Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Optische fotothermische infrarood-fluorescentie in situ hybridisatie (OPTIR-FISH)

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66562

⸱

23 februari 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Neuroscience Research Institute, Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of California Santa Barbara, 3Photothermal Spectroscopy Corp., 4School of Biological Sciences, University of Southampton, 5Department of Electrical & Computer Engineering, Photonics Center, Boston University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat gebruik maakt van optische fotothermische infrarood-fluorescentie in situ hybridisatie (OPTIR-FISH), ook bekend als mid-infrarood fototherme-FISH (MIP-FISH), om individuele cellen te identificeren en hun metabolisme te begrijpen. Deze methodologie kan breed worden toegepast voor diverse toepassingen, waaronder het in kaart brengen van het cellulaire metabolisme met een resolutie van één cel.

Samenvatting

Het begrijpen van de metabolische activiteiten van individuele cellen binnen complexe gemeenschappen is van cruciaal belang voor het ontrafelen van hun rol bij menselijke ziekten. Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor gelijktijdige celidentificatie en metabole analyse met het OPTIR-FISH-platform door rRNA-gelabelde FISH-sondes en isotoop-gelabelde substraten te combineren. Fluorescentiebeeldvorming biedt celidentificatie door de specifieke binding van rRNA-gelabelde FISH-sondes, terwijl OPPIR-beeldvorming metabolische activiteiten binnen afzonderlijke cellen biedt door isotoop-geïnduceerde roodverschuiving op OPPIR-spectra. Met behulp van bacteriën gekweekt met 13C-glucose als testbed, schetst het protocol microbiële cultuur met isotopische labeling, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), monstervoorbereiding, optimalisatie van de OPTIR-FISH-beeldvormingsopstelling en gegevensverzameling. We demonstreren ook hoe beeldanalyse kan worden uitgevoerd en spectrale gegevens kunnen worden geïnterpreteerd op het niveau van één cel met een hoge doorvoer. Het gestandaardiseerde en gedetailleerde karakter van dit protocol zal de acceptatie ervan door onderzoekers met verschillende achtergronden en disciplines binnen de brede onderzoeksgemeenschap naar het metabolisme van één cel aanzienlijk vergemakkelijken.

Inleiding

Cellulair metabolisme staat als een fundamentele pijler in de celbiologie en stuurt vele processen aan die de gezondheid, functie en interactie van cellen met de omgeving bepalen. Het analyseren van het metabolisme op individueel celniveau, met name in de oorspronkelijke omgevingen, biedt onschatbare inzichten om de heterogene en complexe activiteiten inbiologische systemen aan het licht te brengen. Dit is vooral cruciaal bij de studie van micro-organismen, aangezien veel microben unieke groeivereisten of omgevingsafhankelijkheden vertonen die traditionele teeltmethoden uitdagen2. Sommige soorten kunnen bijvoorbeeld specifieke voedingssamenstellingen of symbiotische relaties vereisen die niet gemakkelijk in een laboratoriumomgeving kunnen worden gerepliceerd, waardoor ze niet kunnen worden gekweekt met standaardtechnieken3. Bovendien vormen de langere perioden die nodig zijn voor de teelt van bepaalde soorten aanzienlijke uitdagingen voor microbiologisch onderzoek, die vaak verder reiken dan de praktische termijnen voor studie en analyse. Om deze beperkingen te omzeilen, maken alternatieve methoden zoals polymerasekettingreactie en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) de identificatie van microbiële soorten mogelijk zonder dat kweek nodig is4, wat een nauwkeuriger en holistischer beeld van microbiële ecosystemen kan opleveren. Deze analytische technologieën missen echter het vermogen om het cellulaire metabolisme op te helderen. Deze kloof benadrukt de voortdurende uitdagingen op het gebied van microbiologie: de gelijktijdige taak om de cellulaire identiteit te differentiëren en het metabolisme op het niveau van één cel op te helderen. Vooruitgang in technieken zoals beeldvormende massaspectrometrie (IMS) in combinatie met stabiele isotopen zijn naar voren gekomen als krachtige hulpmiddelen voor metabole analyse van één cel5. In deze experimenten werden cellen geïncubeerd met substraten die isotopen bevatten, zoals 13C of 15N. De nieuw geanaboliseerde biomoleculen dragen deze isotopen, waardoor ze te onderscheiden zijn op de m/z-spectra. IMS heeft echter te lijden onder dure instrumentatie, gecompliceerde monstervoorbereiding, relatief lage doorvoer en expertise die nodig is voor het analyseren van de m/z-spectra. In combinatie met moleculaire marker-specifieke fluorescentiebeeldvorming is er vooruitgang geboekt bij het ophelderen van het cellulaire metabolisme met verhoogde specificiteit6. Desalniettemin blijven er uitdagingen bestaan bij het overbruggen van deze twee modaliteiten. Het verschil in resolutie tussen IMS en fluorescentiebeeldvorming, gecombineerd met verschillende operationele opstellingen, maakt het moeilijk om bevindingen op elkaar af te stemmen en te correleren7.

De integratie van vibrationele spectroscopische beeldvorming met stabiele isotopenlabeling biedt een nieuwe oplossing voor de studie van het metabolisme van één cel. De opname van zwaardere isotopen vertraagt de trilling van chemische bindingen, wat leidt tot roodverschoven pieken in de trillingsspectra8. Met name trillingsbeeldvorming biedt een ruimtelijke resolutie die vergelijkbaar is met fluorescentiebeeldvorming, en zowel metabole kwantificering als celidentificatie kunnen in één opstelling worden uitgevoerd, waardoor de beeldregistratie en correlatie worden vereenvoudigd. Ons recente werk heeft de combinatie aangetoond van een geavanceerd platform voor trillingsbeeldvorming: optisch fotothermisch infrarood (OPTIR) met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om het glucosemetabolisme in bacteriële gemeenschappente onderzoeken 9 (Figuur 1). OPTIR is een vibrationeel spectroscopisch microscopiesysteem dat het fotothermische effect van mid-IR-absorptie benut door de zichtbare lichtverandering te detecteren, die een sub-micrometerresolutie biedt zoals in optische microscopie, maar met de extra vibrationele spectroscopische informatie die afkomstig is van de mid-IR-absorptie. FISH is een veelgebruikte techniek om de identiteit van micro-organismen op celniveau te bepalen. De sequentie van oligonucleotiden zou kunnen worden ontworpen om zich te richten op specifieke 16S-sequenties van verschillende taxa, en verschillende fluoroforen zouden kunnen worden gehecht. Specifieke hybridisatie van de ontworpen oligonucleotide-sondes met het doel-rRNA leidt tot sterke fluorescentiesignalen van doelsoorten in individuele cellen, en meerkanaals fluorescentiebeeldvorming kan worden uitgevoerd om meerdere soorten binnen de populatie te identificeren. Aangezien zowel OPTIR als fluorescentiebeeldvorming gebaseerd zijn op optische detectie, is het combineren van OPPIR- en FISH-fluorescentie eenvoudig te implementeren. De twee modaliteiten delen dezelfde optische resolutie voor analyse van één cel en kunnen gemakkelijk worden geschakeld zonder dat extra uitlijning of co-registratie nodig is.

Dit protocol biedt een gedetailleerde handleiding voor het gebruik van het OPTIR-FISH-platform voor geavanceerde structuur-functieanalyse van één cel. We gebruikten de bacteriële monsters gekweekt in 13C-glucosebevattende media als testbed en kwantificeerden de novo eiwitsynthese van 13C-glucose. Om het vermogen van het platform om cellen te identificeren aan te tonen, gebruikten we bacteriemengsels waarin elke soort werd gelabeld met behulp van rRNA-gerichte FISH-sondes. Deze aanpak vergemakkelijkte nauwkeurige eencellige identificatie van specifieke bacteriestammen, zoals Escherichia coli (E. coli) en Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), en hun metabolisme. Dit protocol biedt onderzoekers een krachtig hulpmiddel voor gelijktijdige metabole profilering en soortidentificatie op het niveau van één cel, en belooft ons begrip van cellulaire interacties, fysiologie en hun rol in complexe omgevingen te vergroten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het gebruik van bacteriële monsters in deze studie is in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Review Board (IRB) van Boston University en het National Institute of Health.

OPMERKING: De algemene workflow die in dit protocol wordt gevolgd, is samengevat in afbeelding 2.

1. Etikettering van bacteriecultuur en isotopen (figuur 2A)

OPMERKING: Het voorbeeld dat hier wordt gegeven, is voor het labelen van een zuivere bacteriecultuur. Als dit protocol wordt toegepast op polymicrobiële gemeenschappen, moeten het medium en de etiketteringstijd worden aangepast aan de gemeenschap en de fysiologie van de organismen van belang.

  1. Inoculeer de betreffende bacteriestam van een enkele kolonie en voorcultuur in een voedingsrijk medium zoals tryptische sojabouillon (TSB) of Luria-Bertani-bouillon (LB) gedurende 3 uur om de exponentiële groeifase (log) te bereiken. E. coli BW25113 wordt in dit protocol als voorbeeldstam gebruikt.
    OPMERKING: De tijd die nodig is om de logfase te bereiken, is afhankelijk van de gebruikte soort. Deze tijd moet voor elke soort worden aangepast.
  2. Meet de optische dichtheid bij 600 nm om de bacterieconcentratie te schatten.
  3. Bereid een minimaal groeimedium voor, aangevuld met isotopisch gelabelde substraten. Voor E. coli BW25113 het M9 minimal medium aanvullen met 13C-glucose in een eindconcentratie van 0,2% (w/v).
    OPMERKING: De gebruikte 13C-glucose (D-glucose U−13C6, 99%) was universeel gelabeld, waarbij alle koolstofatomen werden vervangen door 13C-atomen. De keuze van het minimale groeimedium is afhankelijk van de bacteriestam. De keuze van het isotopensubstraat hangt af van het specifieke metabolische proces dat van belang is. Het algemene doel is dat het isotopische substraat zou dienen als de belangrijkste voedingsbron in vergelijking met hun niet-geëtiketteerde tegenhangers.
  4. Verdun bacteriën in het minimale groeimedium dat het isotopisch gelabelde substraat bevat tot een eindconcentratie van 5 × 10,5 kve/ml.
    OPMERKING: Meestal wordt een hoge verdunningsverhouding zoals 1:100 gebruikt en wordt de niet-geëtiketteerde voeding uit het rijke medium te verwaarlozen. Om ervoor te zorgen dat het voedingsrijke medium volledig wordt verwijderd, kan ook een wasbeurt met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) worden uitgevoerd door centrifugatie bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en resuspensie in PBS, gevolgd door een tweede centrifugatie en uiteindelijke resuspensie in het minimale groeimedium.
  5. Kweek bacteriemonsters in een orbitale schudincubator onder optimale groeiomstandigheden. Stel in het algemeen de orbitale schudincubator in op een snelheid van 220 tpm en een temperatuur van 37 °C, en plaats de kweekbuisjes gekanteld met een losse dop voor aërobe incubatie. Voor E. coli is 24 uur aërobe incubatie bij 37 °C meestal voldoende om de maximale etikettering van 13°C te bereiken.
    OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van het metabolische proces dat van belang is. Een langere incubatietijd leidt over het algemeen tot een hogere isotopenetikettering. Een groeicurvemeting onder dezelfde omstandigheden met een niet-gelabeld substraat zou inzicht kunnen geven in het bepalen van de juiste verzamelmomenten.
  6. Verzamel bacteriecellen op de gewenste tijdstippen door centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  7. Verwijder het supernatans en resuspendeer in een gelijk volume van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Fixeer de cellen in PFA-oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) of 2 uur bij 4 °C. Was de cellen voor langdurige opslag twee keer met PBS, resuspendeer de cellen in 1 ml 50% (v/v) PBS en 96% ethanol en bewaar ze bij -20 °C tot verder gebruik.

2. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) (Figuur 2B)

  1. Hybridiseer E. coli-cellen met de Gam42a10 oligonucleotide-sonde gelabeld met een cyanine5 (Cy5) fluorofoor (Gam42a-Cy5) en B. theta-cellen met de Bac30311 oligonucleotide-sonde gelabeld met een cyanine3 (Cy3) fluorofoor (Bac303-Cy3), volgens een standaard FISH-protocol.
    OPMERKING: Grondbeginselen van rRNA-FISH voor identificatie: rRNA-moleculen zijn ideale doelwitten van FISH omdat ze alomtegenwoordig worden gedistribueerd en op natuurlijke wijze worden versterkt in microbiële cellen. rRNA bevat ook zowel geconserveerde als variabele sequentieregio's, zodat de fylogenetische diepte van de doelgroep kan worden bepaald door de mate van conservering van de oligonucleotide-sonde. Door specifieke binding van de ontworpen sonde aan de doelsequentie vertoont de gelabelde fluorofoor fluorescerende signalen voor individuele cellen.
  2. Raadpleeg eerder gepubliceerde literatuur 12,13,14 voor het gedetailleerde protocol voor fluorescentie in situ hybridisatie. In de onderstaande stappen wordt kort het standaardprotocol voor microbiële cellen beschreven.
    1. Dehydratie:
      1. Centrifugeer de vaste cellen (100 μL) bij 14.000 x g gedurende 10 minuten tot pellet, resuspendeer in 100 μL 96% ethanol van analytische kwaliteit en incubeer gedurende 1 minuut bij RT.
      2. Centrifugeer de cellen vervolgens opnieuw bij 14.000 x g gedurende 5 minuten, verwijder de ethanol en laat de celpellet aan de lucht drogen.
    2. Hybridisatie: Hybridiseer de cellen in oplossing (100 μL) gedurende 3 uur bij 46 °C.
      OPMERKING: De hybridisatiebuffer bestaat uit 900 mM NaCl, 20 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan HCl, 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur, 0,01% natriumdodecylsulfaat, 100 ng van het respectieve fluorescerend gelabelde oligonucleotide en de vereiste formamideconcentratie om aan strenge voorwaarden te voldoen.
    3. Centrifugeren: Breng de monsters onmiddellijk na hybridisatie over in een centrifuge met een rotor die is voorverwarmd op 46 °C en centrifugeer op 14.000 x g gedurende 15 minuten bij de maximaal toegestane temperatuur (meestal 40 °C).
    4. Wassen en bewaren:
      1. Was de monsters gedurende 15 minuten bij 48 °C in een buffer met een geschikte strengheid. Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 15 minuten bij 14.000 x g bij de maximaal toegestane temperatuur in een centrifuge met een rotor die is voorverwarmd op 46 °C.
      2. Was ten slotte de cellen met 500 μL ijskoude PBS, resuspendeer ze in 20 μL 1x PBS en bewaar ze bij 4 °C tot verder gebruik.
        OPMERKING: De specifieke binding van de sonde wordt verzekerd door de juiste hybridisatiestrengheid. Hoge strengheid kan worden bereikt door de hybridisatietemperatuur te verhogen, de zoutconcentratie te verlagen of denatureringsformamide toe te voegen. Formamide interfereert met de waterstofbruggen die nucleïnezuurduplexen stabiliseren. Hier worden de temperatuur en zoutconcentratie niet gewijzigd in hybridisatie tijdens het afstemmen van de formamideconcentratie. De optimale formamideconcentratie voor nieuw ontworpen sondes wordt experimenteel bepaald met behulp van formamide-dissociatiecurven10. De vereiste formamideconcentratie voor gepubliceerde sondes is te vinden in probeBase15 of door een literatuuronderzoek. Als alternatief kunnen voorspelde formamideconcentraties worden verkregen uit in-silico-analyse met behulp van mathFISH16. In de wasstap leidt een iets hogere temperatuur tot een iets strengere voorwaarde, wat leidt tot een hogere bindingsspecificiteit.

3. Voorbereiding van het monster (figuur 2C)

  1. Reinigen en coaten van dia's:
    1. Gebruik gestandaardiseerde CaF 2-objectglaasjes (10 mm in diameter en 350 μm dik voor compatibiliteit met de monsterhouder van het instrument). Dompel de CaF2 15 minuten onder in 70% ethanol en spoel twee keer af met DI-water.
    2. Breng de gereinigde objectglaasjes over in 0,1% poly-L-lysine-oplossing en incubeer ze een nacht bij 4 °C. Spoel de glaasjes een keer af met DI-water en droog ze aan de lucht.
  2. Ontdooi de voorbereide celmonsters bij RT terwijl ze beschermd zijn tegen licht.
  3. Om overmatige zoutkristallen van PBS tijdens het drogen van het monster te voorkomen, volgt u de stappen 3.3.1-3.3.2.
    1. Was de cellen twee keer met gedeïoniseerd water (DI). Centrifugeer op 14.000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
    2. Voeg het oorspronkelijke volume DI-water terug en draai voorzichtig mee. Herhaal de centrifugatie en voeg opnieuw de DI-waterwas toe.
  4. (Optioneel) Breng voor mengselmonsters hetzelfde volume van elk monster over en meng het in één centrifugebuis.
  5. Concentreer de bacteriële celmonsters door centrifugatie bij 14.000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
  6. Draai de resterende oplossing voorzichtig rond gedurende ~30 s en voeg 1-2 μL oplossing toe op het voorbereide CaF 2-objectglaasje. Laat het monster 30 minuten aan de lucht drogen terwijl het beschermd is tegen licht.
    NOTITIE: Na het drogen aan de lucht zou er een kleine ronde stip op het glaasje moeten verschijnen. Vanwege het "koffiering"-effect zouden de randen van de stip een hogere dichtheid aan bacteriële cellen hebben. Deze centrifugestap is bedoeld om een geschikte dichtheid te bereiken voor efficiënte bacteriële beeldvorming met één cel. De ideale concentratie zou moeten leiden tot een uniforme en dichte laag van individuele bacteriële cellen onder de microscoop. Als er na het centrifugeren een heldere pellet is die met het blote oog te zien is, verwijder dan het supernatans zodat de oplossing er na de draaikolk bijna helder uitziet. Er kan een snelle test worden uitgevoerd op het controlemonster om het verwijderingsvolume van het bovendrijvende middel te schatten. Een reeks druppeltjes met verschillende hoeveelheden overgebleven supernatans kan op het glazen objectglaasje van de microscoop worden afgezet om het optimale verdunningsvolume onder de helderveldmicroscoop te onderzoeken. Als er na het centrifugeren geen zichtbare pellet is, verwijder dan het grootste deel van het supernatans om de monsters zo goed mogelijk te concentreren. De truc is om de centrifugebuis met het scharnier aan de buitenkant in een rotor met een vaste hoek te plaatsen, zodat de pellet aan dezelfde kant van het buisscharnier verschijnt. Verlaag bovendien de pipetgroottes (P1000, P200, P10) voor een grotere precisie tijdens het verwijderen van het bovendrijvende middel om de pellet intact te houden.
  7. Monteer het objectglaasje in een meegeleverde monsterhouder en gebruik kleine puntjes polyestertape om het objectglaasje tijdens het meten vast te zetten.

4. OPTIR-FISH-beeldvorming

NOTITIE: De fluorescentiebeeldvorming en OPPIR-beeldvorming worden uitgevoerd op het OPPIR-systeem.

  1. Geometrie van het systeem:
    1. Gebruik tegenpropagatie van mid-IR-pomp en zichtbare sonde, achterwaartse (epi) detectie van zichtbaar licht met dit protocol.
    2. Om het zichtbare licht te focussen en teruggekaatst en verstrooid zichtbaar licht te verzamelen, gebruik je een luchtobjectief (50x 0,8NA). Om het mid-IR-licht te focussen, gebruik je een Cassegrain-objectief (40x 0.78NA).
    3. Zorg ervoor dat het systeem ook is uitgerust met een breedveld epi-fluorescentiemodule met meerdere fluorescentiefiltersets. Voor de fluoroforen die in dit protocol worden gebruikt, selecteert u de groene fluorescerende proteïne (GFP) filterset voor Cy3-detectie en de Alexa Fluor 647-filterset voor Cy5-detectie.
  2. Bereid je voor op metingen:
    1. Schakel het systeem in en open de software voor de besturing van het instrument. Zet na initialisatie de schuifregelaar Contraschroef en Fluorescentie in de aan-stand.
    2. Stel het doel in op 50x en voer vervolgens Auto-achtergrond uit om het IR-vermogensspectrum te verkrijgen. Gebruik het vermogensspectrum om verkregen monsterspectra te normaliseren of OPPIR-beelden te normaliseren bij verschillende golfnummers. Hiermee wordt het effect van mid-IR-laservermogensverschillen op gegevensanalyse en -kwantificering uitgesloten.
      OPMERKING: Het verkrijgen van IR-vermogensspectra voor normalisatie is absoluut noodzakelijk voor de stroomafwaartse kwantitatieve analyse, aangezien de gemeten intensiteit lineair gerelateerd is aan het IR-vermogen. Na het uitvoeren van Auto-background, normaliseert de software de OPPIR-spectra en OPPIR-afbeeldingen automatisch naar de IR-vermogensspectra voor gebruikers. Het spoelen van het systeem met N2 kan de invloed van waterdamp minimaliseren en de reproduceerbaarheid tussen experimenten vergroten.
  3. Als u het monster wilt laden, gebruikt u de knop Verwijderen om het monster naar buiten te verplaatsen. Gebruik een objectief met een lage vergroting, zoals 10x, om het monstergebied te lokaliseren en navigeer naar het gebied met een optimale monsterdichtheid. Stel het monster scherp door de objectiefhoogte aan te passen in de besturingssoftware. Verander de objectiefselectie naar 50x.
  4. Acquisitie van afbeeldingen
    OPMERKING: De gebruikte monsters zijn: i) E. coli (13C-glucose geïncubeerd); ii) E. coli (12C-glucose geïncubeerd); iii) B. theta (12C-glucose geïncubeerd); iv) mengsel van E. coli (13C-glucose geïncubeerd) en B. theta (12C-glucose geïncubeerd).
    1. Helderveldafbeeldingen (Afbeelding 2D): Breng het monster in beeld door naar de helderveldafbeeldingen te kijken.
    2. Fluorescentiebeelden (Afbeelding 2E): Wijzig de filterset door op de filternaamknop te klikken (GFP voor Cy3 en Alexa Fluor 647 voor Cy5) om fluoroforen te detecteren die zijn gekoppeld aan de ontworpen FISH-sondes en achtereenvolgens fluorescentiebeeldvorming te verkrijgen met behulp van de fluorescentiemodule in de software. Pas de lichtintensiteit en belichtingstijd aan om voldoende signaalcontrast te krijgen voordat u de fluoroforen bleekt.
      OPMERKING: Aangezien de sonde die bij OPPIR-metingen wordt gebruikt, fluoroforen kan fotobleken, moet u altijd fluorescentiebeelden maken voordat u OPPIR-beelden maakt. Voor bezorgdheid over het effect van fluorescerende markers op OPPIR-detectie, verwijzen we naar een eerder gepubliceerd werk dat aantoonde dat FISH met Cy5-fluorofoor geen invloed heeft op de volgende kwantificering op basis van OPPIR-beelden, aangezien Cy5 klein van formaat is en weinig voorkomt in vergelijking met bacterieel eiwit9 van het doelwit.
    3. OPPIR-afbeeldingen (Figuur 2F):
      1. Bepaal de normale piek en isotoop-geïnduceerde roodverschoven piekpositie. In het geval van eiwitsynthese uit 13C-glucose wordt de normale amide I-piek gedetecteerd rond 1656 cm-1 en de roodverschoven piek rond 1612 cm-1 (Figuur 3A).
        OPMERKING: De normale piekpositie is afhankelijk van de biochemische component en/of het metabolische product van belang. De verschoven piekpositie hangt ook af van welke isotoop wordt gebruikt voor de etikettering. Deze twee golfgetallen kunnen ook experimenteel worden bepaald door het meten van de volledige spectra van niet-gelabelde en maximaal gelabelde cellen (zie stap 4.5)
      2. Stem de golflengte van de IR-pomp af op 1656 cm-1 met behulp van de software. Wijzig het sondevermogen en de versterking van de detector dienovereenkomstig om verzadiging van het DC-signaal (8 V) te voorkomen. Verfijn de hoogte van het onderste Cassegrain-objectief om het AC-signaal te maximaliseren.
        OPMERKING: Het typische IR-vermogen bij het monster is ongeveer 5 mW en het sondevermogen bij het monster is ongeveer 3-15 mW, afhankelijk van het monster. Zowel het IR- als het sondevermogen kunnen worden aangepast met behulp van de besturingssoftware om het vermogensniveau te optimaliseren om een hoog beeldcontrast te garanderen en tegelijkertijd beschadiging van de cellen te voorkomen.
      3. Stel OPPIR-afbeeldingen in op 200 x 200 pixels en stel de scansnelheid in op 100 μm/s. Stel de stapgrootte in de X- en Y-richting in op 150 nm, zodat de beeldgrootte ongeveer 30 x 30 μm2 is.
      4. Verkrijg het beeld.
      5. Stem de golflengte van de IR-pomp af op 1612 cm-1 en verkrijg een beeld vanuit hetzelfde gezichtsveld op dit golfnummer.
      6. Afbeelding voor elke steekproef ten minste drie gezichtsvelden voor statistische analyse.
  5. (Optioneel) Spectrale meting: Voer na beeldacquisitie de spectrale meting uit als een ruimtelijk kenmerk van belang is gelokaliseerd.
    1. Locaties selecteren: Kies een enkel punt of specificeer een reeks punten voor analyse in de Spectral-module van de software.
    2. Stel de spectrale scanparameter in. Selecteer het dekkingsbereik van het golfgetal, de scansnelheid en de afstand tussen de gegevensuitvoer op basis van de vereisten.
      OPMERKING: als de scansnelheid en de afstand tussen de gegevens anders zijn dan die welke worden gebruikt in de stap voor het verzamelen van de achtergrond (stap 4.2), is een nieuwe achtergrond op basis van de huidige spectrale scanparameters nodig voor een correcte normalisatie.
    3. Stel het co-gemiddeldegetal in en start de spectrale meting. Het verhogen van de co-averaging verhoogt ook de signaal-ruisverhouding van spectra, maar vereist langere acquisitietijden.
      OPMERKING: Als er significante fluctuaties worden waargenomen tijdens co-gemiddelde, kan dit duiden op door laserverwarming geïnduceerde instabiliteit van het monster. Dit kan vaak worden verholpen door het IR-vermogen te verlagen en/of het zichtbare sondevermogen te verlagen.

5. Gegevensverwerking en -analyse op het niveau van één cel

  1. Kwantificeer de metabole synthese van isotopische substraten (Figuur 2G)
    OPMERKING: De volgende kwantificering van metabole incorporatie uit isotopische substraten is gebaseerd op OPPIR-beelden met twee golfgetallen die overeenkomen met de normale en verschoven pieken van de doelmacromoleculen. Vergeleken met een volledige hyperspectrale stapel zou beeldvorming met twee golfgetallen de tijd die nodig is voor elk gezichtsveld aanzienlijk kunnen verkorten en de doorvoer kunnen verbeteren, terwijl het isotopische effect dat cruciaal is voor de kwantificering van het metabolisme volledig wordt herwonnen.
    1. Trek het verschoven piek-OPPIR-beeld af van het normale piek-OPPIR-beeld en genereert een visuele kaart van syntheseactiviteiten van isotopensubstraten. Ter illustratie (figuur 3C), voor E. coli gekweekt met 13C-glucose, duiden de positieve pixels in de afbeelding (1656 cm-1-1612 cm-1) op actieve opname van 13C in eiwitten, dus een hoger eiwitsyntheseniveau.
      OPMERKING: Het aftrekken kan worden uitgevoerd met behulp van de ImageJ Image Calculator-functie. Als alternatief kan het aftrekken eenvoudig worden uitgevoerd in elke gewenste programmeertaal voor batchverwerking.
    2. Kwantificering van de metabolische activiteit van één cel
      1. Verkrijg coëfficiënten (weergegeven door h in figuur 2G) van niet-geëtiketteerde en volledig geëtiketteerde referentiemonsters. Aangezien de door isotoop geïnduceerde roodverschoven piek gedeeltelijk zou overlappen met de normale piek, zullen zowel niet-gelabelde als gelabelde (nieuw gesynthetiseerde uit het isotopisch gelabelde substraat) monsters bijdragen aan de OPPIR-signalen bij de normale en verschoven piek. Kwantificeer deze verschillende bijdragen met behulp van de genormaliseerde OPPIR-signaalintensiteit bij de normale en verschoven piek van niet-gelabelde en volledig gelabelde referentiemonsters.
        OPMERKING: Voor referentiemonsters worden niet-gelabelde referentiemonsters gekweekt (of geïncubeerd) zonder isotopisch gelabeld substraat. Volledig geëtiketteerde referentiemonsters worden meestal gekweekt met de hoogste concentratie isotopisch gelabeld substraat met de langste teelttijd.
      2. Voor analyse van één cel verkrijgt u maskers met één cel op basis van de heldere-veldbeelden.
        OPMERKING: Verschillende technieken in beeldverwerking kunnen hier worden toegepast om dit masker te genereren, waaronder verschillende deeltjesdetectie zoals blobanalyse en celsegmentatiemethoden zoals waterscheiding.
      3. Meet de intensiteit van het OPPIR-signaal van individuele cellen. Pas het verkregen eencellige masker toe op de twee OPPIR-afbeeldingen (bij normale piek en verschoven piek) en neem voor elke afzonderlijke cel het gemiddelde van de pixelwaarden in het maskergebied met één cel. De gemiddelde waarde van individuele cellen wordt gebruikt bij de kwantificering.
      4. Bereken voor elke cel de relatieve bijdrage van niet-gelabelde en gelabelde biocomponenten op basis van de coëfficiënten uit stap 5.1.2.1 en signalen uit stap 5.1.2.3.
        OPMERKING: Een isotopenvervangingsverhouding wordt gedefinieerd als de relatieve bijdrage van gelabelde biocomponenten ten opzichte van de som van zowel gelabelde als niet-gelabelde biocomponenten (Figuur 2G). Deze verhouding moet in het bereik van 0 tot 1 liggen. De isotopenvervangingsverhouding is lineair evenredig met de verhouding van 13C-glucose tot 12C-glucose (met een vaste totale hoeveelheid glucose)9. Voor E. coli-cellen is een hoge detectiegevoeligheid van 5% 13C-glucose aangetoond.
  2. Identificeer bacteriesoorten aan de hand van meerkanaals fluorescentiebeelden (Figuur 2H)
    1. Voeg de meerkleurige fluorescentiekanalen samen om visuele begeleiding te creëren voor verschillende bacteriesoorten met behulp van ImageJ (Image > Color > Merge Channels).
    2. Genereer voor analyse van één cel voor elk fluorescentiekanaal een reeks interessegebieden (ROI's) voor individuele cellen.
      OPMERKING: Verschillende technieken in beeldverwerking kunnen hier worden toegepast om het masker te genereren, waaronder verschillende methoden voor automatische drempelvorming en celsegmentatiemethoden.
  3. Correleer FISH-identiteiten en OPTIR-metabole activiteiten (Figuur 2I)
    1. Koppel de bacteriële identiteiten op celniveau van FISH-fluorescentiebeelden rechtstreeks aan de metabolische activiteiten van OPPIR-beelden door de posities van de ROI's te correleren.
    2. Voer statistische analyses uit om de metabolische activiteiten van verschillende soorten te vergelijken.
      OPMERKING: Maskers worden afzonderlijk van fluorescentiebeelden en OPPIR-beelden gegenereerd omdat metabolische activiteiten kunnen worden geanalyseerd voor alle cellen van OPPIR-beelden, terwijl onbekende cellen niet op een van de fluorescentiekanalen zouden verschijnen. Dit zorgt ervoor dat alle cellen kunnen worden meegenomen in de metabole analyse. Als er een groot aantal niet-geïdentificeerde cellen is, moeten mogelijk verschillende FISH-sondes worden overwogen die zich richten op het rRNA van verschillende taxa die van belang zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De algemene workflow voor eencellige microbiële metabole analyse met genetische identificatie door OPTIR-FISH is samengevat in Figuur 2. De representatieve resultaten die het single-cell metabole beeldvormingsvermogen van OPTIR aantonen, worden getoond in Figuur 3. In dit voorbeeld werden E. coli-cellen gebruikt die waren geïncubeerd met 12C- hetzij 13C-glucose gedurende 24 uur. De oprichting van 13

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier hebben we een gedetailleerd protocol beschreven voor het toepassen van het OPTIR-FISH-platform voor gelijktijdige identificatie van microbiële soorten en kwantificering van metabolische activiteiten op de single-cell resolutie. De kritieke stappen omvatten cultuur met stabiele isotopenetikettering voor het bestuderen van specifieke metabolische activiteiten en fluorescentie in situ hybridisatie voor het identificeren van microbiële doelsoorten. Meerkanaals fluorescentiebeel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Y.B. is een parttime consultant voor Photothermal Spectroscopy Corp.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health R35GM136223, R01AI141439 aan J.X.C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96% EthanolThermoScientificT032021000
Calcium FluorideCrystranCAFP10-0.35
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)Cambridge Isotopic LaboratoriesCLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE9884-100G
formamideThermoScientific17899
Luria-Bertani broth Sigma-AldrichL3522-250G
M9 Minimal Salts 5xSIGMAM6030-1KG
OPTIR instrumentPhotothermal Spectroscopy Corp.mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBSThermoScientificJ19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v) Sigma-AldrichP8920-500ML
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-25G
Sodium dodecyl sulfateSigma-AldrichL3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%ThermoScientificA11379.18
Trypic Soy BrothSigma-Aldrich22092-500G

Referenties

  1. Evers, T. M. J., et al. Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis. Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).
  2. Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. Present and future of culturing bacteria. Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).
  3. Epstein, S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr Opin Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
  4. Su, C., Lei, L., Duan, Y., Zhang, K. -Q., Yang, J. Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective. Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 993-1003 (2012).
  5. Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS. FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).
  6. Jiang, H., Kilburn, M. R., Decelle, J., Musat, N. NanoSIMS chemical imaging combined with correlative microscopy for biological sample analysis. Curr Opin Biotechnol. 41, 130-135 (2016).
  7. Porta Siegel, T., et al. Mass spectrometry imaging and integration with other imaging modalities for greater molecular understanding of biological tissues. Mol Imaging Biol. 20 (6), 888-901 (2018).
  8. Lagunov, O., Drenchev, N., Chakarova, K., Panayotov, D., Hadjiivanov, K. Isotopic labelling in vibrational spectroscopy: a technique to decipher the structure of surface species. Top Catal. 60, 1486-1495 (2017).
  9. Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -X. Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells. Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).
  10. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -H. Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions. System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).
  11. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Vancanneyt, M., Schleifer, K. -H. Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment. Microbiology. 142, 1097-1106 (1996).
  12. Daims, H., Stoecker, K., Wagner, M. Fluorescence In Situ Hybridization for the Detection of Prokaryotes. Molecular Microbial Ecology. , Taylor & Francis. London. (2004).
  13. Bridger, J. M., Volpi, E. V. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications. , Springer, Humana. Totowa, NJ. (2010).
  14. Wang, D. O., et al. A quick and simple FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligodeoxynucleotide probes. RNA. 18 (1), 166-175 (2012).
  15. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Res. 44, D586-D589 (2016).
  16. Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. mathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Appl Environ Microbiol. 77 (3), 1118-1122 (2011).
  17. Lima, C., Muhamadali, H., Xu, Y., Kansiz, M., Goodacre, R. Imaging isotopically labeled bacteria at the single-cell level using high-resolution optical infrared photothermal spectroscopy. Anal Chem. 93 (6), 3082-3088 (2021).
  18. Yin, J., et al. Nanosecond-resolution photothermal dynamic imaging via MHZ digitization and match filtering. Nat Commun. 12 (1), 7097(2021).
  19. Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -X. Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect. Sci Adv. 7 (20), (2021).
  20. Xia, Q., Yin, J., Guo, Z., Cheng, J. -X. Mid-infrared photothermal microscopy: principle, instrumentation, and applications. J Phys Chemi B. 126 (43), 8597-8613 (2022).
  21. Du, J., Wang, H., Wei, L. Bringing vibrational imaging to chemical biology with molecular probes. ACS Chem Biol. 17 (7), 1621-1637 (2022).
  22. Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Phys Biol. 16 (4), 041003(2019).
  23. Shi, L., et al. Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes. Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).
  24. Bai, Y., et al. Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems. Nat Commun. 15 (1), 350(2024).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Ge, X., et al. SRS-FISH: A high-throughput platform linking microbiome metabolism to identity at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (26), e2203519119(2022).
  27. Bai, Y., et al. Ultrafast chemical imaging by widefield photothermal sensing of infrared absorption. Sci Adv. 5 (7), 7127(2019).
  28. Zhang, J., Zhao, J., Lin, H., Tan, Y., Cheng, J. -X. High-speed chemical imaging by dense-net learning of femtosecond stimulated Raman scattering. J Phys Chem Lett. 11 (20), 8573-8578 (2020).
  29. Lin, H., et al. Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning. Nat Commun. 12 (1), 3052(2021).
  30. Fu, P., et al. Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy. Nat Photon. 17, 330-337 (2023).
  31. Tamamitsu, M., et al. Mid-infrared widefield nanoscopy. arXiv. , (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

metabolisme van enkelvoudige cellenisotoopmarkeringidentificatie van bacteriële cellenmetabole beeldvormingrRNA FISH-sondescalciumfluoride-dia'sspectrale data-analyse
Optische fotothermische infrarood-fluorescentie in situ hybridisatie (OPTIR-FISH)
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.