Methodenartikel

Intravitale twee-fotonmicroscopie van de getransplanteerde muizenlong

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66566

⸱

19 april 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de getransplanteerde linkerlong van de muis intravitaal in beeld te brengen met behulp van twee-fotonmicroscopie. Dit is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire dynamiek en interacties in real-time na longtransplantatie bij muizen.

Samenvatting

Complicaties na longtransplantatie houden grotendeels verband met het immuunsysteem van de gastheer dat op het transplantaat reageert. Dergelijke immuunresponsen worden gereguleerd door overspraak tussen donor- en ontvangercellen. Een beter begrip van deze processen is afhankelijk van het gebruik van preklinische diermodellen en wordt geholpen door het vermogen om de handel in intra-transplantaat-immuuncellen in realtime te bestuderen. Intravitale twee-fotonmicroscopie kan worden gebruikt om weefsels en organen af te beelden tot een diepte van enkele honderden microns met minimale fotoschade, wat een groot voordeel biedt ten opzichte van confocale microscopie met één foton. Selectief gebruik van transgene muizen met promotor-specifieke fluorescerende eiwitexpressie en/of adoptieve overdracht van fluorescerende kleurstof-gelabelde cellen tijdens intravitale twee-fotonmicroscopie maakt de dynamische studie van individuele cellen binnen hun fysiologische omgeving mogelijk. Onze groep heeft een techniek ontwikkeld om muizenlongen te stabiliseren, waardoor we de cellulaire dynamiek in naïeve longen en orthotopisch getransplanteerde longtransplantaten in beeld kunnen brengen. Deze techniek maakt een gedetailleerde beoordeling van het cellulaire gedrag in het vaatstelsel en in het interstitium mogelijk, evenals voor onderzoek naar interacties tussen verschillende celpopulaties. Deze procedure kan gemakkelijk worden geleerd en aangepast om immuunmechanismen te bestuderen die ontstekings- en tolerogene reacties na longtransplantatie reguleren. Het kan ook worden uitgebreid naar de studie van andere pathogene longaandoeningen.

Inleiding

Longtransplantatie is de laatste optie voor veel patiënten die lijden aan longziekte in het eindstadium; De overleving op lange termijn na longtransplantatie is echter slecht in vergelijking met andere solide orgaantransplantaties. De overleving na 5 jaar is slechts ~60%-70%1, vergeleken met 80%-90% in harten2 en 85%-90% in denieren3. Veel complicaties na longtransplantatie, zoals disfunctie van het primaire transplantaat, afstoting door antilichamen en chronische disfunctie van longtransplantaten, zijn te wijten aan de immuunrespons van de gastheer op het transplantaat. Onze groep heeft bijvoorbeeld aangetoond dat neutrofielen snel worden gerekruteerd in het longtransplantaat na transplantatie-geïnduceerde ischemie-reperfusieschade en dynamische clusters vormen rond bloedmonocyten4. Overspraak tussen donor- en ontvangercellen is verantwoordelijk voor schadelijke allo-immuunresponsen 5,6,7, en het vermogen om deze dynamische celinteracties in een levend diermodel te bestuderen is van onschatbare waarde.

Twee-fotonmicroscopie maakt intravitale beeldvorming met hoge resolutie mogelijk tot diepten tot enkele honderden microns met minimale fotobleking van weefsels 8,9. Het wordt gebruikt in verschillende weefsels en anatomische plaatsen, waaronder de neocortex10,11, huid12,13 en nier14,15. Meer recentelijk is het aangepast aan niet-statische organen zoals de long en het hart 4,16,17. In dit protocol beschrijven we een techniek om longtransplantaten in beeld te brengen, te beademen en te perfunderen na orthotope linkerlongtransplantatie bij muizen. Een belangrijk voordeel van het transplantatiemodel is de mogelijkheid om de donor en ontvanger afzonderlijk genetisch te manipuleren. Individuele celpopulaties kunnen worden gevisualiseerd met transgene muizenstammen met knock-in fluorescerende eiwitexpressie, adoptieve overdracht van fluorescerend gelabelde cellen5 of intraveneuze injectie van fluorescerend gelabelde antilichamen om celspecifieke markers te binden 4,16,17,18.

Om de long tijdens beeldvorming te stabiliseren, omvat dit protocol het lijmen van de long op een dekglas, terwijl andere groepen zuigstabilisatie hebben beschreven met behulp van een op maat gemaakt omkeerbaar vacuümapparaat19. Ons protocol heeft verschillende voordelen, waaronder een groter beeldvormingsgebied en relatief eenvoudig in te stellen met behulp van algemeen beschikbare materialen in een microscopielaboratorium (inclusief dekglas en lijm). Aangezien deze lijmtechniek de long aan de bovenzijde beperkt, wordt verwacht dat deze de beademingsbeweging vermindert en een diepere beeldvorming mogelijk maakt. Deze intravitale beeldvormingstechniek maakt gedetailleerde observatie van het gedrag en de interacties van immuuncellen in realtime mogelijk, wat bijdraagt aan de studie van immuunmechanismen die inflammatoire versus tolerogene reacties na longtransplantatie reguleren.

Protocol

Alle procedures voor het hanteren van dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health Care en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Washington University School of Medicine.

1. Anesthesie en intubatie

OPMERKING: Orthotope linkerlongtransplantatie van muizen wordt uitgevoerd, zoals eerder beschreven 20,21. Longen van 20-25 g C57BL/6 (B6) muizen worden getransplanteerd in B6-ontvangers van geslacht en leeftijd. B6. LysM-GFP-reportermuizen worden gebruikt als ontvangers voor geselecteerde experimenten om neutrofiele infiltratie in longtransplantaten te visualiseren. Ontvangende muizen kunnen direct na een longtransplantatie in beeld worden gebracht.

  1. Verdoof muizen opnieuw met intraperitoneale toediening van ketamine (80-100 mg/kg) en xylazine (8-10 mg/kg). Dien buprenorfine met verlengde afgifte (0,5-1,0 mg/kg) subcutaan toe voor aanvullende pijnbestrijding. Bevestig voldoende diepte van de anesthesie met een pootknijp.
    OPMERKING: Als de tijd tussen longtransplantatie en geplande intravitale beeldvorming minder dan twee uur is, kan de verdoving opnieuw worden gedoseerd met 50% van de startdosis ketamine.
  2. Verwijder het haar van de hele linkerborst met behulp van een elektrische tondeuse en veeg de borst af om de overtollige geknipte haren te verwijderen.
  3. Breng niet-medicinale oogzalf aan op de ogen van de muis om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
  4. Intubeer de muis orotracheaal opnieuw met een angiokatheter van 20 G, zoals eerder beschreven21.
  5. Ventileer met kamerlucht met een snelheid van 120 ademhalingen/min en een ademvolume van 0,5 cc.
  6. Lever endotracheaal 1% isofluoraan toe gedurende de gehele procedure.
  7. Om bloedvaten tijdens beeldvorming te visualiseren, injecteert u 20 μL 655 nm niet-gerichte kwantumdots (q-dots) in 50 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing intraveneus ten minste 5 minuten voorafgaand aan de beeldvorming.

2. Chirurgische voorbereiding van de linkerlong voor beeldvorming

  1. Plaats de muis in een rechter zijwaartse decubituspositie (zie figuur 1A).
  2. Desinfecteer de borsthuid met een mengsel van 0,75% jodium en 70% ethanol, drie keer.
  3. Open de linker thoracotomie (van longtransplantatie bij muizen) opnieuw via de derde intercostale ruimte (zie figuur 1A).
  4. Verwijder een deel van de huid en het zachte weefsel over de linker thoracotomieplaats en meet 1,5 cm x 1,5 cm (zie figuur 1B).
  5. Klem voorafgaand aan de ribresectie eerst de ribben ~10 s vast om eventuele microvasculatuur te trombose om hemostase te bereiken (zie figuur 1C, D).
  6. Reseceer delen van de 3etot 5eribben om een beeldvormingsvenster te creëren dat groot genoeg is om de long te bevrijden (~0,8 cm craniocaudaal en ~1,0 cm anteroposterieur, figuur 1D, E).
  7. Stop eventuele extra bloedingen van de ribbelranden met elektrocauterisatie.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om hemostase in de snijrand van de ribben te bereiken om overmatig bloedverlies tijdens de beeldvormingsperiode te voorkomen.
  8. Plaats een kleine bult (4 cm x 4 cm gaas 3 keer in de lengterichting gevouwen) onder de rechterborst (zie figuur 1E).
  9. Til met behulp van wattenstaafjes het longtransplantaat uit de borstkas en plaats het onderste deel van de long op een strook van 1 cm x 3 cm met zoutoplossing doordrenkt gaas (zie figuur 1F).
    OPMERKING: Deze strook met zoutoplossing doordrenkt gaas voorkomt glijden van de long, handhaaft een vochtige omgeving voor de long, beschermt de long tegen de scherpe randen van de weggesneden ribben en scheidt de long van de hartbeweging. Zodra de omtrekbeeldvormingskamer over de long is aangebracht (Figuur 1G, H, beschreven in sectie 3), zou er tijdens de beeldvormingsperiode minimaal warmte- en vochtverlies uit de open borstholte moeten zijn.

3. Voorbereiding van de beeldvormingskamer

OPMERKING: Een beeldvormingskamer is op maat gemaakt (zie afbeelding 2A). Deze beeldvormingskamer bestaat uit een basisplaat en een bovenplaat waartussen de muis wordt geplaatst en aan weerszijden met veerbelaste bouten op zijn plaats wordt vastgezet (Figuur 2B). De bovenplaat bevat een ronde uitsparing met een diameter van ~2 cm. In deze opening aan de voorkant van de bovenplaat is een zwarte O-ring van overeenkomstige grootte geplaatst, die de objectieflens zal beschermen (Figuur 2C). Aan de achterzijde van de bovenplaat wordt met hoogvacuümvet een dekglas van 24 mm x 50 mm gelijmd, waardoor een waterdichte afdichting ontstaat. Dit dekglas zal dienen als beeldvormingsvenster door zich aan de long eronder te hechten en de beeldvormingsmedia (d.w.z. water) erboven vast te houden. Zorg ervoor dat er geen vacuümvet binnen het ronde beeldvormingsvenster komt. Bij elk nieuw beeldvormingsexperiment wordt het dekglas vervangen. De grondplaat wordt verwarmd tot 35-37 °C met behulp van een thermokoppeltemperatuursonde (figuur 2A).

  1. Plaats de geïntubeerde muis op de basisplaat van de beeldvormingskamer met de open linkerborst naar boven gericht (zie afbeelding 1G, H). Zet de muis vast met zijden tape over het gezicht, de voorpoten en de staart (zie afbeelding 1H en afbeelding 2A).
  2. Breng lijm aan op de onderkant van het afdekglas dat aan de bovenplaat is bevestigd (grijze cirkel in figuur 2C, onder) en laat een lijmvrije cirkel van 0,8-1,0 cm in het midden.
    OPMERKING: Er is een afweging tussen de grootte van de lijmvrije cirkel en de hoeveelheid bewegingsartefact; Het wordt dus aanbevolen dat de cirkel niet groter is dan 1,0 cm in diameter.
  3. Laat de bovenplaat zakken totdat het dekglas contact maakt met de long, waarbij de lijm het longoppervlak raakt (zie afbeelding 1G).
    OPMERKING: De linkerlong wordt op het dekglas gelijmd met een schone, lijmvrije cirkel in het midden, het gebied dat wordt afgebeeld.
  4. Houd het dekglas tegen de long en blaas de long 1-2 s op zodat het lijmgebied zich hecht aan het omliggende weefsel. Bereik het opblazen van de longen door de uitstroomslang van de endotracheale tube van de muis naar het beademingsapparaat af te sluiten.
    OPMERKING: Blaas de long niet langer dan 1-2 seconden op, omdat dit overmatig barotrauma kan veroorzaken.
  5. Trek de bovenplaat iets terug om de druk op het longweefsel te verminderen. Zorg ervoor dat het gebied van de long binnen het beeldvormingsvenster niet beweegt met ventilatie.
  6. Zet beide uiteinden van de bovenplaat vast door de duimmoer over elke bout vast te zetten (zie afbeelding 2B).

4. Beeldvorming met twee fotonen

OPMERKING: Voor intravitale microscopie moet een rechtopstaande microscoop met een 20x of 25x >1.0 numerieke apertuur (NA) wateronderdompelingsobjectief worden gebruikt. Hieronder ziet u de opstelling die in deze studie is gebruikt voor een B6 naar B6. LysM-GFP linkerlongtransplantatie met 655-nm q-dot bloedvatlabeling. Bij toepassing van dit protocol kan de opstelling van de microscoop, lasers en dichroïsche filters worden aangepast op basis van de behoeften van het specifieke experiment en de gebruikte fluorescerende reporters.

  1. Plaats de hele beeldvormingskamer met de geïntubeerde ontvangende muis (B6 linkerlong getransplanteerd in B6. LysM-GFP met 655 nm q-dots) op de microscooptafel (zie figuur 2A).
  2. Gebruik dichroïsche filters met golflengten van 480 nm, 560 nm en 635 nm, die de signalen op de juiste manier scheiden van de GFP-reporter, q-dots en het signaal van de tweede harmonische generatie (SHG) (445 nm) dat wordt gegenereerd door collageen. Deze filters kunnen worden aangepast op basis van het specifieke experiment.
    OPMERKING: Het SHG-signaal dat door collageen wordt gegenereerd, bakent donkere kraterachtige structuren af, die alveolaire luchtruimen vertegenwoordigen (zie witte pijlen in figuur 3).
  3. Stel de titanium-saffier femtoseconde gepulseerde laser in op 890 nm (binnen het nabij-infrarode bereik) voor excitatie. Gebruik een zo laag mogelijk laservermogen om een voldoende signaal te verkrijgen.
    OPMERKING: De laserinstellingen moeten worden aangepast voor het specifieke experiment om de signaalscheiding te maximaliseren.
  4. Breng ~1 ml water aan om het afdekglas op de bovenplaat volledig te bedekken, dat op zijn plaats wordt gehouden door de O-ring en de vacuümvetafdichting van het afdekglas op de bovenplaat (zie afbeelding 1G en afbeelding 2C).
  5. Gebruik het 20x >1.0 NA wateronderdompelingsobjectief op de microscoop. Zorg ervoor dat de objectieflens is aangepast op basis van het specifieke experiment.
    OPMERKING: Grotere NA zorgt voor meer lichtverzameling, een hoger contrast en gedetailleerdere beelden. Doelstellingen voor onderdompeling in water hebben de voorkeur, omdat water of buffer beter compatibel is met biologische weefsels.
  6. Laat het objectief van de microscoop in het water zakken en stel scherp op het oppervlak van de long.
  7. Activeer de bodemplaatverwarmer en houd de temperatuur op 35-37 °C.
    OPMERKING: Als er bezorgdheid bestaat over het onvermogen om de weefseltemperatuur op peil te houden of voldoende perfusie naar de long, kunnen naast de basisplaat twee extra weerstanden worden bevestigd om de bovenplaat te verwarmen (zie aanvullende afbeelding 1).
  8. Verkrijg afbeeldingsstapels met acquisitiesoftware naar keuze.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de kamer volledig donker is tijdens de aankoop, wat het gebruik van verduisterende gordijnen/jaloezieën en strategische afdekking van alle lichtbronnen kan inhouden.

5. Video-acquisitie

OPMERKING: De volgende parameters kunnen worden aangepast op basis van het specifieke experiment. In de stappen 5.1-5.3 worden de specifieke parameters beschreven die voor de B6 tot en met B6 worden gebruikt. Lysm-GFP muizentransplantatie naar de linkerlong, die als naslagwerk kan worden gebruikt.

  1. Gebruik een bidirectionele scanner met videosnelheid om de afmetingen van de x-y-scan in te stellen op 512 x 512 pixels.
  2. Gebruik een xyz-stepper-eenheid om time-lapse-opnamen te maken van een z-stack van 21 stappen met een gemiddelde van 10 frames per stap. Elke stapel duurt ongeveer 20 s om te verwerven, inclusief de tijd die nodig is voor frame-averaging, de stappenmotor om te bewegen en zijn positie te controleren, en een vertraging van 100 ms.
    OPMERKING: De bidirectionele scanner op de microscoop die in dit onderzoek is gebruikt, werkt met een videosnelheid van 30 frames/s. Dit kan verschillen afhankelijk van de specifieke opstelling van de microscoop.
  3. Verkrijg 80 opeenvolgende z-stacks om time-lapse-beeldvorming van leukocytenmigratie binnen het weefselparenchym te verkrijgen. Dit duurt ongeveer ~27 min bij 20 s/stapel.
    OPMERKING: De stapelgrootte, het gemiddelde van het frame, het laservermogen en de totale duur van de time-lapse-opname moeten tot een minimum worden beperkt om overmatige blootstelling van de laser aan het weefsel te voorkomen. Als de gebruikte fluorescerende reporters helder zijn (d.w.z. GFP) en het laservermogen laag is, wordt het herhalen van een 21-staps z-stack met een gemiddelde van 10 frames, een scan van 512 x 512 pixels, met tussenpozen van 20 s gedurende ~27 minuten goed verdragen door de muis. Als langere perioden van beeldvorming gewenst zijn, moet de acquisitietijd per stapel worden verlengd om de totale laserbelichting hetzelfde te houden (d.w.z. 1 minuut per stapel gedurende ~1.5 uur). Deze instellingen moeten worden geoptimaliseerd op basis van de gebruikte fluorescerende verslaggevers.
  4. Euthanaseer de muis aan het einde van de beeldacquisitie. Om te euthanaseren, verdooft u de muis met ketamine (80-100 mg/kg) en xylazine (8-10 mg/kg), gevolgd door daaropvolgende cervicale dislocatie. Typische beeldvormingspreparaten behouden de levensvatbaarheid van de muis gemakkelijk tot 2 uur.
    OPMERKING: Om deze periode te verlengen, kunnen aanvullende vochtsuppletie, anesthesie met isofluraan en aandacht voor temperatuurregulatie nodig zijn.
  5. Volledige videoweergave met Imaris. Andere beeldvormingssoftware (zoals ImageJ) kan ook worden gebruikt.
    OPMERKING: Afbeeldingen kunnen na de acquisitie worden verwerkt met behulp van contrastverbetering, vloeiendheid en kanaalrekenkunde om kanaaloverspraak te verwijderen.

Resultaten

Na 1 uur koude ischemische opslag bij 4 °C hebben we de linkerlong orthotopisch getransplanteerd van een B6-muis naar een B6. LysM-GFP muis4, en vervolgens werd intravitale beeldvorming van twee fotonen uitgevoerd, zoals hierboven beschreven. We voerden beeldvorming uit op twee tijdstippen na de transplantatie - 2 uur (Figuur 3A) en 24 uur (Figuur 3B). Bloedvaten worden rood gelabeld door de q-dots die direct voor de beeldvorming worden geïnjecteerd. Bovendien kunnen we monocyten visualiseren die 24 uur4 q-dots hebben opgenomen. In de bijbehorende video 24 uur na de transplantatie zijn groen gelabelde neutrofielen te zien die het longtransplantaat infiltreren (aanvullende video 1). longblaasjes kunnen worden gevisualiseerd als donkere kraters als gevolg van SHG uit collageen (witte pijlen in figuur 3). We zien dat er 24 uur na de transplantatie meer neutrofielen in de long zijn dan 2 uur na de transplantatie (Figuur 3).

figure-results-1
Figuur 1: Voorbereiding van de muis op twee-fotonbeeldvorming. (A) De huid wordt heropend over de linker thoracotomie. (B) Huid en zacht weefsel uitgesneden over de linkerborst. (C,D) Ribben 10 s vastgeklemd voordat ze worden verdeeld. (E) Linker 3-5eribben doorgesneden om een raam te creëren van ~ 0,8 cm craniocaudaal x 1,0 cm anteroposterieur. (F) Linkerlong opgeheven uit de linkerborst en geplaatst op een strook gaas. (G) Een beeldvormingskamer met een beeldvormingsvenster over de linkerlong. (H) De beeldvormingskamer die op de microscooptafel wordt geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Afbeelding 2: Opstelling van de beeldkamer. (A) De beeldvormingskamer die op de microscooptafel is geplaatst. (B) Vergrote weergave van het veerbelaste boutmechanisme om de bovenplaat over de linkerlong te bevestigen. (C) Voor- en achterkant van de bovenplaat met O-ring en afdekglas. Witte lijnen geven het gebied aan waar vacuümvet wordt aangebracht om dekglas aan de bovenplaat te hechten. De grijze cirkel stelt een ring van lijm voor die op het dekglas moet worden aangebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Twee-foton intravitale beeldvorming van muistransplantatie van de linkerlong van B6 naar B6. LysM-GFP-muis met 1 uur koude ischemische opslag. Beeldvorming wordt uitgevoerd om (A) 2 uur en (B) 24 uur na transplantatie. Rood staat voor q-dots. Groen staat voor neutrofielen uit B6. LysM-GFP-ontvanger. Blauw staat voor SHG uit collageenrijke longblaasjes. Witte pijlen geven het alveolaire luchtruim aan. De schaalbalk geeft 20 μm weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende afbeelding 1: Bovenplaat met twee weerstanden bevestigd om voor extra verwarming te zorgen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 1: Time-lapse-beeldvorming met twee fotonen van de getransplanteerde linkerlong van muizen van B6 naar B6. LysM-GFP-muis met 1 uur koude ischemische opslag, uitgevoerd 24 uur na transplantatie. Rood staat voor q-dots. Groen staat voor neutrofielen van de LysM-GFP-ontvanger. Blauw staat voor de tweede harmonische generatie van collageenrijke longblaasjes. De schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Excitatie van twee fotonen werd voor het eerst beschreven in haar proefschrift door Maria Göppert-Mayer in 1931, die later de Nobelprijs voor de natuurkunde won voor het beschrijven van de nucleaire schilstructuur 22,23. Traditionele fluorescentiemicroscopie is gebaseerd op excitatie van één foton, met excitatiegolflengten die korter en energieker zijn dan emissiegolflengten. In tegenstelling tot enkelvoudige fotonmicroscopie, omvat twee-fotonmicroscopie gelijktijdige excitatie door twee fotonen, elk met langere golflengten dan die van het uitgezonden fluorescentiesignaal 24,25,26. Omdat twee individuele fotonen co-localiseren om een enkel brandpunt in het weefsel te exciteren, is de excitatie van twee fotonen ruimtelijk tot een klein monstervolume, waardoor optische doorsnede 24,25,26 mogelijk is en er minder fotobleking is boven en onder het vlak dat het brandpunt 27 bevat. De kans op gelijktijdige excitatie door twee fotonen is erg laag, dus een femtoseconde gepulseerde laser is nodig om de excitatie-intensiteit te bereiken die nodig is voor een fluorescentie-emissiesignaal 25,26,27. De excitatielaser bevindt zich in het nabij-infraroodbereik (700-1100 nm), met als voordeel minder verstrooiing, waardoor het licht dieper in het weefsel kan doordringen28. De diepte van de beeldvorming is afhankelijk van de oscillatiesnelheid en het vermogen van de laser24. In de long kunnen beeldvormingsdiepten van ~500-600 μm worden bereikt17. De combinatie van beelddiepte en lage fotobleking maakt twee-fotonmicroscopie dus zeer geschikt voor intravitale beeldvorming van organen.

Twee-fotonmicroscopie is gebruikt in meerdere verschillende weefsels en anatomische plaatsen, zoals de huid12,13, lymfeklieren29, veneus endotheel30, hersenschors10,11, nier14,15 en lever31,32. In de dermis van muizen is bijvoorbeeld intravitale beeldvorming van twee fotonen gebruikt om het zwermen van neutrofielen na steriel lichamelijk letsel te beschrijven12. In een model van veneuze trombose werden bloedmonocyten en neutrofielen gevisualiseerd die langs het endotheel van de inferieure vena cavakropen 30. Menselijke microglia zijn met succes in vivo in beeld gebracht nadat ze waren geëxenotransplanteerd in een menselijk hersenorganoïde model33. Met voortdurende vooruitgang in twee-fotonmicroscopie is intravitale beeldvorming mogelijk op grotere diepten en zelfs in niet-statische organen. Zo zijn dieptes tot 1000 μm in beeld gebracht in de neocortex bij muizen met behulp van een Ti:Al2O3 regeneratieve versterker34.

Een van de uitdagingen van intravitale beeldvorming in thoracale organen is beeldstabilisatie. Door beweging van het kloppende hart en de longademhaling kunnen bewegingsartefacten de beeldkwaliteit aanzienlijk verminderen. Er zijn verschillende methoden voor stabilisatie voor beeldvorming van hart en longen ontwikkeld, waaronder lijmenvan het orgaan 4,7, zuigstabilisatie 19,35,36,37 en a posteriori bewegingscorrectie38. Onze techniek voor het afbeelden van de long is gebaseerd op het lijmen van het longoppervlak op een gestabiliseerd dekglas. We houden de long doorbloed, beademd en normotherm, wat de omstandigheden in vivo simuleert. Vergeleken met de zuigstabilisatiemethode beschreven door Looney et al.19 heeft dit protocol verschillende voordelen. Ten eerste hebben we geen speciale afzuiging nodig. In plaats daarvan kunnen onze beeldvormingskamer en bovenplaat worden geconstrueerd met materialen die direct beschikbaar zijn in een microscopielaboratorium. Bovendien maakt de lijmtechniek die in dit onderzoek wordt gebruikt, in vergelijking met het zuigapparaat (dat een interne diameter van 4 mm heeft), een groter beeldoppervlak mogelijk (tot 10 mm). Bij omtreklijm wordt het gebied van de long binnen de lijmcirkel voldoende beperkt en wordt de beademingsbeweging geminimaliseerd. In vergelijking met de zuigtechniek voorkomt de benadering van het afdekglas convexe vervorming van het longoppervlak, wat de subpleurale capillaire bloedstroom zou kunnen beïnvloeden. Nadelen van ons systeem zijn onder meer het onvermogen om het dekglaasje te verwijderen zonder de pleuroparenchymale overgang in gevaar te brengen. Het is dus niet mogelijk om de long een tweede keer af te beelden met de hier gebruikte lijmtechniek, terwijl de zuigtechniek seriële beeldvorming mogelijk maakt. Bovendien vereist het gebruik van een thoracotomie het verlies van de normale negatieve intrathoracale druk, die, in combinatie met positieve drukventilatie, niet fysiologisch is. Aanvullende beperkingen, beperkingen van beeldvorming met twee fotonen worden hieronder besproken.

Terwijl de borstkas open is tijdens intravitale beeldvorming, is het van cruciaal belang om zo dicht mogelijk bij een fysiologische omgeving te blijven. De bodemplaat waarop de muis ligt, wordt op een temperatuur van 35-37 °C gehouden. Met alleen de huidplaat verwarmd, hebben we ontdekt dat de kerntemperatuur van de muis (gemeten via een rectale sonde) gedurende enkele uren goed wordt gereguleerd. Onze ervaring is dat de beweeglijkheid en het gedrag van de cellen pas zichtbaar worden beïnvloed wanneer de temperatuur onder de 32 °C daalt, wat met deze opstelling waarschijnlijk niet zal gebeuren. Als er een probleem is bij het handhaven van weefselnormothermie of longperfusie tijdens de eerste installatie van deze beeldvormingskamer, kunnen naast de basisplaat twee extra weerstanden worden bevestigd om de bovenplaat te verwarmen (aanvullende afbeelding 1). Zodra de beeldvormingskamer is geoptimaliseerd, is het niet nodig om tijdens elk beeldvormingsexperiment routinematig de interne temperatuur van de muis te controleren. Bovendien hebben we ontdekt dat de combinatie van met zoutoplossing doordrenkt gaas dat over de open borstholte wordt geplaatst en de occlusieve lijmring rond het gebied van de long dat moet worden afgebeeld, effectief is in het minimaliseren van vochtverlies tijdens beeldvorming.

Een belangrijke technische overweging is het bereiken van een goede hemostase tijdens ribresectie bij het maken van het thoracale beeldvormingsvenster. Delen van de linker 3etot en met 5eribben worden weggesneden en aanhoudende bloedingen uit deze gesneden ribben zullen de overleving van de muis tijdens beeldvorming in gevaar brengen. Om dit tegen te gaan, raden we aan om de ribben eerst proximaal af te klemmen op de plaats waar ze moeten worden verwijderd gedurende 10 s om de microvasculatuur te trombose (zie figuur 1C,D). Vervolgens, na het verwijderen van de ribben, moeten de snijranden van de ribben royaal worden gecoaguleerd met elektrocauterisatie. Ten slotte is het van cruciaal belang om de linkerlong tijdens de beeldvorming op de strook met met zoutoplossing doordrenkt gaas te plaatsen (zie figuur 1F) om te voorkomen dat de scherpe ribranden de long doorboren. Met deze combinatie van technische overwegingen kunnen we gedurende enkele uren duidelijke video's maken van het verkeer van immuuncellen in het longparenchym met minimaal bewegingsartefact zonder longbeschadiging of verlies van normale perfusiepatronen.

Twee-fotonmicroscopie is in longen gebruikt om modellen van infectieziekten en steriele ontstekingen te bestuderen. De ene groep gebruikte beeldvorming met twee fotonen om de motiliteit en migratie van B-cellen in het geheugen van de bewoner te bestuderen na herhaalde uitdagingen van muizenlongen met het influenzavirus39. Bovendien is twee-fotonmicroscopie gebruikt bij transplantatie van huid-, nier- en pancreaseilandjes 40,41,42,43. Met een transplantatiemodel kunnen de donor en ontvanger genetisch worden veranderd om hun respectievelijke celpopulaties te bestuderen. Voor zover wij weten, was onze groep de eerste die intravitale beeldvorming van twee fotonen uitvoerde bij longtransplantaties bij muizen4. We zagen snelle rekrutering en clustering van neutrofielen na transplantatie-gemedieerde ischemie-reperfusieschade, die werd verminderd door farmacologische depletie van bloedmonocyten4. In verder werk hebben we aangetoond dat van de milt afgeleide monocyten van de ontvangende milt neutrofiele extravasatie vergemakkelijken door de productie van IL-1B44. Intravitale beeldvorming in deze onderzoeken stelde ons in staat om stroomopwaartse regulatoren van neutrofiele extravasatie te ontdekken als mogelijke therapeutische doelen om de ontstekingsreactie na transplantatie te verminderen45. Daarnaast hebben we ook intravitale beeldvorming uitgevoerd in kloppende muizenharten na heterotope transplantatie16. We visualiseerden de rekrutering van neutrofielen naar het myocardium en ontdekten dat ferroptotische celdood van harttransplantaatcellen ontstekingen initieert na harttransplantatie46. We pasten een vergelijkbare stabilisatietechniek toe op getransplanteerde aortabogen om monocytair verkeer in atherosclerotische plaques te visualiseren47. Deze studies toonden de haalbaarheid en het nut aan van intravitale beeldvorming van niet-statische getransplanteerde thoracale organen.

Ten slotte is het de moeite waard om methoden te bespreken om verschillende celtypen en het longparenchym te visualiseren. Er worden twee hoofdmethoden gebruikt om cellen te labelen: 1) transgene muizenstammen met knock-in-mutaties van fluorescerende eiwitten en 2) fluorescerend gelabelde antilichamen tegen kleurcellen. Veelgebruikte transgene muizenstammen om immuuncellen te identificeren door middel van twee-fotonmicroscopie zijn onder meer LysM-GFP voor neutrofielen48, CX3Cr1-GFP voor verschillende interstitiële macrofaagpopulaties49,50, CCR2-GFP voor klassieke monocyten51, CD19-tdTomato voor B-cellen52 en Foxp3-GFP voor regulerende T-cellen5. Met name CX3Cr1 alleen is niet voldoende om cellen ondubbelzinnig te identificeren, maar dit kan worden geholpen door celmorfologie en locatie die consistent zijn met die van interstitiële macrofagen. Alveolaire macrofagen kunnen zonder labeling worden afgebeeld vanwege hun autofluorescentie53,54, onderscheidende morfologie en gedrag (d.w.z. gebrek aan beweeglijkheid bij de tijdresolutie van time-lapse-opnamen). Vergeleken met eosinofielen, die ook autofluorescerend zijn, zijn alveolaire macrofagen groter en aanzienlijk helderder met een excitatie van 890 nm54. Als alternatief kunnen alveolaire macrofagen ook worden geëtiketteerd op basis van hun fagocytische functie via intrapulmonale toediening van kleurstofaggregaten54.

Visualisatie van immuuncellen bij ontvangers van transplantaties kan ook worden bereikt door intravasculaire adoptieve overdracht van fluorescerend gelabelde cellen of door injectie van fluorescerend gelabelde antilichamen tegen celspecifieke oppervlaktemarkers 18,55. Een ander inherent voordeel van twee-fotonmicroscopie is SHG door bepaalde dubbelbrekende structuren in weefsel, zoals collageen56. Dit fenomeen is vooral nuttig voor beeldvorming van de longen vanwege het hoge collageengehalte in de alveolaire zakjes, dat fungeert als een intrinsieke indicator van de alveolaire structuur zonder extra fluorescerende kleurstoffen. Verder worden longblaasjes ook begrensd door alveolaire haarvaten die worden gelabeld met 655 nm q-dots. Ten slotte kunnen bloedvaten worden gelabeld met intraveneuze injectie van q-dots (zoals beschreven in dit protocol) of rhodamine B dextran. Bij het ontwerpen van een intravitaal twee-fotonmicroscopie-experiment raden we het gebruik van niet meer dan vier verschillende emissiekanalen aan om het risico op doorbloeding en slechte differentiatie tussen kanalen te minimaliseren.

Een van de belangrijkste beperkingen van onze beschreven lijmstabilisatietechniek is het onvermogen om het dekglas uit de long te verwijderen zonder mogelijke weefselbeschadiging en lijmresten op het longoppervlak. De long kan dus maar één keer in beeld worden gebracht in plaats van op meerdere tijdstippen gedurende meerdere dagen. Om deze beperking aan te pakken, heeft één groep een semi-permanent thoracaal beeldvormingsvenster beschreven, dat seriële beeldvorming van de long mogelijk maakt57. Onze ervaring is echter dat deze benadering geen adequate longstabilisatie mogelijk maakt voor langere perioden van beeldvorming. Deze techniek biedt de mogelijkheid om de long meerdere uren in beeld te brengen, wat belangrijke inzichten biedt in aangeboren en adaptieve immuunresponsen na transplantatie.

Andere beperkingen van beeldvorming met twee fotonen zijn onder meer de dure initiële kosten van de installatie en de expertise die nodig is om het systeem te onderhouden. De scanvelden zijn relatief klein in vergelijking met immunofluorescerende beeldvorming. Thermische en fotoschade kunnen aanzienlijk zijn zonder zorgvuldige optimalisatie van de acquisitieparameters. De functie voor de spreiding van het excitatiepunt met twee fotonen is breed, wat de resolutie enigszins beperkt, vooral in de z-dimensie. Bovendien vereist beeldvorming met twee fotonen dat cellen van belang fluorescerend worden geëtiketteerd, en sommige cellen kunnen niet ondubbelzinnig worden gelabeld met een enkele celmarker. Het aantal signalen dat tegelijkertijd kan worden afgebeeld, is vaak beperkt tot vier of minder. Ten slotte kunnen anesthesie, chirurgie en beeldvorming extra ontsteking en fysiologische veranderingen veroorzaken bovenop de longtransplantatie die experimentele resultaten en interpretaties kunnen verwarren, ondanks de inspanningen om een fysiologische omgeving te behouden. Toekomstige richtingen omvatten de ontwikkeling van minimaal invasieve methoden voor intravitale beeldvorming (zoals door middel van een kleinere thoracotomie of bronchoscopische benadering).

Concluderend is intravitale twee-fotonmicroscopie een hulpmiddel van onschatbare waarde bij het bestuderen van meerdere ziekteprocessen. Hier beschrijven we een betrouwbare techniek van longimmobilisatie en beeldvorming met twee fotonen, die intravitale observatie van celverkeer en dynamische interacties tussen verschillende celpopulaties na longtransplantatie bij muizen mogelijk maakt. Deze techniek heeft ons begrip van het immuunlandschap na transplantatie verbreed en zal een onmisbaar hulpmiddel blijven bij de studie van longtransplantatie en andere longziekteprocessen.

Openbaarmakingen

De auteurs rapporteren geen relevante openbaarmakingen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van NIH 1P01AI11650 en de Foundation for Barnes-Jewish Hospital. We danken de In Vivo Imaging Core van de Washington University School of Medicine.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.75% povidone-jodiumAplicareNDC 52380-0126-2Voor desinfectie
1-inch 20G IV-katheterTerumoSROX2025CAVoor endotracheale tube (ETT)
1-inch zijden tapeDurapore3M ID 7100057168Om de muis in positie te houden
20x water immersie lange objectieflensOlympusN20X-PFH
3M Vetbond lijmMedi-Vet.com10872Om de dekglas op de long te plakken
655 nm niet-gerichte quantum dotsThermoFisherQ21021MPVoor het labelen van bloedvaten
70% ethanolSigma AldrichEX0281Voor desinfectie
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
Zwarte O-ring (2 cm)HardwarewinkelN/AVoor op maat gebouwde beeldvormingskamer
Boulon (2)HardwarewinkelN/AVoor op maat gebouwde beeldvormingskamer
Messing duimmoer (2)HardwarewinkelN/AVoor op maat gebouwde beeldvormingskamer
Buprenorfine 1.3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30Voor pijnbestrijding
Chameleon titanium-saffier femtoseconde gepulseerde laserCoherentN/A
Dekglas (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63Voor op maat gebouwde beeldvormingskamer
Gebogen muggenklem (1)Fine Science Tools13009-12
Dual kanaal verwarmingsregelaarWarner InstrumentsTC-344B
Fijne schaar (1)Fine Science Tools15040-11
Staande microscoop met vaste standOlympusBX51WI
Gaas (gesneden tot 1 cm x 3 cm)McKesson476709Om onder de linkerlong te plaatsen
Hoge vacuümvetDow CorningN/AOm het dekglas op de bovenplaat te hechten
Isofluraan 1%Sigma Aldrich26675-46-7Voor anesthesie
Ketaminehydrochloride 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Voor anesthesie
Metalen plaat (3 cm x 7 cm)HardwarewinkelN/AVoor op maat gebouwde beeldvormingskamer
Spitse katoenen applicatorsSolon56225Om de long te manipuleren en voor stompe dissectie
Power Pro Ultra knipmachineOster078400-020-001
Puralube Vet oogzalfMedi-Vet.com11897Om ooguitdroging te voorkomen
Kleine dierenventilatorHarvard Apparatus55-0000
Rechte tang (1)Fine Science Tools91113-10
Driekanaals sluiter driverUniblitzVMM-D3Resonant scanner
x.y.z optische stapmotorPrior ScientificOptiScan II
Xylazin 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20Voor pijnbestrijding

Referenties

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Khush, K. K., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: 37th adult heart transplantation report-2020; focus on deceased donor characteristics. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1003-1015 (2020).
  3. Wang, J. H., Skeans, M. A., Israni, A. K. Current status of kidney transplant outcomes: Dying to survive. Adv Chronic Kidney Dis. 23 (5), 281-286 (2016).
  4. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  5. Li, W., et al. Bronchus-associated lymphoid tissue-resident Foxp3+ T lymphocytes prevent antibody-mediated lung rejection. J Clin Invest. 129 (2), 556-568 (2019).
  6. Kurihara, C., et al. Crosstalk between nonclassical monocytes and alveolar macrophages mediates transplant ischemia-reperfusion injury through classical monocyte recruitment. JCI Insight. 6 (6), e147282(2021).
  7. Spahn, J. H., et al. DAP12 expression in lung macrophages mediates ischemia/reperfusion injury by promoting neutrophil extravasation. J Immunol. 194 (8), 4039-4048 (2015).
  8. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  9. Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2 (11), 872-880 (2002).
  10. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  11. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  12. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Ashworth, S. L., Sandoval, R. M., Tanner, G. A., Molitoris, B. A. Two-photon microscopy: visualization of kidney dynamics. Kidney Int. 72 (4), 416-421 (2007).
  15. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9(+) cell to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203-12213 (2020).
  16. Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. J Clin Invest. 122 (7), 2499-2508 (2012).
  17. Nava, R. G., et al. Two-photon microscopy in pulmonary research. Semin Immunopathol. 32 (3), 297-304 (2010).
  18. Li, W., et al. Necroptosis triggers spatially restricted neutrophil-mediated vascular damage during lung ischemia reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (10), e2111537119(2022).
  19. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  20. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 4 (1), 86-93 (2009).
  21. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7 (6), 1672-1679 (2007).
  22. Grzybowski, A., Pietrzak, K. Maria Goeppert-Mayer (1906-1972): two-photon effect on dermatology. Clin Dermatol. 31 (2), 221-225 (2013).
  23. Göppert-Mayer, M. Uber Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Ann Phys. 401 (3), 273-294 (1931).
  24. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  25. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Diaspro, A., et al. Multi-photon excitation microscopy. Biomed Eng Online. 5, 36(2006).
  27. Williams, R. M., Piston, D. W., Webb, W. W. Two-photon molecular excitation provides intrinsic 3-dimensional resolution for laser-based microscopy and microphotochemistry. FASEB J. 8 (11), 804-813 (1994).
  28. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  29. Chtanova, T., et al. Dynamics of neutrophil migration in lymph nodes during infection. Immunity. 29 (3), 487-496 (2008).
  30. von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  31. Stanciu, S. G., et al. Experimenting liver fibrosis diagnostic by two photon excitation microscopy and Bag-of-Features image classification. Sci Rep. 4, 4636(2014).
  32. Hsiao, C. Y., et al. Improved second harmonic generation and two-photon excitation fluorescence microscopy-based quantitative assessments of liver fibrosis through auto-correction and optimal sampling. Quant Imaging Med Surg. 11 (1), 351-361 (2021).
  33. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126 (2023).
  34. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  35. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  38. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infect Immun. 82 (2), 864-872 (2014).
  39. MacLean, A. J., et al. Secondary influenza challenge triggers resident memory B cell migration and rapid relocation to boost antibody secretion at infected sites. Immunity. 55 (4), e718 718-733 (2022).
  40. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (31), 12863-12868 (2011).
  41. Camirand, G. New perspectives in transplantation through intravital microscopy imaging. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 6-12 (2013).
  42. Camirand, G., et al. Multiphoton intravital microscopy of the transplanted mouse kidney. Am J Transplant. 11 (10), 2067-2074 (2011).
  43. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17 (6), 744-749 (2011).
  44. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  45. Li, W., et al. Resolvin D1 prevents injurious neutrophil swarming in transplanted lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (31), e2302938120(2023).
  46. Li, W., et al. Ferroptotic cell death and TLR4/Trif signaling initiate neutrophil recruitment after heart transplantation. J Clin Invest. 129 (6), 2293-2304 (2019).
  47. Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-Brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (5), 1030-1036 (2018).
  48. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  49. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods Mol Biol. 1041, 307-317 (2013).
  50. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute Crit Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  51. Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circ Res. 124 (2), 263-278 (2019).
  52. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), e134700(2020).
  53. Lohmeyer, J., Friedrich, J., Rosseau, S., Pralle, H., Seeger, W. Multiparameter flow cytometric analysis of inflammatory cells contained in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 172 (1), 59-70 (1994).
  54. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), e111 110-125 (2020).
  55. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  56. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  57. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).

Herprints en machtigingen

Tags

Intravitale beeldvorminglongtransplantatielongtransplantaat van muistransport van immuuncellenorthotope longtransplantatieneutrofieleninfiltratieregulatoire T-cellenbeeldvormingsvensterpulmonaal allograft
Intravitale twee-fotonmicroscopie van de getransplanteerde muizenlong
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.