegevens van dubbele spectrofotometeranalyse en enkelvoudige fluorometermeting van dsDNA en eventuele verontreinigingen per monster. Klik hier om deze tabel te downloaden.

figure-results-1
Figuur 8: Voorbeeld smeltcurve. Smeltcurve voor voorbeeldgegevens zoals gegenereerd in de software. De eerdere piek ~80 °C vertegenwoordigt de telomeeramplicon en de secundaire piek bij ~89 °C vertegenwoordigt de albumine-amplicon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor dit project was de gemiddelde telomeerefficiëntie 98,6% met een bereik van 90,7 tot 102,1 en de gemiddelde albumine-efficiëntie was 102,3% met een bereik van 93,6 tot 108,2 over alle runs. Er werden gemiddeld 0,97 replicaten verwijderd van de standaardcurves, wat voldoet aan de QC-criteria van dit protocol. De gemiddelde interplate CV was 1,83% met een SD van 0,00616 en de gemiddelde intraplate CV was 3,78% met een SD van 0,00658. De gemiddelde TL's voor deze representatieve steekproeven zijn weergegeven in tabel 4 en tabel 5. De gemiddelde TL was 1,37 met een SD van 0,24 en een bereik van 0,84 tot 2,32. T/S-ratio, SD, CV en Z-gescoord TL per steekproef staan vermeld in tabel 4. Aangezien de output van de T/S-ratio van de MMqPCR-test een relatieve meting van TL is, werden de ratio's omgezet in deze Z-score om vergelijking tussen studies mogelijk te maken. ICC voor dit project werd berekend met behulp van het R-script zoals beschreven in TRN-richtlijnen in aanvullend bestand 2, waarbij rekening wordt gehouden met batch- en run-effecten20. Om de ICC binnen het project te berekenen, hebben we 10% van de passerende monsters opnieuw uitgevoerd, waarbij we ervoor hebben gezorgd dat de ICC-platen werden gevuld met ten minste één monster van elke plaat van het cohort. De totale project-ICC van 0,801 [CI: 0,703, 0,86] geeft de hoge reproduceerbaarheid van TL-resultaten aan.

Niet alle resultaten zullen optimaal zijn. De resultaten in Figuur 9 en Tabel 7 tonen suboptimale resultaten van de MMqPCR-test. Figuur 9 toont een standaardcurve met een telomeerefficiëntie van minder dan 90%, wat onder de QC-normen ligt, waardoor de hele plaat moet worden herhaald. Problemen met de efficiëntie van de primer zijn meestal te wijten aan een probleem met reagentia, dus het is belangrijk om de datums bij te houden waarop reagentia zijn gealiquoteerd en wanneer ze verlopen als een eerste stap om te bepalen welk reagens verantwoordelijk is voor een lage efficiëntie. Verlopen reagentia moeten worden vervangen voordat de plaat opnieuw wordt gebruikt. Tabel 7 toont een plaat die de initiële QC-criteria op monsterniveau heeft doorstaan, maar een hoge mate van variabiliteit tussen de platen heeft, wat leidt tot QC-falen op plaatniveau. Variatie tussen platen is meestal te wijten aan fouten in pipetteer- en plaatvultechnieken. In dit geval moet de technicus eventuele problemen evalueren die zich hebben voorgedaan tijdens het instellen van de plaat en ervoor zorgen dat de pipetten zijn gekalibreerd.

figure-results-2
Figuur 9: Suboptimale resultaten. Deze standaardcurve die in de software werd weergegeven, slaagde er niet in om QC te doorstaan, aangezien de efficiëntie van de versterking voor de telomeerprimer minder dan 90% was. De afbeelding is van P1, maar P2 had een vergelijkbaar laag rendement. De gegevens van deze run konden niet worden gebruikt en alle monsters moesten opnieuw worden uitgevoerd na vervanging van het causale reagens dat was verlopen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 7: Suboptimale resultaten. De tabel toont de telomeergegevenssjabloon voor een run waarbij veel van de monsters niet voldeden aan de QC-normen. Steekproeven die opnieuw moesten worden uitgevoerd, werden bepaald op basis van CV-waarden, waarna de steekproefnaam werd gewijzigd in een rood lettertype voor eenvoudige identificatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Telomeer gegevens spreadsheet sjabloon. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: ICC-berekening. Dit protocol is opgesteld door het Telomere Research Network (TRN). Dit bestand is gewijzigd van20. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Richtlijnen voor TRN-rapportage. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode die vóór 2002 het meest werd gebruikt voor TL-meting in grotere populatiestudies, was de Southern blot-analyse van terminale restrictiefragmentlengtes (TRF)24,25. TRF biedt, ondanks het feit dat het een uitstekende precisie en reproduceerbaarheid biedt in gespecialiseerde laboratoria, beperkt in toepasbaarheid vanwege de hoeveelheid en kwaliteit van het vereiste DNA en de beperkte doorvoer, waardoor het de achtergrond vormt voor het toegenomen gebruik van op qPCR gebaseerde TL-assays en vervolgens de MMqPCR-test. De MMqPCR TL-methode biedt herhaalbare TL-metingen wanneer deze wordt ingesteld, geoptimaliseerd en onderhouden met zorgvuldige aandacht voor elk QC-criterium. De berekening en rapportage van de specifieke ICC voor elk geanalyseerd cohort is vereist om de betrouwbaarheid van de test te garanderen. Hoewel de MMqPCR-methode afhankelijk is van DNA-kwaliteit en technische expertise, is ze zeer geschikt voor grote populatiestudies die TL onderzoeken, omdat er kleine hoeveelheden DNA voor nodig zijn, ze betrouwbaarder zijn dan singleplex-PCR en efficiënter zijn in reagenskosten en technicustijd dan andere methoden. Het vermogen om hoge ICC's te genereren levert aanvullende gegevens op ter ondersteuning van het gebruik van MMqPCR voor grote populatiegebaseerde onderzoeken naar TL. MMqPCR TL-meting kan worden toegepast op een breed scala aan onderzoeken die de rol van TL willen definiëren als een biomarker van sterfte door alle oorzaken, veroudering, levenslange stress, blootstelling aan het milieu en lichamelijke gezondheidsresultaten zoals hart- en vaatziekten en kanker 4,7,8,10,11,12,13,26,27,28, 29,30,31.

Een beperking van de MMqPCR-methode is dat het TL rapporteert als een T/S-ratio, een relatieve schatting van de lengte die varieert afhankelijk van de selectie van het gen voor één kopie, de samenstelling van de hoofdmix en de PCR-cyclusparameters32. De T/S-verhouding is eenheidloos. Zonder te combineren met andere TL-meetmethoden is deze methode dus niet in staat om schattingen te rapporteren in basenpaarwaarden 18,33,34. Als gevolg hiervan moet de T/S-ratio worden omgezet in een Z-score om relevant te zijn voor alle onderzoeken35. Aanzienlijke voorzichtigheid is geboden bij het uitvoeren hiervan in laboratoria, methoden en tests. Verder kan deze methode, net als bij op gel gebaseerde hybridisatietests, kwantificering van interstitiële telomeren omvatten. Deze sequenties vormen echter een zeer klein deel van de totale telomeer-DNA-inhoud per genoom. Bovendien is het waarschijnlijker dat interstitiële telomeersequenties niet-overeenkomende basenpaarsequenties bevatten die afwijken van canonieke telomeerherhalingen, waardoor de kans op primerbinding en amplificatie afneemt. Bovendien, hoewel de minimale hoeveelheid DNA die nodig is voor de MMqPCR-test voordelig is, is het belangrijk op te merken dat op qPCR gebaseerde metingen van TL worden beïnvloed door pre-analytische factoren die van invloed zijn op de kwaliteit en integriteit van DNA, waaronder opslagcondities voor monsters, DNA-extractiemethodologie en biologisch weefsel36,37. Het is aangetoond dat analytische controle voor deze factoren de externe validiteit van TL-metingen die zijn gegenereerd met behulp van qPCR38 kan verbeteren. Toch moet de impact van verschillen in DNA-kwaliteit op TL gegenereerd door MMqPCR-test specifiek systematisch worden geëvalueerd, aangezien er momenteel geen op gegevens gebaseerde richtlijnen bestaan om te bepalen of een monster van voldoende kwaliteit is om een nauwkeurige schatting van TL te genereren met behulp van deze benadering. Ondanks deze beperkingen zijn de toepassingen van deze test voor studies naar gezondheidsresultaten op populatieniveau aanzienlijk.

Bij gebruik van de MMqPCR-test is een voortdurende beoordeling van de precisie en doorvoer nodig. Zoals het momenteel is ontworpen, voeren technici drievouden van monsters tegelijkertijd uit op dubbele platen met behulp van twee thermocyclers. Als er geen meerdere thermocyclers zijn, raden we aan om dubbele drievoudige metingen en lopende platen achtereenvolgens te behouden voor een betere precisie, zelfs ten koste van een verminderde doorvoer. Elke beslissing om de doorvoer voorrang te geven boven precisie, bijvoorbeeld door gebruik te maken van enkelvoudige metingen, moet vergezeld gaan van grondige tests en evaluatie van de resulterende ICC's voordat wordt overgegaan tot de analyse van analytische monsters. Bij het nemen van beslissingen over doorvoer en precisie moet men rekening houden met de steekproefomvang en de kwaliteit van het monster-DNA. Een kleinere steekproefomvang of DNA-monsters van slechte kwaliteit vereisen het prioriteren van een hogere precisie23. Dit is nog belangrijker bij het werken met steekproeven uit verwante groepen (bijv. familieleden, proefpersonen met meerdere tijdstippen). In deze gevallen is een zorgvuldige planning, bijvoorbeeld het toewijzen van gerelateerde monsters aan dezelfde plaat voordat het experiment wordt gestart, een manier om verlies van statistische kracht te voorkomen door onbedoelde groep voor plaat confounding.

Voor deze test werd een spectrofotometer gebruikt om de kwaliteit van DNA-monsters te beoordelen: monsters binnen het bereik van 1,6-2,0 voor 260/280-verhoudingen en 2,0-2,2 voor 260/230-verhoudingen werden als acceptabel beschouwd. Deze kwaliteitsbeoordeling en de nauwkeurige beoordeling van dubbelstrengs DNA via een fluorometer zijn cruciale stappen in dit protocol voor het verkrijgen van herhaalbare TL-gegevens. Andere, meer beschrijvende metingen van DNA-integriteit, zoals fragmentgrootte en/of samenvattende metingen van DNA-kwaliteit bepaald via agarosegel (bijv. DNA-integriteitsnummer) kunnen ook worden gebruikt bij het bepalen van de monsterkwaliteit38. We raden ook aan om de verdunning van monsters alleen uit te voeren op het moment van monstervoorbereiding voor het uitvoeren van de MMqPCR-test. Dit zorgt ervoor dat DNA-aliquots na extractie zo min mogelijk manipulatie ondergaan, waardoor de variabiliteit in de behandeling vóór de test wordt verminderd. Als DNA-monsters moeten worden vervoerd, moeten ze worden vervoerd op droogijs met de hoogst mogelijke concentratie om de afbraak te verminderen die optreedt in DNA-monsters bij lagere concentraties39,40. Vanwege de afbraak van DNA die optreedt bij vries-dooicycli, moet het aantal vries-dooien om DNA op te slaan tot een minimum worden beperkt41. Aliquots van het gepoolde controle-DNA moeten worden gemaakt voordat het cohort wordt uitgevoerd en aliquots van individuele analytische DNA-monsters moeten worden gemaakt voordat de test wordt uitgevoerd.

Belangrijke meetgegevens voor testprestaties en QC zijn onder meer het NTC-signaal, interplaat- en intraplaat-CV's en standaardcurve R2. Het niet voldoen aan de QC-criteria kan op verschillende manieren worden beperkt. Door de voorraden van PCR-klasse H2O regelmatig te vervangen en de subvoorraden van PCR-klasse H2O voor elk paar platen te aliquoteren, worden bronnen van verontreiniging en NTC-versterking tot een minimum beperkt. Aanvullende stappen om besmetting te verminderen zijn onder meer: het aanwijzen van een specifieke PCR-kap die alleen bedoeld is voor de MMqPCR-test; het afvegen van de PCR-kap en apparatuur met een DNA-ontsmettingsoplossing; het bestralen van de kamer met ultraviolet licht; en het beoefenen van steriele techniek in de PCR-kap. Om de herhaalbaarheid van de test te verbeteren en CV's te verminderen, wordt aanbevolen om monsters, verdunningen en de PCR-strips krachtig te vortexen op hun respectievelijke vortexstappen en grondig te resuspenderen bij het pipetteren van DNA-monsters. Een onder de drempelwaarde standaard R2-curve (<0,995) is hoogstwaarschijnlijk toe te schrijven aan pipetteerfouten tijdens het laden van de plaat. Om dit te voorkomen, moet u zorgvuldig letten op nauwkeurig pipetteren en pipetten jaarlijks kalibreren, standaard PCR-strips krachtig mengen voordat u ze laadt en de benodigdheden zorgvuldig organiseren om een efficiënte workflow te bevorderen. Als wordt waargenomen dat het gebruik van twee machines en één plaat consistent hogere CV's produceert, moet de machine worden onderhouden als een mogelijke manier om het probleem te verhelpen. QC-platen van de fabrikant moeten regelmatig op de platen worden uitgevoerd om de prestaties van de thermocycler te beoordelen.

Als de problemen zich blijven voordoen, zelfs na toepassing van de hierboven aanbevolen stappen, kunnen de volgende stappen worden gebruikt om problemen met het protocol op te lossen. Het bijhouden van wanneer alle reagentia zijn gealiquoteerd en eventuele relevante vervaldatums kan helpen bij het stroomlijnen van het probleemoplossingsproces wanneer er zich onvermijdelijk problemen voordoen. Een belangrijk onderdeel van elk probleemoplossingsproces is om slechts één reagens tegelijk aan te passen om de specifieke oorzaak te bepalen van platen die niet aan de QC-criteria voldoen, te beginnen met het goedkoopste reagens in kwestie. Als bijvoorbeeld zowel het telomeer- als het gen voor een enkele kopie een lage efficiëntie hebben, zijn gedeelde reagentia zoals de DTT, dNTP's of SYBR-aliquot waarschijnlijker de oorzaak dan ampliconspecifieke primers. Tegen de vermelde prijs moeten nieuwe aliquots worden getest in volgorde van DTT, vervolgens dNTP's en ten slotte, als het probleem zich blijft voordoen, nieuwe SYBR-aliquots. Omgekeerd, als slechts één van de amplicons (telomeer of gen voor één kopie) een lage efficiëntie heeft, is de oorzaak van de moeilijkheid waarschijnlijker een van de primers. De interpretatie van de pieken in de smeltcurve in figuur 8 kan dienen als een bron van belangrijke informatie voor het oplossen van problemen. Visualisatie van de pieken van de twee smeltcurves kan worden gebruikt om mogelijke problemen met een bepaald monster te identificeren, aangezien een individueel probleemmonster zich zal onderscheiden van de algemene trend van pieken die worden vertoond door normen of resterende analytische monsters. De smeltcurve kan ook worden gebruikt om problemen met een bepaalde primer te diagnosticeren als de pieken voor een bepaald amplicon systematisch minder scherp zijn dan de andere.

Dit manuscript beschrijft hoe de MMqPCR-test voor het meten van TL met brede toepasbaarheid op volksgezondheidsonderzoek met succes kan worden opgezet en introduceert belangrijke aanbevelingen voor QC en probleemoplossing met als doel de toegankelijkheid en betrouwbaarheid van deze efficiënte en kosteneffectieve methode te vergroten.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de Telomere Research Network Advisory Committee en de financiering van het National Institute on Aging / National Institute of Environmental Health Sciences (U24 AG066528 en U24 AG066528-S1) erkennen die dit werk mogelijk hebben gemaakt.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5mL TubesUSA Scientific1605-0099Seal-Rite 0.5mL Microcentrifuge Tubes, Sterile
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
1.5mL TubesUSA Scientific1615-5599Seal-Rite 1.5mL Microcentrifuge Tubes, Sterile
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
100mM DTTIn HouseNot ApplicableGemaakt met stock DTT, verdund natriumacetaat en PCR Grade H2O
Opslagtemperatuur en -condities: minus 20 °C 
15mL TubesThermo Fisher14-959-53ACorning 352196 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
1M MgCl2Thermo Fisher50152107Biotang Inc 1M MgCl2 1M Magnesium Chloride Solution, Prepared in 18.2 Megohms Water and Filtered through 0.22 Micron Filter
Opslagtemperatuur en -condities: 4 °C 
1x Gold BufferIn HouseNot Applicable10X Gold Buffer verdund met PCR Grade H2O
Opslagtemperatuur en -condities: minus 20 °C 
25mM dNTPsNew England BioLabsN0446SDeoxynucleotide Solution Set
Opslagtemperatuur en -condities: minus 20 °C 
5mL TubesThermo Fisher3391276Argos Technologies Microcentrifuge Tubes – 5mL
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
96 Well PlateBio-RadHSP9601Hard-Shell 96-Well PCR Plates, Low Profile, Thin Wall, Skirted, White / Clear
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
Aluminum FoilOffice Depot3489072Reynolds Wrap Stanard Aluminum Foil Roll, 12" x 75', Silver
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
AmpliTaq Gold Kit – Polymerase and BufferThermo Fisher4311806AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 (MgCl2 in this kit is not used), 10X Gold Buffer, 2.5U AmpliTaq Gold Polymerase
Opslagtemperatuur en -condities: minus 20 °C 
BetaineThermo FisherAAJ77507ABBetaine, 5M Solution, Molecular Biology Grade, Ultrapure, 10mL
Opslagtemperatuur en -condities: minus 20 °C 
Big Tube RackThermo Fisher344817Fisherbrand 4-Way Tube Rack
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
CFX Maestro SoftwareBio-Rad12004110Software voor real-time PCR plate opstelling, gegevensverzameling, statistieken en grafieken van resultaten
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems with Starter PackageBio-Rad184509696-well optische module voor real-time PCR
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
DTTFisher ScientificAAJ1539706Dithiothreitol, >99.5+ Molecular Biology Grade, 5 g
Opslagtemperatuur en -condities: minus 20 °C 
ELIMINaseFisher Scientific04-355-32ELIMINase Laboratory Decontaminant
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
HEPA FilterUSA ScientificReplacement FiltersHigh-Efficiency Particulate Air Filter for AirClean Workstations
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
KimwipesThermo Fisher06666AKimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
Loading TroughThermo Fisher14387069Thermo Scientific Matrix Reagent Reservoirs
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
Microsoft ExcelMicrosoftNot ApplicableMicrosoft 365 package, Excel software application
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
Mini CentrifugeGenesee Scientific31-500BPoseidon 31-500B Mini Centrifuge, Blue Lid
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
PCR Grade H2OThermo FisherAM9937Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
PCR HoodUSA Scientific4263-2588Nucleic Acid Workstation with HEPA Filtration, AirClean Systems Combination PCR Workstation
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
PCR StripsThermo FisherAB0776Low Profile Tubes and Flat Caps, Strips of 8
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
PCR Tube RackThermo Fisher344820Fisherbrand 96-Well PCR Tube Rack
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
Pipette Tips (Multichannel)Ranin17005860Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5, 20µL Maximum
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
Pipette Tips (Single Channel)USA Scientific1181-385010µL Graduated TipOne RPT Filter Tips
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
Pipette Tips (Single Channel)USA Scientific1180-185020µL Beveled TipOne RPT Filter Tips
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
Pipette Tips (Single Channel)USA Scientific1111-0880200µL Natural TipOne Pipette Tips in Racks
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
Pipette Tips (Single Channel)USA Scientific1111-28901000µL Natural Graduated TipOne Pipette Tips in Racks
Opslagtemperatuur en -condities: kamertemperatuur
Pipettors

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hemann, M., Strong, M., Hao, L., Greider, C. The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability. Cell. 107 (1), 67-77 (2001).
  2. Xu, L., Li, S., Stohr, B. A. The role of telomere biology in cancer. Ann Rev Pathol: Mech Dis. 8, 49-78 (2013).
  3. Lindrose, A., Drury, S. Minimum reporting recommendations for pcr-based telomere length measurement. Telomere Research Network. , (2020).
  4. Verhulst, S., et al. Commentary: The reliability of telomere length measurements. Int J Epidemiol. 44 (5), 1683-1686 (2015).
  5. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1-2), 59-67 (2012).
  6. Mundstock, E., et al. Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis. Obesity. 23 (11), 2165-2174 (2015).
  7. Haycock, P. C., et al. Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: Systematic review and meta-analysis. BMJ. 349, 4227(2014).
  8. Astuti, Y., Wardhana, A., Watkins, J., Wulaningsih, W. Cigarette smoking and telomere length: A systematic review of 84 studies and meta-analysis. Environ Res. 158, 480-489 (2017).
  9. Ridout, K. K., Ridout, S. J., Price, L. H., Sen, S., Tyrka, A. R. Depression and telomere length: A meta-analysis. J Affect Disord. 191, 237-247 (2016).
  10. Wang, Q., Zhan, Y., Pedersen, N. L., Fang, F., Hägg, S. Telomere length and all-cause mortality: A meta-analysis. Ageing Res Rev. 48, 11-20 (2018).
  11. Hu, R., Hua, X. G., Jiang, Q. C. Associations of telomere length in risk and recurrence of prostate cancer: A meta-analysis. Andrologia. 51 (7), e13304(2019).
  12. Schneider, C. V., et al. Association of telomere length with risk of disease and mortality. JAMA Inter Med. 182 (3), 291-300 (2022).
  13. Deng, Y., et al. Telomere length and the risk of cardiovascular diseases: A mendelian randomization study. Front Cardiovasc Med. 9, 1012615(2022).
  14. D'mello, M. J., et al. Association between shortened leukocyte telomere length and cardiometabolic outcomes: Systematic review and meta-analysis. Circulation: Cardiovasc Gene. 8 (1), 82-90 (2015).
  15. Wilbourn, R. V., et al. The relationship between telomere length and mortality risk in non-model vertebrate systems: A meta-analysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160447(2018).
  16. Gardner, M., et al. Gender and telomere length: Systematic review and meta-analysis. Exp Gerontol. 51, 15-27 (2014).
  17. Lai, T. -P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160451(2018).
  18. Cawthon, R. Telomere measurement by quatitative pcr. Nuc Acid Res. 30 (10), e47-e53 (2002).
  19. Cawthon, R. M. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative pcr method. Nuc Acid Res. 37 (3), e21-e21 (2009).
  20. Lindrose, A. R., et al. Method comparison studies of telomere length measurement using qpcr approaches: A critical appraisal of the literature. PLoS One. 16 (1), e0245582(2021).
  21. Lin, J., et al. Effects of DNA extraction, DNA integrity, and laboratory on the precision of qpcr-based telomere length measurement - a multi-lab impartial study. bioRxiv. , (2022).
  22. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
  23. Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: An overlooked detail of pcr troubleshooting. Clin Microbiol Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
  24. Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
  25. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  26. Ye, Q., et al. Telomere length and chronological age across the human lifespan: A systematic review and meta-analysis of 414 study samples including 743,019 individuals. Ageing Res Rev. 90, 102031(2023).
  27. Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. Telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence. J Vis Exp. (75), e50246(2013).
  28. Liu, M., et al. Immune-mediated inflammatory diseases and leukocyte telomere length: A mendelian randomization study. Front Genetics. 14, 1129247(2023).
  29. Van Ockenburg, S., et al. Stressful life events and leukocyte telomere attrition in adulthood: A prospective population-based cohort study. Psychol Med. 45 (14), 2975-2984 (2015).
  30. Zong, Z. Q., et al. Ambient air pollution exposure and telomere length: A systematic review and meta-analysis. Public Health. 215, 42-55 (2023).
  31. Tang, L., Li, D., Wang, J., Su, B., Tian, Y. Ambient air pollution, genetic risk and telomere length in uk biobank. J Expo Sci Environ Epidemiol. , (2023).
  32. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1), 59-67 (2012).
  33. Lin, J., et al. Systematic and cell type-specific telomere length changes in subsets of lymphocytes. J Immunol Res. 2016, 5371050(2016).
  34. Needham, B. L., et al. Socioeconomic status, health behavior, and leukocyte telomere length in the national health and nutrition examination survey, 1999-2002. Soc Sci Med. 85, 1-8 (2013).
  35. Verhulst, S. Improving comparability between qpcr-based telomere studies. Mol Ecol Res. 20 (1), 11-13 (2020).
  36. Dagnall, C. L., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PloS one. 12 (9), e0184098(2017).
  37. Lin, J., Smith, D. L., Esteves, K., Drury, S. Telomere length measurement by qpcr-summary of critical factors and recommendations for assay design. Psychoneuroendocrinology. 99, 271-278 (2019).
  38. Wolf, S. E., et al. Cross-tissue comparison of telomere length and quality metrics of DNA among individuals aged 8 to 70 years. PLOS One. 19 (2), e0290918(2024).
  39. RoDer, B., FruHwirth, K., Vogl, C., Wagner, M., Rossmanith, P. Impact of long-term storage on stability of standard DNA for nucleic acid-based methods. J Clin Microbiol. 48 (11), 4260-4262 (2010).
  40. Dagnall, C., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PLoS One. 12 (9), e0184098(2017).
  41. Shao, W., Khin, S., Kopp, W. C. Characterization of effect of repeated freeze and thaw cycles on stability of genomic DNA using pulsed field gel electrophoresis. Biopreserv Biobank. 10 (1), 4-11 (2012).
  42. Institute for Statistics and Mathematics of WU. The Comprehensive R Archive Network. , Available from: https://cran.r-project.org/ (2024).
  43. Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biol Rev. 85 (4), 935-956 (2010).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Monochrome Multiplex PCRTelomeermetingMMqPCR assayperifere bloedmononucleaire cellenSYBR Greenstandaardcurvetechnisch replicakwaliteitscontrole van de plaat

Gerelateerde artikelen