Het protocol presenteert twee methodologieën om de isolatie van anaërobe darmbacteriën te verbeteren. De eerste richt zich op de isolatie van een breed scala aan bacteriën met behulp van verschillende kweekmedia. De tweede richt zich op de kweekstappen van een specifieke microbiële groep, die mogelijk myo-inositol assimileert, om de ecologische betekenis ervan volledig te begrijpen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Strategieën om de teelt van anaërobe bacteriën uit het maagdarmkanaal van kip te verbeteren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het maagdarmkanaal (GIT) van kip is een complex ecosysteem met biljoenen microben die een cruciale rol spelen in de fysiologie van de gastheer, de spijsvertering, de opname van voedingsstoffen, de rijping van het immuunsysteem en het voorkomen van het binnendringen van ziekteverwekkers. Voor een optimale gezondheid en productiviteit van dieren is het noodzakelijk om deze micro-organismen te karakteriseren en hun rol te begrijpen. Hoewel het maagdarmkanaal van pluimvee een reservoir van micro-organismen bevat met potentiële probiotische toepassingen, blijft het grootste deel van de diversiteit onontgonnen. Om ons begrip van niet-gekweekte microbiële diversiteit te vergroten, zijn gezamenlijke inspanningen nodig om deze micro-organismen in cultuur te brengen. Isolatie en kweek van GIT-koloniserende micro-organismen leveren reproduceerbaar materiaal op, waaronder cellen, DNA en metabolieten, en biedt nieuwe inzichten in metabolische processen in de omgeving. Zonder teelt blijft de rol van deze organismen in hun natuurlijke omgeving onduidelijk en beperkt tot een beschrijvend niveau. Ons doel is om teeltstrategieën te implementeren die gericht zijn op het verbeteren van de isolatie van een breed scala aan anaërobe microben uit het maagdarmkanaal van de kip, waarbij gebruik wordt gemaakt van multidisciplinaire kennis uit de dierfysiologie, diervoeding, metagenomica, voederbiochemie en moderne teeltstrategieën. Daarnaast streven we ernaar om het gebruik van de juiste praktijken voor bemonstering, transport en mediavoorbereiding te implementeren, waarvan bekend is dat ze van invloed zijn op het succes van isolatie. Passende methoden moeten zorgen voor een consistente zuurstofvrije omgeving, optimale atmosferische omstandigheden, de juiste incubatietemperatuur van de gastheer en voorzieningen voor specifieke voedingsbehoeften die zijn afgestemd op hun specifieke behoeften. Door deze methodologieën te volgen, zal de teelt niet alleen reproduceerbare resultaten voor isolatie opleveren, maar ook de isolatieprocedures vergemakkelijken, waardoor een uitgebreid begrip van het ingewikkelde microbiële ecosysteem in het maagdarmkanaal van de kip wordt bevorderd.
Inleiding
De heropleving van de teelt bij het bestuderen van micro-organismen heeft de inzichten uit metagenomische studies aangevuld door materiaal te leveren om metabole hypothesen te testen die voorheen slechts gedeeltelijk werden beschreven en gekwantificeerd. Het kweken van darmbacteriën levert materiaal om toekomstig onderzoek naar interacties tussen microben en gastheer te ondersteunen, gerichte kolonisatiestudies te vergemakkelijken en moleculaire interactiestudies te verbeteren 1,2,3. De kennis die is opgedaan over gastro-intestinale micro-org....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol is verdeeld in vier delen: bemonstering, bacteriële isolatie, identificatie en conservering van de verkregen micro-organismen. Goedgekeurde toestemmingen voor het gebruik van dieren werden afgegeven door de ethische commissie van Regierungspräsidium Tübingen, Duitsland met de goedkeuringsnummers HOH50/17 TE en HOH67-21TE.
1. Het verkrijgen van monsters voor de kweek van anaërobe bacteriën
- Onderhoud van dieren
- Dieren houden op een ad libitum commercieel dieet op basis van maïs (Legehennen/ Junghennenfutter; zie Tabel met materialen) en ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Monitoring van anaërobe omstandigheden tijdens transport
Door toevoeging van natriumresazurine duidt de kleurverandering van de transportoplossing naar roze vóór de overdracht van het monster in de buis op een verstoring of falen in het onderhoud van anaërobe omstandigheden. Daarom werd afgezien van het gebruik van de buizen die kleurverandering vertoonden tijdens het transport en werden alleen de buizen gebruikt die geen kleurverandering vertoonden, zoals te zien is .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het doel van deze methodologie is om de kweek van anaërobe darmbacteriën te verbeteren door de kwaliteit van de bemonsteringsomstandigheden, de monsterverwerking en de formulering en voorbereiding van media te verbeteren. Bij het formuleren van de kweekmedia moet rekening worden gehouden met de fysisch-chemische omstandigheden van monsters (pH, de beschikbaarheid van koolstof, stikstof en cofactoren). Vergeleken met bacteriecultuurcollecties verkregen van varkens, mensen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële of persoonlijke belangen hebben die verband houden met het werk dat in dit script wordt gerapporteerd.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen het partnerschapsprogramma Rehovot-Hohenheim en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. Dit project werd ontwikkeld in het kader van de onderzoekseenheid P-FOWL (VOOR 2601).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Azijnzuur | VWR | 20104.334 | |
| Agar | VWR | 97064-332 | |
| Ammoniumchloride | Carl Roth | P726.1 | |
| Anaërobe station | Don Whitley Scientific | A35 HEPA | |
| Boterzuur | Merck | 8.0045.1000 | |
| Calciumchloride dihydraat | VWR | 97061-904 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Kip-lysozym (Muramidase) | VWR | 1.05281.0010 | |
| Cysteïne | VWR | 97061-204 | |
| Dextrose | VWR | 90000-908 | |
| Di-kaliumwaterstoffosfaat | Carl Roth | P749.1 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| Legkippen/jonge kippenvoer | Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Duitsland | - | |
| MagAttract HMW DNA Kit | Qiagen | 67563 | |
| Magnesiumchloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Gemengd gas (80% N2 (kwaliteitsniveau 5.0), 15% CO2 (kwaliteitsniveau 3.0) en 5% H2 (kwaliteitsniveau 5.0)) | Westfalen Gase GmbH, Duitsland | - | |
| Mutanolysine, recombinant (lyofilisaat) | A&A Biotechnology | 1017-10L | |
| Myo-inositol | Carl Roth | 4191.2 | |
| PBS 1X | ChemSolute | 8418.01 | |
| Kaliumdiwaterstoffosfaat | Carl Roth | 3904.2 | |
| Propionzuur | Carl Roth | 6026.1 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2671 | |
| RNAse A | QIAGEN Ribonuclease A (RNase A) | 19101 | |
| Natriumchloride | VWR | 27800.291 | |
| Natriumresazurin | VWR | 85019-296 | |
| Natriumthioglycolaat | Sigma-Aldrich | 102933 | |
| Sojapepton, GMO-vrij, dierproefvrij | VWR | 97064-186 | |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | |
| Trypton | Carl Roth | 8952.1 | |
| Tween80 | Carl Roth | 9139.2 | |
| Vitaminenmix (supplement) | VWR | 968290NL | |
| Vortex | Star Lab | 07127/92930 | |
| Gistextract | Carl Roth | 9257.05 | |
| β-D-Fructose | VWR | 53188-23-1 |
Referenties
- Wylensek, D., et al. A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity. Nat Comm. 11 (1), 6389(2020).
- Medvecky, M., et al. Whole genome sequen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
