Zuivering en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit humane van vet afgeleide mesenchymale stamcellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft alle procedures, van het kweken van humane, van vet afgeleide mesenchymale stamcellen (ADSC's) en het verzamelen van supernatans tot het extra-extracellulaire blaasjes (EV's) met behulp van ultracentrifugatie.

Samenvatting

Humane, van vet afgeleide mesenchymale stamcellen (ADSC's) kunnen de regeneratie en reconstructie van verschillende weefsels en organen bevorderen. Recent onderzoek suggereert dat hun regeneratieve functie kan worden toegeschreven aan cel-celcontact en celparacriene effecten. Het paracriene effect is een belangrijke manier voor cellen om te interageren en informatie over korte afstanden over te dragen, waarbij extracellulaire blaasjes (EV's) een functionele rol spelen als dragers. Er is een aanzienlijk potentieel voor ADSC EV's in de regeneratieve geneeskunde. Meerdere onderzoeken hebben gerapporteerd over de effectiviteit van deze methoden. Er worden momenteel verschillende methoden beschreven voor het extraheren en isoleren van EV's op basis van principes zoals centrifugatie, precipitatie, moleculaire grootte, affiniteit en microfluïdica. Ultracentrifugatie wordt beschouwd als de gouden standaard voor het isoleren van EV's. Toch ontbreekt er nog steeds een nauwgezet protocol om voorzorgsmaatregelen tijdens ultracentrifugatie te benadrukken. Deze studie presenteert de methodologie en cruciale stappen die betrokken zijn bij ADSC-cultuur, supernatantverzameling en EV-ultracentrifugatie. Hoewel ultracentrifugatie kosteneffectief is en geen verdere behandeling vereist, zijn er nog steeds enkele onvermijdelijke nadelen, zoals een laag herstelpercentage en EV-aggregatie.

Inleiding

De meeste ADSC's zijn afgeleid van vetweefsel en het is aangetoond dat ze de regeneratie en reconstructie van verschillende weefsels en organen bevorderen, waaronder het myocardium, het bot en^{de huid.} Recent onderzoek suggereert dat de regeneratieve functie van ADSC's te wijten kan zijn aan intercellulair contact en de paracriene effecten van de cellen². Het paracriene effect is een belangrijk middel voor cellen om te interageren en informatie over korte afstanden over te dragen, en deze functie wordt bereikt door extracellulaire vesikels (EV's).

EV's zijn dubbellaagse membraanstructuren die door cellen worden geproduceerd en met een diameter variërend van 40 nm tot 160 nm (met een gemiddelde van ongeveer 100 nm). Ze beïnvloeden verschillende cellulaire functies, zoals de productie van cytokines, celproliferatie, apoptose en metabolisme ^3,4. Er zijn talloze onderzoeken uitgevoerd naar de functies van ADSC EV's, waaronder het bevorderen van botregeneratie, regeneratie van mondslijmvliesweefsel, overleving van vetweefsel na weefseltransplantatie en herstel van huidwonden 5,6,7,8. Het enorme potentieel van ADSC EV's in de regeneratieve geneeskunde is evident. Er bestaan verschillende methoden om EV's te extraheren en te scheiden van de supernatant, zoals technieken op basis van centrifugatie, precipitatie, moleculaire grootte, affiniteit en microfluïdica. De ultracentrifugatiemethode wordt algemeen beschouwd als de gouden standaard voor het isoleren van EV's⁹. Het fundamentele principe van ultracentrifugatie voor EV-scheiding is gebaseerd op het feit dat deeltjes in het monster verschillende bezinkingscoëfficiënten hebben, wat resulteert in hun sedimentatie en aggregatie in verschillende scheidingslagen. Desalniettemin is er nog geen gedetailleerd protocol opgesteld waarin de nadruk wordt gelegd op voorzorgsmaatregelen tijdens ultracentrifugatie.

Daarom schetst deze studie objectief de ADSC-cultuur, het verzamelen van supernatanten en de ultracentrifugatieprocedures en kernpunten van EV's met een logische informatiestroom en duidelijke, formele taal. Dit biedt een waardevolle referentie voor toekomstige experimenten.

Protocol

Het overzicht van de protocolstappen is weergegeven in figuur 1. De details van de reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de media

1. Bereid een kweekmedium voor ADSC zonder exosomen met behulp van 450 ml basaal kweekmedium, 50 ml foetaal runderserum zonder exosomen en 5 ml drievoudige antibiotica.

2. Reanimeren en cultiveren van ADSC's

OPMERKING: Reanimeer ADSC's.

1. Zet vooraf de UV-straling van de ultra-clean tafel aan en desinfecteer deze gedurende 30 min.
2. Verwarm het medium vooraf voor in een waterbad van 37 °C.
3. Haal 2 tubes bevroren ADSC's (P3) uit vloeibare stikstof en schud ze in een waterbad van 37 °C met constante temperatuur tot ze volledig ontdooid zijn.
   NOTITIE: De opening van de vriezerbuis mag niet in contact komen met water om besmetting te voorkomen.
4. Desinfecteer de cryopreservatiebuis met 75% alcohol en verplaats deze vervolgens naar de ultraschone tafel. Zuig de celsuspensie op met een pipet en plaats deze in een centrifugebuisje van 15 ml.
5. Plaats de centrifugebuis in een centrifugemachine met lage snelheid en centrifugeer op 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
6. Bereid vier kweekschaaltjes van 10 cm voor en doe in elk schaaltje 9 ml medium. Markeer de naam, het celtype, de generatie en de experimentele datum en verwarm ze vervolgens voor in een thermostatische celincubator van 37 °C.
7. Desinfecteer de centrifugebuis en verplaats deze naar de ultraschone tafel. Verwijder het supernatans met een pipet.
8. Voeg 4 ml medium toe en schud de oplossing voorzichtig (1 x 10⁵ cellen/ml) totdat deze gelijkmatig is verdeeld.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de celpellet niet wordt geëxtraheerd bij het extraheren van het supernatant.
9. Voeg 1 ml celsuspensie toe aan elk gerecht. Schud de gerechten met een kruismethode.
   NOTITIE: Plaats de plaat op een vlakke ondergrond en schud hem in een kruispatroon (beweeg hem omhoog, omlaag, naar links en naar rechts) gedurende 5-6 herhalingen. Vermijd cirkelvormige bewegingen, omdat deze celophoping in het midden kunnen veroorzaken.
10. Observeer de cellen met een vergroting van 40x met de optische microscoop en plaats de schaaltjes vervolgens in de couveuse.
    OPMERKING: Het primaire doel van het observeren van de cellen is om te bepalen of ze gelijkmatig zijn verdeeld, aangezien een ongelijke verdeling de daaropvolgende groei zal beïnvloeden.
11. Bereid uitwisselingsmedium voor de cellen voor.
    1. Zet vooraf de UV-straling van de ultra-clean tafel aan en desinfecteer deze gedurende 30 min.
    2. Verwarm het medium vooraf voor in een waterbad van 37 °C.
    3. Observeer de celtoestand onder de optische microscoop bij een vergroting van 40x. Het samenvloeiingsniveau is ongeveer 50%.
       OPMERKING: Het samenvloeiingsniveau wordt berekend als de verhouding tussen het gebied dat door de cellen wordt ingenomen en het oppervlak van de petrischaal nadat de cellen zich aan de wand hechten en volledig zijn uitgerekt.
    4. Breng de kweekschaal na desinfectie over naar de ultraschone tafel (bioveiligheidsniveau 2) en verwijder het medium.
    5. Spoel elk kweekschaaltje twee keer voorzichtig af met 2 ml PBS-oplossing.
    6. Voeg 10 ml medium toe aan elk gerecht. Breng de schaaltjes over naar de broedmachine.

3. Het verzamelen van de ADSC's als supernatant en het extraheren van de EV's

1. Zet vooraf de UV-straling van de ultra-clean tafel aan en desinfecteer deze gedurende 30 min.
2. Observeer de celtoestand onder een microscoop. Het samenvloeiingsniveau is ongeveer 80%.
3. Breng de schaal na desinfectie over naar de ultraschone tafel. Vang het supernatans voorzichtig op met een pipet en plaats het in een centrifugebuisje van 50 ml.
   OPMERKING: Cellen kunnen worden ingevroren of weggegooid. Als steriliteit niet vereist is, kunnen de volgende stappen op de operatietafel worden uitgevoerd. Op dit punt kan het experiment worden gepauzeerd en later opnieuw worden gestart. Als het experiment wordt stopgezet, bewaar het supernatans dan niet langer dan een week in een koelkast van 4 °C. Langdurige opslag wordt niet aanbevolen, omdat dit de activiteit van EV's kan beïnvloeden. De optimale aanpak is om EV's onmiddellijk te extraheren.
4. Centrifugeer (300 x g, 10 min, bij kamertemperatuur) om zwevende cellen te verwijderen. Verzamel het supernatans met een pipet.
   LET OP: Niet gieten. Laat een beetje overdrijvend over om te voorkomen dat de korrel wordt opgezogen.
5. Centrifugeer om celresten te verwijderen (2000 x g, 10 min, 4 °C) en ga vervolgens door met het verzamelen van het supernatans met een pipet.
   OPMERKING: De belangrijkste punten zijn dezelfde als in stap 3.4.
6. Filtreer het supernatans met een membraan van 0,22 um om grote deeltjes en celresten te verwijderen.
   OPMERKING: Filtreer het supernatans met 2 ml steriel PBS om het filtermembraan te bevochtigen vóór filtratie.
7. Centrifugeer in de ultracentrifugemachine (10.000 x g, 30 min, 4 °C).
8. Centrifugeer vervolgens 70 minuten bij 1,00,000 x g bij 4 °C om de pellet te verwijderen en het supernatant op te vangen.
   OPMERKING: De verkregen EV's werden meerdere keren gezuiverd door centrifugeren om hun zuiverheid te vergroten. De pellet is mogelijk niet zichtbaar voor het blote oog. Daarom is het van cruciaal belang om de pipet voorzichtig te bedienen en een beetje supernatans op de bodem achter te laten om te voorkomen dat de korrels zich ophopen.
9. Verwijder het supernatans met een pipet. Resuspendeer de pellet met PBS en centrifugeer (1,00,000 x g, 70 min, 4 °C).
   NOTITIE: De pellet is mogelijk niet zichtbaar voor het blote oog. Daarom is het bij het opzuigen van het supernatans met een pipet van cruciaal belang om het supernatans voorzichtig en grondig te verwijderen om de zuiverheid van EV's te maximaliseren.
10. Verwijder het supernatans en verkrijg de EV-pellet. Resuspendeer het met 1 ml PBS, breng het over in een centrifugebuis van 1 ml en bewaar het in een koelkast van 4 °C voor latere detectie.
    NOTITIE: De pellet is mogelijk niet zichtbaar voor het blote oog. Daarom is het bij het opzuigen van het supernatans met een pipet van cruciaal belang om het supernatans voorzichtig en grondig te verwijderen om de zuiverheid van EV's te maximaliseren. Als de monsters voor een langere periode niet nodig zijn, bewaar ze dan in een koelkast van -80 °C.

Resultaten

Ten eerste werden ADSC's gekarakteriseerd en geïdentificeerd, inclusief hun morfologie¹⁰ en oppervlakte-antilichamen. Op basis van figuur 2A is het duidelijk dat ADSC's in een spilvorm zijn gerangschikt en een draaikolk vormen na dichte groei. De gekweekte cellen werden gedifferentieerd in adipogene, osteogene en chondrogene cellen en gekleurd met Oil Red O, Alizarin Red en Alcian Blue¹¹. Het geïnduceerde differentiatie-experiment en de flowcytometrie bevestigden dat het inderdaad ADSC's zijn met het potentieel voor multidirectionele differentiatie. 22% van de cellen is echter CD45-positief in de resultaten, wat de conclusie niet zal beïnvloeden omdat voldoende positieve en negatieve antilichamen dit ondersteunen (Figuur 2A,B).

Vervolgens is de identificatie van de geëxtraheerde EV's essentieel. Het omvat voornamelijk drie aspecten: morfologie, deeltjesgrootte en markereiwitten. De TEM-resultaten tonen duidelijk de komvormige EV-structuur met een dubbellaags membraan¹² (Figuur 3A). NTA geeft aan dat EV's een deeltjesgrootteverdeling hebben van ongeveer 50-150 nm, met een concentratie van ongeveer 1,6 x^{10 10} deeltjes/ml (Figuur 3B). Western Blot-analyse laat ook zien dat de markereiwitten van EV's, waaronder CD9, CD63 en TSG101¹³, soepel tot expressie worden gebracht (Figuur 3C).

Figuur 1: Overzicht van de protocolstappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Karakterisering van ADSC's. (A) De morfologie van ADSC's is spoelvormig. ADSC's werden in het medium gekweekt voor respectievelijk adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie. Adipogene differentiatie werd geïdentificeerd door Olie Rood O kleuring. Osteogene en chondrogene differentiatie werd bevestigd door respectievelijk Alizarin Red-kleuring en Alcian Blue-kleuring. Schaalbalk: 100 μm. (B) Flowcytometrieanalyse van ADSC's voor MSC-oppervlaktemarkers (CD90, CD105, CD29 en CD73) en hematopoëtische celspecifieke markers (CD31, CD34, CD45 en HLA-DR). De poortstrategie: omcirkel eerst de lege groep. Op basis daarvan omcirkel je achtereenvolgens CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 en HLA-DR volgens de gelabelde antilichamen van elke groep. Deze figuur is een bewerking van Han, Y. D. et ^al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Karakterisering van EV's. (A) De TEM-resultaten laten duidelijk de komvormige EV-structuur van het dubbellaagse membraan zien. Schaal balk: 200 nm. (B) NTA geeft aan dat EV's een deeltjesgrootteverdeling hebben van ongeveer 50-150 nm, met een concentratie van ongeveer 1,6 x^{10 10} deeltjes/ml. (C) Detectie van TSG101-, CD9- en CD63-expressies in exosomen door Western blot. Deze figuur is een bewerking van Han, Y. D. et ^al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Tijdens het formele experimentele proces zijn verschillende punten cruciaal voor het bereiken van de beste experimentele resultaten. Op basis van onze eerdere ervaring is het aan te raden om te kiezen voor doorgang 3-6 ADSC's, omdat deze zorgen voor de best mogelijke celtoestand. Vóór P3 zijn rode bloedcellen, endotheelcellen en andere diverse cellen mogelijk niet gescreend. Na P6 kunnen de cellen geleidelijk verouderen, wat de toestand van uitgescheiden EV's kan beïnvloeden. Ten tweede moet het supernatans worden verzameld wanneer de celconfluentiegraad tussen 80% en 90% ligt om voldoende secretie van zoveel mogelijk EV's te garanderen. Om de maximale zuiverheid van EV's te behouden, moeten de onderzoekers voorzichtig zijn tijdens de eerste drie centrifugaties en ervoor zorgen dat er geen vloeistofresten achterblijven om te voorkomen dat onzuiverheden en pellets worden opgezogen. Zorg er tijdens de laatste twee centrifugaties voor dat het supernatans volledig is verwijderd terwijl u de pellet beschermt.

Ultracentrifugatie is kosteneffectief en vereist geen verdere behandeling. Deze techniek is op grote schaal gebruikt in EV-studies en heeft een bevredigende efficiëntie aangetoond bij het verkrijgen van EV's, zoals bevestigd door karakteriseringsexperimenten. Toch zijn er enkele onvermijdelijke nadelen. Ten eerste is het herstelpercentage van EV's laag. Ten tweede hebben EV's soms de neiging om samen te aggregeren. Bovendien kunnen niet-cellulaire componenten worden geïsoleerd en kunnen sommige EV's tijdens het proces scheuren, wat leidt tot ophoping van puin 14,15,16. Om deze defecten aan te pakken, richt het meeste onderzoek zich op het zuiveren van EV's^12,13. Dit protocol omvat echter het hele proces van celkweek tot exosoomzuivering, omdat we geloven dat het hele proces van invloed is op de status en zuiverheid van de uiteindelijke geëxtraheerde EV's. Het is van cruciaal belang om zich tijdens het gebruik aan de bovengenoemde richtlijnen te houden. Bovendien kan het verzamelen van meer supernatans en het implementeren van 3D-celcultuur nuttig zijn, aangezien talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat 3D-cultuur effectiever is in het stimuleren van de afscheiding van EV's in vergelijking met 2D-cultuur^17,18.

Dit protocol schetst het proces van het extraheren van EV's uit ADSC's met behulp van ultracentrifugatie. Het biedt praktische richtlijnen en stelt onderzoekers in staat om details tijdens de operatie zoveel mogelijk te vermijden. Samenvattend helpt het protocol onderzoekers bij het verbeteren van de kwaliteit van monsters en herinnert het ons eraan dat we ons niet alleen moeten concentreren op de details van elke stap, maar ook het experiment als geheel moeten beschouwen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane	Acros Organics	4652	0,22 μm
Basal Medium For Cell Culture	OriCell	BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)	OriCell	HUXMD-05002
Inverted Microscope	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)	Solarbio	P1410