Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Vaststelling van hepatocarcinoom bij BALB/c-nu-muizen en onderzoek naar het therapeutisch effect van de Sanleng Jiashen-formule

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66599

⸱

26 januari 2024

 ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we het stap-voor-stap protocol om de therapeutische en vasculaire remmende effecten van de Sanleng Jiashen-formule op BALB/c-nu-muizen met orthotopisch hepatocellulair carcinoom te onderzoeken.

Samenvatting

De dodelijkheid van leverkanker en de resistentie tegen chemische geneesmiddelen hebben de zoektocht naar effectieve voorschriften van traditionele kruiden voor leverkanker gedwongen. Diermodellen die herhaalbaar zijn, gemakkelijk te manipuleren zijn en de pathofysiologische processen van leverkanker sterk nabootsen, zijn de voorwaarde voor de succesvolle screening van effectieve kandidaat-geneesmiddelen. Ondertussen zijn betrouwbare indicatoren en middelen voor de evaluatie van de werkzaamheid van geneesmiddelen ook de garantie voor onderzoek en ontwikkeling van geneesmiddelen tegen leverkanker.

Sanleng Jiashen-formule, een representatief recept van de traditionele Chinese geneeskunde met Sparganium stoloni erum, Buch. -Ham. (Sanleng), Panax ginseng C. A. Mey. (ginseng), Rheum officinale Baill. (rabarber) en Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong), wordt voorgeschreven om de lever te voeden en warmte te verwijderen, gifstoffen te verwijderen en de bloedcirculatie te bevorderen om leverkanker te behandelen. Dit experimentele protocol beschrijft de bereiding van de gevriesdroogde Sanleng Jiashen-formule en het vestigingsproces van in-situ leverkanker bij BALB/c-nu-muizen. Histopathologische kleuring, immunohistochemische detectie van kankermarkers, in vivo beeldvorming van muizen en chorioallantoïsche membraantest met kuikenembryo's werden gebruikt om de remming en het anti-angiogenese-effect van de Sanleng Jiashen-formule op kwaadaardige proliferatie van leverkankerweefsel te onderzoeken. De gegevens tonen aan dat de Sanleng Jiashen-formule effectief bestand is tegen de kwaadaardige proliferatie van leverkankerweefsel, die zich manifesteert door een verminderd tumormassavolume, verbeterde pathologische schade en lagere niveaus van de kankermarker ki67.

De superieure remming van angiogenese suggereert ook dat de Sanleng Jiashen-formule het potentieel kan hebben om de progressie en verslechtering van leverkanker te behandelen en te voorkomen. Het hele experimentele schema toont een uitgebreid proces van traditionele Chinese geneeskundecomponenten bij de behandeling van leverkanker bij muizen, dat een referentie biedt voor het opzetten en optimaliseren van een leverkankermodel, evenals het onderzoek en de ontwikkeling van geneesmiddelen om leverkanker te voorkomen en te behandelen.

Inleiding

Leverkanker is een dodelijke vorm van kanker die zijn oorsprong vindt in de lever en wereldwijd de op één na meest voorkomende doodsoorzaak door kanker is1. De cijfers voor leverziekten in de Verenigde Staten en sommige ontwikkelingslanden vertonen hoge niveaus en er zouden tegen 2030 wereldwijd meer dan 1 miljoen gevallen van leverkanker kunnen zijn2. Als gevolg van ongezonde leefgewoonten zoals roken, obesitas en drinken, en de verwoestingen van hepatitis B, hepatitis C en andere virussen, is de incidentie en mortaliteit van leverkanker jaar na jaar3 aanzienlijk toegenomen. Als een heterogene kwaadaardige tumor met verschillende histologische kenmerken en een slechte prognose, heeft leverkanker een zeer breed scala aan incidentieën, waaronder hepatocellulair carcinoom, intrahepatisch cholangiocarcinoom en fibrolamellaire leverkanker4. Leverkanker wordt vaak in een vergevorderd stadium gediagnosticeerd en veel gevorderde patiënten komen niet in aanmerking voor bestralingstherapie5. De multikinaseremmer sorafenib is een zeer geaccepteerd geneesmiddel voor patiënten met gevorderde leverkanker, maar patiënten ontwikkelen vaak binnen een korte periode een aanzienlijke resistentie6. Op dit moment hebben immuuncheckpointremmers PD-1 en PD-L1 in combinatie met sorafenib enige vooruitgang geboekt bij het beheersen van de ontwikkeling van leverkanker, maar het therapeutische effect is nog steeds controversieel7.

Orthotope leverkanker is een vroege vorm van leverkanker: kankercellen hebben zich niet rond het leverweefsel verspreid of treden geen metastasen tussen organen op, en de functie van de lever wordt niet sterk aangetast8. Omdat orthotope leverkanker over het algemeen geen duidelijke ongemakssymptomen vertoont, kunnen sommige patiënten milde leverpijn, vermoeidheid en andere symptomen hebben9. In de klinische praktijk kunnen kleurendoppler-echografie van de lever en verbeterd computertomografieonderzoek substantiële ruimte-innemende laesies in de lever diagnosticeren10. Hoewel de lokale leverkanker die niet is uitgezaaid en uitgezaaid, operatief kan worden verwijderd, zijn er bepaalde chirurgische risico's en de onvermijdelijke psychologische belasting voor de patiënten11. Chemoradiotherapie kan alle of een deel van de leverkankercellen doden, en langdurige immunosuppressie bij patiënten met medicatie kan de effectiviteit van de behandeling beïnvloeden en het risico op andere ziekten verhogen12. Daarom is het zoeken naar veilige en effectieve medicamenteuze therapie voor vroege preventie en behandeling van leverkanker de sleutel tot het terugdringen van de progressie en verslechtering van leverkanker.

Het principe van de Chinese geneeskunde voor de behandeling van leverkanker is gebaseerd op het concept van evenwicht en harmonie in het lichaam. De Chinese geneeskunde beschouwt leverkanker als een onbalans of disharmonie in de energie van het lichaam, bekend als Qi, die de lever aantast13. De behandeling van leverkanker in de Chinese geneeskunde omvat verschillende benaderingen, waaronder kruidengeneeskunde, acupunctuur, dieettherapie en aanbevelingen voor levensstijl. Het principe is om de balans van Qi te herstellen, de afweermechanismen van het lichaam te versterken en het vermogen van het lichaam om zichzelf te genezente bevorderen 14,15. Leverkanker in de traditionele Chinese geneeskunde behoort tot de categorie "tympanieten" en "leveraccumulatie". Al in de "Innerlijke Canon van Huangdi" is de symptomen gedetailleerd vastgelegd, maar leverkanker wordt veroorzaakt door bloedstasis en Zhengqi-deficiëntie en wordt behandeld door bloedstasis te verwijderen, tympanieten te elimineren en de weerstand van het lichaam te versterken om de constitutie te consolideren13. De Sanleng-pil is afkomstig uit het boek "Weisheng Baojian", geschreven door Luo Tianyi, een beroemde arts in de Yuan-dynastie. Het is samengesteld uit drie soorten medicijnen: Sparganium stoloni erum, Buch. -Ham. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong), en Rheum officinale Baill. (rabarber). Deze drie soorten geneesmiddelen kunnen de levermeridiaan binnendringen en hebben therapeutische waarde voor de behandeling van leverkanker14. De formule van Sanleng Jiashen is samengesteld uit 16 g Sanleng, 16 g Panax ginseng C.A.Mey. (ginseng), 8 g rabarber en 2 g Chuanxiong (Figuur 1), die wordt voorgeschreven om de lever te versterken, warmte te klaren, gifstoffen te verwijderen en de bloedcirculatie te bevorderen. Van deze kruiden wordt aangenomen dat ze kankerbestrijdende eigenschappen hebben en helpen de tumorgroei te verminderen, de symptomen te verlichten en het algehele welzijn te verbeteren. In de eerdere in vitro experimenten kan de Sanleng Jiashen-formule de proliferatie van leverkankercellen remmen15. Maar hoe kan het remmende effect van Chinese kruidenverbindingen op leverkanker efficiënt en redelijk worden geëvalueerd? Door het opzetten van een BALB/c-nu muis in situ leverkankermodel, werd het remmende effect van de Sanleng Jiashen-formule op leverkanker en angiogenese voornamelijk onderzocht door middel van live beeldvorming van kleine dieren en chorioallantoïsche membraantest met kuikenembryo's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

BALB/c-nu mannelijke naaktmuizen die specifiek pathogeenvrij waren, 5 weken oud waren en 18-22 g wogen, werden gevoed in het Animal Experimental Center of Transformation Medical College van Jilin University; de voedingsomstandigheden waren 22 °C-24 °C met een relatieve vochtigheid van 40%-60%. Het licentienummer voor proefdieren is SYXK(Ji) 2018-0006 en het experimentele proces voldoet aan de regels en voorschriften van de ethische commissie van Jilin University, en het goedkeuringsnummer voor dierethiek is 20221228-01.

1. Bereiding van gevriesdroogde Sanleng Jiashen formule15

  1. Doe 16 g Sanleng, 16 g ginseng, 8 g rabarber en 2 g Chuanxiong in een intelligente afkookpot (zie Materiaaltabel) en week 30 minuten in 294 ml gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur. Na het verwarmen en koken, kook nog 30 minuten op 100 °C en filtreer de vloeistof door dubbel medisch gaas (zie Materiaaltabel). Voeg 252 ml gedeïoniseerd water toe aan het residu, kook gedurende 30 minuten op 100 °C en filtreer de vloeistof met dubbel gaas.
  2. Vang het filtraat uit stap 1.1 op in een schone roestvrijstalen schaal en vries het 12 uur in bij -80 °C (zie materiaaltabel).
  3. Plaats de Sanleng Jiashen-formule uit stap 1.2 in een vacuümvriesdroger (zie materiaaltabel) (koude valtemperatuur: -55 °C) en droog gedurende 48 uur om het gevriesdroogde poeder van de Sanleng Jiashen-formule te verkrijgen.

2. Bouw van een HCCLM3-cellijn die luciferase stabiel tot expressie brengt16

  1. Voeg 1,0 ml HCCLM3-celsuspensie toe in de plaat met 24 putjes (zie materiaaltabel) met 5 × 105 cellen/putje en kweek in een volledig medium (10% foetaal runderserum + 1% penicilline-streptomycineoplossing + DMEM) (zie materiaaltabel) met 3 μg/ml puromycine gedurende 72 uur in een celincubator (37 °C, 5% CO2, zie Materiaaltabel).
  2. Gooi het bovenliggende celsupplement in stap 2.1 weg en voeg 100 μl 0,25% trypsineoplossing toe om de cellen gedurende 1 minuut in een celincubator te verteren (zie Materiaaltabel). Voeg 300 μL volledig medium toe en gebruik een pipet om de aanhangende cellen te bevrijden en de spijsvertering te beëindigen. Verzamel alle celsuspensies en plaats ze gedurende 5 minuten in een centrifugebuis van 15 ml bij kamertemperatuur bij 1.000 × g . Nadat u het supernatant hebt weggegooid, voegt u 1 ml volledig medium toe en mengt u door te pipetteren.
  3. Voeg 100 μL celsuspensie van 4 × 103 HCCLM3-cellen/putje uit stap 2.2 toe aan een plaat met 96 putjes en kweek gedurende 24 uur in een celincubator (37 °C, 5% CO2, zie materiaaltabel).
  4. Voeg in stap 2.3 0,27 μl GFP-lentivirus toe aan de platen met 96 putjes en kweek gedurende 15 uur in een celincubator (37 °C, 5% CO2, zie materiaaltabel). Gooi de celsupernatant weg, voeg 100 μL volledig kweekmedium toe en verkrijg beelden met behulp van een fluorescentiemicroscoop bij de excitatiegolflengte van 488 nm en de emissiegolflengte van 507 nm (zie Materiaaltabel).
  5. Vervang 2 ml GFP lentivirus en blijf gedurende 24 uur kweken. Vervang 2 ml compleet kweekmedium zonder GFP lentivirus gedurende nog eens 24 uur.
    OPMERKING: De transfectieefficiency van GFP-lentivirus in HCCLM3-cellen was 80% zoals gezien onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
  6. Voeg 5 ml 2 × 105-cellige suspensie uit stap 2.1 toe aan een petrischaaltje van 60 mm en kweek gedurende 24 uur in een celincubator. Voeg 64,5 μl luciferase toe en blijf gedurende 15 uur kweken in een celincubator (37 °C, 5% CO2, zie materiaaltabel).
  7. Gooi het bovenstaande weg en voeg 5 ml volledig medium toe om door te gaan met kweken totdat de cellen voor 90% samenvloeien in het petrischaaltje. Gooi de celsupernatant weg, spoel met 2 x 1 ml PBS en voeg 1 ml 0,25% trypsineoplossing toe om de cellen gedurende 1 minuut in een celincubator te verteren (37 °C, 5% CO2, zie materiaaltabel). Voeg 3 ml volledig medium toe en pipetteer op en neer om de aanhangende cellen vrij te maken en beëindig de spijsvertering. Verzamel alle celsuspensies voor de daaropvolgende injectie met de muis.
    OPMERKING: Om een voldoende aantal cellen te verkrijgen, werden de cellen continu gepasseerd en gekweekt.

3. Opstelling van een BALB/c-nu naakt muizenmodel van leverkanker in situ en behandeling15

  1. Voeg 100 μl 1 × 107 HCCLM3-cellen die in stap 2.7 met luciferase zijn getransfecteerd en 100 μl matrixlijm (zie materiaaltabel) toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml (zie materiaaltabel) en meng lichtjes met een pipet van 1 ml (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Het hele proces van het bereiden van de oplossing moet op ijs worden uitgevoerd om te voorkomen dat de matrixlijm uithardt.
  2. Desinfecteer de linker- en rechteroksels van BALB/c-nu naaktmuizen met jodopine (zie materiaaltabel) en ontjodium met alcohol (zie materiaaltabel).
  3. Injecteer langzaam 100 μL van het mengsel van HCCLM3-cellen en matrixlijm uit stap 3.1 in de linker- en rechteroksels van BALB/c-nu naaktmuizen met een wegwerpspuit van 1 ml.
    OPMERKING: Na ongeveer 10 dagen ontwikkelden BALB/c-nu naakte muizen een tumormassa van ongeveer 0,5 cm3 op de bilaterale okselinjectieplaats.
  4. Verdoving BALB/c-nu naakte muizen in stap 3.3 door intraperitoneale injectie van 1%, 50 mg/kg natriumpentobarbital. Snijd de huid van beide oksels af met een oogheelkundige schaar en pincet (zie Materiaaltabel) en pel de onderhuidse tumormassa voorzichtig af om deze in een celkweekschaaltje te plaatsen (zie Materiaaltabel) met voorgekoelde PBS-buffer (zie Materiaaltabel), en snijd het in 1 mm3 stukken met een scalpel (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: De okseltumormassa van BALB/c-nu naakte muizen moet binnen 0,5 uur op ijs worden geoogst om de tumorcelactiviteit te behouden en het slagingspercentage van het model te verhogen. Aan het einde van de bemonstering werden de muizen gedood door verwijdering van de halswervels. Als er een necrotisch deel van de tumor is, moet dit worden verwijderd, zodat alleen de viswitte tumor overblijft om infectie tijdens de orthotope kankertransplantatie te voorkomen.
  5. Verdoof BALB/c-nu naaktmuizen met 1%, 50 mg/kg natriumpentobarbital intraperitoneaal (zie materiaaltabel), desinfecteer de buik met jodium (zie materiaaltabel) en ontjodisch met alcohol (zie materiaaltabel).
  6. Gebruik een oogheelkundige schaar en pincet (zie materiaaltabel) om een chirurgische incisie van 45° ongeveer 1 cm af te snijden op een positie van 0,5 cm onder het xiphoid-proces om de lever bloot te leggen, druk voorzichtig op de lever om leverweefsel uit te knijpen en fixeer de lever met weegpapier.
    OPMERKING: Wattenstaafjes of staafjes kunnen onder de ribben van muizen worden geplaatst om de lever effectief bloot te leggen.
  7. Neem in stap 3.4 een klein stukje tumorweefsel met een wegwerpinjectienaald van 10 ml en implanteer de tumormassa ongeveer 0,5 cm evenwijdig aan de lever in de lever om deze onder de levercapsule te fixeren en de naald langzaam terug te trekken.
    OPMERKING: Gebruik een wegwerpspuit van 1 ml om 2 druppels gesmolten matrixlijm te laten vallen, observeer de tumormassa zonder onbedoelde uitglijders en zonder bloedingen, en hecht vervolgens de chirurgische incisie.
  8. Sluit de chirurgische incisie met een tang met een naald van 12 cm en 6-0 chirurgische hechtingen (zie materiaaltabel). Breng erytromycine oogzalf (zie materiaaltabel) aan op de operatieplaats om infectie te voorkomen. Plaats de muizen op een verwarmd kussen (zie Tabel met materialen) en houd ze na het ontwaken in aparte kooien.
  9. Vanaf de eerste dag na het modelleren 7,5 mg/kg sorafenib en Sanleng Jiashen-formule (7,8 g/kg, 15,6 g/kg en 31,2 g/kg) via een maagsonde aan de muizen toedienen vanaf stap 3,8 gedurende 14 dagen, eenmaal per dag. Dien een gelijke hoeveelheid normale zoutoplossing toe aan de muizen in de modelgroep.

4. Evaluatie van in-vivobeeldvorming

OPMERKING: Op dag 14 werd 1 uur na het einde van de toediening live beeldvorming uitgevoerd.

  1. Schakel de computer en het in vivo beeldvormingsinstrument in (zie materiaaltabel). Dubbelklik op het Living Image-pictogram op het bureaublad om het programma te starten. Klik op IVIS-systeem initialiseren in het configuratiescherm om het hele IVIS-systeem te starten.
    OPMERKING: Nadat de machine de zelftest heeft voltooid, is het temperatuurstatuslampje op het bedieningspaneel rood. Wacht ongeveer 5-10 minuten nadat de temperatuur is gedaald en het licht groen wordt, beeldacquisitie kan worden uitgevoerd.
  2. Desinfecteer de buik van muizen met alcohol en injecteer intraperitoneaal 10 μL D-luciferine per g lichaamsgewicht (zie materiaaltabel) met een wegwerpspuit. Verdoof muizen door intraperitoneale injectie van 1%, 50 mg/kg natriumpentobarbital.
    OPMERKING: D-luciferine werd verdund met steriel PBS tot 15 mg/ml.
  3. Plaats de verdoofde muizen in stap 4.3 in de observatiebox en sluit de deur, stel de belichtingstijd in op 30 s in het bedieningspaneel: Modusselectie: selecteer luminencentie op basis van het monstertype, selecteer standaard automatisch programma en druk op verwerven om beelden te verkrijgen.
  4. Klik op Levende Afbeeldingsgegevens opslaan, selecteer Alle levende afbeeldingsgegevensbestanden en sla deze op het bureaublad van de computer op.
  5. Klik op Exit in Living image op het hoofdscherm. Schakel achtereenvolgens de cameravoeding, de stroom van het beeldinstrument en de computer uit.
  6. Euthanasie na beeldvorming van de verdoofde muizen (intraperitoneale injectie van 1%, 50 mg/kg natriumpentobarbital) door dislocatie van de halswervels.

5. Hematoxyline-eosine kleuring17

  1. Fixeer het verse leverweefsel van muizen uit stap 4.7 in 4% paraformaldehyde gedurende 48 uur en spoel vervolgens 3 keer gedurende 5 minuten af met stromend water om het paraformaldehyde weg te spoelen (zie materiaaltabel).
  2. Dehydrateer de leverweefsels in stap 5.1 in 30% ethanol, 50% ethanol, 70% ethanol, 95% ethanol figure-protocol-1, 95% ethanol figure-protocol-2en watervrije ethanol gedurende 1 uur achtereenvolgens (zie materiaaltabel).
  3. Zet de gedehydrateerde leverweefsels in stap 5.2 tot 50% ethanol, 50% xyleen, xyleen, xyleen figure-protocol-3figure-protocol-4en xyleen figure-protocol-5 achtereenvolgens om ze gedurende 1 uur transparant te maken (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Xyleen is vluchtig en giftig, deze stap wordt uitgevoerd in de zuurkast.
  4. Smelt de paraffinewas en houd de temperatuur op ongeveer 55 °C. Plaats de leverweefselblokken in stap 5.3 in een paraffine-inbeddingsmachine (zie Materiaaltabel) gevuld met wasoplossing om in te bedden.
  5. Bevestig het ingebedde wasblok van muizenleverweefsel in stap 5.4 op de paraffinesnijmachine (zie materiaaltabel), snijd het in plakjes van 5 μm dik, leg de plakjes volledig plat in water van 50 °C en schep ze met een schuif op. Doe ze ten slotte in een bakmachine voor biologisch weefsel om 20 minuten bij 70 °C te drogen (zie materiaaltabel).
  6. Week de 5 μm-secties in stap 5.5 achtereenvolgens 10 minuten in xyleen figure-protocol-6, xyleen figure-protocol-7, watervrije ethanol figure-protocol-8en watervrije ethanol figure-protocol-9 , week vervolgens in respectievelijk 95% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol en 70% ethanol gedurende 5 minuten en was ten slotte met gedestilleerd water voor de wasbehandeling (zie tabel met materialen).
  7. Verf de gedehydrateerde, 5 μm dikke, parraffinewas leverweefselsecties met hematoxyline gedurende 8 minuten en spoel vervolgens af met stromend water.
  8. Differentieer in 1% zoutzuuroplossing gedurende 10 s en spoel gedurende 30 minuten af met stromend water (zie materiaaltabel).
  9. Verf met 0,5% eosine-oplossing gedurende 1 minuut (zie materiaaltabel).
  10. Doe de plakjes in 95% alcohol figure-protocol-10, 95% alcohol figure-protocol-11, watervrije ethanol figure-protocol-12, watervrije ethanol figure-protocol-13, xyleen figure-protocol-14en xyleen figure-protocol-15 gedurende 5 minuten om te dehydrateren (zie materiaaltabel).
  11. Sluit af met neutraal tandvlees en maak foto's onder een microscoop met omgekeerd licht (zie materiaaltabel).

6. Immunohistochemische kleuring18

  1. Laat 1,5% H2O2 op de 5 μm secties van de muizenlever vallen in stap 5.6 en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur, daarna wassen met PBS gedurende 2 x 5 minuten (zie materiaaltabel).
  2. Repareer het weefsel met een citroenzuuroplossing (zie materiaaltabel) gedurende 5 minuten en was met PBS gedurende 3 x 5 minuten.
  3. Incubeer met 0,2% triton X-100 (zie materiaaltabel) bij kamertemperatuur gedurende 4 minuten, incubeer vervolgens 4 minuten met 0,5% triton X-100 bij kamertemperatuur en was met PBS.
  4. Voeg geitenserum (zie tabel met materialen) toe om gedurende 15 minuten af te sluiten en voeg vervolgens het primaire ki67-antilichaam (zie tabel met materialen) verdund met PBS (1:300) toe om een nacht bij 4 °C te incuberen. Wassen met PBS gedurende 3 x 5 min.
  5. Incubeer met secundair antilichaam verdund met PBS (1:200) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en was met PBS gedurende 3 x 5 minuten (zie materiaaltabel).
  6. Kleur gedurende 5 minuten met de ontwikkeloplossing en spoel af met dubbel gedestilleerd water (zie materiaaltabel).
  7. Opnieuw kleuren met hematoxyline gedurende 2 min, differentiëren in 1% zoutzuuroplossing gedurende 10 s en spoelen met stromend water gedurende 30 minuten (zie materiaaltabel).
  8. Doe de plakjes in 95% alcohol figure-protocol-16, 95% alcohol figure-protocol-17, watervrije ethanol figure-protocol-18, watervrije ethanol figure-protocol-19, xyleen figure-protocol-20en xyleen figure-protocol-21 gedurende 5 minuten om te dehydrateren (zie materiaaltabel).
  9. Sluit af met neutraal tandvlees en maak foto's onder een microscoop met omgekeerd licht (zie materiaaltabel).

7. Chorioallantoïsche membraantest met kuikenembryo's19

  1. Laat de kippeneieren met witte veren (zie Materiaaltabel) 2 uur op kamertemperatuur staan en besproei met alcohol om te desinfecteren. Boor een gat in de luchtkamer met een schedelboor (zie materiaaltabel) en broed de eieren uit met de luchtkamer omhoog gedurende 7 dagen (incubatietemperatuur 37,8-38,2 °C en relatieve vochtigheid 65%).
    OPMERKING: Tijdens de eerste 3 dagen van de incubatie wordt de automatische knop voor het draaien van eieren ingeschakeld om te voorkomen dat het chorioallantoïsche membraan van het kuikenembryo zich aan de schaal hecht en een valse luchtkamer creëert.
  2. Gooi de zwakke/onbevruchte eieren weg in de eierverlichter (zie Materiaaltabel). Trek een raam van 1 x 1 cm voorzichtig uit met een oogpincet (zie materiaaltabel) nadat u met een schedelboor een gat in de nepluchtkamer hebt geboord (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Houd er rekening mee dat de eierschaal niet in het chorioallantoïsche membraan van het kuikenembryo mag vallen.
  3. Voeg op dag 8 van de incubatie 100 μL tumorcelsuspensie (1 × 106 cellen) toe aan elk ei uit de nep-luchtkamer, behalve de controlegroep. Voeg in de medicijngroepen 100 μL sorafenib-oplossing en de Sanleng Jiashen-formule toe. Voeg in de controle- en modelgroep 100 μL PBS toe.
    OPMERKING: De tumorcelsuspensie is samengesteld uit HCCLM3-cellen en matrixlijm in gelijk volume. De geneesmiddelconcentratie is als volgt vastgesteld: 7,5 mg/kg sorafenib en Sanleng Jiashen-formule (7,8 g/kg, 15,6 g/kg en 31,2 g/kg).
  4. Bedek het raam met een transparant verband (zie Materiaalopgave) en desinfecteer met alcoholspray (zie Materiaalopgave). Verwijder na 7 dagen incubatie het transparante verband en voeg 1 ml fixeermiddel (methanol:aceton = 1:1) (zie Materiaaltabel) toe uit de nep-luchtkamer voor een fixatie van 30 minuten.
  5. Gooi het fixeermiddel weg met een spuit van 1 ml. Knip ~5 x 5 cm chorioallantoïsch membraan in de nep-luchtkamer met een oogheelkundige schaar en plaats deze in een petrischaal van 60 mm.
    OPMERKING: Voor het chorioallantoïsche membraan van het kuikenembryo met bloed, spoelen met PBS. Voor kuikenembryo's chorioallantoïsch membraan bevestigd aan het weefsel, scheiden met een oogheelkundige schaar.
  6. Leg het chorioallantoïsche membraan uit stap 7.5 onder een optische microscoop en fotografeer de vaten (zie Materiaaltabel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals te zien is in figuur 2A, hebben we een in-situ leverkankermodel van BALB/c-nu-muizen opgesteld en het antitumoreffect van de Sanleng Jiashen-formule geëvalueerd. Figuur 2B laat zien dat de Sanleng Jiashen-formule de groei van levertumoren aanzienlijk kan onderdrukken. De pathologische resultaten gaven aan dat, in vergelijking met de controlegroep, de tumorhaarden in de modelgroep duidelijke grenzen hadden met het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een grote hoeveelheid bewijs heeft bevestigd dat Sanleng, ginseng, rabarber en Chuanxiong in de Sanleng Jiashen-formule farmacologische effecten hebben op de behandeling van leverkanker. Studies hebben aangetoond dat Sanleng de proliferatie en groei van tumorcellen aanzienlijk kan remmen om invasie en metastase van tumorcellen te voorkomen, celapoptose te induceren en de celcyclus en tumormicro-omgeving te reguleren20. Het is bewezen dat kaempferol, het actieve in...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Philosophy and Social Science Foundation of China (20VYJ070), het Project van Jilin Provincial Education Department (JJKH20230963KJ) en de Second Batch of Xinglin Scholars Engineering Project aan de Changchun University of Chinese Medicine (QNKXJ2-2021+ZR25).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% trypsinoplossingHyClone, AmericaSH30042.01B
1 mL wegwerpsyringeMingankang Medical Equipment Co., Ltd., ChinaRWSB
1% Penicillin & streptomycin oplossingHyclone, AmericaSV30010
1,5 mL centrifugeerbuisCorning, AmericaMCT-150-C-S
12 cm naaldtangHesdick, ChinaHKQS-211
6-0 chirurgische hechtdraadShanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, ChinaCR631
75% alcoholSichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China1.00009E+11
96-wells platenNEST, China701001
AcetonTianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, ChinaGB686-89
BALB/c-nu mannelijke naakte muizenBeijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaSYXK(Ji) 2018-0006
Biologische weefsel bakmachineLeica, DuitslandLeica HI1220
Celcultuur schaalNEST, ChinaNEST.706001
Citroenzuur oplossingWuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, Chinasj1074
D-luciferineGold Biotechnology®, Inc., ChinaLUCK-100
DMEMHyclone, AmericaSH30243.01
Ei-verlichterShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, ChinaWZSDT
Eosine kleuringsoplossingHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China110703061
Erytromycine oogzalfCisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, ChinaH37022025
Foetaal runderserumClark, AmericaFB25015 
Volautomatische intelligente kuikenincubatorShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China29538
GFP lentivirussoplossingSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaF22AZ
GeitenserumShenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, ChinaWLA067
Handbediende muisschedelboorSTRONGWT, China190
HCCLM3 cellijnWheLab, Shanghai, ChinaC1010
VerwarmingskussensZhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, ChinaGEJRD-10W
HematoxylineHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, ChinaB-YH250-1
Intelligante decoctiepotHangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China3003BQ
Inverteerde fluorescentiemicroscoopOlympus, JapanIX73
ki67 primaire antilichaamWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB121141-100
Lodophor desinfectiemiddelCofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China202110073
LuciferaseSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaE26JZ
MatrixlijmCorning, America356234
Medische gaasYunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China71712049971
MethanolGuangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China1.17001.023
Oogheelkundig schaarHesdick, ChinaHKQS-209
Oogheelkundig pincetHesdick, ChinaHKCL-20
Paraffine inbeddingsmachineLeica, DuitslandEG1150H
Paraffine slijpmachineLeica, DuitslandLeica CM1950
ParaformaldehydeBiosharp, ChinaBL539A
PBS bufferWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaG2156-1L
PuromycinBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaP8230
KoelkastThermo Scientific, AmericaTDE40086FV-ULTS
SchaarHesdick, ChinaHKCL-93
Secundair antilichaamWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB23301
Klein dieren live beeldvorming systeemCaliper Life Sciences, AmericaIVIS Lumina XR
SorafenibShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China284461-73-0 
Transparante dressing3M, America9534HP
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaT8200
VacuumvriesdrogerNingbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Chinasz-10N
Witte veer kippen eierenShandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, ChinaSCXK(Lu) 20180004
XyleenSigma-Aldrich,, America534056

Referenties

  1. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  2. Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
  3. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics. CA-A Cancer J. Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  4. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  5. Verslype, C., et al. The management of hepatocellular carcinoma. Current expert opinion and recommendations derived from the 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer, Barcelona, 2008. Ann. Oncol. , (2009).
  6. Greten, T. F., et al. Biomarkers for immunotherapy of hepatocellular carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 20 (11), 780-798 (2023).
  7. Rimassa, L., Finn, R. S., Sangro, B. Combination immunotherapy for hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 79 (2), 506-515 (2023).
  8. Wu, Z. H., et al. A terrylene-anthraquinone dyad as a chromophore for photothermal therapy in the NIR-II window. J. Am. Chem. Soc. 145 (48), 26487-26493 (2023).
  9. Pawlik, T. M. Hepatocellular carcinoma. Sure. Oncol. Clin. N. Am. 33 (1), (2024).
  10. Schwarze, V., et al. Diagnostic value of contrast-enhanced ultrasound versus computed tomography for hepatocellular carcinoma: a retrospective, single-center evaluation of 234 patients. J. Int. Med. Res. 48 (6), 1-10 (2020).
  11. Maki, H., Hasegawa, K. Advances in the surgical treatment of liver cancer. Biosci. Trends. 16 (3), 178-188 (2022).
  12. Pepe, A., et al. Medical radiology: current progress. Diagnostics. 13 (14), 2439(2023).
  13. Li, Y., Zhang, C. Significance of 'harmonious' thinking in Inner Canon of Huangdi on the prevention and treatment of primary liver cancer. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 28 (02), 305-308 (2013).
  14. Luo, T. Wishing Baojian (M). , China Medical Science and Technology Press. Beijing, China. (2019).
  15. Li, Y. Effect and mechanism of Sanlengjiashen Decoction on hepatocellular carcinoma by JAK2/STAT3 signaling pathway [D]. , Changchun University of Chinese Medicine. (2022).
  16. Wang, P., et al. BTF3 promotes proliferation and glycolysis in hepatocellular carcinoma by regulating GLUT1. Cancer Biol. Ther. 24 (1), 2225884(2023).
  17. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240(2022).
  18. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. J. Ethnopharmacol. 241, 111801(2019).
  19. Guerrieri, A. N., et al. A novel patient-derived immortalised cell line of myxofibrosarcoma: a tool for preclinical drugs testing and the generation of near-patient models. BMC Cancer. 23 (1), 1194(2023).
  20. Li, Y., Zhao, J., Zhao, H., Yu, C. Research progress of Sparganium Stoloniferum. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 20 (09), 92-94 (2018).
  21. Kim, T. W., Lee, S. Y., Kim, M., Cheon, C., Ko, S. G. Kaempferol induces autophagic cell death via IRE1-JNK-CHOP pathway and inhibition of G9a in gastric cancer cells. Cell Death Dis. 9 (9), 875(2018).
  22. Lee, M. J., et al. Kaempferol alleviates mitochondrial damage by reducing mitochondrial reactive oxygen species production in lipopolysaccharide-induced prostate organoids. Foods. 12 (20), 3836(2023).
  23. Zhang, Q., et al. Molecular docking and in vitro experiments verified that kaempferol induced apoptosis and inhibited human HepG2 cell proliferation by targeting BAX, CDK1, and JUN. Mol. Cell. Biochem. 478 (4), 767-780 (2023).
  24. Kumar, S., et al. Myricetin: a potential plant-derived anticancer bioactive compound-an updated overview. N-S Arch. Pharmacol. 396 (10), 2179-2196 (2023).
  25. Wang, M., et al. Myricetin reverses epithelial-endothelial transition and inhibits vasculogenic mimicry and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by directly targeting PAR1. Phytother. Res. 36 (4), 1807-1821 (2022).
  26. Li, J., Li, F., Jin, D. Ginsenosides are promising medicine for tumor and inflammation: A review. Am. J. Chinese Med. 51 (4), 883-908 (2023).
  27. Guo, X., Hu, N., Sun, G., Li, M., Zhang, P. Shenyi capsule plus chemotherapy versus chemotherapy for non-small cell lung cancer:A systematic review of overlapping meta-analyses. Chinese Journal of Integrative Medicine. 24 (3), 227-231 (2018).
  28. Zhang, R., et al. Network Meta-analysis of oral Chinese patent medicine for adjuvant treatment of primary liver cancer. China Journal of Chinese Materia Medica. 46 (09), 2333-2343 (2021).
  29. Oh, H. M., Cho, C. K., Son, C. G. Experimental evidence for the anti-metastatic action of ginsenoside Rg3: A systematic review. Int. J. Mol. Sci. 23 (16), 9077(2022).
  30. Nowak-Perlak, M., Ziółkowski, P., Woźniak, M. A promising natural anthraquinones mediated by photodynamic therapy for anti-cancer therapy. Phytomedicine. 119, 155035(2023).
  31. Bai, J., et al. Emodin, a natural anthraquinone, suppresses liver cancer in vitro and in vivo by regulating VEGFR and miR-34a. Invest. New Drug. 38 (2), 229-245 (2020).
  32. Cheng, G., et al. Cell metabolomics reveals the potential mechanism of aloe emodin and emodin inhibiting breast cancer metastasis. Int. J. Mol. Sci. 23 (22), 13738(2022).
  33. Wang, X., et al. Inhibition of tetramethylpyrazine on P-gp, MRP2, MRP3 and MRP5 in multidrug resistant human hepatocellular carcinoma cells. Oncol. Rep. 23 (1), 211-215 (2010).
  34. Hu, J., et al. Ultrasonic extraction, antioxidant and anticancer activities of novel polysaccharides from Chuanxiong rhizome. Int. J. Biol. Macromol. 85, 277-284 (2016).
  35. Zhong, C., et al. Physicochemical properties of polysaccharides from Ligusticum chuanxiong and analysis of their anti-tumor potential through immunoregulation. Food Funct. 12 (4), 1719-1731 (2021).
  36. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J. Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Leverkankerhepatocarcinoommodeltraditionele Chinese geneeskundetumorremmingangiogeneseremminghistopathologische kleuringimmunohistochemische detectiein vivo imaging

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.