Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Strategieën om de teelt van anaërobe bacteriën uit het maagdarmkanaal van kip te verbeteren

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66570

⸱

10 mei 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Animal Science, University of Hohenheim, 2HoLMiR - Hohenheim Center for Livestock Microbiome Research, University of Hohenheim

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol presenteert twee methodologieën om de isolatie van anaërobe darmbacteriën te verbeteren. De eerste richt zich op de isolatie van een breed scala aan bacteriën met behulp van verschillende kweekmedia. De tweede richt zich op de kweekstappen van een specifieke microbiële groep, die mogelijk myo-inositol assimileert, om de ecologische betekenis ervan volledig te begrijpen.

Samenvatting

Het maagdarmkanaal (GIT) van kip is een complex ecosysteem met biljoenen microben die een cruciale rol spelen in de fysiologie van de gastheer, de spijsvertering, de opname van voedingsstoffen, de rijping van het immuunsysteem en het voorkomen van het binnendringen van ziekteverwekkers. Voor een optimale gezondheid en productiviteit van dieren is het noodzakelijk om deze micro-organismen te karakteriseren en hun rol te begrijpen. Hoewel het maagdarmkanaal van pluimvee een reservoir van micro-organismen bevat met potentiële probiotische toepassingen, blijft het grootste deel van de diversiteit onontgonnen. Om ons begrip van niet-gekweekte microbiële diversiteit te vergroten, zijn gezamenlijke inspanningen nodig om deze micro-organismen in cultuur te brengen. Isolatie en kweek van GIT-koloniserende micro-organismen leveren reproduceerbaar materiaal op, waaronder cellen, DNA en metabolieten, en biedt nieuwe inzichten in metabolische processen in de omgeving. Zonder teelt blijft de rol van deze organismen in hun natuurlijke omgeving onduidelijk en beperkt tot een beschrijvend niveau. Ons doel is om teeltstrategieën te implementeren die gericht zijn op het verbeteren van de isolatie van een breed scala aan anaërobe microben uit het maagdarmkanaal van de kip, waarbij gebruik wordt gemaakt van multidisciplinaire kennis uit de dierfysiologie, diervoeding, metagenomica, voederbiochemie en moderne teeltstrategieën. Daarnaast streven we ernaar om het gebruik van de juiste praktijken voor bemonstering, transport en mediavoorbereiding te implementeren, waarvan bekend is dat ze van invloed zijn op het succes van isolatie. Passende methoden moeten zorgen voor een consistente zuurstofvrije omgeving, optimale atmosferische omstandigheden, de juiste incubatietemperatuur van de gastheer en voorzieningen voor specifieke voedingsbehoeften die zijn afgestemd op hun specifieke behoeften. Door deze methodologieën te volgen, zal de teelt niet alleen reproduceerbare resultaten voor isolatie opleveren, maar ook de isolatieprocedures vergemakkelijken, waardoor een uitgebreid begrip van het ingewikkelde microbiële ecosysteem in het maagdarmkanaal van de kip wordt bevorderd.

Inleiding

De heropleving van de teelt bij het bestuderen van micro-organismen heeft de inzichten uit metagenomische studies aangevuld door materiaal te leveren om metabole hypothesen te testen die voorheen slechts gedeeltelijk werden beschreven en gekwantificeerd. Het kweken van darmbacteriën levert materiaal om toekomstig onderzoek naar interacties tussen microben en gastheer te ondersteunen, gerichte kolonisatiestudies te vergemakkelijken en moleculaire interactiestudies te verbeteren 1,2,3. De kennis die is opgedaan over gastro-intestinale micro-organismen heeft de voeding en het welzijn van dieren verbeterd door de formulering van het dieet te beïnvloeden en de beschikbaarheid van voedingsstoffen te verbeteren4. Dit inzicht heeft bijgedragen aan prestatieverbeteringen bij het gebruik van prebiotische en probiotische interactie. Er is echter diepgaand onderzoek nodig om een volledig begrip te krijgen van hoe biochemische en fysisch-chemische omstandigheden op elkaar inwerken en het microbiële profiel en de structuur ervan beïnvloeden. Om dit doel te bereiken, blijft teelt noodzakelijk, als een cruciaal hulpmiddel om zich te verdiepen in de ingewikkelde dynamiek van microbiële gemeenschappen binnen het gastro-intestinale milieu.

In tegenstelling tot het uitgebreide onderzoek naar microben die verband houden met de menselijke darm en klinische kweekstudies5, hebben rapporten over micro-organismen van vee voornamelijk gebruik gemaakt van een beperkt aantal media voor isolatie, waardoor de diversiteit van isolaten mogelijk wordt beperkt 2,3. Bovendien zijn verbeteringen in de formulering van media en studies naar de interactie van fosfaat en zouten met agar, zoals toegelicht door Tanaka et al. en Kawasaki et al., nog niet geïmplementeerd voor darmmicrobioomstudies 6,7,8,9.

Myo-inositol (MI) wordt beschouwd als een semi-essentiële stof en er is gemeld dat het een cruciale rol speelt in diverse metabole, fysiologische en regulerende processen10,11. Deze omvatten betrokkenheid bij botmineralisatie, ontwikkeling van borstspieren, cellulaire signalering, bevordering van ovulatie en vruchtbaarheid, modulatie van neuronale signalering en fungeren als regulator van glucosehomeostase en insulineregulatie bij pluimvee10,11. MI speelt een rol als voorloper door zijn onderlinge omzetting binnen cruciale biochemische processen, waaronder het glycolyse/gluconeogeneseproces, de citroenzuurcyclus en de pentosefosfaatroute. Bovendien dient het ook als een voorloper van fosfatidylinositol (PI), dat verder betrokken is bij het glycerofosfolipidenmetabolisme12. Weinig onderzoeken hebben gemeld dat de metabolisatie van MI leidt tot veranderingen in de botstabiliteit en de prestaties van dieren. Dit omvat verbeteringen in de voederconversie en de toename van het lichaamsgewicht, wat de impact ervan na absorptie en gebruik in het dier aantoont13,14. De route voor MI-metabolisatie en de impact ervan op het metabolisme van pluimvee blijft echter ongrijpbaar15. Bovendien suggereren weinig studies een mogelijke rol van bacteriën bij het gebruik van MI, met name in regio's met hoge metabolische activiteit zoals het ileum 16,17,18,19.

Inspanningen op het gebied van het kweken van bacteriën uit het maagdarmkanaal van dieren zijn gericht op het verbeteren van genomische databases en het uitbreiden van onderzoek, het verifiëren van op genoom gebaseerde hypothesen en het begrijpen van het ecologische belang van deze hulpbronnen20. Het doel van dit werk is het verbeteren van strategieën voor bacterieteelt uit het maagdarmkanaal van kip om de isolatiediversiteit en de gerichte isolatie van een ecologische belangengroep die myo-inositol assimileert en metaboliseert, te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol is verdeeld in vier delen: bemonstering, bacteriële isolatie, identificatie en conservering van de verkregen micro-organismen. Goedgekeurde toestemmingen voor het gebruik van dieren werden afgegeven door de ethische commissie van Regierungspräsidium Tübingen, Duitsland met de goedkeuringsnummers HOH50/17 TE en HOH67-21TE.

1. Het verkrijgen van monsters voor de kweek van anaërobe bacteriën

  1. Onderhoud van dieren
    1. Dieren houden op een ad libitum commercieel dieet op basis van maïs (Legehennen/ Junghennenfutter; zie Tabel met materialen) en huisvesten op het proefstation van de Universiteit van Hohenheim.
  2. Voorbereiding van de transportoplossing
    1. Bereid 1-2 dagen voor de monsterafname de transportoplossing met 1,00 g/l natriumthioglycolaat, 0,10 g/l calciumchloridedihydraat (CaCl2,2H 2O) en 0,5% cysteïne21 en 0,1% natriumresazurineoplossing.
    2. Stel de pH van het medium in op 6.0 ± 0.2 bij 25 °C en autoclaaf op 121 °C gedurende 15 minuten bij een druk van 15 psi.
    3. Nadat het medium is afgekoeld tot ongeveer 50 °C, plaatst u de dop van de mediumfles terug door een steriele schroefdop met een boring en een rubberen stop. Steek twee steriele spuitnaalden op verschillende posities in de rubberen stop en bevestig een hydrofoob spuitfilter (0,22 μm) op een van de naalden.
      NOTITIE: Het vervangen van doppen en het inbrengen van naalden en filter moet worden uitgevoerd in een laminaire luchtstroom (LAF).
    4. Sluit de slang met 100% stikstof (N2) aan op het spuitfilter en spuit N2-gas gedurende 10 minuten in de fles bij 1 psi.
    5. Breng vervolgens de mediumfles en de steriele Hungate-buizen over in het anaërobe station en breng het transportmedium aseptisch over in de Hungate-buizen. Vul de Hungate-buizen volledig tot aan de bovenkant en zorg ervoor dat er geen lucht in zit.
  3. Slachten en monsterneming
    1. Handhaaf tijdens het slachtproces axenische omstandigheden om besmetting te voorkomen door tijdens de hele procedure handschoenen, maskers, plastic laboratoriumschort en steriele chirurgische instrumenten te gebruiken. Ontsmet de werkbank bovendien op de juiste manier met ethanol en tissues om een steriele omgeving te behouden.
    2. Verdoof in het proefstation 10, 50 weken oude Lohmann-legkippen met een gebotteld gasmengsel bestaande uit 35% N2, 35% CO2 en 30% O2 en onthoofd ze onmiddellijk.
      OPMERKING: De verdoving en het offeren moet worden uitgevoerd door een proefdiertechnicus die goed thuis is in dierenwelzijn en wetenschappelijke procedures. Dit zorgt ervoor dat de opofferingsprocedure voldoet aan de ethische normen, wettelijke voorschriften en veiligheidsrichtlijnen.
    3. Voordat u doorgaat met de dissectie van het maagdarmkanaal, moet u het vereiste darmsegment, namelijk de krop, het ileum en het jejunum, vastzetten met behulp van een steriele Kelly-hemostaat (ook bekend als een Kelly-klem; Figuur 1).
      OPMERKING: De dissectie van het dier moet worden uitgevoerd door een dierenarts of een goed opgeleid persoon die bekend is met de anatomie van kippen.
    4. Doe elk afzonderlijk deel in een aparte Hungate-buis gevuld met transportmedium en sluit het deksel goed. Voeg indien nodig extra transportmedium toe aan de buis om eventuele resterende lucht te verplaatsen.
      NOTITIE: De overdracht van de sectie is een cruciale stap en het is essentieel om eventuele vertraging of opening van de sectie tot een minimum te beperken om langdurige blootstelling aan zuurstof te voorkomen
  4. Vervoer van het monster
    1. Ga voorzichtig om met het transport van de Hungate-buizen en plaats ze in een piepschuimdoos om elk risico op breuk te voorkomen. Als de buitentemperatuur lager is dan 15 °C, houd dan de temperatuur van het monster op peil met behulp van warme pakken. Zorg ervoor dat de transporttijd niet langer is dan 4 uur.
    2. Breng de buizen voorzichtig over in het anaërobe station voor verder proces.

2. Isolatie van anaërobe bacteriën

  1. Voorbereiding van de cultuurmedia
    OPMERKING: De geschetste methode presenteert verschillende overwegingen voor de voorbereiding van cultuurmedia. Tabel 1 illustreert een voorbeeld van hoe oplossingen worden verdeeld voor de diverse isolatie van micro-organismen.
    1. Verdeel de ingrediënten van de te gebruiken mediaformulering in vier oplossingsgroepen: koolstofbron, stikstofbron, agar en minerale bron. Voor rich media zoals Brain-Heart infusion (BHI) is scheiding niet altijd mogelijk (zie voorbeeld van medium 2 in Tabel 1). Zorg in dergelijke gevallen voor een gescheiden bereiding en autoclaveren van agar of aanvullende oplossingen.
    2. Bereid de koolhydraatoplossing in 1/4e van het uiteindelijke volume van het benodigde medium, bijv. in 250 ml voor een totaal volume van 1 L media. Los volgens het voorbeeld van medium 1 in tabel 1 2 g dextrose en 0,5 g zetmeel op in 250 ml gedestilleerd water.
    3. Bereid de eiwitoplossing in 1/4e van het uiteindelijke benodigde volume media, bijv. in 250 ml voor een totaal volume van 1 L media. Los volgens het voorbeeld van medium 1 in tabel 1 10 g pepton op in 250 ml gedestilleerd water.
    4. Bereid agar-oplossing in 45% tot 48% van het uiteindelijke volume media, bijv. in 450 tot 480 ml voor een totaal volume van 1 L media. Los volgens het voorbeeld van mediu 1 in tabel 1 15 g agar op in 450 tot 480 ml gedestilleerd water.
    5. Bereid de minerale oplossing voor in het resterende volume van 20 tot 50 ml media wanneer het uiteindelijke volume media 1 l is. Los volgens het voorbeeld van medium 1 in tabel 1 0,5 g K2HPO4 op in 20 tot 50 ml gedestilleerd water.
    6. Autoclaaf de eiwitoplossing, agaroplossing en minerale oplossingen bij 121 °C gedurende 15 minuten bij een druk van 21 psi. Autoclaaf de koolhydraatoplossing bij 110 °C gedurende 30 minuten bij 5 psi.
    7. Zodra alle oplossingen steriel zijn, koelt u ze af tot 50 °C en mengt u ze onder steriele omstandigheden in een geschikte geautoclaveerde glazen fles met een dop met een boring en een rubberen stop. Volg hierna de stappen 1.2.3 en 1.2.4.
      OPMERKING: Het mengen van oplossingen moet in een LAF worden gedaan.
    8. Zodra de media zijn gemengd en ontgast, giet u het in steriele petrischalen of -buizen in het anaërobe station.
  2. Isolatie van anaërobe bacteriën
    OPMERKING: De volgende methodologie legt een isolatiestrategie uit voor het kweken van een breed scala aan anaërobe bacteriën die in het spijsverteringskanaal van kippen leven.
    1. Breng de monsters over naar een anaëroob station met een flessengasmengsel dat bestaat uit 80% N2 (kwaliteitsniveau 5.0), 15% CO2 (kwaliteitsniveau 3.0) en 5% H2 (kwaliteitsniveau 5.0) dat wordt geleverd door een commerciële leverancier (zie Materiaaltabel).
    2. Breng in het anaërobe station het gedeelte van de hungate-buis naar de steriele petrischaal over met behulp van een autoclaveertang.
    3. Knip het gedeelte voorzichtig open met een steriele schaar en verwijder met een steriele spatel ongeveer 1 g digesta-inhoud uit het darmsegment.
      OPMERKING: Nadat u 1 g digesta-inhoud hebt ingenomen, schrobt u de resterende digesta weg en brengt u deze over naar de respectievelijke transportmediumbuis voor de gerichte isolatie.
    4. Voer een 10-voudige seriële verdunning uit met behulp van een steriele fysiologische oplossing (0,85% NaCl).
    5. Doseer 0,1 ml van het monster uit verdunningen 10−4 tot 10−7 in steriele en correct geëtiketteerde petrischaaltjes, mediaplaten en verdeel met een steriele Drigalski-spatel.
    6. Incubeer de platen in het anaërobe station gedurende 24-48 uur bij 39 °C.
      OPMERKING: Wanneer u in een couveuse incubeert, plaatst u de petrischaaltjes in een luchtdichte doos voordat u de petrischaaltjes uit het anaërobe station haalt.
  3. Gerichte isolatie van een specifieke bacteriegroep.
    OPMERKING: De volgende methodologie legt een isolatiestrategie uit voor anaërobe bacteriën die MI mogelijk kunnen assimileren.
    1. Voor de bereiding van verrijkingsmedium, minimaal agarmedium en minimaal bouillonmedium, volgt u de samenstelling gespecificeerd in tabel 2 en tabel 3, waarbij u zich houdt aan de richtlijnen die worden beschreven in stap 2.1. Voeg na het autoclaafproces 0,2 ml/l filter-steriel vitaminemengsel (zoals beschreven in de samenstelling) toe aan minimale agarmedia en minimale bouillonmedia.
    2. Homogeniseer het eerste monster met behulp van een vortexmixer gedurende 10-15 s. Breng het gehomogeniseerde monster vervolgens over in de buis met verrijkingsmedium met een snelheid van 5% (bijv. als het volume van het verrijkingsmedium 10 ml is, inoculeer dan 0,5 ml gehomogeniseerd monster) met behulp van een pipet. Incubeer het vers geënte monster gedurende 24 uur bij 39 °C in het anaërobe station.
    3. Meng de verrijkte buis na incubatie grondig met behulp van een vortexmixer gedurende 10-15 s of door te pipetteren. Breng het gemengde monster vervolgens over in een steriel minimaal bouillonmedium met een snelheid van 5% en incubeer vervolgens gedurende 24 uur bij 39 °C.
    4. Verdun de monsters serieel in een steriele zoutoplossing (d.w.z. 0,85% NaCl), beginnend met een verdunning van 1:10 en doorgaand tot een verdunning van 1:1000. Homogeniseer het monster na elke verdunning grondig bij kamertemperatuur met behulp van een vortexmixer gedurende 10-15 s of door te pipetteren.
    5. Breng onder steriele en anaërobe omstandigheden 1 ml verdund monster over in een petrischaaltje. Giet ongeveer 15-20 ml gesmolten minimaal agar-medium in de petrischaal en draai voorzichtig horizontaal voor een gelijkmatige menging.
      OPMERKING: De temperatuur van agar moet rond de 45 °C liggen, zodat er geen klontjes aanwezig zijn en om te voorkomen dat het monster door hitte wordt gedood. Medium gieten moet worden gedaan onder anaërobe omstandigheden.
    6. Na het stollen van de agar de petrischaaltjes gedurende 24 uur bij 39 °C in omgekeerde positie in een anaëroob station of in een incubator uitbroeden. Na 24 uur incubatie verschijnen bacteriekolonies als duidelijke, kleine stippen ingebed in de media.
      NOTITIE: Wanneer u de petrischaal in een broedmachine uitbroedt, plaatst u de platen in een luchtdichte doos voordat u ze uit het anaërobe station haalt.
    7. Gebruik een steriele inoculatielus om de individuele bacteriekolonie voorzichtig te kiezen en over te brengen in aparte buisjes met minimaal bouillonmedium.
    8. Nadat de kolonies in afzonderlijke buisjes zijn overgebracht, worden de geënte buisjes anaeroob geïncubeerd bij 39 °C gedurende 24 uur. Na incubatie zal verhoogde troebelheid in de media duiden op bacteriegroei.
      OPMERKING: Elke keer voordat de mediaflessen in het anaërobe station worden geplaatst, moeten ze worden ontgast zoals eerder vermeld in stap 2.1.7. Stappen 2-8 moeten worden uitgevoerd in het anaërobe station.

3. Identificatie van anaërobe bacteriën

  1. DNA extraheren uit culturen met een incubatietijd van 24 uur tot 48 uur, volgens een enzymatisch lyseprotocol22.
  2. Centrifugeer de cultuur bij 3000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans weg met een pipet.
  3. Was de korrel 2x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door te suspenderen in 2 ml PBS. Homogeniseer het monster met behulp van een vortexmixer gedurende 10-15 s. Herhaal de centrifugeerstap bij 3000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans voorzichtig weg.
  4. Suspendeer de celpellet in 0,2 ml PBS pH 7,4 en incubeer bij 50 °C met 1 U lysozym en 1 U recombinant mutanolysine gedurende 30 min, gevolgd door een incubatie van 30 min bij 56 °C met 5 μL proteïnase K.
  5. Voeg een eenheid RNAseA van 4 μl toe aan elke buis en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugebuisjes op 21168 x g gedurende 1 min. Recupereer het supernatans en zuiver met behulp van magnetische kralen.
  6. Voer kwantificering van DNA uit met een fluorometrische methode volgens de instructies van de fabrikant voor de dsDNA-kwantificeringskit (vermeld in de materiaaltabel).
    OPMERKING: Geëxtraheerd DNA kan worden bewaard bij -20 °C.
  7. Gebruik DNA-monsters als sjablonen voor PCR-amplificatie met behulp van de primers 27f en 1492r23 volgens de voorwaarden weergegeven in tabel 4. Om er zeker van te zijn dat de PCR-reactie succesvol was, voert u agarosegelelektroforese uit volgens de standaard agarosegelelektroforesemethode met behulp van 1X TAE-buffer en 1% agarose.
  8. Zuiver het PCR-product met behulp van een in de handel verkrijgbare PCR-zuiveringskit om primers, nucleotiden en andere verontreinigingen te verwijderen.
  9. Stuur het PCR-product voor Sanger-sequencing naar de geschikte sequencing-serviceprovider.
    OPMERKING: Naast sequencing kunnen serviceproviders ook diensten leveren, waaronder zuivering van het PCR-product tegen extra kosten. PCR-producten kunnen worden bewaard bij 4 °C of bij -20 °C.
  10. Nadat u de sequentieresultaten in FASTA-formaat hebt verkregen, samen met een chromatogrambestand (meestal in ABI- of SCF-formaat), analyseert u de sequenties met behulp van bio-informaticatools. Gebruik sequentieanalysesoftware om het chromatogrambestand te openen en te visualiseren.
    OPMERKING: De algehele kwaliteit van het chromatogram werd gecontroleerd op basis van duidelijke en duidelijke pieken zonder overmatige ruis
  11. Vergelijk amplicons en stem af op de nauw verwante soorten in de niet-redundante GenBank 16S ribosomale RNA-database van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) met behulp van Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) tool24 en de Refseq-genoomdatabase.
    OPMERKING: Als u NCBI BLAST gebruikt, kopieert u de hele FASTA-reeks in de zoekbalk.

4. Behoud van zuivere bacterieculturen

  1. Oogst bacteriële cellen uit een goed gegroeide cultuur van 24 uur tot 48 uur door centrifugatie (3000 x g gedurende 10 minuten) of door biomassaverzameling van een axenische cultuur op een bord.
  2. Suspendeer de bacteriecultuur in een geschikte isotone steriele oplossing (NaCl 0,85%) en was door de bacterieoplossing gedurende 10 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 3000 x g .
  3. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de bacteriekorrel in een kleine hoeveelheid steriele isotone oplossing (0,5 ml). Om ervoor te zorgen dat eventuele resten van het groeimedium worden verwijderd, herhaalt u dit 1x.
  4. Resuspendeer de pellet in 0,8 ml tot 1 ml steriel kweekmediumconcentraat en homogeniseer met een vortexmixer gedurende 5-10 s of door voorzichtig te pipetteren.
  5. Breng 0,5 ml celsuspensie over naar een steriel en correct geëtiketteerd cryovial van 1 ml en voeg 0,5 ml geautoclaveerde 50% glyceroloplossing toe. Homogeniseer de cryovial met behulp van een vortexmixer en bewaar in een vriesrek bij -80 °C (Figuur 3).
    OPMERKING: Alle stappen voordat de cryovials naar -80 °C worden overgebracht, moeten in het anaërobe station worden uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Monitoring van anaërobe omstandigheden tijdens transport
Door toevoeging van natriumresazurine duidt de kleurverandering van de transportoplossing naar roze vóór de overdracht van het monster in de buis op een verstoring of falen in het onderhoud van anaërobe omstandigheden. Daarom werd afgezien van het gebruik van de buizen die kleurverandering vertoonden tijdens het transport en werden alleen de buizen gebruikt die geen kleurverandering vertoonden, zoals te zien is ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het doel van deze methodologie is om de kweek van anaërobe darmbacteriën te verbeteren door de kwaliteit van de bemonsteringsomstandigheden, de monsterverwerking en de formulering en voorbereiding van media te verbeteren. Bij het formuleren van de kweekmedia moet rekening worden gehouden met de fysisch-chemische omstandigheden van monsters (pH, de beschikbaarheid van koolstof, stikstof en cofactoren). Vergeleken met bacteriecultuurcollecties verkregen van varkens, mensen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële of persoonlijke belangen hebben die verband houden met het werk dat in dit script wordt gerapporteerd.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen het partnerschapsprogramma Rehovot-Hohenheim en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. Dit project werd ontwikkeld in het kader van de onderzoekseenheid P-FOWL (VOOR 2601).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurVWR20104.334
AgarVWR97064-332
AmmoniumchlorideCarl RothP726.1
Anaërobe stationDon Whitley ScientificA35 HEPA
BoterzuurMerck8.0045.1000
Calciumchloride dihydraat VWR97061-904
CentrifugeEppendorf5424R
Kip-lysozym (Muramidase)VWR1.05281.0010
CysteïneVWR97061-204
DextroseVWR90000-908
Di-kaliumwaterstoffosfaatCarl RothP749.1
EDTACarl Roth8043.2
Legkippen/jonge kippenvoerDeutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Duitsland-
MagAttract HMW DNA KitQiagen67563
MagnesiumchlorideCarl Roth2189.1
Gemengd gas (80% N2 (kwaliteitsniveau 5.0), 15% CO2 (kwaliteitsniveau 3.0) en 5% H2 (kwaliteitsniveau 5.0))Westfalen Gase GmbH, Duitsland-
Mutanolysine, recombinant (lyofilisaat)A&A Biotechnology1017-10L
Myo-inositolCarl Roth4191.2
PBS 1XChemSolute8418.01
KaliumdiwaterstoffosfaatCarl Roth3904.2
PropionzuurCarl Roth6026.1
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2671
RNAse A QIAGEN Ribonuclease A (RNase A) 19101
NatriumchlorideVWR27800.291
NatriumresazurinVWR85019-296
NatriumthioglycolaatSigma-Aldrich102933
Sojapepton, GMO-vrij, dierproefvrijVWR97064-186
ThermocyclerBio-RadT100
TryptonCarl Roth8952.1
Tween80Carl Roth9139.2
Vitaminenmix (supplement)VWR968290NL
VortexStar Lab07127/92930
GistextractCarl Roth9257.05
β-D-FructoseVWR53188-23-1

Referenties

  1. Wylensek, D., et al. A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity. Nat Comm. 11 (1), 6389(2020).
  2. Medvecky, M., et al. Whole genome sequencing and function prediction of 133 gut anaerobes isolated from chicken caecum in pure cultures. BMC Geno. 19 (1), 561(2018).
  3. Zenner, C., et al. Early-life immune system maturation in chickens using a synthetic community of cultured gut bacteria. mSystems. 6 (3), 1110-1128 (2021).
  4. Borda-Molina, D., et al. Effects on the ileal microbiota of phosphorus and calcium utilization, bird performance, and gender in japanese quail. Animals. 10 (5), 885(2020).
  5. Bonnet, M., Lagier, J. C., Raoult, D., Khelaifia, S. Bacterial culture through selective and non-selective conditions: The evolution of culture media in clinical microbiology. New Micro New Infect. 34, 100622(2020).
  6. Tanaka, T., et al. A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability. Appl Environ Microbiol. 80 (24), 7659-7666 (2014).
  7. Kawasaki, K., Kamagata, Y. Phosphate-catalyzed hydrogen peroxide formation from agar, gellan, and κ-carrageenan and recovery of microbial cultivability via catalase and pyruvate. Appl Environ Microbiol. 83 (21), e01366-e01417 (2017).
  8. Kato, S., et al. Isolation of previously uncultured slow-growing bacteria by using a simple modification in the preparation of agar media. Appl Environ Microbiol. 84 (19), e00807-e00818 (2018).
  9. Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nat Rev Microbiol. 19 (4), 225-240 (2021).
  10. Su, X. B., Ko, A. L. A., Saiardi, A. Regulations of myo-inositol homeostasis: Mechanisms, implications, and perspectives. Adv Biol Regul. 87, 2212-4926 (2023).
  11. Monastra, G., Dinicola, S., Unfer, V. Physiological and pathophysiological roles of inositols in A clinical guide to inositols. , Elsevier. (2023).
  12. Kanehisa, M. Toward understanding the origin and evolution of cellular organisms. Prot Sci. 28 (11), 1947-1951 (2019).
  13. Lee, S. A., Nagalakshmi, D., Raju, M. V., Rao, S. V. R., Bedford, M. R. Effect of phytase superdosing, myo-inositol and available phosphorus concentrations on performance and bone mineralisation in broilers. Animal Nutri. 3 (3), 247-251 (2017).
  14. Farhadi, D., Karimi, A., Sadeghi, G., Rostamzadeh, J., Bedford, M. Effects of a high dose of microbial phytase and myo-inositol supplementation on growth performance, tibia mineralization, nutrient digestibility, litter moisture content, and foot problems in broiler chickens fed phosphorus-deficient diets. Poultry Sci. 96 (10), 3664-3675 (2017).
  15. Weber, M., Fuchs, T. M. Metabolism in the niche: A large-scale genome-based survey reveals inositol utilization to be widespread among soil, commensal, and pathogenic bacteria. Microbio Spect. 10 (4), e02013-e02022 (2022).
  16. Kawsar, H. I., Ohtani, K., Okumura, K., Hayashi, H., Shimizu, T. Organization and transcriptional regulation of myo-inositol operon in Clostridium perfringens. FEMS Microbiol Lett. 235 (2), 289-295 (2004).
  17. Hellinckx, J., Heermann, R., Felsl, A., Fuchs, T. M. High binding affinity of repressor IolR avoids costs of untimely induction of myo-inositol utilization by Salmonella Typhimurium. Sci Rep. 7 (1), 44362(2017).
  18. Yebra, M. J., et al. Identification of a gene cluster enabling Lactobacillus casei BL23 to utilize myo-inositol. Appl Environ Microbiol. 73 (12), 3850-3858 (2007).
  19. Zhang, W. Y., et al. Comparative analysis of iol clusters in Lactobacillus casei strains. World J Microbiol Biotechnol. 26, 1949-1955 (2010).
  20. Labeda, D. P. Bergey's manual of systematic bacteriology. , Springer. (2001).
  21. Peterson, L. R. Effect of media on transport and recovery of anaerobic bacteria. Clin Infect Dis. 25, 134-136 (1997).
  22. Ulrich, R. L., Hughes, T. A. A rapid procedure for isolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and other Gram-positive bacteria. Lett Appl Microbiol. 32 (1), 52-56 (2008).
  23. Relman, D. Universal bacterial 16s rRNA amplification and sequencing. Diag Mol Microbiol. , 489-495 (1993).
  24. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs. Nuc Acid Res. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  25. Rios-Galicia, B., et al. Novel taxonomic and functional diversity of eight bacteria from the upper digestive tract of chicken. Int J Syst Evol Microbiol. 74 (1), 006210(2024).
  26. Lagier, J. C., et al. Microbial culturomics: Paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin Microbiol Infect. 18 (12), 1185-1193 (2012).
  27. Lagkouvardos, I., et al. The mouse intestinal bacterial collection (mibc) provides host-specific insight into cultured diversity and functional potential of the gut microbiota. Nat Microbiol. 1 (10), 1-15 (2016).
  28. Gilroy, R., et al. Extensive microbial diversity within the chicken gut microbiome revealed by metagenomics and culture. PeerJ. 9, e10941(2021).
  29. Huang, P., et al. The chicken gut metagenome and the modulatory effects of plant-derived benzylisoquinoline alkaloids. Microbiome. 6 (1), 1-17 (2018).
  30. Zhang, Y., et al. Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads. GigaScience. 11, 116(2022).
  31. Segura-Wang, M., Grabner, N., Koestelbauer, A., Klose, V., Ghanbari, M. Genome-resolved metagenomics of the chicken gut microbiome. Front Microbiol. 12, 726923(2021).
  32. Borrelli, R. C., Fogliano, V., Monti, S. M., Ames, J. M. Characterization of melanoidins from a glucose-glycine model system. Euro Food Res Technol. 215, 210-215 (2002).
  33. Ferrario, C., et al. Untangling the cecal microbiota of feral chickens by culturomic and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 19 (11), 4771-4783 (2017).
  34. Crhanova, M., et al. Systematic culturomics shows that half of chicken caecal microbiota members can be grown in vitro except for two lineages of clostridiales and a single lineage of bacteroidetes. Microorganisms. 7 (11), 496(2019).
  35. Rubio, L., et al. Lactobacilli counts in crop, ileum and caecum of growing broiler chickens fed on practical diets containing whole or dehulled sweet lupin (lupinus angustifolius) seed meal. British Poult Sci. 39 (3), 354-359 (1998).
  36. Bjerrum, L., et al. Microbial community composition of the ileum and cecum of broiler chickens as revealed by molecular and culture-based techniques. Poult Sci. 85 (7), 1151-1164 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Microbiota van de kipdarmbacteriële cultivatiemicrobiële isolatieseriële verdunninganaerobe werkstationmyo-inositolmetabolismeminimaal agarmediumisolatie van bacteriële kolonies
Strategieën om de teelt van anaërobe bacteriën uit het maagdarmkanaal van kip te verbeteren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.