Long-op-chip-modellen overtreffen traditionele 2D-culturen door de lucht-vloeistofinterface en endotheelcelperfusie na te bootsen, waardoor de bloedstroom en de uitwisseling van voedingsstoffen worden gesimuleerd die cruciaal zijn voor longfysiologiestudies. Dit verhoogt de relevantie van longonderzoek en biedt een dynamische, fysiologisch nauwkeurige omgeving om het begrip en de behandeling van luchtweginfecties te bevorderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Immunocompetent alveolus-op-chip-model voor het bestuderen van alveolaire mucosale immuunresponsen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
We introduceren een geavanceerd immunocompetent long-on-chip-model dat is ontworpen om de menselijke alveolaire structuur en functie na te bootsen. Dit innovatieve model maakt gebruik van een microfluïdisch geperfuseerde biochip die een lucht-vloeistofinterface ondersteunt die de omgeving in de menselijke longblaasjes nabootst. Weefselmanipulatie wordt gebruikt om belangrijke cellulaire componenten, waaronder endotheelcellen, macrofagen en epitheelcellen, te integreren om een representatief weefselmodel van de alveolus te creëren. Het model vergemakkelijkt diepgaand onderzoek van de mucosale immuunresponsen op verschillende ziekteverwekkers, waaronder virussen, bacteriën en schimmels, waardoor ons begrip van longimmuniteit wordt bevorderd. Het primaire doel van dit protocol is om details te verstrekken voor het opzetten van dit alveolus-op-chip-model als een robuust in vitro-platform voor infectiestudies, waardoor onderzoekers de complexe interacties tussen ziekteverwekkers en het immuunsysteem van de gastheer binnen de longomgeving nauwkeurig kunnen observeren en analyseren. Dit wordt bereikt door de toepassing van op microfluïdica gebaseerde technieken om de belangrijkste fysiologische omstandigheden van de menselijke longblaasjes te simuleren, waaronder de bloedstroom en biomechanische stimulatie van endotheelcellen, naast het handhaven van een lucht-vloeistofinterface die cruciaal is voor de realistische blootstelling van epitheelcellen aan lucht. Het modelsysteem is compatibel met een reeks gestandaardiseerde tests, zoals immunofluorescentiekleuring, cytokineprofilering en kolonievormende eenheid (CFU)/plaque-analyse, waardoor uitgebreid inzicht in de immuundynamiek tijdens infectie mogelijk is. De Alveolus-on-chip is samengesteld uit essentiële celtypen, waaronder menselijke distale longepitheelcellen (H441) en menselijke navelstrengader-endotheelcellen (HUVEC's) gescheiden door poreuze polyethyleentereftalaat (PET) membranen, met primaire monocyt-afgeleide macrofagen strategisch gepositioneerd tussen de epitheel- en endotheellagen. Het weefselmodel verbetert het vermogen om de genuanceerde factoren die betrokken zijn bij pulmonale immuunresponsen in vitro te ontleden en te analyseren. Als een waardevol hulpmiddel moet het bijdragen aan de vooruitgang van het longonderzoek, door een nauwkeuriger en dynamischer in vitro model te bieden voor het bestuderen van de pathogenese van luchtweginfecties en het testen van mogelijke therapeutische interventies.
Inleiding
De menselijke long speelt een opmerkelijke rol bij de ademhaling en de immuunafweer, met complexe interacties tussen de immuunresponsen van het alveolaire slijmvlies1. Het vermogen van de longblaasjes om een efficiënte immuunrespons te creëren is van vitaal belang voor het voorkomen van longinfecties en het veiligstellen van de longgezondheid. Aangezien de longen voortdurend worden blootgesteld aan een breed scala aan potentiële risico's, waaronder bacteriën, virussen, schimmels, allergieën en fijnstof, is het begrijpen van de complexiteit van alveolaire mucosale immuunresponsen van cruciaal belang voor het ontdekken van de mechanismen achter luchtweginfecties, ontstekingsaandoeningen en de behandeling vanlongziekten.
Om infectie- en ontstekingsgerelateerde processen van de luchtwegen in vitro te bestuderen, zijn modellen nodig die het alveolaire milieu en de immuunresponsen getrouw kunnen nabootsen. 2D-celkweek en diermodules worden al tientallen jaren gebruikt als essentiële hulpmiddelen voor biomedisch onderzoek naar de immuunrespons van de longen. Ze hebben echter vaak beperkingen in hun translatiepotentieel naar menselijke situaties. Long-op-chip-modellen kunnen bijdragen aan het dichten van de kloof tussen traditionele in-vitro- en in-vivomodellen en een nieuwe benadering bieden voor het bestuderen van mensspecifieke immuunresponsen 2,3. Long-op-chip-modellen kunnen de lucht-vloeistofinterface nabootsen, die longcellen nodig hebben om fysiologische omstandigheden van de luchtwegen te recapituleren en om een nauwkeuriger en robuuster weefselmodel te ontwikkelen. Deze kweektechniek maakt een nauwkeurig onderzoek mogelijk van celdifferentiatie, functioneren en reacties op geneesmiddelen of ziektegerelateerde stimuli in vitro2.
In deze studie presenteren we een op microfluïdisch gebaseerd model van de menselijke alveolus als een effectief hulpmiddel om het menselijke alveolaire milieu te recapituleren door perfusie toe te passen om de bloedstroom na te bootsen en biomechanische stimulatie van endotheelcellen en een lucht-vloeistofinterface op te nemen met epitheelcellen die zijn blootgesteld aan een luchtfase4. We hebben een microfluïdisch geperfundeerd alveolus-op-chip ontwikkeld dat de fysieke structuur en biologische interacties van de menselijke longblaasjes nabootst, met een bijzondere focus op de lucht-vloeistofinterface. Deze interface speelt een cruciale rol bij de differentiatie van respiratoire epitheelcellen, wat essentieel is voor het nauwkeurig modelleren van de longomgeving. Het model maakt gebruik van menselijke distale longepitheelcellen (H441) en menselijke navelstrengader-endotheelcellen (HUVEC's), gescheiden door poreuze polyethyleentereftalaat (PET) membranen, met primaire monocyt-afgeleide macrofagen tussen de cellagen. Deze opstelling repliceert de ingewikkelde cellulaire rangschikking van de longblaasjes en is van cruciaal belang voor het nauwkeurig simuleren van de lucht-vloeistofinterface, die een belangrijke factor is in de fysiologische functie van longweefsel.
De grondgedachte achter de modelontwikkeling strekt zich uit tot de integratie van zowel circulerende als weefsel-residente immuuncellen. Deze benadering is ontworpen om de inflammatoire gastheerrespons op menselijke luchtweginfecties nauwkeurig na te bootsen en een dynamische omgeving te bieden om interacties tussen ziekteverwekkers en gastheren te bestuderen. De aanwezigheid van macrofagen maakt het mogelijk om onmiddellijke immuunresponsen en hun interactie met ziekteverwekkers te onderzoeken, wat de eerste verdedigingslinie tegen luchtweginfecties weerspiegelt. Bovendien vergemakkelijkt het ontwerp van het biochipplatform een gemakkelijke en nauwkeurige manipulatie van zowel biofysische als biochemische signalen, wat cruciaal is voor het repliceren van de alveolusfunctie in vitro. Deze flexibiliteit is van groot belang bij het ontleden van de factoren die bijdragen aan menselijke infecties, waardoor onderzoekers de omstandigheden kunnen aanpassen om verschillende ziektetoestanden weer te geven of om potentiële therapeutische interventies te testen. De compatibiliteit van het platform met meerdere uitleestechnologieën, waaronder geavanceerde microscopie, microbiologische analyses en biochemische afvalwateranalyse, vergroot de bruikbaarheid ervan. Deze mogelijkheden maken een uitgebreide beoordeling van de weefselrespons op infecties mogelijk, inclusief het evalueren van cellulair gedrag, proliferatie van pathogenen en de effectiviteit van immuunresponsen.
We presenteren een gedetailleerd protocol en technieken om een menselijk alveolus-op-chip-model te creëren en te gebruiken, gericht op het repliceren van de lucht-vloeistofinterface en het integreren van immuuncellen om menselijke infecties in vitro te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
HUVEC-cellen worden geïsoleerd uit navelstrengen en gebruikt tot passage 4. Primaire monocyten worden geïsoleerd van gezonde donoren uit volbloed. De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Ziekenhuis van Jena, Jena, Duitsland (3939-12/13). Volgens de Verklaring van Helsinki gaven alle personen die cellen doneerden voor het onderzoek hun geïnformeerde toestemming.
1. Dag 1: Bereiding van de biochip
- De biochips zijn verkrijgbaar in verschillende maten en modellen. Gebruik hier het model BC002 voor experimenten. Plaats de biochip in een glazen petrischaaltje, vul het schaaltje en spoel alle holtes door met steriele 70% ethanol (EthOH). Incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Spoel daarna de holtes 2x door met steriele ddH2O. Verwijder de ddH2O.
- Smeer het biochipmembraan van beide holtes in met steriele collageen IV-oplossing (0,5 mg/ml in 0,5 mM azijnzuur; gebruik een concentratie van 1:100 in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing die magnesium en calcium PBS bevat (+/+)) door de collageen IV-oplossing voorzichtig door beide holtes te spoelen met behulp van een pipet van 1.000 μl met blauwe punten. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C en 5% CO2 .
OPMERKING: Het gebruik van een pipet van 1.000 μl met blauwe filter (P1000) tips wordt aanbevolen gedurende het hele protocol. De diameter van de opening van de filtertip bedekt de opening van de poorten die de kanalen verbinden volledig, waardoor het invoegen van luchtbellen in de chip wordt voorkomen. - Spoel na 30 minuten incubatie de onderste en bovenste kamers 2x door met steriel PBS (+/+) om het resterende collageen en azijnzuur weg te spoelen.
- Bereid EC-medium voor door 1:100 (v/v) penicilline/streptomycine (10.000 E/ml) toe te voegen. Vul de bovenste kamer van elke holte met 250 μL EC-medium en de onderste kamer met 150 μL EC-medium.
- Oogst HUVEC uit een confluente T25-kolf: Wassen met 5 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder magnesium en calcium PBS (-/-), 1 ml 0,25% trypsine + 1 mM EDTA in PBS (-/-) toevoegen en 3 minuten incuberen bij 37 °C. Stop de trypsine-activiteit door 5 ml PBS (+/+) + 5% FCS toe te voegen en centrifugeer op 350 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) in een conische buis van 50 ml. Verwijder het supernatans en resuspendeer de celpellet in 1 ml EC-medium.
- Gebruik een seriële verdunning van 1:10 bij het tellen van cellen. Voeg 10 μl van de geresuspendeerde celpellet toe aan 90 μl celmedium. Combineer de monsters zorgvuldig. Gebruik een microcentrifugebuisje met 10 μL trypanblauwe vlek. Verdun de celoplossing met trypan blauw (1:1) met behulp van objectglaasjes voor het tellen van cellen. Tel de cellen handmatig met een Neubauer-kamer of met een geautomatiseerde cellenteller. Bepaal het celgetal en pas de concentratie aan naar 0,4 x 106 cellen per 200 μL.
- Vervang het endotheelcelmedium in de bovenste kamer van de biochip door 200 μL EC-medium met zwevende HUVEC's. Pipeteer voorzichtig om de vorming van luchtbellen in de kanalen of kamers te voorkomen. Zet het glazen petrischaaltje met de biochips op 37 °C en 5% CO2 .
2. Dag 2: Controle van de cellaag
- Controleer op dag 2 visueel op de samenvloeiing van de HUVEC-cellaag in de bovenste kamer. Voer mediumuitwisseling uit in de bovenste kamer met 300 μL EC-medium. Pipeteer voorzichtig om te voorkomen dat de cellen van het membraan loskomen. Voer dagelijks na 24 uur een media-uitwisseling uit. Zet het glazen petrischaaltje met de biochips terug op 37 °C en 5% CO2 .
3. Dag 3: Voorbereiding van de onderste kamer
- Controleer visueel de samenvloeiing van de endotheelcellaag. Bepaal op dit punt de aanwezigheid van een confluente laag en een geplaveide morfologie (Figuur 1). Voer mediumuitwisseling uit in de bovenste kamer met 300 μL EC-medium.
- Bereid vervolgens de onderste kamer voor op het zaaien van de cellen die de epitheellaag vormen. Spoel de onderste kamer voorzichtig door met 150 μl van het RPMI-medium (voeg 1:100 (v/v) penicilline/streptomycine (10.000 E/ml), 5% foetaal koeienserum, 1 μM dexamethason toe).
- Zaad voor de onderste kamer 0,5 x 106 H441-cellen gesuspendeerd in 200 μL RPMI-medium (RPMI) per holte.
- H441-cellen oogsten
- Was de cellen eenmaal met 5 ml PBS (-/-). Voeg 2 ml 0,25% trypsine + 1 mM EDTA toe aan PBS (-/-).
- Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C en 5% CO2 . De incubatietijd varieert afhankelijk van de samenvloeiing van de laag. Binnen 5-7 minuten zouden de cellen volledig moeten loskomen.
- Stop de trypsine-activiteit met 10 ml PBS (+/+) + 5% FBS, verzamel de cellen en centrifugeer op 200 x g gedurende 4 minuten.
- Gooi na het centrifugeren het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 1 ml RPMI en tel.
- Zaai 0,5 x 106 cellen per kamer door de celoplossing voorzichtig in de onderste kamer te pipetteren. Sluit alle poorten en draai de biochip ondersteboven zodat de cellen zich aan het PET-membraan kunnen hechten. Houd de biochip ondersteboven en incubeer een nacht in een celcultuurincubator bij 37 °C en 5% CO2 .
4. Dag 4 - Dag 7: Onderhoud van cellen en oogsten van monocyten
- Voer dagelijkse mediumuitwisseling uit in de boven- en onderste kamer. Voer voor de bovenste kamer de mediumuitwisseling uit met 300 μL EC-medium.
- Gebruik 200 μL RPMI+ (RPMI-medium plus 1:100 (v/v) Penicilline/Streptomycine (10.000 E/ml), 10 ng/ml gm-csf, 10% autoloog humaan serum, 1 μM dexamethason) voor de onderste kamer. Spoel op dag 7 de onderste kamer met RPMI+ om de holte voor te bereiden op het zaaien van monocyten.
- Zaad 0,1 x 106 monocyten gesuspendeerd in 200 μL RPMI+ in de onderste kamer.
- Monocyten oogsten
- Was de cellen met 1 ml PBS (-/-) en incubeer gedurende 7 minuten bij 37 °C in voorverwarmde PBS (-/-) met 4 mg/ml lidocaïne + 5 mM EDTA bij 37 °C en 5% CO2.
- Verzamel de cellen en centrifugeer op 350 x g gedurende 7 minuten, resuspendeer de cellen in 1 ml RPMI+ en tel. Plaats de biochippoorten naar beneden gericht zodat de cellen zich aan het membraan hechten.
5. Dag 8: Biochip perfusie
- Zorg er nu voor dat de biochips klaar zijn om op de stroom te worden aangesloten en te worden doorbloed. Voordat u met de perfusie begint, bereidt u een lege couveuse voor en plaatst u de peristaltische pomp erin.
- Perfusie van de biochips
- Voordat u de gesteriliseerde slang op de biochip bevestigt, spoelt u de slang door met 200 μL PBS (+/+), gevolgd door 200 μL EC-medium. De slang heeft een binnendiameter van 0,5 mm, bestaande uit langere (20 cm) en kortere (12 cm) zijden gescheiden door twee peristaltische pompstoppers. Leg de slang opzij en bereid de reservoirs voor op het medium.
- Voer mediumuitwisseling uit in de bovenste en onderste kamers door ze te spoelen met het respectievelijke vers bereide celcultuurmedium.
- Plaats het reservoir aan de uitlaatzijde van de biochip en sluit het reservoir met de slang aan op de inlaat van de biochip (Figuur 2). Sluit de slang aan op het reservoir en de biochip zodat er een cirkelvormige mediumperfusie is tussen het reservoir en de biochip.
- Zodra alles op de poorten is aangesloten, vult u het reservoir met een EC-medium van 500 μL. Sluit de biochip aan op de slang op een perfusie met een debiet van 21 μL/min (Figuur 2). Observeer nauwlettend tijdens de eerste 15 minuten van de perfusie voor het inbrengen van bubbels. Voer dagelijks een mediumuitwisseling uit in beide kamers.
6. Dag 9 - Dag 11: Opzetten van een lucht-vloeistof interface
- Stop de perfusie, leeg de reservoirs en vul opnieuw met vers bereid medium onder een steriele veiligheidskast. Pipeteer 500 μL EC-medium in de reservoirs en spoel de onderste kamer voorzichtig door met 200 μL RPMI+. Start de perfusie opnieuw met een perfusiesnelheid van 21 μL/min.
- Lucht Vloeistof Interface (ALI)
- Stel ALI vast vanaf dag 12 tot het einde van het experiment (dag 14). Stel tijdens de ALI-cultuur de epitheelcellen bloot aan lucht.
- Om de ALI-cultuur tot stand te brengen, bereidt u een nieuw vasculair medium EC voor (voeg 1:100 (v/v) penicilline/streptomycine (10.000 E/ml), 10 ng/ml GM-CSF, 20% autoloog humaan serum, 1μM dexamethason toe) om alle celtypen in de chip te behouden. Op dit punt bevat het medium een hogere concentratie AS (20%).
- Open de pluggen in de onderste kamer onder een steriele veiligheidskast en zuig het medium voorzichtig op totdat er een luchtbel zichtbaar is, zoals weergegeven in afbeelding 3. Zorg ervoor dat de volledige vloeistof uit het kanaal en de kamer is verwijderd en sluit de poorten zorgvuldig.
- Vul de reservoirs met EC (-/-) medium en ga door met de perfusiecultuur met een debiet van 21 μL/min. Vervang het medium alleen in de bovenste kamer tot dag 14 en bewaar de epitheelcellen in de onderste kamer met alleen lucht.
7. Dag 14: Weefsel oogsten en analyseren
- Koppel de biochip los van de stroom. Sluit de slang aan en controleer de microscoop op celconfluentie. Door de lucht in de onderste kamer kunnen de cellagen wazig en moeilijk te visualiseren lijken. Op dit punt is het model klaar om verder te experimenteren.
- Fixatie en kleuring van weefsel in biochip
- Was de holtes met PBS (+/+) om het celkweekmedium te verwijderen. Pipetteer 300 μL 4% paraformaldehyde (PFA) opgelost in PBS (-/-) in de bovenste kamer en 200 μL in de onderste kamer en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
OPMERKING: Gebruik bij het werken met fixatiechemicaliën zoals PFA een zuurkast. Verzamel en voer het afval dienovereenkomstig af. - Was de kamers 3x met PBS (+/+). Bewaar de biochips na fixatie bij 4 °C of gebruik ze direct voor immunofluorescentiekleuring van cellen.
- Voor permeabilisatie pipet 300 μL 0,25% Triton X-100 in PBS (+/+). Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
- Was na incubatie beide kamers met PBS (+/+) en pipetteer 300 μL 3% runderserumalbumine (BSA) in PBS (+/+) in beide kamers. Incubeer gedurende 1 uur bij RT.
- Bereid intussen het antilichaampaneel voor op immunofluorescentiekleuring. Om het antilichaampaneel voor te bereiden op immunofluorescentiekleuring, werd een buisje met een voldoende hoeveelheid van 3% BSA opgezet om de antilichamen te verdunnen. Gebruik 50 μL antilichaamverdunningen voor elk membraan. Gebruik een verdunningsverhouding van 1:100 voor primaire antilichaampanels en 1:200 voor secundaire antilichaampanelen. Bereid bovendien DAPI voor het secundaire antilichaampanel in een verdunningsverhouding van 1:2.000. Voor overeenkomstige antilichamen, zie (Tabel 1).
- Om direct toegang te krijgen tot de cellen in de biochip, moet de hechtfolie worden verwijderd. Om de microfluïdische kamers te openen, maakt u een exacte snede over de buitenkant van de holte en verwijdert u de hechtfolie. Knip het membraan uit door de randen die met het scalpel aan de biochip zijn vastgemaakt te verwijderen.
NOTITIE: Werk nauwkeurig en nauwkeurig tijdens deze stap om schade aan het membraan en verwondingen als gevolg van de scherpte van het scalpel te voorkomen. - Nadat je het membraan van de biochip hebt losgemaakt, verdeel je het membraan in twee stukken. Verzamel de stukjes membraan met een pincet en plaats ze op een microscopisch glaasje om te kleuren.
- Pipetteer 50 μL antilichaamoplossing per membraanstuk. 's Nachts incuberen bij 4 °C, beschermd tegen licht.
- Plaats het membraan na incubatie in 500 μL PBS (-/-) in een plaat met 24 putjes en was het membraan 3x gedurende 5 minuten in PBS (+/+). Na het wassen 50 μL secundaire antilichaamoplossing pipotteren en gedurende 1 uur incuberen bij RT beschermd tegen licht.
- Was het membraan met PBS (+/+) 3x gedurende 5 minuten elk. Bereid ondertussen de microscopische objectglaasjes voor het experiment voor en label ze. Plaats een druppel montagemedium op het objectglaasje en plaats het bijbehorende membraan. Herhaal deze stap voor alle membranen. Plaats aan het einde nog een druppel van het montagemedium op de bovenkant van het membraan en gebruik een afdekglas. Bewaren bij 4 °C.
- Was de holtes met PBS (+/+) om het celkweekmedium te verwijderen. Pipetteer 300 μL 4% paraformaldehyde (PFA) opgelost in PBS (-/-) in de bovenste kamer en 200 μL in de onderste kamer en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een onderzoek naar morfologische veranderingen en de expressie van markereiwitten kan worden uitgevoerd met behulp van immunofluorescentiekleuring. Na 14 dagen co-culturatie worden de vasculaire en epitheelzijden geanalyseerd op expressie van de respectievelijke celmarkers. Deze methode is nuttig voor het bestuderen van de interacties en integriteit van vasculaire en epitheliale componenten, wat essentieel is voor ziektemodellering als een functionele biologische uitlezing gerelateerd aan infectie. Immunofluorescentiekle...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het alveolus-on-chip-model vertegenwoordigt een meerlagig weefselmodel van de menselijke alveolus, waarbij essentiële celtypen van de onderste luchtwegen worden geïntegreerd, waaronder longepitheelcellen, endotheelcellen en macrofagen, gekweekt in een organotypische opstelling bij een ALI met gemiddelde perfusie van de endotheelbekleding. Cellen van verschillende lagen brengen specifieke celmarkereiwitten tot expressie, zoals E-cadherine, een calciumafhankelijk adhesiemolecuul van longepitheelcellen, dat centraal staat b...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
K.R. is CEO van Dynamic42 GmbH en heeft aandelen in het bedrijf. A.S.M. is wetenschappelijk adviseur van Dynamic 42 GmbH en heeft aandelen in het bedrijf. Alle andere auteurs hebben geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
H.K. en A.S.M. erkennen de financiering van de Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, gefinancierd door de financieringslijn Strategic Networking van de Leibniz Association. M.A. en A.S.M. werden gesteund door het IGF-project IMPROVE, gefinancierd door het Bondsministerie van Economische Zaken en Energie op basis van een resolutie van de Duitse Bondsdag. A.S.M erkent verder financiële steun van het Cluster of Excellence Balance of the Microverse in het kader van de Duitse Excellence Strategy - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Verbruiksartikelen | |||
| Cellcounting chamber slides (Countess) | Invitrogen | C10283 | |
| Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| Coverslips (24x40mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | |
| Eco wipes | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
| Gauze swab | Noba | PZN 2417767 | |
| Handschoenen Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
| Microscope slides | Menzel-Gläser | AAAA000001##12E | |
| Multiwell Plates 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Pasteur pipettes (glass) 150mm | Assistent | 40567001 | |
| Pasteur pipettes (glass) 230mm | Assistent | 40567002 | |
| Round-bottom tubes (PS, 5mL) | Falcon | 352052 | |
| Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| Scalpels | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| Serological pipettes 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| Serological pipettes 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| Serological pipettes 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| Serological pipettes 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
| Serological pipettes 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Softasept N | Braun | 3887138 | |
| T25 flask | Greiner Bio-One | 690 960 | |
| Tips sterile 10µL | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| Tips sterile 1250µL | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| Tips sterile 300µL | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| Tips unsterile 10µL | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| Tips unsterile 1000µL | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| Tips unsterile 200µL | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
| Chemicals | |||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
| Ethanol 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Methanol | VWR | 20847.295 | |
| Saponin | Fluka | 47036 | |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
| Cell culture | |||
| Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E788S | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | |
| Fetal bovine Serum | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| Lidocain | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | 72400047 | |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Primary antibodies | |||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat) | BD | 610252 | |
| CD68 (rabbit) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Cadherin (goat) | R&D | AF748 | |
| SP-A (mouse) | Abcam | ab51891 | |
| Secondary antibodies | |||
| AF488 (donkey anti mouse) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (donkey anti mouse) | invitrogen | A31571 | |
| AF647 (donkey anti rabbit) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (donkey anti goat) | jackson research | 705-165-147 | |
| Microfluidic |
Referenties
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
