Registratie van spieractiviteit van de voorpoten bij muizen die op het hoofd zijn gefixeerd met chronisch geïmplanteerde EMG-elektroden

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de handfabricage en chirurgische implantatie van elektromyografische (EMG) elektroden in de voorpootspieren van muizen om spieractiviteit vast te leggen tijdens experimenten met hoofdgefixeerd gedrag.

Samenvatting

Krachtige genetische en moleculaire hulpmiddelen die beschikbaar zijn in neurowetenschappelijk onderzoek naar muissystemen hebben onderzoekers in staat gesteld om de functie van het motorische systeem met ongekende precisie te ondervragen bij muizen met een hoofdfixatie die een verscheidenheid aan taken uitvoeren. Het kleine formaat van de muis maakt het meten van motorische output moeilijk, aangezien de traditionele methode van elektromyografische (EMG) registratie van spieractiviteit is ontworpen voor grotere dieren zoals katten en primaten. In afwachting van in de handel verkrijgbare EMG-elektroden voor muizen, is de huidige gouden standaardmethode voor het registreren van spieractiviteit bij muizen het maken van elektrodesets in eigen huis. Dit artikel beschrijft een verfijning van gevestigde procedures voor handmatige fabricage van een elektrodeset, implantatie van elektroden in dezelfde operatie als implantatie van de hoofdplaat, fixatie van een connector op de hoofdplaat en postoperatieve herstelzorg. Na herstel kunnen EMG-opnamen met een resolutie van milliseconden worden verkregen tijdens hoofdfixatiegedrag gedurende enkele weken zonder merkbare veranderingen in de signaalkwaliteit. Deze opnames maken nauwkeurige meting van de spieractiviteit van de voorpoten mogelijk, naast in vivo neurale registratie en/of verstoring om mechanismen van motorische controle bij muizen te onderzoeken.

Inleiding

In de afgelopen decennia zijn muizen een aantrekkelijk modelorganisme geworden voor het bestuderen van het motorische systeem van zoogdieren. Gebruikelijke experimentele benaderingen omvatten muizen met een vast hoofd die motorische taken uitvoeren naast het monitoren en/of verstoren van neurale activiteit 1,2,3,4,5. Motorische systeemstudies bij grotere soorten (zoals katten en primaten) zijn van oudsher gebaseerd op elektromyografie (EMG) om de motorische output direct te meten tijdens dergelijke experimenten ^6,7,8. Het registreren van spieractiviteit bij muizen is echter een uitdaging omdat hun spierstelsel te klein is voor in de handel verkrijgbare EMG-elektroden die worden gebruikt in experimenten met grote zoogdieren⁹. Veel onderzoekers kiezen ervoor om de kinematica van ledematen te volgen via video ^4,10,11 en/of gedragsprestaties ^2,4,12 om de motorische output indirect te onderzoeken, maar deze methoden missen de resolutie om de invloed van neurale activiteit op milliseconden en verstoring daarvan op spieren te detecteren. Het opnemen van EMG is dus wenselijk voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in directe neurale controle van spieren.

EMG omvat het meten van de spanning tussen twee punten, meestal gescheiden door een korte afstand die ongeveer evenwijdig is aan de vezels van de spier die wordt geregistreerd. EMG-elektroden zijn er in oppervlakte- (of "patch") en intramusculaire (of "naald") varianten. Oppervlakte-elektroden worden op de huid geplaatst of over het spierweefsel gelegd en vastgezet met lijm of hechten. Als zodanig zijn oppervlakte-elektroden minder invasief dan intramusculaire elektroden en zijn ze het populairst bij mensen, katten en primaten vanwege hun relatieve gebruiksgemak. Oppervlakte-elektroden zijn ook met succes gebruikt bij ratten en muizen^13,14; Ze moeten echter met de hand worden vervaardigd en chirurgisch onder de huid worden geïmplanteerd vanwege de neiging van knaagdieren om te proberen vreemde voorwerpen te verwijderen tijdens het verzorgen. Intramusculaire EMG-elektroden daarentegen worden chirurgisch geïmplanteerd in het spierweefsel. Omdat ze worden opgeslokt door spierweefsel, bieden ze een hoge ruimtelijke resolutie en blijven ze voor onbepaalde tijd op hun plaats gefixeerd. Geïmplanteerde intramusculaire EMG-elektroden zijn dus ideaal over oppervlakte-elektroden voor langdurige experimenten met knaagdieren. Om intramusculaire EMG betrouwbaar bij muizen vast te leggen, hebben onderzoekers een methode ontwikkeld voor het met de hand vervaardigen en implanteren van EMG-elektroden in spieren die zo klein zijn als die in de onderarm van een volwassen muis. Deze elektroden maken chronische spierregistratie mogelijk tijdens motorisch gedrag bij knaagdieren gedurende meerdere weken.

Het hier beschreven protocol is het resultaat van een tien jaar durende verfijning van gevestigde methoden 15,16,17,18, die heeft geleid tot een procedure voor het met de hand vervaardigen, implanteren en registreren van draad-EMG-elektroden die chronisch zijn geïmplanteerd in buig-/strekspierparen van de elleboog en pols bij zich gedragende muizen. Het eerste deel beschrijft de handmatige fabricage van een elektrodeset met vier elektrodeparen en een 8-pins connector voor de interface van de hoofdstage. In het volgende deel wordt de chirurgische implantatie van de elektroden intramusculair in de boven- en onderarmspieren beschreven in dezelfde operatie als de implantatie van de hoofdplaat. Ten slotte worden representatieve opnames van muizen die verschillende gedragingen vertonen besproken. Over het algemeen is deze methode een kosteneffectieve en aanpasbare manier om spieractiviteitsmetingen op te nemen in experimenten met hoofdvast gedrag, wat ideaal is voor laboratoria met enige ervaring met het vervaardigen van elektroden.

Protocol

Alle experimenten en procedures werden uitgevoerd volgens de NIH-richtlijnen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Northwestern University. Andere landen en/of instellingen kunnen andere regelgeving hebben die wijzigingen in deze procedure vereisen. De dieren die in dit onderzoek werden opgenomen, waren volwassen mannen uit C57BL6/J (zie materiaaltabel) van 12-20 weken met een minimaal lichaamsgewicht van 20 g.

1. Fabricage van elektrodesets

OPMERKING: Voer deze stappen uit op een schoon werkblad met behulp van een stereomicroscoop met een vergrotingsbereik van 10x-40x en schone, blote handen. Zie afbeelding 1 voor schema's met details over het strippen van de elektrodedraad (Figuur 1A) en de montage van de connector (Figuur 1B).

1. Draden doorknippen: Knip voor elk elektrodepaar twee stukken PFA-gecoate gevlochten roestvrijstalen draad (7-aderigs, 0.0055" diameter) af (zie Materiaaltabel). Knip voor de bovenarmspieren elke draad 9,5 cm lang af. Knip voor de onderarmspieren elke draad 10,5 cm lang af.
2. Bind de twee draden aan elkaar met een enkele knoop - dit wordt de knoop die net buiten de inbrengplaats (proximale knoop) zit wanneer deze wordt geïmplanteerd. De gebonden draden bestaan uit één elektrodepaar.
   1. Gebruik een naald van 18 G die in een stuk golfkarton wordt gestoken, plaats de knoop op 6 cm van het insteekuiteinde en draai deze vast rond de naald door de elektrodestrengen tegen het karton te trekken. Het insteekuiteinde krimpt tot ongeveer 5,5 cm, terwijl de resterende 0,5 cm in de knoop wordt vastgebonden.
   2. Verwijder voorzichtig de naald en trek de knoop twee keer met blote handen strak om hem verder aan te spannen.
      OPMERKING: De knoop mag niet zo strak mogelijk zijn; Als u deze manier aanspant, ontstaat er een proximale knoop die de juiste maat heeft om de geïmplanteerde elektroden in het weefsel te verankeren.
   3. Zorg er voor de bovenarmspieren voor dat de uiteinden van de connector 3.5 cm lang zijn. Zorg er voor de onderarmspieren voor dat de uiteinden van de connector 4.5 cm lang zijn.
3. Strip 0,5 mm isolatie van elke draad: 1-1,5 mm van de knoop op de ene draad en 2-2,5 mm van de knoop op de andere draad. Figuur 1 illustreert waar elke draad moet worden gestript.
   1. Plak de elektrode strak tegen een stuk plat karton met de twee einddraden van de connector aan elkaar en de insteekeinddraden uit elkaar.
   2. Maak met een scalpel inkepingen in de isolatie en markeer de uiteinden waar de isolatie zal worden verwijderd.
   3. Maak bij elke inkeping een reeks van ~6 sneden met een scalpelmesje bij elke inkeping: ~2 bovenop, ~2 aan de zijkant en ~2 onder de draad.
      NOTITIE: Het is van cruciaal belang om de draad zelf niet te veel door te knippen. Anders kunnen de lokken breken. Er is oefening nodig om de juiste hoeveelheid druk te bereiken om de isolatie volledig door te snijden met beperkte schade aan de draad.
   4. Draai het elektrodepaar 180 graden en herhaal de 6 sneden in elke inkeping.
   5. Plaats indien nodig extra sneden om de 0.5 mm isolatie te scheiden van de onderliggende draad. Het aantal sneden dat hier nodig is, is afhankelijk van de uitgeoefende druk en de scherpte van het scalpelmesje.
   6. Snijd het scalpelmesje onder een hoek langs de losgeraakte isolatie en verwijder het met een pincet van de draad.
   7. Inspecteer de blootliggende draad op breuk en/of gerafelde isolatie die schade kan veroorzaken tijdens het inbrengen in het weefsel.
4. Strip 1 mm van het uiteinde van elke draad aan het uiteinde van de connector.
5. Strip 5 mm van het uiteinde van elke draad aan het insteekuiteinde.
6. Draai de segmenten van de insteekdraad in elkaar en krimp de blootliggende uiteinden van 5 mm samen in de as van een 0.5 inch. 27 G naald. Typische injectienaalden kunnen worden gebruikt na het verwijderen van het luer lock-einde.
7. Herhaal stap 1.1-1.6 voor elk elektrodepaar.
8. Monteer de connector.
   1. Knip het vrouwelijke uiteinde van de 12-pins connector (zie Materiaaltabel) op maat: # elektrodeparen x 2-pins sleuven.
   2. Verwijder de messing fittingen van elke connectorpoort (deze zijn vooraf bevestigd aan de 12-pins connector) voorzichtig met een tang. Bewaar deze fittingen voor de volgende stap.
   3. Soldeer elk blootliggend uiteinde van 1 mm van elke draad aan het buitenoppervlak van een van de bladen van een messing fitting.
      LET OP: Bij solderen komen dampen vrij die huid-, oog- en ademhalingsirritatie kunnen veroorzaken. Draag handschoenen (of was daarna uw handen), gebruik oogbescherming en gebruik een plaatselijk rookafzuigapparaat om de blootstelling te beperken.
      1. Zet de messing fitting vast in een tandeloze krokodillenklem die is bevestigd aan een helpend handgereedschap met de buitenkant van een van de messen naar boven gericht.
      2. Plaats de fitting onder de microscoop om een hoge visuele controle tijdens het solderen mogelijk te maken. Gebruik een uitgevouwen paperclip of een stuk schrootdraad om een kleine hoeveelheid roestvrijstalen compatibele flux op het oppervlak van het mes te deppen.
      3. Breng voldoende soldeer aan op het mes om de onderste ~1.5 mm van het messing mes te bedekken met behulp van een smalle conische soldeerpunt.
         OPMERKING: Te veel soldeer hier zal de montage van de connector verstoren, terwijl te weinig soldeer een ontoereikende verbinding kan achterlaten. Zorg dat er extra messing fittingen beschikbaar zijn om indien nodig opnieuw te beginnen.
      4. Smeer het oppervlak van het soldeer op het mes royaal in met roestvrijstalen vloeimiddel, maar voorkom dat er vloeimiddel in de ruimte tussen de twee bladen druppelt.
      5. Houd de 1 mm blootliggende elektrodedraad vlak tegen het soldeer op het mes en verwarm het soldeer met het strijkijzer om de verbinding te smelten.
      6. Inspecteer de verbinding: Het grootste deel van de blootliggende draad moet worden ondergedompeld in het soldeer en de draad moet stevig aan de messing fitting worden bevestigd. Zorg ervoor dat er geen soldeer tussen de twee bladen van de messing fitting is terechtgekomen - dit kan het later moeilijk maken om een mannelijke connector te plaatsen. Zorg er ten slotte voor dat de verbinding gelijk ligt met het messing messing, zodat de fitting in de volgende stap weer in de connector kan worden gestoken.
   4. Gebruik een rechte pincet om elke gesoldeerde messing fitting terug in de connector te plaatsen en zorg ervoor dat de draden van elk elektrodepaar naast elkaar liggen en niet in de knoop raken met andere elektrodeparen. Zie afbeelding 1B om de oriëntatie van een enkel elektrodepaar in de connector te visualiseren.
      OPMERKING: De ideale oriëntatie van links naar rechts is: biceps (3,5 mm aan het uiteinde van de connector), triceps (3,5 mm aan het uiteinde van de connector), extensor carpi radialis (ECR; 4,5 mm aan het uiteinde van de connector) en palmaris longus (PL; 4,5 mm aan het uiteinde van de connector). Markeer één kant met een stift of white-out om de oriëntatie van de connector tijdens de implantatie bij te houden.
   5. Knip een mannelijke 12-pins connector af tot dezelfde grootte (# elektrodeparen x 2) als het vrouwelijke uiteinde en sluit deze aan op de vrouwelijke connector. Als fittingen zijn verplaatst, kunnen ze met een rechte tang opnieuw worden ingebracht nadat de mannelijke connector is geplaatst.
   6. Verwijder de lipjes die uit de messing fittingen komen met een tang.
   7. Smeer de pinsleuven in met epoxy en zorg ervoor dat al het metaal of de draad in de buurt van de connector wordt geïsoleerd van weefsel.
      LET OP: Epoxy kan bij langdurige blootstelling huid-, oog- en ademhalingsirritatie veroorzaken. Draag handschoenen, oogbescherming en gebruik epoxy alleen in een goed geventileerde ruimte of onder een plaatselijk rookafzuigapparaat.
   8. Laat de connector minimaal 30 minuten aan de lucht drogen.
9. Test de weerstand van elk elektrodepaar en label naalden met kleine gekleurde krimpsegmenten voor eenvoudige identificatie tijdens de operatie.
   NOTITIE: De weerstand moet tussen 18-50 ohm liggen. Een lagere weerstand kan duiden op kortsluiting. Een hogere weerstand kan duiden op te veel schade aan de draadstrengen. Een hoge weerstand komt echter vaak voort uit een onvolmaakte verbinding tussen de naaldas en de draad (gemaakt in stap 1.6), wat kan worden opgelost door extra krimpen op deze kruising.
10. Zorg ervoor dat de elektrodeset vrij is van vezels en ander vuil voordat u deze implanteert. Hiervoor kan een spuitbus worden gebruikt. Inspecteren onder de microscoop kan nuttig zijn om te verifiëren.

2. Implantatie van elektroden chirurgie

OPMERKING: Dit gedeelte beschrijft een enkele chirurgische ingreep om een hoofdplaat en elektroden die in het vorige gedeelte zijn vervaardigd, te implanteren in de triceps, biceps, extensor carpi radialis (ECR) en palmaris longus (PL). Voor de laatste twee spieren is het erg moeilijk om de elektrode uitsluitend in deze individuele spieren te implanteren zonder door nabijgelegen synergistische spieren te gaan. Zie de onderstaande discussie over de kanttekeningen bij het proberen om opnames van individuele spieren te isoleren. Kopplaten worden meestal op maat ontworpen en gefabriceerd voor specifieke experimenten. In de huidige studie is gebruik gemaakt van 3D-geprinte plastic RIVETS-kopplaten¹⁹. Veel open-source kopplaatontwerpen zijn online beschikbaar via Janelia, het Allen Institute en onafhankelijke onderzoeksgroepen. De hier beschreven kopplaatprocedure is met succes toegepast met titanium en kunststof kopplaten. De chirurgische ingreep moet worden uitgevoerd op een stereotaxisch instrument (zie Materiaaltabel) met een stereomicroscoop met een vergroting van 10-40x.

1. Steriliseer de elektroden en de kopplaat koud met 1,5% glutaaraldehyde 's nachts of gedurende 8 uur. Spoel kort af in steriel water en laat volledig aan de lucht drogen voordat u implanteert.
   LET OP: Glutaaraldehyde is schadelijk bij inslikken en kan irritatie van de ogen, huid en luchtwegen veroorzaken. Hanteer met handschoenen in een geventileerde zuurkast.
2. Induceer anesthesie met 2-4% isofluraan in zuurstof van medische kwaliteit in een inductiekamer tot verlies van de oprichtreflex (ongeveer 3 minuten) volgens institutioneel goedgekeurde protocollen.
3. Breng het dier over naar de beweegbare neuskegel om de anesthesie voort te zetten. Onder narcose met 2% isofluraan in zuurstof van medische kwaliteit, scheer het hoofd, de nek en de ledematen van het dier voorafgaand aan de operatie. Voer alle overige stappen in dit gedeelte uit onder narcose. Pas de dosering van isofluraan indien nodig aan om een ademhalingsfrequentie van 1 Hz en de afwezigheid van een teenknijpreflex te behouden.
4. Breng oogsmeermiddel aan en breng tijdens de operatie elke 1 uur opnieuw aan.
5. Injecteerbare pijnstillers (zoals carprofen, 5 mg/kg) en antibiotica (zoals enrofloxacine, 10 mg/kg) subcutaan toedienen (zie Materiaaltabel) aan het begin van de operatie.
6. Implanteer de hoofdplaat met behulp van de volgende stappen of een alternatieve, door de instelling goedgekeurde methode.
   1. Zet de kop van het dier vast in de oorkappen op het stereotaxische instrument en zorg voor anesthesie (2% isofluraan) via de neuskegel die aan het stereotaxische instrument is bevestigd. Voeg een steriel laken toe om asepsis te behouden.
   2. Reinig het hoofd en de nek met povidon-jodium prep pads en steriele alcohol prep pads.
      Breng indien nodig opnieuw oogsmeermiddel aan.
   3. Injecteer lidocaïne (4 mg/kg) (zie Materiaaltabel) subcutaan op de plaats van de incisie.
   4. Zorg voor voldoende anesthesie-inductie door een teenknijp uit te voeren. Als de oprichtende reflex afwezig is, maak dan een incisie langs de middellijn van de kop van het dier van de staartrand van de ogen tot de staartrand van de oren.
   5. Klem de huid uit met tissueclips: twee aan de rostrale rand aan elke kant net achter de ogen en twee aan de staartrand net achter de oren.
   6. Reinig het schedeloppervlak door voorzichtig met een scalpelmesje te schrapen om opgedroogde fascia te verwijderen.
   7. Breng een dunne laag tandcement (zie Materiaaltabel) aan op het oppervlak van de schedel en laat het 5 minuten drogen.
   8. Plaats de kopplaat op de schedel van het dier. Hoe en waar de kopplaat wordt geïmplanteerd, verschilt per kopplaat en onderzoeksvraag.
   9. Gebruik tandheelkundig cement om de hoofdplaat aan de schedel te bevestigen. Zorg ervoor dat de schedel volledig bedekt is. Laat tandheelkundig cement 10 minuten drogen.
7. Breng het dier over naar een beweegbare plastic neuskegel om anesthesie te bieden voor de rest van de operatie; Dit maakt het mogelijk om het dier tijdens de operatie regelmatig te herpositioneren om toegang te krijgen tot verschillende spieren met behoud van anesthesie.
8. Verleng de incisie aan de achterkant van de nek (gemaakt tijdens de implantatie van de hoofdplaat) zodat deze 1 cm caudaal tot aan de oren komt.
9. Gebruik een stompe botschraper om de huid onder de incisie in de nek te scheiden van het onderliggende weefsel om een pad vrij te maken van de incisie in de nek naar de voorpoot, waar elektroden worden geïmplanteerd.
10. Bevestig de EMG-connector tijdelijk aan de kopplaat met behulp van een klein stukje tape om deze op zijn plaats te houden tijdens de implantatie van de elektrode.
11. Reinig de voorpoot van het dier met povidonjodium-prep-pads en steriele alcoholprep-pads.
12. Maak de incisie in de triceps.
    1. Leg het dier op zijn zij met de triceps naar boven gericht.
    2. Injecteer lidocaïne (4 mg/kg) op de geplande plaats van de incisie. Dit verlicht lokale pijn en houdt de spieren vochtig tijdens de implantatie.
       OPMERKING: Spieren moeten tijdens de operatie vochtig blijven, maar niet druipnat. Breng indien nodig steriele zoutoplossing plaatselijk aan als de spieren of de huid droog lijken.
    3. Snijd 7 mm over de triceps evenwijdig aan het bot.
13. Scheid de huid rond de incisie van het onderliggende weefsel met de stompe botschraper. Werk de schraper onder de huid en terug naar de incisie in de nek om een pad vrij te maken voor de elektroden.
14. Knip alle fascia weg die de spier verbergt.
15. Zorg ervoor dat het pad van de nek naar de triceps groot genoeg is door een gesloten schaar door de incisie in de triceps te steken en het nekgat naar buiten te duwen, waarbij het iets opent na het verlaten van het gat.
16. Breng de triceps-elektrode naar de triceps-incisie: Steek de punt van de grote naaldschroevendraaier door de triceps-incisie en uit de incisie in de nek. Klem de schroevendraaier in de lengte om de elektrodenaald en trek door tot aan de incisie in de triceps.
17. Triceps inbrengen: Volg stap 3 "elektroden in de spieren inbrengen".
18. Maak de incisie in de distale arm.
    1. Leg het dier op zijn rug.
    2. Plak de arm langs de zijkant van het dier met de handpalm naar beneden.
    3. Injecteer lidocaïne (4 mg/kg) op de geplande plaats van de incisie.
    4. Maak een incisie van 1 cm boven de biceps en ECR vanaf de onderkant van de deltaspier tot halverwege de onderarm, evenwijdig aan het bot. Het distale uiteinde van de incisie moet ~2 mm boven het uiteinde van de onderarmspieren zijn.
19. Verwijder de fascia om de bicepsspier bloot te leggen.
20. Maak een pad vrij van de incisie in de distale arm terug naar de incisie in de triceps boven (proximaal naar) het grote bloedvat dat onder de huid van de bovenarm loopt.
21. Rijg de biceps-elektrode onder de huid door de incisie in de nek naar de incisie in de triceps en vervolgens van de incisie in de triceps naar de incisie in de distale arm.
22. Biceps inbrengen: Volg stap 3 "elektroden in de spieren inbrengen".
    1. Plak de arm van het dier opnieuw vast in dezelfde positie, maar met de handpalm naar beneden.
    2. Breng zo dicht mogelijk bij het proximale uiteinde van de blootgestelde biceps in.
    3. Om ten minste 3 mm van de elektrode in het spierweefsel onder te dompelen, moet u ervoor zorgen dat deze iets diagonaal ten opzichte van de spiervezels wordt ingebracht, afhankelijk van de grootte van de muis.
23. Maak een pad vrij van de incisie in de triceps naar de inbrengplaats van de distale arm onder (distaal van) het grote bloedvat dat onder de huid van de bovenarm loopt, waardoor een ander pad ontstaat dan dat van de biceps-elektrode.
24. ECR-invoeging: Volg stap 3 "elektroden in de spieren inbrengen".
    1. Invoegen in het meest proximale deel van ECR.
    2. Ga naar buiten in de vouw tussen ECR en zijn antagonist en leg de knoop in deze vouw.
25. Maak een pad vrij van de triceps-insertie naar de PL-insertieplaats onder de elleboog.
26. PL inbrengen: Volg stap 3 "elektroden inbrengen in spieren".
    1. Leg het dier op zijn rug en plak zijn arm over zijn kop met de handpalm naar boven.
    2. Plaats net distaal van de elleboog.
    3. Verlaat voldoende proximaal van de polspezen, zodat de knoop op de uitgangsplaats op de spier ligt en niet op de polspezen.
27. Leg het dier op zijn zij en hecht de incisie in de triceps met behulp van 6-0 zijden hechtingen.
28. Verplaats het dier op zijn rug en hecht de incisie in de distale arm met behulp van 6-0 zijden hechtingen.
29. Bevestig de connector aan de achterkant van de kopplaat met tandheelkundig cement.
30. Hecht de incisie in de nek met behulp van 6-0 zijden hechtingen.
31. Breng actuele antibiotische crème aan op incisieplaatsen om ontstekingen te verminderen.
32. Bevestig een Elizabethaanse halsband (zie Materiaaltabel) om het dier om te voorkomen dat het de hechtingen tijdens het herstel stoort.

3. Elektroden in de spieren inbrengen

1. Buig de naald (27 G, stap 1) lichtjes door te buigen.
   1. Houd de naald vast met de schroevendraaier (zie Tabel met materialen) en druk deze tegen het handvat van een pincet om een buiging van 5-10 graden toe te voegen.
   2. Voeg in totaal drie bochten op verschillende posities langs de lengte van de naald toe.
2. Visualiseer waar je de spier kunt binnenkomen en verlaten.
3. Verwijder al het vet en de fascia die de in- en uitgang verdoezelen door met een fijne tang te snijden of te trekken. Probeer vasculaire schade te voorkomen om het bloeden te beperken.
4. Streef naar 3-5 mm ondergedompelde draad die evenwijdig loopt aan de spiervezels. Dit zorgt ervoor dat de blootgestelde stukken elektrodedraad in de spier worden ondergedompeld.
5. Gebruik de schroevendraaier om de naald in het proximale uiteinde van de spier te steken terwijl u tegendruk uitoefent met een stompe gebogen pincet in uw andere hand. Duw de naald door de spier naar de uitgangsplaats.
6. Zodra de naald de spier verlaat, pakt u de punt met een stompe tang vast en trekt u de naald erdoorheen. Blijf trekken totdat de proximale knoop bovenop de inbrengplaats zit.
7. Maak de distale knoop.
   1. Bind met een tang een losse knoop distaal van de uitgangsplaats. Span de knoop aan tot een lus van 1 cm.
   2. Duw de lus met een tang en plaats deze over de uitgang.
   3. Visualiseer waar de distale knoop moet worden gesloten voordat deze volledig wordt vastgedraaid, ongeveer 0.5 mm distaal van de uitgangsplaats. Pak de lus voorzichtig vast met de fijn gebogen pincet in deze positie en trek de lus strak over je pincet.
      OPMERKING: Span de distale knoop in deze stap niet direct over de uitgangsplaats aan, anders wordt de spier samengedrukt wanneer de knoop in de volgende stap volledig is aangetrokken.
   4. Verwijder de fijne pincet uit de knoop en voltooi het aanspannen van de knoop door de knoop met de fijngebogen pincet naar de uitgang te duwen en met de vingers aan het naalduiteinde te trekken. Zorg ervoor dat zowel de proximale als de distale knopen goed buiten de inbreng- en uitgangsplaatsen zijn geplaatst om de ingebrachte elektrode op zijn plaats te verankeren.
   5. Pak de uitgangsknoop vast met een rechte, fijne tang en krul de distale draad strak rond de tang om de draad rond de knoop en naar de spier/weg van de huid te buigen.
   6. Knip de draad 0,5 mm distaal van de distale knoop af en laat een klein knobbeltje rond de knoop gekruld.
      De vorige stap zorgt ervoor dat het afgeknipte uiteinde van de knobbel niet in de huid van het dier prikt, wat irritatie kan veroorzaken.

4. Postoperatieve zorg

1. Voer direct na de operatie de volgende stappen uit.
   1. Huisvest het dier alleen, zodat zijn kooigenoten zijn hechtingen niet verstoren.
   2. Plaats het dier in een schone kooi met lage bodembedekking. Verwijder alle nestjes en verrijkingsmateriaal dat de mobiliteit van het dier zou kunnen belemmeren tijdens het dragen van de Elizabethaanse halsband.
   3. Geef het dier water en natvoer waar het bij kan tijdens het dragen van de halsband.
2. Voer de volgende stappen 24 uur en 48 uur na de operatie uit.
   1. Verwijder de Elizabethaanse halsband zodat het dier zichzelf 20 minuten kan verzorgen.
   2. Induceer anesthesie met isofluraan, zoals vermeld in stap 2.2 en stap 2.3.
   3. Injecteerbare pijnstillers en antibiotica toedienen.
   4. Inspecteer incisieplaatsen op ontbrekende hechtingen, open wonden en tekenen van infectie of irritatie. Vervang de hechtingen en breng indien nodig meer actuele antibiotica aan.
   5. Vervang natvoer elke 48 uur totdat de Elizabethaanse halsband is verwijderd.
3. Voer de volgende stappen 6 dagen na de operatie uit.
   1. Controleer wonden voor volledige genezing.
   2. Als de wonden gesloten zijn, verwijder dan de hechtingen. Als de wonden open zijn, wacht dan nog twee dagen om de hechtingen te verwijderen. Verwijder de Elizabethaanse kraag wanneer de hechtingen zijn verwijderd.
   3. Zet de muis terug in een nieuwe, schone kooi met volledige bodembedekking en verrijking.
      OPMERKING: Dieren kunnen 7 dagen na de operatie overgaan tot experimenten of wateronthouding.

Resultaten

Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4 tonen genormaliseerde spieractiviteit geregistreerd van de voorpootspieren van muizen die verschillend gedrag vertonen: lopen op de loopband zonder hoofdfixatie (Figuur 2), klimmen op een roterend wiel onder hoofdfixatie (Figuur 3) en reiken naar waterdruppels onder hoofdfixatie (Figuur 4). Figuur 2 toont 1,5 s voortbeweging op de loopband met een geschatte stapcyclus geschat op basis van de tijd tussen twee activeringen van de elleboogbuiger. Figuur 3 toont 5 s EMG-gegevens van een dier waarbij de polsstrekelektrode 6 weken na implantatie defect raakte. In figuur 3A produceren alle vier de elektroden een schoon EMG-signaal dat is uitgelijnd met het draaien van het wiel (wat duidt op klimmen). Figuur 3B toont het signaal van dezelfde elektroden na falen: de polsstrekelektrode produceert een luidruchtig signaal dat niet verandert met de beweging van het dier. Figuur 4 toont 1 s EMG van de vier spiergroepen van de voorpoten tijdens een taak waarbij de muis overging van immobiliteit naar het reiken naar een waterdruppel.

In Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4 werden de spanningssignalen versterkt en bandpass gefilterd (250-20.000 Hz) met behulp van een differentiële versterker. Ruwe spanning werd vervolgens gesubsampled naar 1 kHz en z-gescoord voor vergelijking tussen datasets. Merk nogmaals op dat hoewel elektroden werden geïmplanteerd in de vier spieren die in het protocol worden gespecificeerd (biceps, triceps, ECR en PL), het niet gegarandeerd is dat aangrenzende synergetische spieren het EMG-signaal niet beïnvloedden; Daarom wordt elke opname toegewezen aan zijn synergiegroep (elleboogbuiger, enz.) voor nauwkeurigheid. Het verifiëren van geïsoleerde opnames van enkele spieren zou gelijktijdige opnames in meerdere synergisten vereisen om overspraak tussen spieropnames te testen, wat onbetaalbaar moeilijk kan zijn, vooral in de onderarm van muizen.

Figuur 1: Schema's van de fabricage van de elektrodeset. (A) Schema van een enkel elektrodepaar. Grijze gebieden geven aan waar moet worden gestript. (B) Schema van de connectorassemblage met een enkel voltooid elektrodepaar dat in de connector is geplaatst. Het diagram in (B) is niet op schaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve EMG-opname van vier spieren van een vrij bewegende (niet met het hoofd gefixeerde) muis die op een loopband loopt. De totale duur is 1,5 s. De stapcyclus werd geschat op basis van de tijd tussen opeenvolgende activeringen van de elleboogstrek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve EMG-opname van vier spieren van een muis met een gefixeerd hoofd die naturalistisch klimgedrag vertoont. De 5e^{rij toont} de positie van het klimwiel, uitgelezen door een roterende encoder; Veranderingen in deze waarde geven aan dat het wiel draait en het dier actief klimt. De totale duur is 5 s. (A) Opname 36 dagen na implantatie tijdens het klimmen. (B) Opname 72 dagen na implantatie in dezelfde muis nadat de polsstrekelektrode is mislukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve EMG-opname van vier spieren van een muis met een gefixeerd hoofd die overgaat van immobiliteit naar het uitvoeren van een reikende beweging. De totale duur is 1 s. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Dit protocol maakt stabiele spieractiviteitsregistraties mogelijk van muizen met een gefixeerd hoofd die gedurende enkele weken verschillende gedragingen vertonen. Onlangs is deze methode gebruikt om neurale controle van de spieren van de ledematen te onderzoeken tijdens gedrag zoals de voortbeweging van de loopband^18,20, een joysticktrektaak¹⁸ en een co-contractietaak²¹. Hoewel het hier beschreven protocol specifiek is voor elleboog- en polsspieren van muizen, kan het eenvoudig worden aangepast om van verschillende spieren of een ander aantal spieren op te nemen door de lengte en/of het totale aantal elektrodeparen te wijzigen. De hier beschreven methode is aangepast van de methoden die eerder werden gebruikt om de spieractiviteit van de voor- en achterpoten te registreren bij muizen zonder hoofdsteun 15,16,17.

De fabricage van elektroden vereist veel oefening om onder de knie te krijgen. Dagelijkse oefening gedurende 1-2 uur wordt aanbevolen tijdens het leren. Het strippen van de elektroden is de meest uitdagende stap vanwege het precieze krachtniveau dat nodig is om de isolatie door te snijden zonder de onderliggende draad te beschadigen. Dit krachtniveau is afhankelijk van de scherpte van het mesje, dus het regelmatig vervangen van het scalpelmesje kan de reproduceerbaarheid tijdens het leren helpen garanderen. Het solderen van de draden aan de messing bladen van de connector kan ook moeilijk zijn omdat roestvrij staal niet gemakkelijk soldeert. Het toepassen van een ruime hoeveelheid roestvrijstalen flux helpt de verbinding te bevorderen.

De grootste uitdaging tijdens de implantatiechirurgie is het leggen van de distale knoop zonder de geïmplanteerde draad of proximale knoop te verstoren. De proximale knoop moet groot genoeg zijn om te voorkomen dat hij op de inbrengplaats in de spier glijdt - vermijd dus om de knoop te strak te leggen in stap 2 van de fabricage van de elektrodeset. Als de proximale knoop na implantatie migreert, gebruik dan een tang met koolstofvezelpunt om deze voorzichtig te herpositioneren. Draai de distale knoop langzaam vast terwijl u de draad stevig vasthoudt met een tang om te voorkomen dat u de hele elektrode erdoorheen trekt. Deze stap is van cruciaal belang om de levensduur van geïmplanteerde elektroden te garanderen: te veel spanning op de elektrode kan ervoor zorgen dat deze breekt wanneer het dier beweegt, terwijl een losse elektrode tijdens het herstel kan verschuiven en het contact met de bijbehorende spier kan verliezen naarmate het weefsel geneest.

Dieren herstellen opmerkelijk goed van de operatie, hoewel er mogelijke complicaties zijn op te merken. Ten eerste zullen muizen op hun hechtingen en elektroden kauwen als ze de kans krijgen. Hoewel de Elizabethaanse halsband dit voorkomt, voorkomt het ook dat het dier zichzelf verzorgt. Sommige muizen ontwikkelen een slijmachtige ophoping rond hun ogen. Af en toe ervaren mannelijke muizen, vooral oudere, urethra-blokkades die verontrustend kunnen zijn voor het dier. Door het dier elke dag 20 minuten de tijd te geven zich te verzorgen voordat de hechtingen worden geïnspecteerd, moet het dier voldoende tijd hebben om deze problemen te voorkomen.

Er zijn belangrijke beperkingen van deze methode om op te merken. Ten eerste kunnen deze aangepaste elektroden over het algemeen de activiteit van een enkele motoreenheid niet oplossen. Bovendien is het niet gegarandeerd dat het elektrische signaal uitsluitend afkomstig is van een specifieke spier (d.w.z. biceps), omdat het moeilijk is om overspraak uit te sluiten van activiteit in nabijgelegen synergetische spieren. Daarom verwijzen onderzoekers in publicaties vaak naar de geregistreerde spieren door hun synergiegroep (d.w.z. elleboogbuiger). Het wordt aanbevolen om na elk experiment postmortale dissecties uit te voeren om de positie van elke elektrode te verifiëren, aangezien deze tijdens het herstel in het weefsel kan verschuiven.

Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de activiteit van een enkele motoreenheid, zouden moeten overwegen om nieuw ontwikkelde EMG-elektroden te proberen door het Center for Advanced Motor Bioengineering Research (CAMBER) aan de Emory University. Deze elektroden zijn nog in ontwikkeling, maar CAMBER zal het nieuwste elektrodeontwerp leveren. Het belangrijkste nadeel van deze elektroden is de lange levensduur: de met de hand vervaardigde elektroden die in dit protocol worden beschreven, maken over het algemeen opnames van enkele weken mogelijk, terwijl CAMBER-elektroden het beste werken voor kortetermijnexperimenten. Onderzoekers die een EMG-opnamemethode selecteren, kunnen rechtstreeks contact opnemen met CAMBER om te bepalen of hun elektroden geschikt zijn voor een bepaald experiment.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
#11 Scalpel Blades	World Precision Instruments	504170	Voor EMG elektrode fabricage
#3 Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12	Voor EMG elektrode fabricage
1 mL Sub-Q Syringe (100 pack)	Becton Dickinson	309597	Voor het toedienen van injecteerbare geneesmiddelen
12-pin connector	Newark	33AC2371	12-pin connector met messing fittingen; voor EMG elektrode fabricage
18 G Needles	Exel International	26419	Voor EMG elektrode fabricage
27 G Needles	Exel International	26426	Voor EMG elektrode fabricage
3 M Transpore Surgical Tape	3M	1527-0	Voor het afbinden van dieren ledematen tijdens operatie
6-0 silk sutures	Henry Schein	101-2636	Deze hechtdraden werken goed met de delicate huid rond de polsen
C&B Metabond Complete Kit	Pearson Dental	P16-0126	Tandcement om connector aan hoofdplaat te bevestigen
C57BL6/J Mice	Jackson Laboratories	#000664	Wild type muizen
Carbofib 5-CF Tweezers (2)	Aven tools	18762	Koper met koolstofvezel punten, gebruikt voor het manipuleren van delicate delen van elektrode (afgesneden of ingebrachte delen)
Carprodyl (Carprofen) 50 mg/mL Injectie	Ceva Animal Health, LLC	G43010B	Injecteerbaar analgeticum voor pijnbestrijding tijdens en na operatie
Castroviejo Micro Needle Holder	Fine science tools	12060-01	Voor het naaien
Castroviejo Needle Holder (large)	Fine science tools	12565-14	Voor het inbrengen van naald in spier
Delicate Bone Scraper	Fine science tools	10075-16	Om huid te scheiden van onderliggende weefsel
Dietgel 76A Dieetsupplement	Clear H2O	72-07-5022	Voor post-operatieve zorg
Dumont #5/45 Forceps	Fine science tools	11251-35	Om fascia bovenliggend op spier te verwijderen
Elizabethan collar voor muis	Kent Scientific Corporation	EC201V-10	Voor post-operatieve zorg
Enrofloxacin 2.27%	Covetrus	#074743	Injecteerbaar antibioticum voor gebruik tijdens en na operatie
Epoxy gel	Devcon	14265	Voor EMG elektrode fabricage
Hopkins Bulldog Clamp (4)	Stoelting	10-000-481	Weefselklemmen voor headplate implantatie
Isoflurane Solution	Covetrus	11695067771	Inadembare anesthesie
Lidocaine Hydrochloride Injecteerbaar - 2%	Covetrus	#002468	Topicaal analgeticum voor pijnbestrijding tijdens operatie
Medical Grade Oxygen	Airgas	OX USP200	Voor het toedienen van isofluraan tijdens operatie
MetriCide 1 Gallon	Metrex	10-1400	Glutaraldehyde oplossing voor koude-sterilisatie van headplate en elektroden
MetriTest Strips 1.5%	Metrex	10-303	Test strips voor het monitoren van glutaraldehyde oplossing (aanbevolen)
Model 900LS Small Animal Stereotaxic Instrument	Kopf Instruments	900LS	Stereotax met lazy susan functie die platform rotatie tijdens operatie mogelijk maakt
PFA-coated 0.0055" braided stainless steel wire	A-M systems	793200	Voor EMG elektrode fabricage
Povidone-iodine prep pads	Dynarex	1108	Voor het reinigen van huid
Puralube Vet Ointment	Dechra	37327	Oogzalf voor operatie
Sterile alcohol prep pads	Dynarex	1113	Voor het reinigen van huid
Straight fine #5 forceps	Fine science tools	11295-10	Voor het krullen van draad na inbrengen
Straight fine scissors	Fine science tools	14060-11	Voor het knippen van draad
Student Vannas Spring Scissors	Fine science tools	91500-09	Voor het maken van insnijdingen, het trimmen van vet en fascia, en het naaien
Technik Tweezers 7B-SA (2)	Aven tools	18074USA	Gebogen stompe pincet, voor algemeen gebruik tijdens operatie
Triple Antibiotic Ointment	Walgreens	975863	Topicaal antibioticum voor operatie
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806	Bevat alle benodigde apparatuur voor anesthesie-inductie en scavengen inclusief verdamper, inductiekamer, beweegbare plastic neusconus, en buiswerk