Dit protocol beschrijft de gedetailleerde stappen voor het voorbereiden van netvliesmonsters voor volume-elektronenmicroscopie, met de nadruk op de structurele kenmerken van retinale fotoreceptorterminals.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding van netvliesmonsters voor volume-elektronenmicroscopie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Volume-elektronenmicroscopie (Volume EM) is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van de 3D-structuur van cellen en weefsels met precisie op nanometerniveau. Binnen het netvlies brengen verschillende soorten neuronen synaptische verbindingen tot stand in de binnenste en buitenste plexiforme lagen. Hoewel conventionele EM-technieken waardevolle inzichten hebben opgeleverd in subcellulaire organellen van het netvlies, ligt hun beperking in het verstrekken van 2D-beeldgegevens, wat nauwkeurige metingen kan belemmeren. Het kwantificeren van de grootte van drie verschillende synaptische blaasjespoelen, cruciaal voor synaptische transmissie, is bijvoorbeeld een uitdaging in 2D. Volume EM biedt een oplossing door grootschalige, hoge resolutie 3D-data aan te bieden. Het is vermeldenswaard dat monstervoorbereiding een cruciale stap is in Volume EM, wat een aanzienlijke invloed heeft op de helderheid en het contrast van het beeld. In deze context schetsen we een protocol voor de voorbereiding van monsters voor de 3D-reconstructie van fotoreceptor-axonuiteinden in het netvlies. Dit protocol omvat drie belangrijke stappen: netvliesdissectie en -fixatie, processen voor het inbedden van monsters en selectie van het interessegebied.
Inleiding
Het netvlies is dicht opeengepakt met met elkaar verstrengelde neuronale axonen en dendrieten die synapsen tussen hen vormen1. Microscopie is een onmisbaar hulpmiddel bij het bestuderen van de anatomie van het netvlies, omdat het fijne, ingewikkelde en kleine structuren heeft. Hoewel elektronenmicroscopie (EM) een ongeëvenaard vermogen biedt om de ultrastructuur van subcellulaire organellen en de nauwkeurige lokalisatie van specifieke eiwitten op nanometerniveau2 te onderzoeken, produceert het beelden die beperkt zijn tot het tweedimensionale (2D) vlak, wat leidt tot mogelijk verlies van belangrijke informatie.
De ontwikkeling van opkomende technieken voor volume-elektronenmicroscopie met hoge resolutie (Volume EM) ondersteunt de verstrekking van uitgebreidere en grootschaligere driedimensionale (3D) structurele informatie. Sommige 3D EM-methoden zijn onlangs beoordeeld door andere 3,4,5. 3D EM maakt de reconstructie van neuronale vorm- en connectiviteitsdetails mogelijk, waardoor nauwkeurige kwantitatieve analyse van interessante structuren mogelijk is. Dit toont aan dat de gegevens die door volume EM worden verkregen, systematischer, vollediger en nauwkeuriger zijn.
Retinale fotoreceptoren, die de initiële neuronen vormen in visuele signalering 6,7, brengen synapsen tot stand met dendrieten van bipolaire en horizontale cellen van de tweede orde in de terminal van de fotoreceptor om exciterende signalen te vergemakkelijken 8,9. Deze terminals, aangeduid als kegelsteeltjes en staafbolletjes, omvatten drie cruciale componenten: mitochondriën, synaptische linten en synaptische blaasjes. Hoewel eerdere studies zich voornamelijk hebben geconcentreerd op de algemene structuur van lintsynapsen, is er een opmerkelijke afwezigheid van onderzoek naar de fijne structuur van belangrijke componenten, waaronder mitochondriën, lint, blaasjespoelen en hun ruimtelijke organisatie in terminals 10,11,12,13. Een nauwkeurige en systematische analyse van elke component, samen met een goed begrip van hun onderlinge associatie binnen fotoreceptorterminals, is van vitaal belang voor het ontrafelen van de ruimtelijke organisatie en het volledig begrijpen van visuele verwerkingsfuncties. In fotoreceptoren zijn mitochondriën voornamelijk aanwezig in het binnenste segment, het cellichaam en het terminale. We concentreerden ons hier op de mitochondriën in de terminale fotoreceptoren. Gefocusseerde ionenbundelscanning-elektronenmicroscopie (FIB-SEM), een type volume-EM met een hoge resolutie (x-, y- en z-resolutie < 5 nm) en een relatief grote volumeflux 4,14, staat als een krachtig hulpmiddel voor het nauwkeurig visualiseren van de 3D-structuur van fotoreceptorterminals.
Zowel FIB-SEM als de Serial Block Face Scanning Electron Microscope (SBF-SEM) zijn Volume EM gebaseerd op SEM voor het verkrijgen van het beeld van weefsels door het oppervlak van het monster te scannen. De ultrastructurele kenmerken van het oppervlak van een monster worden onthuld door het contrast dat wordt gecreëerd door de intensiteit van secundaire of terugverstrooide elektronen (BSE) wanneer de elektronenbundel het monster scant15. In wezen maakt het detecteren van BSE of secundaire elektronen uit de dwarsdoorsnede van een in hars ingebed weefselmonster in SEM het mogelijk om beelden van het ingebedde monster te verkrijgen16,17. Wanneer BSE of secundaire elektronen minder worden gegenereerd, kan alleen informatie over het oppervlak van het monster worden verkregen. Het bereiken van een consistent contrast en seriële beelden van hoge kwaliteit vereist voldoende afzetting van zware metalen in het monster. Daarom zijn specifieke protocollen voor monstervoorbereiding cruciaal voor latere segmentatie, 3D-reconstructie en analyse bij het gebruik van SEM voor seriële beeldvorming. De osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO)-methode is een typisch monstervoorbereidingsschema voor 3D-elektronenmicroscopie van biologische monsters, waarbij de structuur van lipidebevattende membranen behouden blijft en een goed contrast behoudenblijft 18,19.
Hier ontwikkelden we de OTO-methode voor de voorbereiding van netvliesmonsters voor het gebruik van Volume EM. Dit proces richt zich met name op het ontleden van het netvlies, het bepalen van de optimale fixatietijd voor netvliesweefsel en het gedetailleerd beschrijven van de specifieke procedures en voorzorgsmaatregelen bij de voorbereiding van 3D-monsters. Bovendien zijn segmentatie en 3D-reconstructie van de doelstructuur integrale stappen in deze uitgebreide toepassing. Het netvlies, een kleine en uitdagende structuur om materialen uit te verkrijgen, vereist snelle en nauwkeurige operaties voor EM, met vaste tijden en verse reagentia die zijn voorbereid voor onmiddellijk gebruik.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De protocollen voor dierverzorging en -gebruik werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Wenzhou Medical University en volgden de richtlijnen die waren opgesteld door de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO). Alle muizen werden gehouden in een 12-uurs licht- en 12-uurs donkercyclus en kregen een standaard chow-dieet.
1. Ontleding en fixatie van het netvlies
- Verdoof de muizen (C57BL/6J, man, 8 weken oud, 20-25 g) door 2,2,2-tribroomethanol (0,25 mg/g lichaamsgewicht) intraperitoneaal te injecteren. Bevestig de diepte van de verdoving door de achterste poot niet terug te trekken na het knijpen van de teen of door niet te knipperen. Ontwricht vervolgens de halswervel terwijl u nog onder narcose bent om het dier te euthanaseren.
OPMERKING: Tribroomethanol werd gekozen vanwege de goed gedocumenteerde werkzaamheid bij het induceren van snelle en betrouwbare anesthesie in kleine diermodellen, met name voor kortdurende procedures. Hoewel anesthetica van farmaceutische kwaliteit de voorkeur hebben, biedt tribroomethanol specifieke voordelen in bepaalde protocollen, waardoor het een geschikt alternatief is als het op de juiste manier wordt bereid en toegediend. Alle voorzorgsmaatregelen zijn genomen om een veilig en effectief gebruik ervan te garanderen. Deze studie houdt zich aan ethische overwegingen door te zorgen voor een goede voorbereiding, toediening en monitoring om mogelijke risico's in verband met het gebruik ervan te beperken. - Verwijder de ogen met een gebogen schaar en dompel de ogen onder in een gemengde oplossing met 2% glutaaraldehyde en 2% paraformaldehyde in fosfaatbuffer (PB, 0,1 M, pH 7,4).
- Verwijder het voorste segment en het glasvocht van de ogen met een pincet onder de ontleedmicroscoop.
- Schil de sclera met de twee tangen totdat het netvlies volledig is geïsoleerd van de oogschelp.
- Snijd het netvlies snel in stroken van 100 - 200 μm dik met een scheermes en behandel de netvliesstrips met een pasteurpipet in een nieuw microcentrifugebuisje (EP) met 2% glutaaraldehyde en 2% paraformaldehyde in fosfaatbuffer (PB, 0,1 M, pH 7,4) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) op de rotator. Plaats na voltooiing de buizen om ze gedurende 24 uur bij 4 °C te fixeren.
2. Voorbeeld inbeddingsproces
- Na 5 keer gedurende 15 minuten in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer (pH 7,4) te hebben gewassen, incubeer de netvliesstrips met een oplossing met 1,5% kaliumferrocyanide en 1% OsO4 (in PB, pH7,4) in 0,1 M natriumcacodylaat met 4 mM CaCl2 gedurende 1,5 uur in het donker op ijs.
OPMERKING: Donkere incubatie en gebrek aan fosfaat kunnen neerslag en artefacten in het monster voorkomen. - Was de netvliesstrips 3 keer in ddH2O gedurende elk 10 minuten en behandel vervolgens met 1% thiocarbohydrazide in ddH2O gedurende 30 minuten in het donker bij RT.
- Na 3 keer 15 minuten in ddH2O te hebben gespoeld, incubeer je de retinastrips in 2% OsO4 (in PB, PH 7,4) gedurende 45 minuten in het donker bij RT.
- Na 3 keer 15 minuten wassen in ddH2Ö, dompelt u de retinastrips een nacht onder in 1% waterig uranylacetaat in het donker bij 4 °C.
- De volgende dag, na 3 keer wassen in ddH2Ö gedurende 15 minuten elk, de netvliesstrips behandelen met 0,66% loodnitraat in L-asparaginezuur (0,03 M, pH 5,5) gedurende 40 minuten bij 65 °C.
- Na 3 keer 15 minuten wassen in ddH2O, dehydrateert u de netvliesstrips met een oplopende ethanolconcentratie van 30%, 50%, 70%, 90% en 100% gedurende 20 minuten in elke oplossing.
- Behandel netvliesstrips met een gemengde oplossing met gelijke ethanol en aceton gedurende 20 minuten, gevolgd door een acetonwasbeurt 2 keer gedurende 20 minuten elk.
- Infiltreer de netvliesstrips in aceton/hars gemengd in een verhouding van 7:3 in het donker bij RT 's nachts en vervolgens aceton/hars in 3:7 in het donker gedurende 24 uur bij RT.
OPMERKING: De precieze samenstelling van de hars is als volgt: Epon812 10,06 ml, DDSA 4 ml, MNA 5,94 ml en DMP-30 0,2 ml. - Vervang de buisjes de volgende dag en infiltreer de netvliesstrips met zuivere hars gedurende 24 uur bij 45 °C. Vervang de hars de volgende dag opnieuw en veranker de netvliesstrips gedurende 48 uur bij 60 °C.
NOTITIE: Het doel van het verhogen van de temperatuur is om de penetratie te verbeteren.
3. Selectie van het interessegebied
- Snijd de harsblokken in secties van 1 μm dik, beits secties met 1% toluïdineblauw en observeer de algemene structuur van het netvlies onder lichtmicroscopie om de ruwe gebieden van belang te selecteren.
- Smeer de harsblokken in met platina met behulp van een sputtercoater, gevolgd door frezen met een 70 nm dikke doorsnede met behulp van een gefocusseerde ionenbundel scanning-elektronenmicroscopie onder een stroom van 0,23 nA en een versnellingsspanning van 30 kV.
- Screen de sectie vooraf met behulp van FIB-SEM met een vergroting van 2000x om de precieze interessegebieden te identificeren.
- Verzamel de gegevens met behulp van FIB-SEM met een bundelstroom van 0,69 nA en een versnellingsspanning van 2 kV. De andere parameters zijn als volgt: verblijftijd = 2 μs, voxelgrootte = 1,8 nm x 1,8 nm x 15 nm.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1A toont het beeld van retinale fotoreceptorterminals die zijn bereid met behulp van de traditionele chemische dubbele fixatiemethode, en Figuur 1B toont het beeld van retinale fotoreceptorterminals die zijn bereid met behulp van de OTO-methode. Beide werden bemonsterd door FIB-SEM. Het is duidelijk te zien dat de celmembraanstructuur zoveel mogelijk behouden kan blijven door gebruik te maken van de OTO-methode, en zelfs ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben het Volume EM-monstervoorbereidingsprotocol van de OTO geïmplementeerd om de terminale structuur van de fotoreceptoren in netvliesweefsel te analyseren. De focus lag op het detailleren van de hele procedure, beginnend bij het losmaken en fixeren van het netvlies tot het presenteren van de resultaten van 3D-reconstructie van fotoreceptor-axonterminals.
Het onderscheidende kenmerk van netvliesweefsel, in tegenstelling tot hersenweefsel, ligt in het ont...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen openbaarmakingen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China (2022YFA1105503), State Key Laboratory of Neuroscience (SKLN-202103), Zhejiang Natural Science Foundation of China (Y21H120019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| Amira 6.8 | Thermo Fisher Scientific | ||
| CaCl2 | Sigma | C-2661 | |
| Inbeddingsvorm | Beijing Zhongjingkeyi Technology | GP10590 | |
| Epon-hars | Electron Microscopy Science | 14900 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| Helios NanoLab 600i dual-beam SEM | FEI | ||
| L-asparaginezuur | Sigma | 56-84-8 | |
| Lodzijn | Sigma | 10099-74-8 | |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | Een component van fosfaatbuffer |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | 71507 | Een component van fosfaatbuffer |
| OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Kaliumferrocyanide | Sigma | 14459-95-1 | |
| Natriumcacodylaat | Sigma | 6131-99-3 | |
| Sputterschild | Leica | ACE200 | |
| Thiocarbohydrazide | Sigma | 2231-57-4 | |
| Uranylacetaat | TED PELLA | CA96049 |
Referenties
- Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).
- Harris, J. R. Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey. Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).
- Varsano, N., Wolf, S. G. Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions. Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).
- Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Sterling, P., Matthews, G. Structure and function of ribbon synapses. Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).
- Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. Synaptic transmission at retinal ribbon synapses. Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).
- Thoreson, W. B. Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina. Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).
- Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
- Schmitz, F. The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do. Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).
- Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons. J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).
- Zampighi, G. A., et al. Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion. PLoS One. 6 (3), e16944(2011).
- Barnes, S., et al. Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs. Plos One. 11 (3), e0150024(2016).
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, e25916(2017).
- Crewe, A. V., Lin, P. S. The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope. Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).
- Richards, R. G., Gwynn, I. A. Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy. J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).
- Wergin, W. P., et al. Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope. Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).
- Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).
- Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy. Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).
- Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
- Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits. Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).
- Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Front Neural Circuits. 12, 98(2018).
- Guo, J., et al. An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM. J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH). J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
