Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Reconstitutie van het bacteriële glutamaatreceptorkanaal door inkapseling van een celvrij expressiesysteem

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66595

⸱

8 maart 2024

 ,  , 
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de omgekeerde emulsiemethode die wordt gebruikt om een celvrije expressie (CFE) -systeem in te kapselen in een gigantisch unilamellair blaasje (GUV) voor het onderzoek naar de synthese en incorporatie van een modelmembraaneiwit in de lipidedubbellaag.

Samenvatting

Celvrije expressie (CFE)-systemen zijn krachtige hulpmiddelen in de synthetische biologie die biomimicry van cellulaire functies zoals biosensing en energieregeneratie in synthetische cellen mogelijk maken. Reconstructie van een breed scala aan cellulaire processen vereist echter een succesvolle reconstructie van membraaneiwitten in het membraan van synthetische cellen. Hoewel de expressie van oplosbare eiwitten meestal succesvol is in gangbare CFE-systemen, is de reconstitutie van membraaneiwitten in lipidedubbellagen van synthetische cellen een uitdaging gebleken. Hier wordt een methode gedemonstreerd voor reconstitutie van een modelmembraaneiwit, bacteriële glutamaatreceptor (GluR0), in gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) als modelsynthetische cellen op basis van inkapseling en incubatie van de CFE-reactie in synthetische cellen. Door gebruik te maken van dit platform wordt het effect aangetoond van het vervangen van het N-terminale signaalpeptide van GluR0 door proteorhodopsine signaalpeptide op succesvolle cotranslationele translocatie van GluR0 in membranen van hybride GUV's. Deze methode biedt een robuuste procedure die celvrije reconstitutie van verschillende membraaneiwitten in synthetische cellen mogelijk maakt.

Inleiding

Bottom-up synthetische biologie heeft de afgelopen tien jaar steeds meer belangstelling gekregen als een opkomend veld met tal van potentiële toepassingen in bio-engineering, medicijnafgifte en regeneratieve geneeskunde 1,2. Met name de ontwikkeling van synthetische cellen als hoeksteen van bottom-up synthetische biologie heeft een breed scala aan wetenschappelijke gemeenschappen aangetrokken vanwege de veelbelovende toepassingen van synthetische cellen en hun celachtige fysische en biochemische eigenschappen die in vitro biofysische studies vergemakkelijken 3,4,5,6 . Synthetische cellen worden vaak gemanipuleerd in gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) ter grootte van een cel waarin verschillende biologische processen worden nagebootst. Reconstitutie van celcytoskelet 7,8, lichtafhankelijke energieregeneratie9, cellulaire communicatie10,11 en biosensing12 zijn voorbeelden van inspanningen die zijn geleverd om celachtig gedrag in synthetische cellen te reconstrueren.

Hoewel sommige cellulaire processen afhankelijk zijn van oplosbare eiwitten, maken veel kenmerken van natuurlijke cellen, zoals detectie en communicatie, vaak gebruik van membraaneiwitten, waaronder ionkanalen, receptoren en transporters. Een grote uitdaging bij de ontwikkeling van synthetische cellen is de reconstitutie van membraaneiwitten. Hoewel traditionele methoden voor membraaneiwitreconstitutie in lipidedubbellagen afhankelijk zijn van detergent-gemedieerde zuivering, zijn dergelijke methoden arbeidsintensief, ineffectief voor eiwitten die giftig zijn voor de expressiegastheer, of zijn ze vaak niet geschikt voor membraaneiwitreconstitutie in GUV's13.

Een alternatieve methode voor eiwitexpressie zijn celvrije expressie (CFE) systemen. CFE-systemen zijn een krachtig hulpmiddel geweest in de synthetische biologie dat in vitro expressie van verschillende eiwitten mogelijk maakt met behulp van cellysaat of gezuiverde transcriptie-translatiemachines14. CFE-systemen kunnen ook worden ingekapseld in GUV's, waardoor gecompartimenteerde eiwitsynthesereacties mogelijk zijn die kunnen worden geprogrammeerd voor verschillende toepassingen, zoals de creatie van lichtoogstende synthetische cellen9 of mechanosensitieve biosensoren15,16. Analoog aan recombinante eiwitexpressiemethoden is de expressie van membraaneiwitten een uitdaging in CFE-systemen17. Aggregatie, misvouwing en gebrek aan posttranslationele modificatie in CFE-systemen zijn belangrijke knelpunten die een succesvolle membraaneiwitsynthese met behulp van CFE-systemen in de weg staan. De moeilijkheid van bottom-up membraaneiwitreconstitutie met behulp van CFE-systemen is deels te wijten aan de afwezigheid van een complexe membraaneiwitbiogeneseroute die berust op signaalpeptiden, signaalherkenningsdeeltjes, translocons en chaperonneringsmoleculen. Onlangs hebben meerdere onderzoeken echter gesuggereerd dat de aanwezigheid van vliezige structuren zoals microsomen of liposomen tijdens de translatie een succesvolle membraaneiwitexpressie bevordert 18,19,20,21. Bovendien hebben Eaglesfield et al. en Steinküher et al. ontdekt dat de opname van specifieke hydrofobe domeinen, bekend als signaalpeptiden, in de N-terminus van het membraaneiwit de expressie ervan aanzienlijk kan verbeteren22,23. Al met al suggereren deze studies dat de uitdaging van membraaneiwitreconstitutie in synthetische cellen kan worden overwonnen als de eiwittranslatie plaatsvindt in aanwezigheid van het GUV-membraan en als het juiste N-terminale signaalpeptide wordt gebruikt.

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het inkapselen van de eiwitsynthese met behulp van recombinante elementen (PURE) CFE-reacties voor membraaneiwitreconstitutie in GUV's. Bacteriële glutamaatreceptor24 (GluR0) wordt geselecteerd als het modelmembraaneiwit en het effect van zijn N-terminale signaalpeptide op zijn membraanreconstitutie wordt bestudeerd. Het effect van proteorhodopsine-signaalpeptide, waarvan door Eaglesfield et al.22 werd aangetoond dat het de efficiëntie van de reconstitutie van membraaneiwitten verbetert, wordt onderzocht door een gemuteerde variant van GluR0 te construeren die wordt aangeduid als PRSP-GluR0 en de expressie en membraanlokalisatie ervan met wildtype GluR0 (hierna WT-GluR0 genoemd) dat zijn oorspronkelijke signaalpeptide herbergt, wordt vergeleken. Dit protocol is gebaseerd op de omgekeerde emulsiemethode25 met aanpassingen die het robuust maken voor CFE-inkapseling. In de gepresenteerde methode worden de CFE-reacties eerst geëmulgeerd met behulp van een lipide-in-olie-oplossing die druppeltjes ter grootte van een micron genereert die het CFE-systeem bevatten en worden gestabiliseerd door de lipidemonolaag. De emulsiedruppels worden vervolgens gelaagd op een olie-waterinterface die verzadigd is met een andere lipide-monolaag. De emulsiedruppels worden vervolgens via middelpuntvliedende kracht over het olie-watergrensvlak gedreven. Door dit proces krijgen de druppels een andere monolaag, waardoor een dubbellaags lipideblaasje ontstaat. De GUV's die de CFE-reactie bevatten, worden vervolgens geïncubeerd, waarbij het membraaneiwit tot expressie wordt gebracht en in het GUV-membraan wordt opgenomen. Hoewel dit protocol is gespecificeerd voor celvrije expressie van GluR0, kan het worden gebruikt voor celvrije synthese van andere membraaneiwitten of verschillende synthetische celtoepassingen zoals cytoskeletreconstitutie of membraanfusiestudies26.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De reagentia en apparatuur die voor dit onderzoek zijn gebruikt, zijn opgenomen in de materiaaltabel.

1. Bulk CFE-reacties in aanwezigheid van kleine unilamellaire blaasjes (SUV's)

  1. SUV voorbereiding
    NOTITIE: Deze stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast volgens de veiligheidsinstructies voor het werken met chloroform.
    1. Bereid 5 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC) SUV's in een glazen injectieflacon door 76 μl 25 mg/ml POPC-bouillonoplossing opgelost in chloroform over te brengen.
    2. Terwijl u de glazen injectieflacon voorzichtig ronddraait, blaast u een zachte stroom argon in de injectieflacon om op de bodem een film van gedroogde lipiden te vormen. Breng vervolgens de glazen injectieflacon over naar een exsiccator met de dop losjes geschroefd om overtollige chloroform te verdampen.
    3. Bewaar de glazen injectieflacon 1 uur in de exsiccator . Voeg vervolgens 0,5 ml ultrazuiver gedeïoniseerd water toe om de lipidenfilm en de draaikolk gedurende ongeveer 2 minuten op te lossen.
    4. Zet een mini-extrusieapparaat op door twee filtersteunen in gedeïoniseerd water te weken en ze op elk van de interne membraansteunen te plaatsen. Week vervolgens een polycarbonaatfilter van 100 nm en plaats deze tussen de twee interne membraansteunen die bij elkaar worden gehouden door de buitenmantel van de extruder en de borgmoer. Plaats deze opstelling in de extruderstandaard.
    5. Spoel twee gasdichte spuiten van 1 ml 3 keer door met ultrazuiver gedeïoniseerd water.
    6. Plaats het monster van het lipide-watermengsel in een van de gasdichte spuiten van 1 ml en plaats het in het ene uiteinde van de mini-extruder met behulp van de zwenkarmclips om de spuit op zijn plaats te houden. Steek de tweede spuit in het andere uiteinde van de mini-extruder en zorg ervoor dat deze volledig is ingedrukt.
      OPMERKING: Wanneer u de spuit laadt met het lipide-watermengsel, zorg er dan voor dat er geen lucht in de spuit zit voordat u deze door de mini-extruder haalt.
    7. Haal het lipide-watermengsel voorzichtig van de originele spuit naar de lege spuit door het mini-extruderapparaat. Herhaal deze stap 11 keer om SUV's te vormen. Breng de SUV's over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      OPMERKING: De SUV-oplossing kan maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
  2. Assemblage van de CFE-reactie
    1. Assembleer de CFE-reactie volgens het protocol voor celvrije expressie dat door de fabrikant is verstrekt, met kleine wijzigingen die hieronder worden beschreven.
    2. Meng 10 μl oplossing 1 (met aminozuren, NTP's, tRNA's en substraten voor enzymen, en de benodigde buffer), 1 μl oplossing 2 (eiwitten in 20% glycerol), 2 μl oplossing 3 (ribosoom (20 μM)), de juiste hoeveelheid DNA die codeert voor oplosbaar sfGFP-sfCherry(1-10)27 (hierna oplosbaar sfGFP genoemd), WT-GluR0-sfGFP of PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 basenparen), 1 μL muizen-RNAseremmer en 4 μL 5 mM SUV-oplossing voor membraaneiwitten of 4 μL water voor oplosbare eiwitten.
    3. Breng het uiteindelijke volume van de reactie op 20 μL door ultrazuiver gedeïoniseerd water toe te voegen.
      OPMERKING: Bij de montage van het CFE-systeem moeten alle onderdelen op ijs worden bewaard. Alle materialen zijn temperatuurgevoelig en kunnen degraderen als ze op kamertemperatuur komen.
  3. Incubatie en monitoring van CFE-reacties
    1. Breng de CFE-oplossing over naar een conische V-bodemplaat met 96 putjes. Om verdamping tijdens de reactie te voorkomen, dekt u de plaat af met een afdichtingsfolie.
    2. Incubeer de plaat bij 37 °C in een plaatlezer gedurende 4-5 uur terwijl u de CFE-reactie bewaakt door het GFP-signaal te meten met een versterking van 100 bij 488 nm/528 nm excitatie-/emissiegolflengten om de 2 minuten.

2. CFE-reacties ingekapseld in GUV's

  1. Bereiding van GUV buitenste bufferoplossing
    1. Meng in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml 1,5 μl 1 M spermidine, 37,5 μl 100 mM ATP, 25 μl 100 mM GTP, 12,5 μl 100 mM CTP, 12,5 μL 100 mM UTP, 25 μL 1 M creatinefosfaat, 18 μL 1 M magnesiumacetaat, 93,33 μL 3 M kaliumglutamaat, 50 μL 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μL 332 mM folinezuur, 100 μL 2 M glucose en 50 μL uit bouillonoplossing van 6 mM mengsel van elk van de 20 aminozuren (bereid volgens het protocol beschreven door Sun et al.28).
    2. Breng het uiteindelijke volume van de oplossing op 1 ml door ultragezuiverd gedeïoniseerd water toe te voegen.
      NOTITIE: Alle onderdelen moeten op ijs worden bewaard. Voeg het aminozuurmengsel aan het einde toe om uitputting van aminozuren te voorkomen28. De oplossing kan worden gealiquoteerd in aliquots van 330 μl en tot gebruik worden bewaard bij -20 °C.
  2. Bereiding van het lipide-in-oliemengsel
    OPMERKING: deze stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast volgens de veiligheidsinstructies voor het werken met chloroform.
    1. Meng in een zuurkast 17,3 μl 25 mg/ml POPC-bouillonoplossing en 1,08 μl 50 mg/ml poly(butadieen)-b-poly(ethyleenoxide) (PEO-b-PBD) copolymeer in een glazen injectieflacon van 15 ml.
      OPMERKING: De uiteindelijke lipide-in-olie-oplossing bevat 0,5 mM lipide met respectievelijk 95% en 5% POPC en PEO-b-PBD. PEO-b-PBD werd gebruikt om de stabiliteit van het membraan tijdens eiwitexpressie te verbeteren, maar werd op een lage molaire verhouding gehouden om de neiging van het copolymeer om te aggregeren tot micellen die gescheiden zijn van lipidemoleculen te verminderen29,30.
    2. Blaas voorzichtig een zachte stroom argongas in de glazen injectieflacon terwijl u de injectieflacon draait om de chloroform te verdampen.
    3. Pipetteer 1,2 ml lichte minerale olie in de glazen injectieflacon van 15 ml met de gedroogde lipiden.
    4. Meng de lipiden en olie door 10-20 s op maximale snelheid te vortexen. De opgeloste lipide-copolymeermix ziet er troebel uit.
    5. Om ervoor te zorgen dat alle mogelijke lipideaggregaten in de olie volledig zijn opgelost en door de olie zijn gedispergeerd, plaatst u de glazen injectieflacon gedurende 20 minuten in een oven op ongeveer 50 °C voordat u nog eens 10-20 s op maximale snelheid vortexeert.
  3. Assemblage en inkapseling van de CFE-reactie (figuur 1 vat de volgende stappen samen).
    1. Bereid 300 μl van de GUV-buitenoplossing in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml door 270 μl CFE-buitenbufferoplossing bereid in stap 2.1, 15 μl 5 M NaCl en 15 μl 4,5 M KCl te mengen.
      OPMERKING: Voeg bij deze stap 0,45 μl 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) toe aan de GUV-buitenoplossing. Het doel van het toevoegen van NaCl en KCl is om de osmolaliteit van de buitenoplossing aan te passen aan deze af te stemmen op de binnenste CFE-oplossing. Het exacte volume van NaCl en KCl is afhankelijk van de gewenste osmolaliteitsaanpassing. Men kan NaCl of KCl of beide toevoegen om de osmolaliteit aan te passen.
    2. Pipetteer voorzichtig 300 μL lipide-in-oliemengsel bovenop de GUV-buitenoplossing.
      OPMERKING: Bij het toevoegen van de lipide-oliemix is het belangrijk dat de olie zich niet vermengt met de waterige buitenoplossing. Na de toevoeging moet er een zichtbaar raakvlak zijn tussen het lipide-in-oliemengsel en de GUV-buitenoplossing.
    3. Incubeer het olie-watergrensvlak bij kamertemperatuur gedurende 2 uur om de lipide-monolaag te laten vormen en stabiliseren op het grensvlak.
    4. Volg ondertussen paragraaf 1.2.1 om een CFE-reactie samen te stellen die het plasmide-DNA bevat dat codeert voor de membraaneiwitvarianten of oplosbaar GFP. Vervang de 4 μL 5 mM SUV-oplossing of water door 4 μL 1 M sucrose. Deze reactie zal de GUV inwendige oplossing zijn.
      OPMERKING: Een osmometer werd gebruikt om de osmolaliteit van de binnen- en buitenoplossingen te meten. De osmolaliteit van de buitenoplossing werd vervolgens dienovereenkomstig aangepast door toevoeging van NaCl of water. De osmolaliteit van de CFE-reactie ligt doorgaans rond de 1600 mOsm/Kg. Door sucrose aan de reactie toe te voegen, wordt de dichtheid van de inwendige oplossing verhoogd, waardoor de blaasjes tijdens de centrifugatiestap over het olie-watergrensvlak kunnen bewegen. Een alternatief voor sucrose is de Opti-Prep dichtheidsgradiëntoplossing.
    5. Voeg 600 μL lipide-oliemengsel toe aan de microcentrifugebuis met de CFE-reactie en pipetteer krachtig op en neer gedurende ~1 minuut om de reactie in lipide-in-olie-oplossing te emulgeren en de lipide-monolaag rond synthetische cellen te vormen.
      OPMERKING: De uiteindelijke oplossing mag geen luchtbellen bevatten en moet er ondoorzichtig uitzien.
    6. Pipeteer de emulsie van de binnenoplossing voorzichtig op de olielaag in de microcentrifugebuis van 1,5 ml waarin de olie-waterinterface is ingesteld.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de interface niet verstoort of destabiliseert.
    7. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2.000 x g bij 4 °C.
      OPMERKING: De centrifugatiesnelheid is geoptimaliseerd voor dit protocol. Adir et al.31 rapporteerden een andere centrifugatiesnelheid.
    8. Zodra het centrifugeren is voltooid, verwijdert u voorzichtig de overtollige olie en de buitenoplossing uit de microcentrifugebuis met behulp van een pipettor. Verwijder de buitenoplossing tot het resterende volume ongeveer 100 μl is.
      OPMERKING: Een pellet GUV's is meestal zichtbaar op de bodem van de microcentrifugebuis. Een gebrek aan een zichtbare korrel betekent echter niet noodzakelijkerwijs geen GUV-opbrengst. In plaats van een pipettor te gebruiken, kan de overtollige olie bovenop de buitenste oplossing worden verwijderd door aspiratie. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de lipide-in-olie-oplossing volledig wordt verwijderd. Olieverontreiniging in de GUV-oplossing kan afbeeldingen van lage kwaliteit veroorzaken.
    9. Resuspendeer de GUV-pellet in de resterende 100 μL-oplossing door voorzichtig op en neer te pipetteren. Breng vervolgens de GUV-oplossing over naar een schone, doorzichtige vlakke bodemplaat met 96 putjes om te incuberen.

3. Incubatie en beeldvorming van ingekapselde CFE-reacties

  1. Dek de plaat af met een afdichtingsfolie om verdamping te voorkomen. Incubeer de plaat 5-6 uur bij 37 °C. Men kan een plaatlezer gebruiken en stap 1.3.2 volgen om de plaatlezer voor te bereiden op de incubatiestap.
  2. Zodra de incubatie voorbij is, plaatst u de plaat met 96 putjes op de beeldvormingstafel van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een EMCCD-camera (of een sCMOS-camera), DAQ-MX-gestuurde laser (of een geïntegreerd lasercombinersysteem) en een CSU-X1 draaiende schijf confocaal (of een confocale laserscanning). Stel u scherp op elke ROI die GUV's bevat en leg beelden vast met een excitatiegolflengte van 488 nm met behulp van een Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA-objectief.
  3. Sla afbeeldingen van GUV's op in .tiff formaat.
  4. Open de afbeeldingen in een beeldverwerkingssoftware (bijv. ImageJ of Fiji). Open het instellingenpaneel voor helderheid/contrast . Pas de helderheid en het contrast aan de juiste instellingen aan die fluorescerende eiwitten zichtbaar maken.
  5. Als het doel is om de signaalintensiteit van verschillende tot expressie gebrachte eiwitten te vergelijken, stapel dan eerst individuele afbeeldingen van GUV's die verschillende eiwitten bevatten met behulp van het deelvenster Afbeeldingen om te stapelen onder het submenu Afbeelding > stapels . Pas vervolgens de helderheid en het contrast van alle afbeeldingen aan met behulp van het paneel Helderheid/contrast .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voorafgaand aan de inkapseling van de CFE-reacties werden twee varianten van GluR0-sfGFP die native- en proteorhodopsine-signaalpeptiden herbergden (signaalpeptidesequenties worden weergegeven in aanvullende tabel 1), en het oplosbare sfGFP werden individueel tot expressie gebracht in bulkreacties, en hun expressie werd gecontroleerd door het sfGFP-signaal te detecteren met behulp van een plaatlezer (Figuur 2A). Membraaneiwitten werden tot expressie gebracht...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vrijwel elk cellulair proces dat afhankelijk is van de overdracht van moleculen of informatie over het celmembraan, zoals celsignalering of celexcitatie, vereist membraaneiwitten. Zo is de reconstitutie van membraaneiwitten het belangrijkste knelpunt geworden bij het realiseren van verschillende synthetische celontwerpen voor verschillende toepassingen. Traditionele detergent-gemedieerde reconstitutie van membraaneiwitten in biologische membranen vereist GUV-generatiemethoden zoals zachte zwelling of elektrovorming. Zwel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

APL erkent de steun van de National Science Foundation (EF1935265), de National Institutes of Health (R01-EB030031 en R21-AR080363) en het Army Research Office (80523-BB)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 nm polycarbonate filterSTERLITECH1270193
96 Well Clear Bottom PlateThermoFisher Scientific165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode ReaderAgilent11-120-533
Creatine phosphateMillipore Sigma10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner UnitYokogawaCSU-X1 
Density gradient medium (Optiprep)Millipore SigmaD1556Optioneel om te wisselen met sucrose in de binnenste oplossing
Filter supportsAvanti610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)Fisher Scientific05-408-129 
Folinic acid calcium salt hydrateMillipore SigmaF7878
GlucoseMillipore Sigma158968
HEPESMillipore SigmaH3375
iXon X3 camera AndorDU-897E-CS0 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrateMillipore SigmaG1501
Light mineral oilMillipore SigmaM5904
Magnesium acetate tetrahydrate Millipore SigmaM5661
Mini-extruder kit (inclusief spuithouder en extruderstandaard)Avanti610020
Olympus IX81 Inverted Microscope OlympusIX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective Olympus1-U2B933 
PEO-b-PBDPolymer SourceP41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNAHomemadeN/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNAHomemadeN/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNAHomemadeN/A
POPC lipid in chloroform Avanti850457C
Potassium chlorideMillipore SigmaP9541
PUREfrex 2.0Cosmo Bio USAGFK-PF201
Ribonucleotide Solution SetNew England BioLabsN0450
RNase Inhibitor, MurineNew England BioLabsM0314S
RTS Amino Acid SamplerBiotechrabbitBR1401801
Sodium chlorideMillipore SigmaS9888
SpermidineMillipore SigmaS2626
SucroseMillipore SigmaS0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600ELITechGroupVAPRO 5600

Referenties

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  2. Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
  3. Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
  4. Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
  5. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685(2021).
  6. Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912(2021).
  7. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
  8. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236(2021).
  9. Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325(2019).
  10. Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
  11. Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
  12. Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605(2023).
  13. Schneider, B., et al. Membrane Protein expression in cell-free systems. Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
  15. Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
  16. Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
  17. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  18. Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917(2019).
  19. Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
  20. Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025(2015).
  21. Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
  22. Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429(2021).
  23. Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
  24. Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
  25. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  26. Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
  27. Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104(2023).
  28. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  29. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  30. Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
  31. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  32. van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416(2023).
  33. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
  34. Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
  35. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332(2021).
  36. Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509(2023).
  37. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  38. Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
  39. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  40. Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Reconstitutie van membraanproteïnensynthetische cellengigantische unilamellaire vesiclesgeïnverteerde druppel-emulsielipide dubbellaagconfocale microscopieproteïne-inkapselingsynthese van ionkanalen
Reconstitutie van het bacteriële glutamaatreceptorkanaal door inkapseling van een celvrij expressiesysteem
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.