Directe microbiële identificatie met behulp van een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem om de EUCAST RAST-methode zonder massaspectrometrie te vergemakkelijken

Summary

EUCAST heeft een protocol voor directe antimicrobiële gevoeligheidstests (AST) ontwikkeld voor geautomatiseerde bloedculturen. De afhankelijkheid van op massaspectrometrie gebaseerde microbiële identificatie kan echter worden vermeden door gebruik te maken van een direct protocol voor de bereiding van inoculum in een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem. Deze aanpak kan AST-rapporten opleveren binnen 24 uur na monsterafname.

Abstract

Gramnegatieve (GN) sepsis is een medisch noodgeval waarbij de behandeling in omgevingen met beperkte middelen berust op conventionele microbiologische kweektechnieken, wat binnen 3-4 dagen resultaten oplevert. Zowel EUCAST als CLSI erkennen deze vertraging in de doorlooptijd (TAT) en hebben protocollen ontwikkeld voor het bepalen van AST-resultaten rechtstreeks uit positief gemarkeerde geautomatiseerde bloedkweekflessen (+aBC's). Het EUCAST rapid AST (RAST)-protocol werd voor het eerst geïntroduceerd in 2018, waarbij breekpunten in de zonediameter voor vier veel voorkomende etiologische agentia van GN-sepsis, namelijk Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa en Acinetobacter baumannii-complex , kunnen worden gerapporteerd. De klinische laboratoria die deze methode in hun routinematige workflow hebben geïmplementeerd, vertrouwen echter op microbiële identificatie op basis van massaspectrometrie, die niet gemakkelijk beschikbaar is, waardoor de implementatie ervan in omgevingen met beperkte middelen wordt uitgesloten. Om dit te omzeilen, evalueerden we een direct inoculumprotocol (DIP) met behulp van een commercieel geautomatiseerd microbieel identificatie- en antimicrobieel gevoeligheidstestsysteem (aMIAST) om vroege microbiële identificatie mogelijk te maken binnen 8 uur na positieve markering van aBC. We hebben dit protocol van januari tot oktober 2023 geëvalueerd om de vier RAST-rapporteerbare GN (RR-GN) in de positief gemarkeerde aBC te identificeren. De microbiële identificatieresultaten in DIP werden vergeleken met het standaard inoculumvoorbereidingsprotocol (SIP) in aMIAST. Van de 204 +aBC's met monomorfe GN (+naBC) werd één van de 4 RR-GN geïdentificeerd in 105 +naBC's door SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 en A. baumannii complex: 26). Hiervan werd 94% (98/105) correct geïdentificeerd door DIP, terwijl de percentages grote fouten en zeer grote fouten respectievelijk 6% (7/105) en 1,7% (4/240) bedroegen. Wanneer DIP voor microbiële identificatie wordt uitgevoerd met behulp van de EUCAST RAST-methode, kunnen binnen 24 uur na ontvangst van het monster voorlopige klinische rapporten worden verstrekt. Deze aanpak heeft het potentieel om de TAT aanzienlijk te verminderen, waardoor een vroege instelling van geschikte antimicrobiële therapie mogelijk wordt.

Introduction

Sepsis, een belangrijk wereldwijd gezondheidsprobleem, wordt gedefinieerd als levensbedreigende orgaandisfunctie als gevolg van een ontregelde reactie van de gastheer op infectie. De Global Burden of Diseases Study schatte dat er in 2017 wereldwijd 48,9 miljoen gevallen van sepsis en 11 miljoen sepsisgerelateerde sterfgevallen waren, wat goed was voor bijna 20% van^{alle wereldwijde} sterfgevallen. Ongeveer 2/3^e van de bloedbaaninfecties (BSI) die sterfte veroorzaken, is te wijten aan gramnegatieve bacteriële pathogenen². De belangrijkste doodsoorzaken onder gramnegatieven (GN) zijn Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa en Acinetobacter baumannii, die ongeveer 40% van de gevallen uitmaken onder 33 bacteriële^pathogenen.

Bloedculturen blijven de gouden standaard voor het diagnosticeren van BSI, en snelle microbiële identificatie samen met de resultaten van antimicrobiële gevoeligheidstests (AST) is de sleutel tot behandeling. Er wordt geschat dat de kans op sterfte met 9% toeneemt met elke uur vertraging bij het instellen van geschikte antimicrobiële stoffen bij sepsis³. De doorlooptijd (TAT) van microbiologisch positieve bloedkweekrapporten met AST-resultaten is ongeveer 48-72 uur met de beschikbare microbiologische hulpmiddelen in omgevingen met beperkte middelen, zelfs met geautomatiseerde systemen. Als gevolg van deze ondermaatse TAT worden breedspectrum antimicrobiële stoffen empirisch gebruikt, wat bijdraagt aan het ontluikende probleem van antimicrobiële resistentie (AMR). EUCAST en CLSI erkennen deze dringende noodzaak om TAT voor microbiologische kweektechnieken voor sepsis te verminderen en evolueren naar het rechtstreeks uitvoeren van ASAT uit positief gemarkeerde bloedkweekflessen (+aBC)^4,5.

In 2018 introduceerde EUCAST voor het eerst de snelle ASAT (RAST)-methode voor het bepalen van ASAT door middel van de Kirby-Bauer-schijfdiffusiemethode bij korte incubatietijden, d.w.z. 4 uur, 6 uur en 8 uur, rechtstreeks vanaf +aBC ^6,7. De methode is momenteel gevalideerd voor het bepalen van ASAT voor +aBC's die een van de 8 meest voorkomende oorzaken van BSI bevatten, namelijk E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa en A. baumannii-complex onder gramnegatieven en Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium en Streptococcus pneumoniae onder grampositieven⁸. De breekpunten voor AST-bepaling met verschillende tijdsintervallen worden verstrekt volgens de hierboven genoemde microbiële soorten. Daarom is microbiële identificatie noodzakelijk voordat AST-resultaten categorisch worden geïnterpreteerd. De RAST-standaard specificeert echter niet de methode om microbiële identificatie binnen dit tijdsbestek mogelijk te maken.

In de meeste studies die de EUCAST RAST-methode in hun setting evalueerden, werd gebruik gemaakt van op massaspectrometrie gebaseerde microbiële identificatie na korte incubatie op vergulde media om micro-organismen te identificeren 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Massaspectrometrie-instrumenten zijn echter niet overal beschikbaar, vooral niet in lage- tot middeninkomenslanden (LMIC's), wat het potentiële nut van deze methode sterk beperkt. Weinig studies hebben de implementatie van deze methode in hun centra gemeld zonder gebruik te maken van massaspectrometrie 18,19,20. Tayşi et ^al.18 rapporteerden een brede categorisering van GN onder Enterobacterales, Pseudomonas en Acinetobacter spp. op basis van gramkleuringsmorfologie en oxidasetest voordat de AST-resultaten werden geïnterpreteerd. In andere studies van dit centrum, door Gupta et ^al.19 en Siddiqui et ^al.20, werd microbiële identificatie op soortniveau gedaan door een bacteriepellet te bereiden uit het positief gemarkeerde bloedbouillonmengsel en deze te inoculeren op de conventionele biochemische tests. Hoewel Tayşi et ^al.18 geen commentaar gaven op de nauwkeurigheid van microbiële identificatie met hun benadering, rapporteerden Gupta et ^al.19 dat met hun benadering in 165/176 (94%) gevallen, een RAST-rapporteerbare gramnegatief (RR-GN), d.w.z. een van E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa en A. baumannii complex. Met de laatste benadering werd het lezen van RAST-resultaten echter retrospectief gedaan met behulp van breekpunten met een zonediameter van 8 uur, pas na de volledige incubatie van conventionele biochemische resultaten, d.w.z. 18-24 uur na inoculatie, en de gemiddelde tijd voor rapportage was ongeveer 2 dagen.

Om de TAT van klinische rapporten verder te verminderen, stellen we een alternatieve methodologie voor om vroege identificatie van GN aanwezig in +aBC's mogelijk te maken met behulp van aMIAST. Vóór de introductie van op massaspectrometrie gebaseerde microbiële identificatiesystemen, werden deze geautomatiseerde identificatiesystemen beschouwd als de zorgstandaard voor microbiële identificatie, waarbij identificatie mogelijk werd gemaakt door colorimetrische en/of fluorometrische veranderingen die werden geïnduceerd door testbacteriën wanneer ze werden geïnoculeerd in geminiaturiseerde biochemische tests die in een cassette werden bewaard en de resultaten matchten met hun isolaatdatabase. De gemiddelde tijd tot identificatie in deze systemen is ongeveer 4 uur tot 8 uur, maar ze worden beperkt door het feit dat de fabrikanten aanbevelen om microben 's nachts te laten groeien voordat hun respectieve identificatiekaarten kunnen worden geïnoculeerd. Deze vereiste beperkt hun bruikbaarheid bij het verkorten van de tijd om te rapporteren aanzienlijk.

Er zijn maar weinig studies die methoden hebben geëvalueerd om microben van +aBC's direct te identificeren met behulp van deze geautomatiseerde systemen 21,22,23,24,25,26,27. In het geval van +aBC's die monomorfe GN bevatten, toonden de meeste onderzoeken een uitstekende overeenstemming aan tussen directe inoculatie uit bacteriële pellets gemaakt van een positief bloedbouillonmengsel en standaard kolonie-incubatie. In het geval van grampositieven waren de concordantiepercentages echter suboptimaal. Aangezien de gemiddelde tijd tot positiviteit van +aBC's tussen 8 uur en 16 uur ligt en de identificatie van GN ~4 uur tot 8 uur duurt in een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem, veronderstellen we dat door gebruik te maken van een direct inoculatieprotocol bij de geautomatiseerde microbiële identificatie, we de klinische rapportage van +aBC's met GN met een RR-GN binnen 24 uur na monsterontvangst kunnen voltooien.

Setting voor de studie
De huidige studie werd van januari tot oktober 2023 uitgevoerd in het klinische bacteriologisch laboratorium van een academisch instituut voor tertiaire zorg van nationaal belang (INI) met 950 bedden in Centraal-India. Het laboratorium is uitgerust met een continu bloedkweek monitoring systeem (CBCMS) en aMIAST. Het bacteriologisch laboratorium is de klok rond functioneel met de beschikbaarheid van technici en microbiologen voor het verwerken en rapporteren van elk positief gemarkeerd bloedkweekflesje (+aBC's).

Microbiële methoden die hier worden gebruikt
De workflow van het onderzoek is weergegeven in figuur 1. De +aBC's die monomorfe GN's (+naBC) vertonen, werden verwerkt door directe inoculatie van overeenkomstige identificatiekaarten om identificatie en AST mogelijk te maken met behulp van het EUCAST RAST-protocol. Deze resultaten werden vergeleken met de standaardbehandeling (SoC) methode voor +aBC's, d.w.z. subcultuur op conventionele vergulde media door middel van schapenbloedagar (SBA), chocolade-agar (CA) en MacConkey-agar (MA), aëroob geïncubeerd gedurende 16 uur tot 24 uur, gevolgd door identificatie- en AST-kaarten gegeven door aMIAST wanneer geïsoleerde kolonies verschijnen. Bloedculturen die grampositieve kokken, grampositieve bacillen, ontluikende gistcellen en ≥2 verschillende micro-organismen op initiële gramkleuring of vergulde media vertoonden, werden uitgesloten van het onderzoek.

Protocol

De studie, gefinancierd door de intramurale onderzoekssubsidie die door AIIMS Bhopal aan Dr. Ayush Gupta werd gegeven, werd goedgekeurd door de Institutional Human Ethics Committee (IHEC) vide letter nr: IHEC-LOP/2022/IL072.

OPMERKING: Er werd een monstervolume van 5 ml gebruikt op basis van studies uitgevoerd door Quesada et ^al.25 en Munoz-Davila et ^al.27.

1. Standaard inoculumprotocol (SIP) voor bacteriële identificatie met behulp van aMIAST

1. Draag schone handschoenen en desinfecteer in een klasse IIa bioveiligheidskast (BSC) het septum van +naBC met een wattenstaafje dat 70% isopropylalcohol bevat.
2. Zuig ongeveer 1 ml bloed-bouillonmengsel op met behulp van een steriele spuit met een naald van 21 G.
3. Doseer 1 grote druppel van het bloedbouillonmengsel van de naald op het oppervlak van de vergulde media, namelijk SBA, CA en MA. Streep de platen en broed de kweekplaten uit in een incubator bij 37 °C ± 2 °C onder aërobe omstandigheden gedurende 18-24 uur.
4. Onderzoek na incubatie de platen op het verschijnen van geïsoleerde kolonies in een BSC en ga verder voor identificatie en ASAT door aMIAST.
5. Plaats voor elk isolaat een aMIAST-polystyreenbuis in de aMIAST-buisstandaard en voeg er 3 ml steriele zoutoplossing aan toe met behulp van een dispenser die aan de fles met zoutoplossing is bevestigd.
6. Raak drie tot vijf morfologisch vergelijkbare kolonies aan met een steriele rechte inoculatiedraad en breng het bacteriële inoculum over naar de eerste buis.
7. Pas de troebelheid aan met steriele zoutoplossing in de geënte buis tussen 0.47-0.63 McFarland met behulp van een densitometer.
8. Plaats de capillaire bevestiging van de gramnegatieve aMIAST-identificatiekaart in het eerste buisje.
9. Leg de geselecteerde kaarten op een geschikte plaats op de cassette. Het inoculum in de cassette is klaar en komt naar de aMIAST in vulgedeelte.
   LET OP: De leeftijd van de suspensie mag niet langer zijn dan 30 minuten voordat de kaarten worden geïnoculeerd.
10. Plaats de cassette op zijn plaats in de vulkamer met de monsterbarcode naar binnen gericht.
11. Sluit de deur en druk op Vullen op het scherm van de gebruikersinterface. Het vullen is een cyclus van 70 s. Wanneer de cyclus is voltooid, knippert het blauwe indicatielampje op het systeem. Door de kaarten in het aMIAST-systeem te plaatsen, wordt het inoculum door de machine in de kleine kamers van de kaarten verdeeld.
12. Verwijder de cassette uit de vulkamer, sluit de deur en plaats deze in de laadkamer. Barcodes worden automatisch gescand en gecontroleerd aan de hand van een virtuele cassette elektronische werklijst. Rietjes worden automatisch verzegeld en de kaarten worden automatisch in de carrousel geladen. De knipperende blauwe pijl op de aMIAST geeft aan dat het laden is voltooid.
13. Verwijder het cassetteafval als u klaar bent. Zie de afvalverwijderingsprocedure in de productliteratuur of volg andere standaardpraktijken. Gebruik de rest van de suspensie in de buisjes om te subcultureren op CLED-agar voor zuiverheidscontrole van de isolaten.
14. Lees de resultaten af nadat het instrument de analyse heeft voltooid.

2. Direct inoculum protocol (DIP) voor bacteriële identificatie met behulp van aMIAST

1. Draag steriele handschoenen en reinig in een bioveiligheidskast het septum van +naBC met een wattenstaafje met 70% isopropylalcohol.
2. Neem met een steriele spuit met een naald van 21 G 5 ml aliquot uit het bloedbouillonmengsel van +naBC en breng dit over in een serumscheidingsbuis (SST) na desinfectie van het rubberen septum met 70% isopropylalcohol (Figuur 2A).
3. Centrifugeer dit aliquot gedurende 10 minuten op 160 x g om de bloedcellen in het bloed-bouillonmengsel te laten bezinken. Let na de eerste centrifugatie op het supernatans waarin de bloedcellen tot rust zullen komen.
4. Open de dop van de injectieflacon in een bioveiligheidskast en verwijder met behulp van een steriele punt en pipet voorzichtig het supernatans en breng het over in een nieuwe gewone injectieflacon voor bloedafname (rode bovenkant) door de bovenkant te verwijderen.
5. Plaats de dop op de injectieflacon en centrifugeer deze opnieuw gedurende 10 minuten op 2000 x g. Na de tweede centrifugatie vormt zich op de bodem een bacteriekorrel.
6. Zuig het supernatans op en gooi het weg met een steriele pipet en tip. De bacteriekorrel blijft op de bodem van de buis en wordt gebruikt om de aMIAST-identificatiekaart te inoculeren.
   OPMERKING: Bij de eerste centrifugatie bij 160 x g werd een serumscheidingsbuis gebruikt. Dit was gebaseerd op studies uitgevoerd door Quesada et ^al.25 en Munoz-Davila et ^al.27_, waarbij de eerste centrifugatiestap ongeveer werd uitgevoerd bij respectievelijk 30 x g en 60 x g. Het bloed-bouillonmengsel van een +aBC werd eerst op lage snelheid gecentrifugeerd in een SST om de bloedcellen eruit te pelleteren.
7. Plaats een aMIAST polystyreen tube in de aMIAST tube standaard en voeg er 3 ml steriele zoutoplossing in toe met behulp van een dispenser die aan de fles met zoutoplossing is bevestigd.
8. Neem met behulp van een steriele inoculatielus de bacteriekorrel van de bodem van de injectieflacon en inoculeer deze in de aMIAST-buis
9. Herhaal stap 1.7-1.14.

3. AST door EUCAST RAST-protocol^{nr. 4}

1. Houd niet-geënte ronde Mueller-Hinton-agar (MHA)-platen van 90 mm bij de hand in de bioveiligheidskast.
2. Draag steriele handschoenen en reinig in een bioveiligheidskast het septum van +naBC met een wattenstaafje met 70% isopropylalcohol.
3. Aspireer met een steriele spuit 125 μL ± 25 μL onverdund bloed-bouillonmengsel van +naBC en voeg toe aan elke MHA-plaat in het midden.
4. Verdeel de bouillon voorzichtig over de borden met een steriel wattenstaafje in drie richtingen en breng ≤ 6 antimicrobiële schijven aan op elk bord.
5. Incubeer de platen in een aërobe incubator bij 35 °C± 1 °C gedurende 8 uur. Let na voltooiing van de incubatie op de zuiverheid van het isolaat.
6. Lees de remmingszones af na 8 uur ± 5 min. Interpreteer de resultaten met behulp van de RAST-breekpunttabel voor korte incubatie na controle van de bacteriële identificatieresultaten in de aMIAST.
7. Rapporteer AST-resultaten alleen als het isolaat wordt geïdentificeerd als een van de RR-GN en de MHA- en CLED-platen een enkel morfotype ontwikkelen.

4. Kwaliteitscontrole

1. Voer een interne kwaliteitscontrole uit voor het SIP-protocol van aMIAST volgens de instructies van de fabrikant met behulp van aanbevolen referentiestammen.
2. Voer wekelijks een interne kwaliteitscontrole van de RAST-methode uit met behulp van de aanbevolen referentiestam van E. coli zoals hieronder beschreven.
   1. Plaats 4 steriele glazen buizen in een buisstandaard. Doseer 3 ml steriele zoutoplossing in de eerste buis en 990 μl steriele zoutoplossing in elk van de tweede, derde en vierde buisjes.
   2. Maak een 0,5 McFarland-suspensie van de QC-stam uit de geïsoleerde kolonies van een nachtelijke cultuur op vergulde media.
   3. Breng met een steriele pipet en tip 10 μL suspensie over van het eerste buisje naar het tweede buisje.
   4. Breng na het mengen 10 μL suspensie over van het tweede naar het derde buisje en vervolgens naar het laatste buisje.
   5. Neem uit de laatste tube 1 ml van het inoculum met behulp van een steriele spuit met een naald en voeg deze toe aan een niet-geïnoculeerde aBC.
   6. Voeg tegelijkertijd 5 ml steriel schapenbloed toe aan de aBC met behulp van een steriele spuit met een naald en incubeer het in het CBCMS totdat het positief markeert als gevolg van verandering in de kleur van de vloeistofemulsiesensor aan de basis van de aBC.
   7. Herhaal de stappen zoals uitgelegd in stap 1-3 voor identificatie met respectievelijk SIP, DIP en RAST. De verwachte resultaten zijn dat de QC-stam correct moet worden geïdentificeerd door beide identificatieprotocollen van de aMIAST en dat de zonediameters in RAST-platen binnen het gespecificeerde bereik²⁸ moeten liggen.

5. Statistische analyse

1. Beschouw microbiële identificatie met behulp van SIP als gouden standaard en als dezelfde identificatie wordt verkregen door DIP, beschouw het dan als concordant.
2. Als een RR-GN, d.w.z. een van het E. coli-, K. pneumoniae-, P. aeruginosa- en A. baumannii-complex geïdentificeerd met behulp van SIP, discordant is in de DIP, beschouw dit dan als een grote fout (ME), terwijl het omgekeerde als een zeer grote fout (VME) wordt beschouwd, omdat het de mogelijkheid heeft om een rapport uit te geven met verkeerde identificatie.
3. Bereken het concordantiepercentage voor RR-GN als de verhouding tussen het totale aantal concordante RR-GN en het totale aantal RR-GN geïdentificeerd door SIP vermenigvuldigd met 100.
4. Bereken het ME-percentage als de verhouding tussen het aantal +naBC's waarvan is vastgesteld dat ze een niet-RR-GN hebben en het totale aantal +naBC's met RR-GN geïdentificeerd door SIP vermenigvuldigd met 100.
5. Bereken het VME-percentage als de verhouding tussen het aantal +naBC's dat ten onrechte is geïdentificeerd als een RR-GN in DIP en het totale aantal. van +naBC's getest door DIP vermenigvuldigd met 100.
6. Bereken de tijd tot isolaatidentificatie (TTI) als de tijd die nodig is om het isolaat door beide protocollen te identificeren vanaf het moment van bloedkweekmarkering door het CBCMS.
7. Bereken de verschillen tussen de DIP en SIP als een vermindering van de TTI. Bereken dit alleen voor de concordante +naBC's met een RR-GN. Noteer de respectievelijke tijdstippen van de klokken van CBCMS en aMIAST.
8. Beheer gegevens en analyseer met behulp van een spreadsheet. Gebruik de Mann-Whitney U-test voor continue variabelen en beschouw een tweezijdige p-waarde van ≤ 0,05 als statistisch significant.

Results

Algemene resultaten
Tijdens de onderzoeksperiode ondergingen 240 +naBC's identificatie door aMIAST met behulp van zowel DIP als SIP. Hiervan bleek 15% (36/240) +naBC's polymicrobieel te zijn na nachtelijke incubatie op de vergulde media. Van de 204 +naBC's bedroeg het door SIP geïdentificeerde aandeel RR-GN 51,5% (105/204). Van hen was 47,6% (50/105) E. coli, 19% (20/105) K. pneumoniae, 8,6% (9/105) P. aeruginosa en 24,8% (26/105) A. baumannii-complex . Een gedetailleerde beschrijving van alle identificatieresultaten per SIP is te vinden in tabel 1.

Diagnostische nauwkeurigheid bij microbiële identificatie
Van de 105 RR-GN waren er 98 (93,3%) en 99 (94,2%) concordant met de DIP, tot identificatie op soort- en geslachtsniveau, respectievelijk. De concordantiepercentages per organisme waren 94% (47/50) voor E. coli, 90% (18/20) voor K. pneumoniae, 100% (9/9) voor P. aeruginosa en 92,3% (24/26) voor A. baumannii-complex , zoals weergegeven in Tabel 1. In 7 +naBC's waren de resultaten discordant tot identificatie op soortniveau met behulp van DIP, waarvan aMIAST ofwel niet-geïdentificeerde (3) of geïdentificeerde niet-RR-GN (4) gaf, zoals weergegeven in tabel 2. Aangezien deze resultaten de klinisch microbioloog niet verplichten om te rapporteren, werden ze beschouwd als grote fouten (ME). Het ME-percentage in onze studie was 6,7% (7/105) tot identificatie op soortniveau. Het aandeel van niet-RR-GN in aMIAST door SIP was 48,5% (99/204). Van hen waren er 60 (60,6%) concordant volgens DIP tot soortniveau-identificatie. Van de 99 niet-RR-GN's werd een RR-GN geïdentificeerd met behulp van DIP in 4 +naBC's, zoals weergegeven in tabel 2. Een dergelijke discrepantie had kunnen leiden tot een rapportagefout en werd beschouwd als een zeer grote fout (VME). Het totale VME-percentage met DIP was 1,7% (4/240). Een volledige beschrijving van de identificatieresultaten en fouten van alle gramnegatieven is weergegeven in aanvullende tabel 1.

Verkorting van de tijd die nodig is om identificatie te isoleren (TTI)
De TTI van concordante +naBC's in DIP was significant minder dan de TTI in SIP (mediaan (IQR): 507,5 min (685-404) versus 2171 min (2532-1855), P2 vs P1, p<0,00001 (Mann-Whitney-test)). Het mediane verschil in TTI tussen beide protocollen was 1635 min (IQR: 1964-1299).

Figuur 1: Workflow van het onderzoek: weergave van de workflow in het onderzoek voor positief gemarkeerde bloedkweekfles met monomorfe gramnegatieven die worden verwerkt door zowel het standaard- als het directe inoculumprotocol. Afkortingen: +aBC = positief gemarkeerd bloedkweekflesje, +naBC = positief gemarkeerd bloedkweekflesje met monomorfe gramnegatieven, DIP = Direct inoculum protocol, SIP = Standaard inoculum protocol, SBA = Schapenbloed agar, CA = Chocolade agar, MA = MacConkey agar, RR-GN = RAST te rapporteren gram-negatief, TAT = Doorlooptijd Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Direct inoculum protocol voor bacteriële identificatie: toont beelden van de flacons tijdens de uitvoering van het direct inoculum protocol. Afkortingen: +naBC = positief gemarkeerd bloedkweekflesje met gram-negatieven Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

RAST Te Rapporteren Gram-negatieven	Geteste isolaten (n)	Concordant	Verkeerde identificatie	Geen legitimatie
		n (%)	n (%)	n (%)
Totaal	105	98 (93.3%)	4 (3.8%)	3 (2.8%)
Escherichia coli	50	47 (94%)	1	2
Klebsiella pneumoniae	20	18 (90%)	1	1
Acinetobacter baumannii-complex	26	24 (92.3%)	2#	0
Pseudomonas aeruginosa	9	9 (100%)	0	0
# Eén isolaat correct geïdentificeerd tot op genusniveau, maar niet op soortniveau (Acinetobacter baumannii-complex geïdentificeerd als A. haemolyticus)

Tabel 1: Resultaten van bacteriële identificatie in het directe inoculumprotocol. De resultaten zijn alleen voor RAST-rapporteerbare Gram-negatieven. Afkortingen: n = teller, % = procent.

Gram-negatieven	Totaal aantal geteste isolaten	Grote fout			Zeer grote fout, n (%)
		Getal	Verkeerde identificatie	Geen legitimatie	(geïdentificeerd als)
		n (%)	n	n
Escherichia coli	50	3 (6%)	1 (A. haemolyticus)	2	0
Klebsiella pneumoniae	20	2 (10%)	1 (Ralstonia pickettii)	1	0
Acinetobacter baumannii-complex	26	2 (7.7%)	2 (A. hemolyticus, Cupriaviadus pauculus)	-	0
Salmonella spp.	10	N.v.t.			1 (10%)
					(E. coli)
Het complex van Enterobacter cloacae	8	N.v.t.			1 (12.5%)
					(E. coli)
Acinetobacter lwoffi	14	N.v.t.			1 (7.1%)
					(A. baumannii complex)
Sphingomonas paucimobilis	9	N.v.t.			1 (11.1%)
					(K. pneumoniae)
Afkortingen- n: teller, %: percentage, ID: identificatie, NA: niet van toepassing,
A: Acinetobacter, E: Escherichia, K: Klebsiella

Tabel 2: Bijzonderheden van grote en zeer ernstige fouten volgens het directe inoculumprotocol. Afkortingen: n = teller, % = procent, ID = identificatie, NA = niet van toepassing, A = Acinetobacter, E = Escherichia, K = Klebsiella.

Aanvullende tabel 1: Gedetailleerde resultaten van de identificatie van organismen in beide protocollen, samen met resultaten van fouten in het directe inoculumprotocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Met behulp van DIP zijn we erin geslaagd de RR-GN's te identificeren met een aanzienlijke diagnostische nauwkeurigheid. De gemiddelde TTI na positieve markering van aBC was slechts 507 min (~ 8,5 uur). Wanneer het dus wordt gedaan in combinatie met de EUCAST RAST-methode voor AST-bepaling, kan het isolaatidentificatie geven bij een AST-leestijd van 8 uur. Deze aanpak heeft het potentieel om de EUCAST RAST-methode te implementeren, waardoor identificatie op basis van massaspectrometrie overbodig wordt. Dit is een zegen voor instellingen met weinig middelen die de EUCAST RAST-methode in hun routineworkflow willen implementeren om de tijd voor klinische rapportage te verkorten en de belangrijkste obstakels voor de implementatie ervan te omzeilen.

Vóór de introductie van de EUCAST RAST-methode hebben meerdere auteurs de nauwkeurigheid van directe tests van +aBC voor verschillende aMIAST-systemen geëvalueerd 21,22,23,24,25,26,27,29,30,31. In deze onderzoeken verschilden de directe testprotocollen in het volgen van een enkele centrifugestap 29,30,31,32 of dubbele centrifugestap 21,22,24,25,26,27 voor het maken van de bacteriekorrel. In de eenstapsmethode werd het bloedbouillonmengsel van een +aBC met hoge snelheid gecentrifugeerd in een serumscheidingsbuis (SST) om de bacteriën boven de siliconengellaag te pelleteren. De korrel werd gebruikt om het inoculum voor te bereiden op de inoculatie van identiteitskaarten. Bij de dubbele centrifugatiemethode werd het bloedbouillonmengsel van een +aBC eerst met lage snelheid gecentrifugeerd in een SST om de bloedcellen eruit te pelleteren. Uit deze buis werd het supernatans bevattende bacteriën verwijderd en overgebracht naar een nieuwe buis en onderging een centrifugatie met hoge snelheid. Uit deze buis werd het supernatans weggegooid en werd de pellet gebruikt om de juiste identificatiekaarten te inoculeren. In deze onderzoeken varieerde het concordantiepercentage van 62%-100%, maar over het algemeen was de nauwkeurigheid hoger met de dubbele centrifugatiemethode.

We ontdekten dat de methode eenvoudig uit te voeren was en werd uitgevoerd in een routinematig diagnostisch laboratorium met een personeelsbestand van >10 laboranten bij toerbeurt, wat de robuustheid van de methode bewijst. In ~94% (98/105) +naBC's die een van de RR-GN's bevatten, identificeerde de DIP het micro-organisme correct. Het concordantiepercentage voor de verschillende categorieën organismen was ook vergelijkbaar met elkaar, aangezien ze respectievelijk 94%, 90%, 100% en 92.3% waren voor E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa en A. baumannii-complex. We ontdekten ook dat het totale concordantiepercentage voor gramnegatief suboptimaal was, ~77% (157/204). De meeste van deze verkeerde identificaties waren echter met niet-fermentatieve gram-negatieven zoals Acinetobacter spp. anders dan baumannii-complex, Pseudomonas spp. anders dan aeruginosa, Moraxella spp. en Sphingomonas paucimobilis, die meestal worden beschouwd als veel voorkomende verontreinigingen van de huid. Misidentificaties met niet-fermentatieve gram-negatieven werden ook opgemerkt door andere auteurs^21,23, wat waarschijnlijk te wijten is aan de lage reactiviteit van deze bacteriën in de aMIAST-identificatiekaarten.

We vonden een significante vermindering van TTI van bacteriën binnen de +naBC's met behulp van DIP. De mediane TTI van DIP was ongeveer 4 keer lager dan de mediane TTI van SIP (507 min versus 2171 min) wanneer het werd gedaan in een routinematig klinisch diagnostisch laboratorium. Deze TTI van ~8,5 uur omvatte ook het interval tussen positieve markering van aBC en de uitvoering van aMIAST-kaartinoculatie, aangezien de gemiddelde tijd om de analyse door aMIAST te isoleren slechts 5,45 uur ± 1,6 uur was. Door de gemiddelde tijd tot positiviteit van 728 minuten ± 301 minuten (~12 uur) voor concordante +naBC's in onze studie op te tellen, heeft deze benadering van bacteriële identificatie het potentieel om dezelfde dag te rapporteren na ontvangst van de aBC in een routinematig diagnostisch laboratorium.

Er zijn ook bepaalde beperkingen met de DIP. Ten eerste, aangezien het een off-label gebruik van entmateriaal is, moeten de resultaten als voorlopig worden beschouwd en dat geldt ook voor de AST-resultaten van EUCAST RAST. Desalniettemin dient het het belangrijkste doel om alleen de RR-GN's met een aanzienlijke diagnostische nauwkeurigheid tijdig te identificeren. Ten tweede is er een praktische mogelijkheid van verspilling van testmiddelen, zoals bij ongeveer 60% +naBC's; we zouden niet hebben kunnen rapporteren vanwege polymicrobiële infecties of identificatie van een niet-RRGN. Deze verspilling van middelen is van toepassing op alle nieuwere geautomatiseerde directe AST-methoden voor bloedculturen. Ten derde was het aantal polymicrobiële infecties en de identificatie van veel voorkomende huidverontreinigingen hoger in deze studie als gevolg van slechte praktijken voor het verzamelen van monsters. Ten vierde hebben we de identiteit van de geteste isolaten niet bevestigd met massaspectrometrie, wat de huidige gouden standaard is voor bacteriële identificatie.

Deze studie stelt met succes vast dat het zelfs met fenotypische tests mogelijk is om positieve bloedculturen op dezelfde dag te rapporteren, vooral bij gramnegatieve bacteriëmie. Dit heeft het potentieel om de duur van het starten van geschikte antimicrobiële therapie in de LMIC's aanzienlijk te verkorten, waar de microbiologische diagnostiek voor bacteriële identificatie en ASAT sterk afhankelijk is van conventionele fenotypische tests. Deze aanpak moet worden gevalideerd door een multicentrisch onderzoek uit te voeren, en de mogelijke impact ervan op de patiëntresultaten, en als een antimicrobieel beheersinstrument moet de focus zijn voor toekomstige klinische onderzoeken in LMIC's.

Tot slot vormt DIP voor aMIAST een aanvulling op de EUCAST RAST-methode om een vroege identificatie van RR-GN's mogelijk te maken. Dit maakt het overbodig om te vertrouwen op geavanceerde microbiële identificatie- en AST-technieken, aangezien de tijd om met deze benaderingen te rapporteren vergelijkbaar is met deze aanpak. In het geval van gramnegatieve bacteriën is rapportage op dezelfde dag haalbaar met conventionele fenotypische methoden, als ze maximaal worden geoptimaliseerd. Dit heeft het potentieel om de duur van breedspectrum antimicrobiële behandeling te verkorten en antimicrobieel beheer te vergemakkelijken in omgevingen met beperkte middelen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli