Niet-destructieve op SPE-UPLC gebaseerde kwantificering van aflatoxinen en stilbenoïde fytoalexinen in enkele pinda's (Arachis spp.) Zaden

Samenvatting

We demonstreren een medium-throughput methode voor het kwantificeren van aflatoxinen en stilbenoïde fytoalexinen in enkele pindazaden met behulp van ultra performance vloeistofchromatografie. Deze methode is speciaal ontwikkeld voor de analyses van wilde Arachis-soorten die worden uitgedaagd door de afplatoxigene Aspergillus-soorten .

Samenvatting

Aflatoxinen zijn zeer kankerverwekkende secundaire metabolieten van sommige schimmelsoorten, met name Aspergillus flavus. Aflatoxinen besmetten vaak economisch belangrijke landbouwproducten, waaronder pinda's, en vormen een hoog risico voor de gezondheid van mens en dier. Door de smalle genetische basis vertonen pindacultivars een beperkte resistentie tegen schimmelpathogenen. Daarom hebben talrijke wilde pindasoorten met tolerantie voor Aspergillus veel aandacht gekregen van wetenschappers als bronnen van ziekteresistentie.

Het onderzoeken van plantenkiemplasma op resistentie tegen aflatoxinen is moeilijk omdat de accumulatie van aflatoxinen geen normale verdeling volgt, wat de noodzaak dicteert van de analyses van duizenden enkele pindazaden. Voldoende gehydrateerde pindazaden (Arachis spp.) zijn, wanneer geïnfecteerd door Aspergillus-soorten , in staat om biologisch actieve stilbenen (stilbenoïden) te produceren die worden beschouwd als defensieve fytoalexinen. Pindastilbenen remmen de ontwikkeling van schimmels en de productie van aflatoxinen. Daarom is het van cruciaal belang om dezelfde zaden te analyseren op pinda-stilbenoïden om de aard van zaadresistentie/vatbaarheid voor de Aspergillus-invasie te verklaren. Geen van de gepubliceerde methoden biedt analyses van enkelvoudige zaden voor aflatoxinen en/of stilbeen fytoalexinen.

We hebben geprobeerd te voldoen aan de vraag naar een dergelijke methode die milieuvriendelijk is, goedkope verbruiksartikelen gebruikt en gevoelig en selectief is. Bovendien is de methode niet-destructief, omdat slechts de helft van het zaad wordt gebruikt en de andere helft met de embryonale as intact blijft. Een dergelijke techniek maakt het mogelijk om de pindaplant te ontkiemen en te laten groeien tot volledige rijpheid uit hetzelfde zaad dat wordt gebruikt voor de analyse van aflatoxine en stilbenoïde. Het geïntegreerde deel van deze methode, het handmatig uitdagen van de zaden met Aspergillus, is een beperkende stap die meer tijd en arbeid vereist in vergelijking met andere stappen in de methode. De methode is gebruikt voor de exploratie van wild Arachis-kiemplasma om soorten te identificeren die resistent zijn tegen Aspergillus en om nieuwe bronnen van genetische resistentie tegen deze schimmelpathogeen te bepalen en te karakteriseren.

Inleiding

Pinda (Arachis hypogaea L.) is een van de belangrijkste voedselgewassen ter wereld. Het wordt geteeld in meer dan 100 landen met een totale productie van meer dan 45 miljoen ton¹. Landbouwproducten, zoals pinda's, maïs en katoenzaad, worden vaak binnengevallen door soorten Aspergillus, op de bodem geboren schimmels die aflatoxinen produceren^. Deze grondstoffen zijn bijzonder gevoelig voor aflatoxinebesmetting vóór de oogst wanneer de omgevingsomstandigheden worden gekenmerkt door hoge temperaturen en droogte. Aflatoxinen behoren tot de krachtigste kankerverwekkende stoffen die bekend^{zijn 3}. Ze besmetten een kwart van de landbouwproducten in de wereld⁴ , waardoor ongeveer de helft van de wereldbevolking chronisch wordt blootgesteld aan aflatoxinen⁵. Vanwege hun hoge kankerverwekkendheid en toxiciteit wordt de aanwezigheid van aflatoxine in voedsel in de meeste landen van de wereld gereguleerd op de laagste, praktisch aanvaardbare limieten⁶.

De Europese Unie (EU) heeft een maximumgehalte vastgesteld van 2 ng/g voor aflatoxine_B1 en 4 ng/g voor totale aflatoxinen (B₁, B₂, G₁ en G₂) in producten voor menselijke consumptie⁷. Dergelijke lage limieten leggen een aanzienlijke druk op de landbouw en de voedingsindustrie die met aflatoxinen verontreinigde goederen verwerkt. Aflatoxinemonitoring en herverwerking van besmette pinda's kan worden beschouwd als een passieve en kostbare strategie om te voorkomen dat aflatoxinen in de voedselketen terechtkomen. Dat is de reden waarom alle belangrijke segmenten van de pinda-industrie enorme winstverliezen lijden als gevolg van de aflatoxinebesmetting van de huidige pindacultivars die vaak een beperkte resistentie tegen schimmelziekten vertonen. Een prospectieve benadering om het aflatoxineprobleem op te lossen, is het verkrijgen van schimmelresistente pindacultivars door middel van genintrogressie, dat wil zeggen de overdracht van genetische informatie van resistente wilde pindasoorten naar elite-cultivars. In de afgelopen jaren hebben ^8,9 wilde pindasoorten veel aandacht gekregen als bronnen van genetische ziekteresistentie, omdat de smalle genetische basis van gecultiveerde pinda's niet langer het benodigde niveau van resistentie tegen de pindaplant kan bieden^10,11. Succesvolle introgressie van wilde pindasoorten vereist de analyses van duizenden enkele, kleine en schaarse zaden (Figuur 1A) ¹².

Figuur 1: Stroomdiagram voor single-seed analyse. (A) Vergelijkende omvang van pindacultivars van verschillende markttypen versus wilde Arachis spp. (1) Virginia; (2) loper; (3) Spaans; (4) wilde Arachis spp. (B) Wilde Arachis spp. (plaat A, zaad 4) in drie delen gesneden, (5) half zaad met embryonale as; dit deel van het zaad wordt gebruikt om een plant te laten groeien (E). (C) De onderdelen (6) en (7) worden geboord met een boor en (D) geënt met schimmelsporen. Na een incubatietijd van 72 uur bij 30 °C wordt een van de zaaddelen (6) of (7) gebruikt voor aflatoxine- en fytoalexineanalyses en een ander deel voor de sequencing van RNA/transcriptoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resistentie van pinda's tegen schimmelpathogenen wordt sterk geassocieerd met fytoalexinen 13,14,15,16,17. Pinda-fytoalexinen worden vertegenwoordigd door antimicrobiële stilbenoïden die worden gebiosynthetiseerd en geaccumuleerd in plantenweefsels na blootstelling aan exogene stimuli, met name aan schimmelinvasie 16,17,18. Snelle accumulatie van voldoende concentraties fytoalexinen op de plaats van schimmelinvasie is remmend voor schimmelgroei en is van cruciaal belang voor de verdediging van planten19,20,21. De ziekteverwekker stopt met groeien wanneer fytoalexinen zich ophopen tot remmende concentraties^16,22. De rol van stilbenoïden als verdedigingsstoffen tegen aflatoxingene schimmels in pinda's werd meer dan 30 jaar geleden geëvalueerd in veldexperimenten¹³. Die experimenten ondersteunden duidelijk de hypothese dat pinda-stilbenoïden een cruciale weerstandsfactor zijn bij aflatoxinebesmetting vóór de oogst. Dergelijk bewijs is gebaseerd op het feit dat stilbenen van nature worden geproduceerd in door het veld beschadigde pinda's; stilbenen vertonen een merkbare biologische activiteit tegen aflatoxinene schimmels; En aflatoxinebesmetting in zaden werd pas gedetecteerd toen pinda's het vermogen voor fytoalexinesynthese verloren als gevolg van door droogte veroorzaakte zaaduitdroging. Een andere reeks veldexperimenten bevestigde het verband tussen de productie van fytoalexine en resistentie van het pindagenotype tegen voor de landbouw belangrijke pindaziekten¹⁷.

Een beter begrip van het natuurlijke, op fytoalexine gebaseerde mechanisme van pindaresistentie tegen schimmelinvasie is een veelbelovende strategie voor de beheersing van aflatoxinebesmetting^15,17.Daarom is het belangrijk om naast de aflatoxineanalyses dezelfde zaden kwantitatief te analyseren op fytoalexines. Hoewel dit mechanisme voor resistentie niet volledig is onderzocht en begrepen, is het toch cruciaal voor het veredelen en genetisch modificeren van pindaplanten voor nieuwe schimmelresistente cultivars²³. Ondanks het bestaan van verschillende analytische methoden voor de bepaling van aflatoxine in verschillende producten, is er nog steeds behoefte aan eenvoudige methoden voor specifiek onderzoek, vooral wanneer traditionele methoden niet voldoen aan analytische en kosteneffectieve eisen. De meeste moderne opruimmethoden die door de pinda-industrie, de landbouw en particuliere laboratoria worden gebruikt, zijn op antilichamen gebaseerde²⁴- en immunoassay 25,26,27-apparaten. Ze zijn selectief en gevoelig, maar aanzienlijk duurder dan minikolommen vol met gewone adsorptiemiddelen. Bovendien was geen van deze methoden ontworpen voor de analyse van monsters met een gewicht van enkele milligrammen. Op basis van ons eerdere onderzoek naar het analytisch gebruik van met magnesiumsilicagel (Florisil) verpakte minikolommen²⁸, hebben we deze procedure aangepast om te voldoen aan de behoeften van lopende en toekomstige pre-fok- en fokprogramma's.

Het doel van dit werk was het ontwikkelen van een niet-destructieve, gemiddelde doorvoer, milieuvriendelijke methode voor de kwantitatieve bepaling van aflatoxinen en fytoalexinen in enkelvoudige pindazaden. Een dergelijke methode is ontwikkeld. De voordelen ten opzichte van gepubliceerde methoden zijn een hogere gevoeligheid, het vermogen om aflatoxinen en fytoalexinen in een extract van één zaad te analyseren, het ontbreken van de noodzaak om monsters te wegen en lagere kosten dankzij kleinere hoeveelheden verbruiksartikelen. Het stroomschema van de geïntegreerde methode is weergegeven in figuur 1. De genetische analyses en andere stappen worden in deze tekst genoemd en in de figuur gedemonstreerd om het belang van de voorgestelde methode te tonen en hoe deze is geïntegreerd in de hele procedure.

Protocol

1. Voorbereiding van zaden voor schimmelprovocatie

1. Incubeer de afplatoxigene Aspergillus flavus NRRL 3357 op een scheutje aardappeldextrose-agar (PDA) in een reageerbuis gedurende 6 dagen bij 30 °C. Oogst schimmelsporen uit de reageerbuis met 10 ml water met Tween 20 (100 μL Tween in 1 L gedestilleerd steriel water), filtreer door glaswol in een trechter en tel de sporen met een hemocytometer volgens de gebruikershandleiding.
2. Verdun de sporensuspensie met steriel water tot een concentratie van 1.000 sporen/μL. Bevestig de concentratie met een hemocytometer.
   OPMERKING: Bereid de sporensuspensie niet eerder dan 2 uur voor de uitdagende experimenten voor.
3. Breek de pindapeulen voorzichtig en verwijder de schillen. Doe de zaden in een steriel bekerglas zodat het volume van het zaad niet groter is dan 1/5 van het volume van het bekerglas, voeg 0,05% waterstofperoxideoplossing toe aan ongeveer 70% van het volume van het bekerglas en laat de zaden gedurende 3 uur water in zich opnemen.
4. Decanteer de waterstofperoxide-oplossing uit de zaden en voeg ongeveer 3x de hoeveelheid 80% ethanol-watermengsel (v/v) toe aan het bekerglas om de zaden te bedekken. Laat 1 minuut staan en spoel de zaden vervolgens 2x af met gelijke volumes steriel gedestilleerd water.
5. Voeg een 5-voudig volume 3% waterstofperoxide toe aan het bekerglas met de met ethanol gesteriliseerde zaden en laat 5 minuten staan, decanteer vervolgens de vloeistof en spoel de zaden twee keer af met gelijke volumes steriel water (Figuur 2A).

Figuur 2: Bereiding van pindazaden voor inoculatie, incubatie en extractie van aflatoxine- en fytoalexinefracties. (A) Steriliseren van opgenomen zaden met 3% waterstofperoxide; (B) het verwijderen van testa (huid) van zaden; (C) het afsnijden van het deel van de embryonale as; (D,E) het boren van een holte in een halve zaadlob met een boor; F) het plaatsen van geboorde delen van zaden op agar; (G) het aanbrengen van schimmelsporen in de geboorde holte. H) petrischaaltje met zaden na incubatie; (I) het plaatsen van geïncubeerde enkelvoudige zaden (foto van controlemonsters) in versterkte parelbuisjes; (J) toevoeging van het gemeten volume van het extractieoplosmiddel; (K) het verpulveren van monsters in een parelruptor; (L) centrifugeren van verpulverde drijfmest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Leg de zaden op een steriele papieren handdoek, verwijder de zaadtesta met een tang en snijd ongeveer 1/3 van het zaad met de embryonale as af met een scalpel (Figuur 2B,C).
7. Gooi dit deel van het zaad weg of gebruik het om een plant te laten groeien in een reageerbuis met groeimedium (Figuur 1B,E).
8. Verdeel het resterende deel van het zaad in twee zaadlobben, plaats ze in een petrischaaltje, bedek de zaaddelen met vochtig steriel filtreerpapier, plaats het deksel terug om uitdroging te voorkomen en ga onmiddellijk verder met de inoculatiestap.
9. Voordat u de uitdagende experimenten uitvoert, bereidt u een voldoende aantal petrischaaltjes met zaadincubatiemedium door 26 ml 1,5% steriele agar in water in de schaaltjes van 100 x 15 mm te gieten en ze een nacht te laten stollen.
10. Maak in het midden van de buitenzijde van elke overgebleven zaadlob een holte van 1,5-2 mm diep door het zaad handmatig te boren met een steriele scherpe boor met een diameter van 1,6-2,34 mm. Het duurt ~2-5 s om een holte te maken (Figuur 2D, E).
11. Doe 4 tot 6 "geboorde" stukjes van de zaden in een petrischaaltje met agar en breng 2 μL van de 1.000 sporen/μL suspensie aan in de geboorde holte van elk halfzaadlobbig stuk met een pipeter van 10 μL. Breng in plaats van de sporensuspensie steriel water aan op de controlezaden (Figuur 2F,G).
12. Dek alle petrischaaltjes af met deksel en incubeer bij 30 °C zonder licht gedurende 72 uur.

2. Bemonstering en bereiding van de geïncubeerde zaadstukjes voor de analyse van aflatoxine en fytoalexine

1. Verzamel zaadstukjes na 72 uur door ze met een tang uit de agar te halen en ze allemaal in geëtiketteerde flesjes van 7 ml met 13 zirkoniumkeramische kralen (12 met een diameter van 2,8 mm en 1 met een diameter van 6,5 mm) te plaatsen (Figuur 2H,I).
   OPMERKING: Op dit punt kunnen de injectieflacons, indien niet onmiddellijk verwerkt, in een vriezer van -80 °C worden geplaatst en maximaal 2 maanden worden bewaard voordat ze verder worden verwerkt.
2. Fytoalexinen en aflatoxinen worden in hetzelfde zaadextract bepaald. Voeg voor de extractie, afhankelijk van de visuele zaadgrootte (klein, middelgroot of groot), 2 of 4 ml nauwkeurig afgemeten methanol-watermengsel (90:10, v/v) toe aan de kraalflesjes en verpulver met 5,5 m/sec gedurende 45 s. Plaats de injectieflacons met verpulverd zaad in een centrifuge en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 1.860 × g (Figuur 2J - L).
   OPMERKING: De volgende belangrijke ^17,22 stilbenoïde derivaten worden bepaald (allemaal in transconfiguratie): resveratrol, arachidin-1, arachidine-2, arachidine-3, 3′-isopentadienyl-3,5,4'-trihydroxystilbeen (IPD) en SB-1.
3. Voor aflatoxineanalyses moet u, voordat u de uitdagende experimenten uitvoert, als volgt een voldoende aantal opruimkolommen voorbereiden. Plaats een bijpassende polyethyleen poreuze (20 μL) fritte in een polypropyleen kolom van 1,5 ml met behulp van een glazen staaf die in een hoek van 90^o is gesneden. Plaats 50 mg van de magnesiumsilicagel (100-200 mesh) in de kolom met een op maat gemaakte schep en sluit de kolom af met een identieke frit door deze met een glazen staaf naar beneden te duwen (Figuur 3A - E).
   OPMERKING: Deze hoeveelheid magnesiumsilicagel neemt een volume van 75 μL in beslag en de hoogte van de adsorberende laag is 3 mm.

Figuur 3: Voorbereiding van opruimkolommen en filters. (A,B) Een poreuze frit in een vat plaatsen; (C,D) vulvat met magnesiumsilicagel; (E) het verpakken van het adsorbens en het inbrengen van een bovenste poreuze frit in het vat. (F) Plaats een cirkel van glasvezel met een diameter van 11,5 mm op een pasteurpipet. (G,H) Duw het midden van de cirkel met een plastic of houten staaf naar de bodem van de Pasteur-pipetcilinder en verdicht de glasvezel stevig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Bereid nu een bijpassend aantal op maat gemaakte filters voor, zoals weergegeven in afbeelding 3F - H.
5. Meet voor aflatoxineanalyses nauwkeurig tot 0,5 ml aliquot van het supernatans (verkregen zoals beschreven in stap 2.2), breng het over in de op maat verpakte minikolom en laat het extract door zwaartekracht uitlekken in een glazen injectieflacon van 4 ml. Breng 1,0 ml methanol-water (90:10, v/v) mengsel over naar de kolom om onzuiverheden door zwaartekracht weg te spoelen in dezelfde injectieflacon van 4 ml (Figuur 4A).

Figuur 4: Zuivering van zaadextracten en voorbereiding voor de UPLC-analyses. (A) Rek met ingepakte kolommen. (B) Verdampingsoplosmiddel met_N2-gas uit zes injectieflacons van 4 ml met gezuiverd extract geëlueerd uit reinigingskolommen. (C) Injectieflacons en filters op een temperatuur onder het vriespunt brengen in schuimcontainers (1 en 2) met ijs voor en na toevoeging van het injectieoplosmiddel (MeOH-H₂O 9:1, v/v) aan de injectieflacons van 4 ml. (D) Filteren van gekoeld extract uit een injectieflacon van 4 ml in een injectieflacon met automatische monsterneming van 400 μl. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Gooi de gecombineerde eluaten weg. Eluto de aflatoxinefractie door zwaartekracht uit de kolom in een schone glazen injectieflacon van 4 ml met een mengsel van 1,2 ml aceton-acetonitril-water-88% mierenzuur (65:31:3.5:0.5, v/v) (Figuur 4A).
7. U kunt ook aflatoxinen uit de kolom elueren met 2,0 ml acetonitril-water-88% mierenzuur (96:3,5:0,5, v/v) mengsel en een aliquot van het eluaat, tot 2 μL, rechtstreeks in het ultra performance liquid chromatography (UPLC)-systeem injecteren (zonder verdamping van het oplosmiddel met N₂).
   OPMERKING: Verwacht in dit geval een tot 10-voudig lagere kwantificeringslimiet voor aflatoxinen; In de meeste gevallen is een dergelijke daling van de gevoeligheid acceptabel, aangezien de aflatoxineconcentraties in uitgedaagd zaad vaak hoog zijn.
8. Verwijder het oplosmiddel uit de injectieflacons in een stroom van N₂ in een verwarmd blok bij 45 °C. Sluit de injectieflacon af en plaats deze 30-45 s in een container met gemalen ijs om verdamping van het oplosmiddel dat in de volgende stap wordt toegevoegd tot een minimum te beperken. Plaats op maat gemaakte filters in wegwerpreageerbuisjes en steek de buisjes in ijs in een andere container om verdamping van oplosmiddel bij filtratie te minimaliseren (Figuur 4B,C).
9. Los na verdamping van het oplosmiddel het droge residu op in nauwkeurig afgemeten 0,25-1,0 ml methanol-watermengsel (90:10, v/v) en vortex gedurende 1-2 s. Plaats injectieflacons met gezuiverde extracten in de UPLC-autosampler en injecteer 0,1 tot 3,0 μl in het UPLC-systeem (Figuur 5A,B).
   OPMERKING: Als het vermoeden bestaat dat de oplossing na het vortexen enkele zwevende deeltjes bevat, filtreer de oplossing dan door het afgekoelde filter (Figuur 4D).

Figuur 5: Het proces en de resultaten van UPLC-analyses van gezuiverde extracten. (A) Het plaatsen van een rek met gezuiverde monsterextracten in de UPLC-autosampler. (B) Het uitvoeren van de instrumentele analyses, het verkrijgen van gegevens en het interpreteren van resultaten. (C) UPLC van vier belangrijke aflatoxinen; de belangrijkste pieken van belang, aflatoxinen B₁ en B₂ vertegenwoordigen respectievelijk 0,04 en 0,004 ng. d) UPLC van aflatoxinen B₁ en B₂; piek 2 vertegenwoordigt aflatoxine_B1 op een niveau van 2 pg (met een stroomcel van 8 μL). (E) UPLC van gezuiverd extract van een zaadje dat is geoogst van een lokaal pindaveld met een wilde Arachis-soort . (F) UPLC van het extract van een uitgedaagd pindazaad, gezuiverd met een minikolom van basisch aluminiumoxide. G) UPLC van het extract van uitgedaagd pindazaad dat is gezuiverd met een Florisil-kolom; blauwe chromatogram toont onzuiverheden die uit de kolom worden gewassen met 1 ml methanol-water (90:10 v/v) mengsel; zwart chromatogram toont pieken van aflatoxinen M₁ en B₁. Het niveau van aflatoxine_B1 is 48 ng/g. (H) Een typisch chromatogram van pinda-stilbenoïden uit een uitgedaagd zaad; afkorting: IPD = 3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbeen. Opmerking: Alle stilbenoïden in zaadextracten zijn in transconfiguratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

10. Voor fytoalexineanalyses brengt u uit elke injectieflacon met parels 200 μl supernatans over in het bovenstaande pasteurpipetfilter. Gebruik N_2-gas uit een gecomprimeerde stikstoftank om de filtratie in een injectieflacon met UPLC-autosampler van 400 μl te versnellen en sluit de injectieflacon af met een bijpassende dop met een PTFE-septum (Figuur 4D).

3. Aflatoxine-analyses

1. Gebruik voor scheidingen van aflatoxinen in zaadextracten een UPLC-systeem dat is uitgerust met een autosampler, een quaternaire pomp, een fluorescentiedetector, een UPLC BEH C18 3,0 mm x 100 mm, een kolom van 1,7 μm met een bijpassende voorkolom en een fotochemische reactor na de kolom (PHRED) met een standaard gebreide PTFE-spoel met een interne diameter van 0,25 die op 25% van de oorspronkelijke lengte is gesneden.
   OPMERKING: Het UPLC-instrument en de bijbehorende apparatuur die door de auteurs worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
2. Gebruik water (A), methanol (B) en acetonitril (C) in de volgende gradiënt: beginomstandigheden, 62,7% A, 24% B, 13,3% C, lineair veranderd in 30% A, 45% B, 25% C in 3,75 min, veranderd in 0% A, 64,4% B, 35,6% C in 3,751 min, isocratisch gehouden gedurende 3,249 min, vervolgens overgeschakeld naar initiële condities in 0,01 min en isocratisch gehouden gedurende 2,499 min voor de volgende injectie. Stel het debiet in op 0.45 ml/min en de looptijd op 9.5 min. Houd de kolom op 40 °C in de systeemkolomverwarmer. Gebruik 362 nm en 440 nm als respectievelijk de excitatie- en emissiegolflengten voor kwantificering van aflatoxinen B₁, B₂, G₁, G₂ en M₁ . De structuren van de belangrijkste aflatoxinen zijn weergegeven in figuur 6A.
   OPMERKING: Onder de experimentele omstandigheden wordt verwacht dat alleen aflatoxinen B₁ en B₂ worden geproduceerd door A. flavus NRRL 3357; als een A. parasiticus-stam wordt gebruikt voor zaaduitdaging, wordt de productie van aflatoxinen B₁, B₂, G₁ en G₂ verwacht.
3. Bepaal de concentraties van aflatoxinen aan de hand van piekgebieden van overeenkomstige authentieke standaarden (kalibratiecurve) zoals beschreven in de gebruikershandleiding van de software.
   OPMERKING: Aangezien de UPLC-procedure basislijnruis vertoont bij de hoge gevoeligheidsinstellingen voor de fluorescentiedetector, worden de detectielimiet (LOD) en de kwantificeringslimiet (LOQ) voor aflatoxinen geëvalueerd met behulp van de algemeen aanvaarde signaal-ruisverhouding van 3:1 voor LOD en 10:1 voor LOQ. In de routinematige experimentele opstelling voor de analyse van pindazaden, beschreven in de secties 2 en 3, wordt verwacht dat de kwantificeringslimieten voor aflatoxinen G₁ en B₁ lager of gelijk zijn aan 0,8 en 0,08 ng/g voor respectievelijk aflatoxinen_{G 2} en_B2.

4. Analyses van stilbenoïde fytoalexine

1. Gebruik voor de afscheiding van stilbenoïden water (A), methanol (B) en 88% mierenzuur (C) in de volgende gradiënt: beginomstandigheden, 53% A, 42% B, 5% C, lineair veranderd in 35% A, 60% B, 5% C in 2,0 min, isocratisch gehouden gedurende 4 min, veranderd in 0% A, 95% B, 5% C in 0,5 min, isocratisch gehouden gedurende 2,5 min, vervolgens in 0,1 minuut overgeschakeld naar de begintoestand en 2,9 minuten isocratisch gehouden vóór de volgende injectie. Stel het debiet in op 0.5 ml/min en de looptijd op 12.0 min.
2. Bepaal de concentraties van stilbenoïden aan de hand van piekgebieden van overeenkomstige authentieke standaarden (kalibratiecurve) en/of gepubliceerde coëfficiënten van molaire extincties zoals beschreven in de gebruikershandleiding van de software. De structuren van de belangrijkste van stilbeen afgeleide fytoalexinen zijn weergegeven in figuur 6B.
   OPMERKING: De scheiding van fytoalexinen wordt bereikt met hetzelfde systeem, maar zonder een fluorescentiedetector en een PHRED-reactor. In plaats daarvan wordt een Diode Array Detector gebruikt voor de detectie en kwantificering van pinda-stilbenoïden. De kwantificeringslimiet (LOQ) voor de belangrijkste stilbenoïde fytoalexinen heeft geen praktische betekenis, aangezien de stilbenoïdeconcentraties de concentraties van aflatoxinen in hetzelfde extract met enkele ordes van grootte overschrijden; Na 3 dagen incubatie worden stilbenoïden betrouwbaar gekwantificeerd.

Resultaten

De ontwikkelde methode voor het kwantificeren van aflatoxine in zaden is de kern van de hele procedure voor het evalueren van wilde pindasoorten op resistentie tegen aflatoxine-accumulatie. Op maat verpakte minikolommen en filters leveren aanzienlijke besparingen op en vereenvoudigen de algehele procedure door het ontbreken van grote hoeveelheden oplosmiddelen, dure en onnodige commerciële filters van 0,22 of 0,45 μm en pompapparatuur. De methode voor aflatoxineanalyses biedt een hoge terugwinning, nauwkeurigheid en precisie binnen het geteste bereik van 1,0-50,0 ng/g aflatoxinen uit gemalen zaden, zoals te zien is in tabel 1. Sterk besmette monsters werden verdund tot de lineair geteste waarde. Figuur 5C toont een basislijnscheiding van vier belangrijke aflatoxinen, B₁, B₂, G₁ en G₂ binnen een elutietijd van 5 minuten, wat acceptabel is aangezien de schimmelprovocatie van pindazaden de beperkende fase van de procedure is en niet UPLC-analyses.

De voorgestelde methode is voldoende gevoelig met een kwantificeringslimiet van 2 pg voor aflatoxine_B1 (figuur 5D). De hoge zuiverheid van de extracten maakt een eenduidige kwantificering van aflatoxinen mogelijk, gezien vanaf een UPLC (Figuur 5E) van gezuiverd extract van zaden geoogst van een veld met een wilde Arachis-soort . Een eerder gepubliceerde minicolumnmethode²⁹ is niet in staat om een bevredigende zuiverheid te bereiken voor door schimmels aangetaste pindazaden (Figuur 5F) in vergelijking met de voorgestelde methode (Figuur 5G). Uit figuur 5F blijkt duidelijk dat aflatoxinen B₂, G₁ en G₂ niet betrouwbaar kunnen worden gedetecteerd en gekwantificeerd vanwege de aanwezigheid van hoge concentraties storende onzuiverheden, waarvan vele, geëlueerd na aflatoxinen, stilbenoïde fytoalexinen en schimmelmetabolieten zijn. Figuur 5G toont daarentegen de hoge efficiëntie van de magnesiumsilicagelkolom bij het verwijderen van onzuiverheden uit de aflatoxinefractie. Blauwe chromatogram toont storende onzuiverheden die uit de kolom worden gewassen met 1 ml methanol-water (90:10) mengsel; zwart chromatogram toont onverhulde pieken van aflatoxinen M₁ en B₁. Dit chromatogram vertegenwoordigt het extract van een uitgedaagd zaad van een wilde soort. Het niveau van aflatoxine_B1 is 48 ng/g.

Kwantificering van pinda-fytoalexinen is een waardevolle aanvulling op de analyses van aflatoxinen in hetzelfde zaad, dat een natuurlijk zaad van een veld kan zijn of een door schimmels uitgedaagd zaad. Figuur 5H toont een typisch chromatogram van pinda-defensieve stilbenoïden uit een uitgedaagd zaad. De scheiding van de verbindingen wordt bereikt met behulp van dezelfde analytische kolom die wordt gebruikt voor aflatoxineanalyses. De kolom en de gekozen chromatografische omstandigheden zorgen voor een bevredigende scheiding van de pieken, waardoor een betrouwbare kwantificering van de stilbenoïden mogelijk is. Evaluatie van de relatie tussen aflatoxine en fytoalexine in uitgedaagde zaden valt buiten het bestek van deze presentatie en de methode wordt hier voorgesteld als een potentieel onderzoeksinstrument, dat al enkele jaren in het laboratorium van de auteurs wordt gebruikt en nuttig is gebleken.

Figuur 6: Structuren van belangrijke aflatoxinen en van stilbeen afgeleide pinda-fytoalexinen. (A) Structuren van belangrijke aflatoxinen: 1, B₁; 2, B₂; 3, G₁; 4, G₂. (B) Structuren van belangrijke van stilbeen afgeleide pinda-fytoalexinen: 6, resveratrol; 7, arachidine-1; 8, arachidine-2; 9, arachidine-3; 10, IPD (3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbeen); 11, SB-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

Spike niveaua (ng/g)	Aflatoxinen
	B1 Zoekertjes	B2 Zoekertjes	G1	G2
50	85.87 (0.97)	82.33 (0.67)	86.63 (2.89)	84.01 (0.86)
5	91.43 (2.76)	87.32 (0.47)	88.08 (2.08)	87.73 (0.77)
1	81.21 (3.16)	85.33 (1.98)	81.76 (4.66)	88.46 (3.24)

Tabel 1: Terugwinning van aflatoxinen uit pindazaden met behulp van de Florisil-kolom en 1,2 ml van het elutiemengsel van de aflatoxinefractie. [gemiddelde (SD), %; n = 5]. Aflatoxinevrije grondmonsters (50 g) van Georgia 06G-pindacultivar werden gelijkmatig verrijkt met behulp van een microspuit met aflatoxine-bouillonoplossing op een niveau van 50, 5 of 1 ng/g en gedurende 16 uur bij kamertemperatuur bewaard. ^a Spike-niveaus worden gegeven voor aflatoxinen B₁ en G₁; voor aflatoxinen_B2 en_G2 moet de vermenigvuldigingsfactor van 0,33 worden gebruikt.

Discussie

Op basis van onze eerdere ervaring²⁸ hebben we een eenvoudige, goedkope, milieuvriendelijke, chemische procedure ontwikkeld die geschikt is voor de exploratie van wilde Arachis kiemplasmacollecties om soorten te identificeren die resistent zijn tegen Aspergillus en om nieuwe bronnen van genetische resistentie tegen deze opportunistische schimmel te bepalen en te karakteriseren. Deze methode is gebaseerd op de zuivering van zaadextract door middel van een vastefase-extractietechniek (SPE) en kwantificering van aflatoxine door Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) en wordt gekenmerkt door een voldoende hoog herstel, precisie en nauwkeurigheid. De voorgestelde "Florisil"-methode is een aanpassing van de opruimprocedure met één minikolom die is gebaseerd op de unieke eigenschap van Florisil (magnesiumsilicagel) om aflatoxinen sterk en selectief vast te houden²⁸. Net als bij de oorspronkelijke methode werden zaadmonsters geëxtraheerd met MeOH-H₂O-mengsel, maar in een andere verhouding van 90:10 (v/v) in vergelijking met de gepubliceerde 80:20 (v/v). Deze verandering heeft de stroomsnelheid van oplosmiddelen door de opruimkolom verhoogd tot 2,5x met dezelfde aflatoxine-terugwinningssnelheid. Dit 90:10 (v/v) methanol-watermengsel zorgde voor bijna 100% herstel van de aflatoxinen B₁, B₂, G₁ en G₂ normen toegevoegd aan het extraheren van oplosmiddel bij piekniveaus gelijk aan 5-50 ng aflatoxineconcentraties in 1 g van een substraat, en zorgde ook voor voldoende hoge terugwinning van de spiked pindazaadmonsters (tabel 1).

Het is aangetoond dat aflatoxinen alleen kunnen worden geëlueerd uit het Florisil-adsorbens met grote hoeveelheden aceton³⁰, aceton-methanol ^31,32 en aceton-watermengsels 33,34,35,36. In de loop van het huidige onderzoek ontdekten we dat aangezuurd acetonitril zich op dezelfde manier gedraagt als aceton in zijn vermogen om aflatoxinen uit Florisil te elueren. Voor zover wij weten is deze eigenschap van acetonitril niet gerapporteerd in de literatuur. De ontdekking van deze eigenschap maakt het mogelijk om gezuiverd extract rechtstreeks in het UPLC-systeem te injecteren, zonder de verdampingsstap van het oplosmiddel, wat de bereidingstijd aanzienlijk verkort. Zelfs wanneer acetonitril werd gemengd met aceton (aceton-acetonitril-water-88% mierenzuur (65:31:3.5:0.5, v/v)), zorgde het voor een soepele, volledige en snelle verwijdering van water uit de gezuiverde eluaten, waardoor de verdampingstijd van het oplosmiddel aanzienlijk werd verkort. De aanwezigheid van acetonitril maakte het gebruik van een enkel oplosmiddel, methanol-water (90:10, v/v) mengsel mogelijk om onzuiverheden effectief uit de Florisil-kolom te verwijderen in vergelijking met een gepubliceerde methode, waarbij twee extra wasoplosmiddelen, methanol en chloroform-methanolmengsel, nodig waren. ²⁸ okt.

Gemiddeld was het standaardherstel van aflatoxine_B1 ~98% bij gebruik van 1,2 ml voor de elutie van aflatoxinen. De hoeveelheid van 50 mg Florisil werd zo gekozen dat 1,2 ml van het elutieoplosmiddel de minikolom tot aan de bovenkant van het vat vulde en tegelijkertijd voor een bevredigend herstel zorgde (tabel 1). Deze aanpak versnelt de opruimprocedure, omdat het kolomvat slechts één keer hoeft te worden gevuld. In de beginfase van dit project was het niet duidelijk of een commerciële Florisil-fractie met een relatief grote deeltjesgrootte, 100-200 mesh, geschikt zou zijn voor een kleine kolom met slechts een laag van 3 mm van het adsorbens. Daarom hebben we verschillende Florisil-fracties onderzocht die zijn verkregen uit een commercieel 100-200 mesh-product met behulp van de Amerikaanse standaard testzeven 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 en >400 mesh. Al deze fracties leverden reproduceerbare, bijna overeenkomende resultaten op met bevredigend herstel. Hoewel kleinere fracties van deeltjesgrootte smallere aflatoxinebanden in de kolom vertoonden onder UV-licht, waren die fracties in geen enkel opzicht superieur aan het commerciële 100-200 mesh-product. Bovendien vertoonde de 100-200 mesh-fractie de kortste elutietijden (8-12 min) voor de hele procedure.

Gradiënte UPLC-oplosmiddelafgifte zorgde voor een bevredigende scheiding van aflatoxinen en voor volledige verwijdering van niet-polaire onzuiverheden uit de kolom (figuur 5G). Deze aanpak leidde tot een vlekkeloze werking van de kolommen en reproduceerbare resultaten van de analyses van honderden monsters. De identiteit van aflatoxinen die uit de Florisil-kolom werden geëlueerd, werd bevestigd zoals eerder beschreven. ²⁸ De analytische UPLC-kolom met een diameter van 3 mm die hier werd gebruikt, vertoonde een hogere selectiviteit en een betrouwbaardere scheiding van aflatoxinen B₁, B₂, G₁ en G₂ bij hogere concentraties in vergelijking met de kolom met een diameter van 2,1 mm van dezelfde chemie. Bovendien was de levensduur van de 3 mm-kolom (meer dan 1.200 injecties) aanzienlijk hoger dan die van de 2,1 mm-kolom (tot 800 injecties). Hoewel de kolom van 3 mm een hogere snelheid van de mobiele fase vereiste (40% meer), werd dit nadeel overtroffen door de bovenstaande voordelen van de kolom.

De Florisil-minikolom was effectief voor de zuivering van extracten van pindazaden die zwaar verontreinigd waren met Aspergillus-metabolieten (Figuur 5G); Dergelijke zaden bevatten ook hoge niveaus van stilbenoïde fytoalexinen die door zaden werden geproduceerd als reactie op de schimmelinvasie. Al die onzuiverheden kunnen de aflatoxineconcentratie in de zaden overschrijden tot 10^{6-voudig 22}, waardoor deze zaden uitdagende objecten zijn voor aflatoxineanalyses. Figuur 5G toont het ontbreken van storende pieken in het chromatogram binnen de aflatoxineretentietijden, waardoor de detectie en kwantificering van aflatoxine op alle geteste niveaus onaangetast bleven (tabel 1). Zoals te zien is in tabel 1, waren de nauwkeurigheid en precisie van de methode voldoende hoog binnen het geteste bereik van 1,0-50,0 ng/g, wat ook het meest kritische bereik is voor de detectie van aflatoxine. De herstelacties op verschillende niveaus voor verschillende genotypen van wilde pinda's waren uniform en de standaarddeviaties voor vijf verschillende extracties waren in wezen laag.

De methode werd ook getest op pinda-, katoen-, maïs- en rijstzaden die van nature besmet waren van nul tot extreem hoge niveaus - meer dan 10.000 ng/g totale aflatoxinen. Het herstel van aflatoxinen B₁, B₂, G₁ en G₂ uit maïs, katoenzaad en rijst op het niveau van 5 ng/g varieerde van respectievelijk 76,1% tot 93,7%, 77,1% tot 86,6% en 90,5% tot 96,2%. Het hoogste herstel van aflatoxinen uit rijst ging gepaard met de "zuiverheid" van het eluent, dat wil zeggen vrijwel het ontbreken van onzuiverheden. Verder vertegenwoordigde rijst het kleinste geteste object, gemiddeld 19 mg/zaad.

De totale bereidingstijd van een enkel pindazaadje (inclusief schillen, wegen, extraheren, centrifugeren en zuiveren) met behulp van een Florisil-kolom bedroeg niet meer dan 20 minuten. De kosten van de Florisil minizuil zijn >10x lager dan die van commerciële opruimzuilen. Extra besparingen vloeien voort uit het gebruik van lagere hoeveelheden adsorptiemiddelen, oplosmiddelen en stikstofgas in vergelijking met de gepubliceerde procedure²⁸. De minikolom heeft geen pomp- of vacuümapparaten nodig om te werken en is voor onbepaalde tijd houdbaar.

Het onderzoeken van plantenkiemplasma op resistentie tegen aflatoxinen is buitengewoon moeilijk omdat de accumulatie van mycotoxinen geen normale verdeling volgt ^37,38; Een groot aantal aflatoxineanalyses in enkelvoudige zaden is nodig om dit fenomeen te ondervangen. Naast het aflatoxinegehalte is informatie over de kwantitatieve samenstelling van fytoalexine zeer waardevol in het licht van een grote hoeveelheid informatie die kan worden verkregen uit een enkel zaadje (figuur 1A) en kan worden getraceerd naar een specifieke plant (figuur 1E). De methode is met succes gebruikt voor het screenen van honderden toevoegingen, waaronder landrassen, geavanceerde veredelingslijnen en elite pindavariëteiten. De methode wordt voorgesteld voor gebruik in onderzoeksprogramma's voor het voorkweken en veredelen van pinda's en kan helpen bij de karakterisering van pindagenen voor schimmelresistentie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acetone, Optima	Fisher Scientific	A929-4
Acetonitrile, Optima	Fisher Scientific	A996-4
Acquity BEH C18 2.1 x 5mm Van-Guard pre-column	Waters Corporation	186003975
Acquity BEH C18 3 x 100mm column	Waters Corporation	186004661
Acquity BEH C18 2.1 x 100mm column	Waters Corporation	186002352
Aflatoxins B1, B2, G1, and G2	Sigma-Aldrich	A9441-1VL	Los op de inhoud van de commerciële flesjes in 5 mL methanol om 5 µg/mL voor aflatoxinen B1 en G1 en 1.5 µg/mL voor B2 en G2 te verkrijgen
Aflatoxin B1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A6636-1MG
Aflatoxin B2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A9887-1MG
Aflatoxin G1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0138-1MG
Aflatoxin G2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0263-1MG
Aflatoxin M1 (10 µg)	Sigma-Aldrich	CRM46319
Agar, gegranuleerd (2kg)	Becton Dickinson	BD214510
Basisch aluminiumoxide (60-325 mesh)	Fisher Scientific	A941-500
Basal medium	Murashige en Skoog	M5519
Bead Ruptor 24	Omni International	19-042E
Kolf (1000mL)	Corning (Pyrex)	10001L
Kolf (250mL)	Corning (Pyrex)	1000250
Kolf (400mL)	Corning (Pyrex)	1000400
Kolf (600mL)	Corning (Pyrex)	1000600
Mes	Feather	#10
Centrifuge (LSE Compact)	Corning	Model: 6755
Microcentrifuge	Corning	Model: 6770
Keramische kralen (2.8 mm)	Omni International	19-646
Keramische kralen (6.5 mm)	Omni International	19-682
Chromeleon 7 series Software	Thermo Scientific
Boor (1,6 mm)	Kyocera	07896
Boor (2,0 mm)	Kyocera	07357
Boor (2,34 mm)	Kyocera	07985
Ethanol (200 proof)	Decon Labs	2805M
Stroom stikstof	organimation	11106	6-position
Excel, Microsoft	Microsoft	Office 365
Filterpapier (#4)	Cytiva Whatman	1004-090
Filterpapier snijder, roestvrij staal (ID 11.5mm)	Onbekend
Filterpapier, glasvezel	Cytiva Whatman	934-AH
Kolf (2800mL)	Corning (Pyrex)	44202XL
Florisil (100-200 mesh)	Fisher Scientific	F101-500
Pincet	Integra Lifescience (Miltex)	PM-0300
Mierenzuur (88%, ACS)	Fisher Scientific	A118P-500
Diepvrieskast (-80oC)	Fisher Scientific	TSX70086D
Trechter (15 x 80mm)	DWK Life Sciences (Kimax)	2902060
Gelzan (medium)	Caisson Labs	G024
Glas staaf (op maat)	Op maat gemaakt
Glaswol	Corning (Pyrex)	3950
Handvat, scalpel	Feather	#7
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Waterstofperoxide	Fisher Scientific	H325-4	30%, gecertificeerd ACS
IJsemmer, rond met deksel	Corning	432122
Incubator	Percival	136VL
Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes	Kimtech	34120	8.2" x 4.39"
Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes	Kimtech	34256	16.4" x 14.43"
Labjas	Cenmed	B113660SBXL
Methanol, Optima	Fisher Scientific	A454-4
Mini kolomrek (op maat)	Op maat gemaakt
Mixer, touch (maxi mix II)	Thermolyne	37600 (model 231)
Nitril handschoenen	Microflex	XC310M
Stroomstikstof, gecomprimeerd (ultra hoge zuiverheid)	Jones Welding
Papier handdoek	Georgia-Pacific	20023 (D400)
pH meter	Fisher Scientific (Accumet)	13-636-AB15
pH/ATC elektrode	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-111
PhCR Photochemische Reactor	Waters (Vicam)	600001222
Pipet, Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	9"
Pipettor (1 mL) (Referentie 2)	Eppendorf	4924000088
Pipettor (10 μL) (Referentie)	Eppendorf	022470051D
Pipettentips: 10 μL, 200 μL, 1 mL	Eppendorf	F144054M
Pipettor (200 µL)(Ergofit)	Fisher Scientific	12-146-67