Methodenartikel

Snelle glyco-kwalitatieve beoordeling van recombinante eiwitten met behulp van een volledig geautomatiseerd systeem

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66571

⸱

28 juni 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular & Cellular Glycoproteomics Research Group, Cellular and Molecular Biotechnology Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2Precision System Science Co., Ltd.

In dit artikel

Samenvatting

Eerder werd al een systeem ontwikkeld voor de geautomatiseerde en snelle analyse van glycanen op eiwitten. Dit artikel presenteert het protocol voor "glyco-kwalitatieve analyse", geoptimaliseerd voor een breed spectrum van gebruikers, zoals degenen die zich bezighouden met het analyseren van glycaanstructuren in biofarmaceutica en andere glycoconjugaatmaterialen.

Samenvatting

Eiwitglycosylering, een cruciale posttranslationele modificatie, beïnvloedt de stabiliteit, werkzaamheid en immunogeniciteit van recombinante eiwitten, waaronder biofarmaceutica. Glycaanstructuren vertonen een aanzienlijke heterogeniteit, variërend met productieceltypen, kweekomstandigheden en zuiveringsmethoden. Daarom is het monitoren en evalueren van de glycaanstructuren van recombinante eiwitten van vitaal belang, vooral bij de biofarmaceutische productie. De lectine-microarray, een techniek die complementair is aan massaspectrometrie, heeft een hoge gevoeligheid en gebruiksgemak. Het duurt echter meestal meer dan een dag om resultaten op te leveren. Om het aan te passen aan niet-glycowetenschappelijk onderzoek of de ontwikkeling van processen voor geneesmiddelen, is een geautomatiseerd alternatief met hoge doorvoer nodig. Daarom werd 's werelds eerste volledig geautomatiseerde glycaanprofileringssysteem op basis van lectine ontwikkeld, waarbij gebruik wordt gemaakt van het technologieconcept "bead array in a single tip (BIST)". Dit systeem maakt de bereiding en opslag van lectine-geïmmobiliseerde kralen mogelijk in eenheden van 1.000, met aanpasbare parallelle invoegorders voor verschillende doeleinden. Dit artikel presenteert een praktisch protocol voor onderzoek met "glyco-gekwalificeerde" recombinante eiwitten. Na het testen van hun reactiviteit tegen 12 polyacrylamide-glycaanconjugaten, werden 15 lectines geselecteerd om de veelzijdigheid van het systeem te vergroten. Bovendien werd het etiketteringsproces van het monster geoptimaliseerd door over te schakelen van Cy3 naar biotine, waardoor de totale verwerkingstijd met 30 minuten werd verkort. Voor onmiddellijke gegevenskwalificatie worden lectinebindende signalen als een dotcode op de bovenste monitor weergegeven. De betrouwbaarheid van het systeem werd bevestigd door dagelijkse reproduceerbaarheidstests, herhaalbaarheidstests en tests voor langdurige opslag, met een variatiecoëfficiënt van <10%. Deze gebruiksvriendelijke en snelle glyco-analyzer heeft potentiële toepassingen in de kwaliteitsbewaking van endogene glycoproteïnen voor de evaluatie en validatie van biomarkers. Deze methode vergemakkelijkt de analyse voor degenen die nieuw zijn in de glycowetenschap, waardoor het praktische nut ervan wordt verbreed.

Inleiding

Eiwitglycosylering is een cruciale posttranslationele modificatie die moet worden beoordeeld in biofarmaceutica. De glycaanprofielen van eiwitten kunnen variëren op basis van kweekomstandigheden, zuiveringsprocessen en gastheercellen1. Er zijn eenvoudige instrumenten nodig om glycosylering binnen de bioprocespijplijn te kwalificeren. Geschat wordt dat meer dan 50% van de uitgescheiden en membraaneiwitten in vivo worden gemodificeerd met meerdere glycanen, die veranderen afhankelijk van de cellijn, het ontwikkelingsstadium en de ziektestatus, zoals het begin van maligniteit2. Het monitoren van glycaanprofielen heeft een aanzienlijk potentieel voor het identificeren van unieke diagnostische markers en medicijndoelen. Er is veel vraag naar geautomatiseerde instrumenten die in staat zijn om snel grootschalige steekproefgroottes te meten om dergelijke afwijkende glycosylering van honderden patiëntmonsters in de ontdekkingspijplijn te verifiëren en te valideren.

Microarray-technologie is opgenomen in glycomics voor het evalueren van de glycaanprofilering van glycoproteïnen3. Bij deze methode worden verschillende lectines, dit zijn glycaanbindende eiwitten, geïmmobiliseerd op een oppervlak zoals een glasplaatje. Deze op interactie gebaseerde glyco-analysetechnologie vereist niet dat glycanen vooraf uit kerneiwitten worden vrijgegeven, wat het proces vereenvoudigt voor onderzoekers die nieuw zijn in glycotechnologie. Ondanks het wijdverbreide gebruik ervan, was er voor industriële toepassingen zoals bioproductie een geautomatiseerd systeem nodig dat in staat was om snel en gemakkelijk glycanen te monitoren voor een groter aantal analysedoelen. Om dit aan te pakken, werd eerder een geautomatiseerd glycaanprofileringssysteem gerapporteerd op basis van een uniek concept genaamd "bead array in a single tip" (BIST), oorspronkelijk ontwikkeld voor genotypering. Dit systeem vereenvoudigt het proces met een high-throughput auto-instrument4 van het one-box-type. Met behulp van tips waarin verschillende lectine-gefixeerde kralen parallel zijn gerangschikt 4,5, werd een methode ontwikkeld voor het analyseren van glycaanstructuren gemodificeerd in glycoproteïnen, die de naam GlycoBIST kreeg (hierna "automatisch glycaanprofileringssysteem" genoemd) (Figuur 1A). Lectines kunnen op 1.000 kralen worden gefixeerd en gedroogd om de activiteit een jaar lang te behouden, zowel voor als na het verpakken in een tip. Zodra tips en cartridges met reagentia zoals HRP-gelabeld anti-streptavidine-antilichaam (SA-HRP) zijn geplaatst in het meetprototype-instrument (een geautomatiseerd reactiemeetapparaat, zie Materiaaltabel), functioneert de tip als een autopipet. Een chemiluminescentiedetectiescanner aan de binnenkant van de achterkant van het instrument kwantificeert de signalen van acht tips tegelijkertijd. De kwantitatieve gegevens van deze acht tips worden compact en gelijktijdig weergegeven als puntcodes op het touchscreen van het instrument voor snelle bevestiging van de meetresultaten. Bovendien wordt de waarde die wordt weergegeven als het maximum van de gemeten piek als ruwe gegevens van het instrument getransporteerd en kunnen individuele onderzoekers grafieken maken (Figuur 1A, onderste paneel).

In dit artikel beschrijven de auteurs een verbeterde methode voor het labelen van eiwitten met biotine, waardoor de verwerkingstijd wordt teruggebracht tot 30 minuten. Doeleiwitten worden vooraf gebiotinyleerd en gedetecteerd door SA-HRP (Figuur 1B). Een standaard GlycoBIST-tip (gespecialiseerde tip voor automatische glycaanprofilering) met 15 geselecteerde lectines werd geconstrueerd om de veelzijdige glycoproteïne-glycaanprofilering te bereiken voor analytische volledigheid.

Protocol

De bijzonderheden van de reagentia en de apparatuur die voor dit onderzoek zijn gebruikt, zijn vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de gespecialiseerde tip voor automatische glycaanprofilering

  1. Breng de gedroogde lectine-gefixeerde kralen, bewaard bij 4 °C in een afgesloten zak, naar de bank en laat ze terugkeren naar kamertemperatuur (~23 °C).
    OPMERKING: Dit voorkomt condensatie op de kralen, wat de kwaliteit ervan kan verminderen. Deze methode voor het bereiden van lectine-fixerende kralen is eerder gerapporteerd5.
  2. Leg een antistatische doek op het bureau en plaats de draagbare statische eliminator met het gezicht naar de werkruimte. Hierdoor kunnen latere werkzaamheden op de werkbank met antistatische bescherming worden uitgevoerd (Figuur 2A).
  3. Steek de kralen met een antistatisch pincet in de lege punt, zodat er twee afstandskralen tussen de lectinefixerende kralen worden geplaatst (Figuur 1A).
  4. Knijp voorzichtig met een tang in de bovenkant van de punt om de opening te sluiten en zorg ervoor dat u de punt niet afsnijdt nadat alle kralen zijn gevuld (Figuur 2B).
    OPMERKING: Dit is om de kralen in de punt vast te zetten. Het wordt aanbevolen om de tang zo te maken dat de punt niet wordt afgesneden (Figuur 2C).
  5. Strek de punt met de hand als deze gebogen is.
  6. Bewaar de voorbereide punt bij 4 °C in een afgesloten zak met een droogmiddel tot gebruik.
    NOTITIE: Voordat u de punt gebruikt, moet deze op kamertemperatuur worden gebracht voordat u de verzegelde zak opent en eruit haalt. Het vocht vermindert de reactiviteit van lectines drastisch.

2. Bereiding van de analyten

  1. Verpak het biotinyleringsreagens voor routineanalyse.
    OPMERKING: Voor routinematige analyse is het nuttig om het biotinyleringsreagens (Biotine-(AC5)2 Sulfo-Osu, zie Materiaaltabel) als volgt in kleine porties voor te pakken voor een snelle analyse. Het wordt aanbevolen om het biotinyleringsreagens te drogen en op te slaan, omdat de succinimidylester over het algemeen gevoelig is voor hydrolyse.
    1. Los het biotinyleringsreagens op in gedeïoniseerd water.
    2. Doseer 10 μg van het reagens in buisjes met behulp van een pipet.
    3. Droog de buisjes met biotinyleringsreagens in een gekoelde vacuümconcentrator en bewaar ze met een droogmiddel bij 4 °C in een lichtdichte zak tot gebruik.
  2. Voeg de analytoplossing (200 ng eq. eiwit) toe aan het buisje met het in stap 2.1 bereide gedroogde biotinyleringsreagens.
    OPMERKING: Houd rekening met de buffersamenstelling die wordt gebruikt om de analyten op te lossen en te verdunnen, afhankelijk van de eigenschappen van het gebruikte biotinyleringsreagens. Vermijd bijvoorbeeld het gebruik van primaire aminereagentia als buffers voor aminekoppeling. Dit voorkomt een vermindering van de biotinyleringsefficiëntie van de analyten.
  3. Meng goed door te vortexen en draai vervolgens naar beneden (1000 x g gedurende 5 s bij kamertemperatuur) in een tafelcentrifuge om de vloeistof op het deksel naar de bodem van de buis te laten vallen.
  4. Incubeer de buizen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, afgeschermd van licht.
  5. Verdun de gebiotinyleerde monsters 10-voudig in de sonderingsbuffer (1% Triton X-100, 0,5 M Glycine, 1 mM CaCl2 en 1 mM MnCl2 in TBS) om niet-gereageerde biotinyleringsreagentia te inactiveren.
    OPMERKING: In het geval van reacties door aminekoppeling wordt het niet-gereageerde biotinyleringsreagens verbruikt door de reactie met een buffer die een primair aminereagens bevat, zoals Tris in TBS, dat de biotinylering van lectines en andere stoffen die op de korrels zijn geïmmobiliseerd, bij de daaropvolgende meting voorkomt.
  6. Incubeer bij kamertemperatuur, afgeschermd van licht, gedurende 2 uur.
  7. Beoordeel de biotinyleringsefficiëntie van de analyten door middel van Western blotting, indien nodig met behulp van HRP-gelabeld streptavidine als detectiesonde. Raadpleeg de literatuur voor Western blotting-methoden6.

3. Bereiding van reagentia voor glycaanprofilering met het geautomatiseerde reactiemeetapparaat

  1. Verdun het HRP-geconjugeerde streptavidine met de blokkerende oplossing in een verhouding van 1:3000.
  2. Meng met gelijke volumes substraat A en substraat B (zie materiaaltabel). Gebruik 160 μL gemengd substraat per monster.
  3. Doseer de blokkeeroplossing, wasbuffer (0,1% Triton X-100/TBS), TBS, HRP-geconjugeerde streptavicine-oplossing en elk substraat in de daarvoor bestemde putjes van een patroon met 10 vloeistofreservoirs.
    OPMERKING: Het aanbevolen volume en de plaatsing van oplossingen om elk putje van de reactiepatroon te vullen, worden hieronder beschreven. De oplossingen en de opstelling van de put kunnen echter van tevoren in het geautomatiseerde reactiemeetapparaat naar behoefte worden gewijzigd.
    1. Voeg 0,2 ml HRP-gelabelde streptavidine toe, bereid in stap 3.1. naar put #2 met behulp van een pipet. De put wordt #1 genoemd naar de voorkant van de cartridge.
    2. Voeg 0,2 ml blokkeringsoplossing toe aan putje #3 met behulp van een pipet.
    3. Voeg 1 ml TBS toe aan putjes #4 en #6 met behulp van een pipet.
    4. Voeg 1 ml wasbuffer toe aan de putjes #7 en #8 met behulp van een pipet.
    5. Voeg 0,16 ml substraatmengsel toe aan put #10 met behulp van een pipet.
    6. Controleer of putten #1, #5 en #9 leeg zijn.
  4. Voeg de in stap 2 bereide analyten toe aan een microbuisje met een schroefdop van 2 ml eiwit met een laag adsorbtiemiddel.
  5. Open de voordeur van het geautomatiseerde reactiemeetapparaat.
  6. Stel de in stap 3.3 voorbereide vloeistofreservoirs, de in punt 1 voorbereide tips en de in stap 3.4 voorbereide analyten als volgt in op de daarvoor bestemde posities van het geautomatiseerde reactiemeetapparaat (figuur 2D). Elke meting wordt uitgevoerd in een enkele verticale lijnrichting.
    1. Plaats een in stap 1 voorbereide punt in elk gat op de positie "een" geel symbool in figuur 2D.
      NOTITIE: Nogmaals, indien gekoeld, breng de tips op kamertemperatuur voordat u de verzegelde zak opent. Lectines verliezen hun signaal dramatisch door vocht.
    2. Verwijder het deksel van de buis met de in stap 3.4 bereide analyt en steek deze op dezelfde manier in elk gat op positie "b".
    3. Plaats de patroon met de vloeistof die in stap 3.3 is bereid en zorg ervoor dat u deze niet morst op positie "c".
    4. Verwijder de hele "afvalbak" in Figuur 2D als deze vol is, gooi de inhoud in de prullenbak en plaats de "afvalbak" terug in zijn oorspronkelijke positie.
      OPMERKING: De gereageerde tips worden na meting automatisch opgevangen in de "afvalbak".

4. Glycaanprofilering met het geautomatiseerde reactiemeetapparaat

  1. Zet de aan/uit-schakelaar aan de zijkant van de hoofdeenheid aan.
  2. Raak de knop "Start diagnose" aan die op het scherm wordt weergegeven (Figuur 3A). Het zelfdiagnoseprogramma start automatisch. Na een tijdje is het zelfdiagnoseprogramma voltooid en verschijnt het HOME-scherm (Figuur 3B).
    OPMERKING: De volgende bewerkingen kunnen worden uitgevoerd door de respectievelijke pictogrammen aan te raken. "Assay" om de meting te starten. "Onderhoud" om een systeemfout te bevestigen. "Geschiedenis" om eerdere meetgegevens te bekijken.
  3. Tik op "Assay" weergegeven op het HOME-scherm om het protocol te selecteren (Figuur 3B).
  4. Selecteer de "BAssaySTD" van de testmethode (Figuur 3C) en druk vervolgens op "Volgende" rechtsonder.
  5. Voer indien nodig de naam van het monster (Figuur 3D) voor elk monster in en tik vervolgens op "Volgende" rechtsonder.
  6. Voer indien nodig de naam van de tip (Figuur 3E) in die voor elk monster wordt gebruikt en tik vervolgens op "Volgende" rechtsonder.
  7. Bevestig de opmerkingen aan de rechterkant (Figuur 3F) en als er geen probleem is, tikt u rechtsonder op "Start" voor de meting.
  8. Bevestig de schermschakelaar naar de bedrijfsmodus (Figuur 3G) en wacht tot de pijl "voltooien" is gemarkeerd. Raak indien nodig "Pauze" aan om de bedrijfsmodus te stoppen.
    OPMERKING: De handelingen die automatisch worden gecontroleerd door het geautomatiseerde reactiemeetapparaat zijn als volgt: (1) Auto-micropipetsproeiers in het instrument bevestigen maximaal acht tips tegelijk (zie het symbool geel "a" in afbeelding 2D); (2) Zuig/ontlaad de oplossing herhaaldelijk in de buis met de analyt gedurende 5 minuten; (3) Breng over naar de blokkerende oplossing en zuig/ontlaad gedurende 5 minuten; (4) Overbrengen naar TBS en aspireren/ontladen gedurende 2 minuten; (5) Overbrengen naar de HRP-gelabelde streptavidine-oplossing en 5 minuten opzuigen/ontladen; (6) Breng over naar de wasbuffer en zuig/ontlaad gedurende 7 minuten; (7) Overbrengen naar TBS en aspireren/ontladen gedurende 2 minuten; (8) Breng over naar het substraatmengsel en zuig onmiddellijk op; (9) Scan de chemiluminescentie van acht tips tegelijk aan de achterkant van het apparaat om piekgegevens te verkrijgen; (10) Gooi gebruikte tips in de afvalbak; (11) Het mondstuk keert terug naar de oorspronkelijke positie.
  9. Controleer of het scherm is overgeschakeld naar de resultaatmodus (Figuur 3H) wanneer de meting is voltooid. De acht puntcodes worden tegelijkertijd op het scherm weergegeven voor eenvoudige verificatie.
    NOTITIE: Tik op de "Geschiedenis" linksonder om de scangrafiek (Figuur 3I,J), staafdiagram (Figuur 3K,L), tabel (Figuur 3M) en detail (Figuur 3N) als resultaat op het scherm weer te geven. Bekijk de resultaten van andere rijstroken in de vervolgkeuzelijst "Rijstrook".
  10. Plaats een USB-geheugen in de USB-poort aan de zijkant van de hoofdeenheid en tik op "Exporteren" rechtsonder in de resultaatmodus om de gegevens van alle lanes afzonderlijk in het USB-geheugen op te slaan.
  11. Exporteer de onbewerkte gegevens (Figuur 3M) als een CSV-bestand met behulp van een USB-poort voor verdere gegevensanalyse en individuele grafieken in Excel. "Waarde" van de tabel geeft de signaalintensiteit van elk lectine aan. De waarden van de intensiteit vertegenwoordigen de maximale waarde van de piekgegevens (figuur 3I,J) in de scan van gereageerde tips.
    OPMERKING: De piekextractiedrempel kan worden ingesteld. Afhankelijk van de analyten kan het signaal in het spacer-kraalgedeelte over het algemeen hoger zijn, in welk geval de waarde in het spacer-gedeelte als achtergrond wordt afgetrokken.

Resultaten

Eerst wordt de signaalverdeling voor elke lectine weergegeven om de kenmerken van de lectineparelarray te begrijpen. Er werd een bibliotheek van lectine-gefixeerde kralen (elk 1.000 kralen) voorbereid. Vijftien kralen werden willekeurig gekozen uit de 1.000 en toegevoegd aan een enkele tip. Onderaan figuur 1A wordt een typische grafiek weergegeven, die bijna dezelfde signaalintensiteit weergeeft die wordt waargenomen bij de 15 kralen die hetzelfde lectine immobiliseren. Deze meetprocedure kan worden toegepast om de productie van handgemaakte lectineparels te kwalificeren voorafgaand aan het gebruik van glycaanprofilering. Zo worden zes tips gebruikt voor de gelijktijdige meting om de variatiecoëfficiënt (CV) te berekenen op basis van de signalen op de 90 kralen. Een typisch voorbeeld is weergegeven in tabel 1. Toen de bibliotheek met lectine-gefixeerde kralen werd uitgebreid om plaats te bieden aan 28 verschillende lectines, vertoonden 25 van de 28 lectines een hoge reproduceerbaarheid met een CV van minder dan 10%.

Vervolgens worden de gegevens voor een lectine bead array met 15 verschillende lectines getoond. De 15 lectines die in Tabel 2 worden getoond, zijn geselecteerd voor de lectineparelarray. Daarnaast werden 12 polyacrylamide (PAA) mono/di/trisacchariden vermeld in tabel 3 gemeten. Na beoordeling van de meetbetrouwbaarheid met behulp van een dotcoderingsdisplay op het scherm, werden de ruwe gegevens geëxporteerd van het geautomatiseerde reactiemeetapparaat (zie protocolstap 4.11) en werd een grafiek gemaakt in Excel met behulp van de reactiepiekwaarden bij elke sacharide (figuur 4A). Deze waarden werden vervolgens gebruikt voor de analyse van de hoofdcomponenten om de correlatie tussen de geselecteerde 15 lectines en de gereageerde sacchariden te visualiseren (Figuur 4B,C). Dit resulteerde in een duidelijk verschil in het bindingspatroon van elk lectine ten opzichte van de 12 PAA-suikers die in figuur 4A worden getoond. Hierin wordt aangetoond dat de validiteit van elk signaal verwijst naar geïntegreerde eerdere lijsten van lectine- en saccharide-specificiteiten 7,8 (zie ook deze specificiteiten in Tabel 2). Aangezien AAL bindt aan terminale α-Fuc, Sia-Lex en Lex, bevestigde automatische glycaananalyse de herkenning van AAL van fucose-bevattende moleculen (Figuur 4A). SSA en MAL (zie Tabel 2 voor de volledige namen van lectines en gegeven afkortingen) erkenden respectievelijk Siaα2-6Gal/GalNAc en Siaα2-3Gal. MAL in de bead array kan ook binden aan 3'-O-sulfo-Galβ3GalNAc en LacNAc. Dit komt overeen met eerdere resultaten die zijn geanalyseerd met behulp van machine learning7, waarbij MAL dominant de voorkeur geeft aan de 3'-O-sulfo-Gal, terwijl LacNAc niet dominant is9. RCA120, een Gal-herkennend lectine, reageerde sterk met terminaal β-Gal, waaronder Lac/LacNAc, en mocht binden aan Siaα2-6Lac, maar niet aan Siaα2-3Lac. ECA had een reactiviteit met LacNAc die veel hoger was dan Lac. WFA had een bredere specificiteit, die niet alleen α/β-GalNAc herkende, maar ook terminaal β-Gal, zoals gerapporteerd 7,10. GSL II, dat GlcNAc en een gegalactosyleerde tri/tetra-antenne N-glycanen erkent, bindt niet aan sachariden, behalve aan een enkel GlcNAc onder de bereide analyten. GRFT, dat hoge mannose-type N-glycanen herkent, reageerde met α-Man. ABA, Jacalin en MAH zijn over het algemeen gebruikt om O-glycanen te detecteren. Aangezien ABA de voorkeur geeft aan de Galβ1-3GalNAcα-Thr/Ser (T) en sialyl-T structuren, reageerde ABA in de bead array sterk met 3'-O-sulfo-Galβ1-3GalNAc en zwak gebonden aan α-GalNAc. ABA erkende ook β-GlcNAc, in overeenstemming met de eerdere rapporten over binding aan agalactosyleren N-glycanen7. Jacalin heeft een relatief bredere specificiteit en reageerde dus met α-mannose, β-GalNAc, βGal, α-GalNAc, 3'-O-sulfo-Galβ1-3GalNAc. MAH herkende specifiek 3'-O-sulfaat-Galβ1,3GalNAc zoals eerder gerapporteerd7. De resterende vier lectines, NPA, LCA, PHA-L en PHA-E, herkenden de interne structuur van N-glycaan die niet was opgenomen in de bereide PA-sacchariden en hadden dus geen affiniteit met alle analyten.

Met behulp van de verkregen gegevens kan de gelijkenis van lectines die bijdragen aan de binding aan elke sacharide worden verduidelijkt door ze uit te zetten op een grafiek voor de analyse van de belangrijkste componenten (Figuur 4B). Alle sacchariden die bijdroegen aan de variantie in Figuur 4B werden weergegeven door een eigenvector, een statistische analysemethode waarbij de bijdrageverhouding wordt weergegeven door een vector (Figuur 4C). Het is hier opmerkelijk dat de gereageerde sacchariden zonder vooringenomenheid bijdragen aan elke lectine. Lectines vertonen geen specificiteit voor slechts één type sacharide. De aanwezigheid van glycanen van het complextype wordt bijvoorbeeld bepaald door de gedeeltelijke herkenning van sommige glycanen in glycanen van het complextype bij mensen. Jacalin, dat O-glycanen herkent (zie de specifieke kenmerken in Tabel 2), kan de 3'suTF-structuur en α-GalNAc herkennen onder de sacchariden die in deze studie zijn gebruikt, en daarom werden de 3'suTF en α-GalNAc uitgezet (Figuur 4C) tegen de positierichting van Jacalin (bruine stip) uitgezet in Figuur 4B. WFA kan α/β-GalNAc herkennen onder de sacchariden die in deze studie zijn gebruikt; daarom werd α/β-GalNAc in figuur 4C in dezelfde richting uitgezet als de WFA in figuur 4B. Daarentegen wordt α-GalNAc uitgezet tussen WFA en Jacalin omdat het een saccharidestructuur is waaraan Jacalin gemakkelijk kan binden. Alle 11 sacchariden die in deze studie zijn uitgezet, komen overeen met de specificiteit (saccharidebinding) van lectinesdie eerder 7,8 zijn gerapporteerd, wat aangeeft dat de voorgestelde methode een betrouwbare meetmethode is. Bovendien zijn de eigenvectoren die overeenkomen met elke sacharide gedispergeerd, wat ondersteunt dat de 15 lectines met minimale bias werden geselecteerd om een uitgebreide dekking in de analyse te garanderen. Daarom werd de tip die met deze 15 lectines werd aangevuld gedefinieerd als de standaard GlycoBIST-tip (Tabel 2).

In het meer praktische voorbeeld werden gezuiverde eiwitproducten onderworpen aan de tipmeting (Figuur 5). Boviene thyroglobuline, die een N-glycosyleringsplaats heeft en complexe, hybride en hoge mannose-type N-glycanen 11 bevat, werd geanalyseerd. De standaardtip gaf een verhoogde reactiviteit van bepaalde lectines op de saccharidenaan 8 (zie de specifieke kenmerken in Tabel 2): PHA-E, dat het doorsnijden van GlcNAc herkent; GRFT, het herkennen van mannose-type N-glycanen; SSA, herkenning van Siaα2-6Gal/GalNAc; RCA120, herkenning van lactose en LacNAc; en AAL, het herkennen van fucose. Deze glycaanstructuren zijn aanwezig in complexe, hybride en hoge mannose-type N-glycanen, wat suggereert dat de N-glycaanstructuur van thyroglobuline11 effectief kan worden geëvalueerd. Bovendien vertoonde thyroglobuline behandeld met sialidase A, een enzym dat siaalzuur verteert, een verminderde reactiviteit met SSA, dat siaalzuur herkent, en verhoogde reactiviteit met RCA120, WFA en ECA, die gemakkelijker worden herkend na de verwijdering van siaalzuren. De aanwezigheid van O-glycaanstructuren in runderthyroglobuline is niet eerder gemeld. Zoals verwacht was er geen herkenning van O-glycaan in thyroglobuline met of zonder behandeling met sialidase in de automatische glycaananalyse.

Een reproduceerbaarheidstest binnen de run met behulp van de 15 geselecteerde lectines blijkt de robuustheid van de meting te begrijpen (tabel 4). Voor deze test werden zeven standaardtips voor analyten en een extra tip voor negatieve controle opgesteld, en alle acht tips werden tegelijkertijd gemeten. Deze procedure werd drie keer op één dag herhaald. "Mix Analytes", een combinatie van analyten die leidde tot het verkrijgen van significante signalen op alle lectines, werden voorbereid voor de kwaliteitscontrole van de kralenreeks. De mixanalyten werden geformuleerd door sialidase-verteerde erytropoëtine (EPO), sialidase- en galactosidase-verteerde EPO, humaan IgA, matrixmetalloproteïnase 3 (MMP3) en thyroglobuline op de juiste manier te mengen. Elk glycoproteïne (200 ng) werd gelabeld met 10 μg biotinyleringsreagens in PBS dat Triton X-100 bevatte. Indien nodig werden behandelingen met sialidase en galactosidase uitgevoerd zoals beschreven in de instructies. Na de spijsvertering werden de producten gedurende 10 minuten in een warmteblok bij 75 °C geïncubeerd om het enzym te inactiveren. De juiste hoeveelheden gebiotinyleerde glycoproteïnen (3 ng EPO, 8 ng humaan IgA, 5 ng MMP3 en 15 ng thyroglobuline) werden onmiddellijk voor de analyse gemengd. De meetresultaten gaven aan dat de maximale CV-waarde 13,5% was en dat de gemiddelde CV voor de 15 lectines 8,2% was, wat een hoge reproduceerbaarheid aantoont.

Bovendien wordt aangetoond dat een dagelijkse reproduceerbaarheidstest variaties als gevolg van de meetdatum begrijpt (tabel 5). Standaardtips en mixanalyten werden van tevoren voorbereid en metingen van zeven tips werden gedurende vijf opeenvolgende dagen dagelijks herhaald. Uit de resultaten bleek dat de meeste lectines een CV van minder dan 10% hadden. Sommige lectines, zoals LCA en ECA, vertoonden echter hogere cv's. Het gemiddelde CV van de 15 lectines per cyclus was tot 7,7% en de gemiddelde CV-waarden over 5 dagen waren minder dan 10%, wat een hoge reproduceerbaarheid betekent. Er werd opgemerkt dat Jacalin, als gevolg van de zelfvertering van MMP3 in de Mix Analyte, een lage temporele reproduceerbaarheid vertoonde. Daarom moet een geschiktere analyt worden geïdentificeerd om MMP3 te vervangen.

Om de stabiliteit van lectine-gefixeerde korrels te begrijpen, wordt een langdurige stabiliteitstest getoond met behulp van deze gedroogde lectine-gefixeerde korrels (Tabel 6). Standaardtips, analysereagentia en mixanalyten werden van tevoren voorbereid en de metingen werden uitgevoerd na 12 maanden opslag. De bovengenoemde vijf soorten gebiotinyleerde analyten werden afzonderlijk opgeslagen en voorafgaand aan de meting gemengd. De resultaten toonden aan dat het gemiddelde CV voor de 15 lectines minder dan 10% was, zelfs tot 12 maanden na droge opslag. Dit suggereert de haalbaarheid van snelle en nauwkeurige metingen door meerdere tips (tot 1.000) van dezelfde partij tegelijk op te slaan.

figure-results-1
Figuur 1: Schema's van het "bead array in a single tip" instrument en analysemethode. (A) Schema van het automatische glycaanprofileringssysteem. Lectine-gefixeerde kralen kunnen worden gedroogd en in tips worden bewaard. Wanneer tips en cartridges met reagentia zoals HRP-gelabeld anti-streptavidine-antilichaam (SA-HRP) in het meetinstrument (geautomatiseerd reactiemeetapparaat) worden geplaatst en geactiveerd, functioneert de tip als een autopipet. De chemiluminescentiedetectiescanner aan de achterkant van het instrument kwantificeert signalen van acht tips tegelijkertijd. Kwantitatieve gegevens worden weergegeven als puntcodes op het touchscreen van het instrument voor een snelle bevestiging van de meetresultaten. Het onderste gedeelte toont de resultaten van het meten van 90 kralen met dezelfde lectine. De meetresultaten worden door het instrument getransporteerd en door de individuele onderzoeker in een grafiek weergegeven. (B) Schema van de detectiemethode die in dit experiment is gebruikt. Doeleiwitten worden vooraf gebiotinyleerd en gedetecteerd met behulp van SA-HRP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Afbeeldingen van materialen en instellingen voor automatische glycaanprofilering met het geautomatiseerde reactiemeetapparaat. (A) Afbeelding van lectine-fixerende kralen die in een punt worden verpakt. De kralen oppakken met een antistatisch pincet op de antistatische mat en de punt vullen met de kralen. (B) Knijp in de punt met een tang. Een klein bovengedeelte van de bovenste kraal wordt samengeknepen. (C) Een tang voor het krimpen van de uiteinden. Het plastic (gele cirkel) wordt samengeknepen om te voorkomen dat ze volledig knippen. (D) Rangschikking van de materialen die worden gebruikt in het geautomatiseerde reactiemeetapparaat. A: TIPS, B: Tube met analyten en C: Cartridges met vloeistof moeten op hun plaats worden geplaatst. In de afvalbak worden de gereageerde tips na meting opgevangen. De doos kan worden verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Afbeelding 3: Touchscreen voor machinemanipulatie. (A) Het zelfdiagnoseprogramma start automatisch wanneer de stroom wordt ingeschakeld. (B) Het HOME-scherm geeft "Analyse", "Onderhoud" en "Geschiedenis" weer. (C-G) Werking van de "Assay"-modus. Selectie van de analysemethode (C). Meerdere protocollen kunnen vooraf worden geregistreerd. Invoer van de volgorde van het monster (analyt) (D). Het type punt selecteren (E). Bevestiging van de instellingen van de testmethode (F) en starten van de test vanaf het scherm "Start Assay" (G). (H-N) Weergave van het resultaat in 'Geschiedenis'. Lectine-puntcode (H) weergegeven na voltooiing van de test of vanuit de "Geschiedenis"-modus. Een scandiagram van 15 lectines wordt op het scherm weergegeven voor alle monsters (I) of voor elk monster (J). Het scandiagram wordt weergegeven als een staafdiagram (K). Staafdiagrammen voor andere rijstroken kunnen worden geselecteerd in de vervolgkeuzelijst "Rijstrook". Staafdiagram waarin acht banen met monsters per lectine (L) worden vergeleken. Andere lectines kunnen worden geselecteerd uit de vervolgkeuzelijst "Lectine". Tabel met kwantitatieve waarden (M). Registratie van de uitgevoerde meetmethode (N). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Evaluatie van de reactiviteit met PAA-sacchariden in het automatische glycaanprofileringssysteem. (A) Een grafiek die de reactiviteit van lectines met verschillende PAA-sacchariden weergeeft, werd gecorrigeerd voor negatieve controlewaarden. (B) Analyse van de belangrijkste componenten op basis van de gegevens onder (A). (C) Eigenvectoren uit de analyse onder (B). Voor de onderdelen (B) en (C) werd compatibele analysesoftware gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Verificatie van de GlycoBIST-reactiviteit met behulp van gezuiverd runderthyroglobuline-eiwit. De monsterbereiding zonder behandeling werd uitgevoerd onder dezelfde digestieomstandigheden als de buffer alleen, met uitzondering van de toevoeging van sialidase A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Herhaalbaarheidstest met lectine-gefixeerde parels. De herhaalbaarheid van reactiviteit voor 28 lectines werd geëvalueerd. Bij elke tip werd gereageerd met analyten. EPO: erytropoëtine, PSA: prostaatspecifiek antigeen, Tf: transferrine, M2BP: Mac-2 bindend eiwit, hIgG: humaan IgG, MMP3: matrix metalloproteïnase 3, (Sia+): sialidase A-verteerde analyten, (Sia+, Gal+): sialidase A en galactosidase-verteerde analyten, Ab: antilichaam. DSA: Datura stramoniumagglutinine , HypninA2: Hypneua japonica-agglutinine , WGA: tarwekiemagglutinine, UDA: Urtica dioica-agglutinine , BPL: Bauhinia purpurea-lectine , Orysata: Oryza sativa-lectine , LSL-N: Laetiporus sulphureus lectine N-terminaal domein, SNA: Sambucus nigra lectine, BanLec: bananenlectine, MPA: Maclura pomifera agglutinine, TxLC-I: Tulipa gesneriana agglutinine, AOL: Aspergillus oryzae lectine, ACG: Agrocybe cylindracea galectine. CV: variatiecoëfficiënt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Lijst van lectines die de standaardtip vormen voor automatische glycaanprofilering. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: PAA-sacchariden gebruikt als standaarden voor het automatische glycaanprofileringssysteem. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Resultaten van de reproduceerbaarheidstest binnen de run. CV: variatiecoëfficiënt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Resultaten van de reproduceerbaarheidstest tussen de dagen. CV: variatiecoëfficiënt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6: Resultaten van de stabiliteitstest op lange termijn. CV: variatiecoëfficiënt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

In deze studie is een snelle evaluatietechniek voor glycosylering ontwikkeld met behulp van "bead array in a single tip"-technologie. De huidige studie introduceerde een standaard GlycoBIST-tip, ontworpen voor zowel glycowetenschappelijke als niet-glycowetenschappelijke onderzoekers, om routinematige, uitgebreide glycosyleringsevaluatie te vergemakkelijken. De lectine-microarray, die meestal 20-100 lectines12,13 gebruikt, is op grote schaal gebruikt bij evaluaties. Echter, gezien de overlappende specificiteiten van sommige lectines op de microarray en de relatief beperkte variëteit aan glycovormen op een doelglycoproteïne in vergelijking met glycomics van ruwe klinische monsters, werd verwacht dat 15 lectines voldoende zouden zijn voor vereenvoudigde evaluatie van gerichte glycaanprofilering.

De cruciale stap in het protocol is om de lectine-geïmmobiliseerde kralen of tips gevuld met die kralen na opslag terug te laten keren naar kamertemperatuur voordat ze worden gebruikt voor metingen. In het bijzonder werd waargenomen dat condensatie de signalen verzwakt; Daarom wordt geadviseerd om de opbergtas nooit te openen totdat deze weer op kamertemperatuur is. Voor de opslag van biotinyleringsreagentia is het ook essentieel om volledig te drogen voordat u het opbergt. Een ontoereikend droogproces vermindert de efficiëntie van biotinylering tot eiwit als gevolg van de hydrolyse van het biotinyleringsreagens14.

Met betrekking tot aanpassingen en probleemoplossing werd een methode onderzocht om de variabiliteit te verminderen, met name met betrekking tot de meetmethode in het geautomatiseerde reactiemeetapparaat. Met name wanneer het volume van de buffer in het voor de analyse gebruikte reservoir 150 μl bedraagt, komen er belletjes in de tip, wat leidt tot een verminderde reactie-efficiëntie en resulteert in een grote variatie in waarden. Daarom wordt aanbevolen om ten minste 200 μL buffer in het reservoir te doen.

De hoeveelheid vloeistof die de tips vult tijdens het automatisch pipetteren is ook een belangrijke factor. De tips kunnen de vloeistof niet volledig verdrijven terwijl deze naar de volgende reactiestap gaat. Daarom wordt de buffer van de vorige stap in niet geringe mate overgedragen naar de volgende stap en blijft de vorige buffer aan de bovenkant van de ingebrachte oplossing wanneer de nieuwe buffer wordt opgezogen. Daarom moeten het substraat en andere oplossingen voldoende worden aangezogen om het bovenste reservoir te vullen (zie figuur 1A). Gezien de onomkeerbaarheid van antilichaamreacties op het instrument, is het van cruciaal belang om voorzichtig te zijn en fouten te voorkomen tijdens de eerste installatie.

Een beperking van de methode is dat deze beperkt is tot oplosbare eiwitten die zijn afgeleid van serum- en kweeksupernatanten. In de huidige methode is lectine niet covalent verknoopt met de kraal, waardoor deze niet in staat is om monsters te analyseren die hoge concentraties oppervlakteactieve stoffen, zoals cel- en weefselextracten, bevatten. Bijgevolg zijn toekomstige verbeteringen nodig om deze beperkingen aan te pakken.

De betekenis van de lectinekralenreeks ligt in de uitwisselbaarheid en uitbreidbaarheid van de lectinesoorten die op de kralen zijn bevestigd. Bij grootschalige differentiële analyse (>1.000 monsters) met behulp van het geautomatiseerde glycaanprofileringssysteem kunnen gebruikers bijvoorbeeld een opstelling van 15 lectines in de tip op maat maken op basis van voorlopige lectine-microarray-gebaseerde glycaanprofilering van het doelglycoproteïne (<100 monsters). Bovendien maakt de hoge stabiliteit van de lectine-gefixeerde korrels het mogelijk om direct te experimenteren, van het eerste tipontwerp tot de meting met routineprocedures. Niet alleen de 25 van de 28 lectines die een hoge betrouwbaarheid hebben aangetoond (Tabel 1), maar alle lectines die van belang zijn voor de gebruiker kunnen worden gebruikt om een op maat gemaakt geautomatiseerd glycaanprofileringssysteem te creëren voor hun specifieke experimenten, volgens de eerder genoemde routinematige betrouwbaarheidstest. Deze aanpak leidde tot het ontwerp van een mogelijke 120-lectine kralenreeks van acht verschillende soorten tips voor uitgebreide meting in combinatie met het standaard glycaanprofileringssysteem.

Een eerdere studie richtte zich op het opzetten van een detectieprocedure voor Cy3-gelabelde glycoproteïnen in lijn met de lectine-microarray15. Deze methode was beperkt tot 13 lectines parallel in de punt vanwege fluorescentie-interferentie. De huidige methode, met behulp van HRP-detectielabels, biedt plaats aan 15 lectine-gefixeerde kralen en twee controlekorrels (positief en negatief) in een tip. Bovendien heeft de biotinylering van monsters het analyseproces verkort.

Deze analytische methode kan niet alleen worden toegepast op academisch onderzoek, maar ook op medisch en farmaceutisch onderzoek, voeding, cosmetica en andere industriële gebieden. Hoewel lectine-microarray- en glycoproteomics-technologieën goed ingeburgerd zijn, blijft de aanpak van deze studie belangrijk vanwege de volledige automatisering en het vermogen voor snelle analyse met minder stappen. In de toekomst zal deze analyse worden verbeterd in een kwantitatieve methode door het signaal te normaliseren met behulp van bepaalde glycoproteïnen, waarbij antilichaam-gefixeerde kralen naast lectine-gefixeerde kralen in een tip worden gebruikt.

Openbaarmakingen

AO, TO, NT, HS, KK, MA, SY, TM, KN, OS en KS zijn werknemers van Precision System Science Co., Ltd.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Adaptable and Seamless Technology transfer Program through Target-driven R&D (A-STEP), gefinancierd door het Japan Science and Technology Agency (JST), onder subsidienummer JPMJTR204A en gedeeltelijk door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 23H02680 aan AK. We willen Editage (www.editage.jp) bedanken voor het redigeren van de Engelse taal.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL 8 PCR tubes + flat capFastGeneFG-0028FC/SEVoor het doseren en opslaan van biotinyleringsreagentia
2.0 mL SC Micro Tube protein LBSARSTEDT AG&Co. KG72.694.600Voor het laden van monsters in LuBEA-VIII
AnalysesoftwareSAS Institute Inc.JMP 17
Anti-Statische Ionisator. 110 voltPlas-Labs800-AS/SPIGebruik tijdens het inbrengen van kralen in BIST Tip.
Antistatische pincet NK2ARUBIS 9-5681-01Gebruik tijdens het inbrengen van kralen in BIST Tip.
Geautomatiseerd reactiemeetapparaatPrecision System Science Co., Ltd.LuBEAAlle gegevens in deze studie zijn verkregen met LuBEA-VIII. Terwijl LuBEA gecommercialiseerd is, bevindt LuBEA-VIII zich momenteel in de ontwikkelingsfase. De website voor productdetails van LuBEA en LuBEA-VIII is te vinden op de volgende URL (https://www.pss.co.jp/english/technology/apit/bist02.html).
Biotine-(AC5)2 Sulfo-OsuDojindo341-06801Als biotinyleringsreagens
BIST spacerkraal- V-11Precision System Science Co., Ltd.F4938000Diameter: 1 mm
BIST tip en hulsPrecision System Science Co., Ltd.F4930-000Vul deze lege tip met kralen.
CalciumchlorideWako039-00475Voor het bereiden van bufferoplossingen
Can Get Signal Solution 2TOYOBONKB-301Deze blokkeringsreagens is goed voor deze methode
CentriVap Benchtop Vacuum ConcentratorsLabconco7810010Voor het drogen van biotinyleringsreagens. De vervanging door andere bedrijven is mogelijk.
Clarity Western ECL Substraat Bio-Rad1705060Voor het meten van de monsters met LuVEA VIII
Cold trap CentriVap seriesLabconco7460040Voor het drogen van biotinyleringsreagens. De vervanging door andere bedrijven is mogelijk.
GlycineWako077-00735Voor het bereiden van bufferoplossingen
Mangaan(II) Chloride TetrahydraatWako139-00722Voor het bereiden van bufferoplossingen
Milli-Q referentieMERCKZIQ7000T0CAls gedeioniseerd water voor het verdunnen van reagentia en buffers
PBSWako162-19321Voor het bereiden van bufferoplossingen
Peroxidase StreptavidinJackson016-030-084Dit antilichaam is goed voor GlycoBIST-analyse. Het is nuttig voor de detectie van de western blotting, hoewel vervangingen kunnen worden geleverd door andere bedrijven.
ProbekraalPrecision System Science Co., Ltd.FP4936000Voor het bereiden van lectin-gefixeerde kralen. Zie Shimazaki, H. et al., Current Protocols in Protein Science, 2020 in de referentiesectie voor meer informatie.
Protein LoBind Tubes 1.5 mLEppendorf0030108442Gebruik bij het bereiden van monsters zoals biotinylering.
Silica gel (voor droogmiddel)Kanto chemical37039-02Gebruik bij het opslaan van de GlycoBIST tip en gedroogde biotinyleringsreagens.
Statische elektriciteit verwijderingsblad MTRUSCO NAKAYAMASD5050Gebruik tijdens het inbrengen van kralen in BIST Tip.
SV Cartridge IIDaido Chemical IndustryED041Voor het meten van de monsters met LuVEA VIII
Tabel Microcentrifuge-CAPSULEFUGETOMYPMC-060Voor het centrifugeren van het mengsel in elk proces
Triton X-100Nacalai tesque35501-15Voor het bereiden van bufferoplossingen

Referenties

  1. Butler, M., Reichl, U. Animal cell expression systems. Adv Biochem Eng Biotechnol. 175, 1-36 (2021).
  2. Silva, M. L. S. Chapter One - Lectin biosensors in cancer glycan biomarker detection. Adv Clin Chem. 93, 1-61 (2019).
  3. Hiono, T., Nagai-Okatani, C., Kuno, A. 4.07 - Application of glycan-related microarrays. Comprehensive Glycoscience (Second Edition). , 134-148 (2021).
  4. Shimazaki, H., et al. Lectin bead array in a single tip facilitates fully automatic glycoprotein profiling). Anal Chem. 91 (17), 11162-11169 (2019).
  5. Shimazaki, H., et al. GlycoBIST: A System for automatic glycan profiling of a target protein using milli-bead array in a tip. Curr Protoc Protein Sci. 99 (1), e103(2020).
  6. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  7. Bojar, D., et al. A useful guide to lectin binding: machine-learning directed annotation of 57 unique lectin specificities. ACS Chem Biol. 17 (11), 2993-3012 (2022).
  8. Nagai-Okatani, C., et al. 2.0: An integrated visualization for lectin microarray-based mouse tissue glycome mapping data with lectin histochemistry. J Proteome Res. 20 (4), 2069-2075 (2021).
  9. Geisler, C., Jarvis, D. L. Effective glycoanalysis with Maackia amurensis lectins requires a clear understanding of their binding specificities. Glycobiology. 21 (8), 988-993 (2011).
  10. Noro, E., et al. N -glycan structures of Wisteria floribunda agglutinin-positive Mac2 binding protein in the serum of patients with liver fibrosis. Glycobiology. 31 (10), 1268-1278 (2021).
  11. Rawitch, A. B., Pollock, H. G., Yang, S. X. Thyroglobulin glycosylation: Location and nature of the N-Linked oligosaccharide units in bovine thyroglobulin. Arch Biochem Biophys. 300 (1), 271-279 (1993).
  12. Dang, K., Zhang, W., Jiang, S., Lin, X., Qian, A. Application of lectin microarrays for biomarker discovery. Chemistry Open. 9 (3), 285-300 (2020).
  13. Chen, S., Qin, R., Mahal, L. K. Sweet systems: Technologies for glycomic analysis and their integration into systems biology. Crit Rev Biochem Mol Biol. 56 (3), 301-320 (2021).
  14. Dwivedi-Agnihotri, H., Srivastava, A., Shukla, A. K. Reversible biotinylation of purified proteins for measuring protein-protein interactions. Methods Enzymol. 633, 281-294 (2020).
  15. Shimazaki, H., et al. Auto-lectin dotcoding by two octopuses: Rapid analysis of fluorescence-labeled glycoproteins by an 8-channel fully-automatic bead array scanner with a rolling-circle detector. Anal Chem. 95 (32), 11868-11873 (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Prote neglycosyleringglycaanprofileringlectine microarraygeautomatiseerde glyco analysebiofarmaceutische kwaliteitglyco biomarkervindingsmethodemassaspectrometrielectine blottingziektebiomarkers

Gerelateerde artikelen