Ons gedetailleerde protocol schetst de creatie en het gebruik van het geavanceerde darm-op-chip-model, dat menselijk darmslijmvlies simuleert met 3D-structuren en verschillende celtypen, waardoor een diepgaande analyse van immuunresponsen en cellulaire functies als reactie op microbiële kolonisatie mogelijk is.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Immunocompetent darm-op-chip-model voor het analyseren van immuunresponsen van het darmslijmvlies
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er is een geavanceerd darm-op-chip-model ontwikkeld dat epitheliale 3D-organotypische villusachtige en crypte-achtige structuren nabootst. Het immunocompetente model omvat endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC), Caco-2 darmepitheelcellen, in het weefsel wonende macrofagen en dendritische cellen, die zichzelf organiseren in het weefsel en de kenmerken van het menselijke darmslijmvlies weerspiegelen. Een uniek aspect van dit platform is het vermogen om circulerende menselijke primaire immuuncellen te integreren, waardoor de fysiologische relevantie wordt vergroot. Het model is ontworpen om de reactie van het intestinale immuunsysteem op bacteriële en schimmelkolonisatie en infectie te onderzoeken. Vanwege de vergrote holtegrootte biedt het model diverse functionele uitlezingen zoals permeatietests, cytokine-afgifte en immuuncelinfiltratie, en is het compatibel met immunofluorescentiemeting van 3D-structuren gevormd door de epitheelcellaag. Het biedt hierbij uitgebreid inzicht in celdifferentiatie en -functie. Het darm-op-chip-platform heeft zijn potentieel aangetoond bij het ophelderen van complexe interacties tussen surrogaten van een levende microbiota en menselijk gastheerweefsel binnen een microfysiologisch doorbloed biochipplatform.
Inleiding
Organ-on-Chip (OoC) systemen vertegenwoordigen een opkomende techniek van 3D-celcultuur die in staat is om de kloof tussen conventionele 2D-celcultuur en diermodellen te overbruggen. OoC-platforms bestaan doorgaans uit een of meer compartimenten met weefselspecifieke cellen die zijn gekweekt op een breed scala aan steigers, zoals membranen of hydrogels1. De modellen zijn in staat om een of meer gedefinieerde organotypische functies na te bootsen. Pompen maken continue microfluïdische perfusie van celkweekmedium mogelijk voor de verwijdering van cellulaire afvalproducten, toevoer van voeding en groeifactoren voor verbeterde cellulaire differentiatie en het nabootsen van essentiële in vivo omstandigheden. Met de integratie van immuuncellen kunnen OoC-systemen de menselijke immuunrespons in vitro nabootsen 2. Tot op heden is een breed scala aan organen en functionele eenheden gepresenteerd1. Deze systemen omvatten modellen van het vaatstelsel3, long4, lever 2,5 en darm6 die kunnen worden gefaciliteerd voor het testen van geneesmiddelen 5,7 en infectiestudies 6,8.
We presenteren hier een menselijk darm-op-chip-model dat menselijke epitheelcellen integreert en een organotypische 3D-topografie vormt van villusachtige en crypte-achtige structuren gecombineerd met een endotheelbekleding en weefsel-residente macrofagen. Het model wordt gekweekt in een microfluïdisch geperfundeerde biochip in de vorm van een microscopisch objectglaasje. Elke biochip bestaat uit twee afzonderlijke microfluïdische holtes. Elke holte is door een poreus polyethyleentereftalaat (PET) membraan verdeeld in een boven- en onderkamer. Het membraan zelf dient ook als steiger voor de cellen om aan elke kant te groeien. De poriën van het membraan maken cellulaire overspraak en celmigratie tussen cellagen mogelijk. Elke kamer is toegankelijk via twee vrouwelijke poorten ter grootte van een luer-slot. Optioneel kan een extra poort ter grootte van een mini-luer-slot toegang bieden tot de boven- of onderkamer (Figuur 1).
Het OoC-platform biedt een aantal uitlezingen die uit een enkel experiment kunnen worden gehaald. De darm-op-chip is afgestemd op het combineren van geperfuseerde 3D-celcultuur, effluentanalyse en fluorescentiemicroscopie om de expressie van celmarkers, metabolisatiesnelheden, immuunrespons, microbiële kolonisatie en infectie en barrièrefunctie te beoordelen 3,6,8. Het model omvat weefsel-residente immuuncellen en direct contact van levende micro-organismen met het gastheerweefsel, wat een voordeel is in vergelijking met andere gepubliceerde modellen9. Verder organiseren epitheelcellen zichzelf tot driedimensionale structuren die een fysiologisch relevante interface bieden voor de kolonisatie met een levende microbiota6.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol vereist toegang tot ~20 ml vers bloed per biochip van gezonde donoren om primaire menselijke monocyten te isoleren. Alle donoren gaven schriftelijke, geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan deze studie, die werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Ziekenhuis Jena (toestemmingsnummer 2018-1052-BO). Raadpleeg de materiaaltabel voor meer informatie over de materialen. Voor details over de samenstelling van alle oplossingen en media, zie Tabel 1.
1. Algemene opmerkingen over de omgang met biochips
- Scheid voorzichtig een strook reservoirs en verwijder de deksels met een verwarmd mes om enkele reservoirs en deksels te verkrijgen. Vergroot het gat van het deksel zodat de siliconenslang goed past.
- De siliconenslang heeft een binnendiameter van 0,5 mm, is asymmetrisch en wordt gescheiden in langere (20 cm) en kortere (12 cm) zijden door twee peristaltische pompstoppers. Monteer twee buizen van elke symmetrie per biochip door een buis te bevestigen aan een mannelijke luer lock-connecter en het deksel aan de andere kant van de buis. Monteer ook vier reservoirs per biochip.
NOTITIE: Bereid slangen en reservoirs van tevoren voor en steriliseer ze voor gebruik in de autoclaaf. Aangezien de siliconenslang een beperkte levensduur heeft, vervangt u de slang na 3-5 experimenten. Voor bepaalde onderzoeksinteresses, zoals het testen van geneesmiddelen, wordt geadviseerd om voor elk experiment nieuwe slangen voor te bereiden. Veel stappen van dit protocol lopen parallel; Raadpleeg de overzichtsfiguur, die de verschillende stappen markeert die op één dag zijn uitgevoerd, zoals weergegeven in afbeelding 2.
Figuur 1: Schematische weergave van het darm-op-chip-model. (A) De biochip wordt gepresenteerd in een dwarsdoorsnede. (B) De afmeting van de hele biochip en van het platte, verwijderbare PET-membraan is zichtbaar. Het totale volume van de bovenste kamer, inclusief de poorten ter grootte van de vrouwelijke luer lock, is respectievelijk 290 μl en 270 μl voor de onderste kamer. (C) Er is een schematische samenstelling te zien van de darmbiochip, het driedimensionale uitgroei-epitheel dat lijkt op villusachtige en crypte-achtige structuren inclusief gedifferentieerde immuuncellen en een slijmlaag. De andere kant van het PET-membraan is bedekt met een endotheliale monolaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch overzicht van de tijdlijn van de modelopbouw en de experimentele opstelling. Deze figuur toont het schematische overzicht van het gepresenteerde protocol. Belangrijke procedures, zoals het zaaien van cellen en de epitheliale uitdaging met LPS, worden aangegeven met pijlen. Afkortingen: HUVEC's = menselijke navelstreng veneuze endotheelcellen; LPS = lipopolysacharide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Sterilisatie van biochips
- Vul een steriel glazen petrischaaltje met een diameter van 15 cm met 70% niet-gedenatureerde ethanol. Plaats de biochip erin zodat alle poorten van de biochip volledig bedekt zijn met de ethanoloplossing.
- Trek twee keer per poort 1 ml 70% ethanol door alle kamers van de chip. Incubeer gedurende 45-60 minuten bij kamertemperatuur (RT).
NOTITIE: Zorg ervoor dat er geen lucht in de biochip zit. Vanaf dit punt mag er geen lucht meer in het biochipsysteem komen en moeten de holtes gevuld blijven met vloeistof. - Verwijder de ethanol in de petrischaal en vervang deze door steriel dubbel gedestilleerd water (ddH2O) totdat alle poorten volledig zijn afgedekt. Nogmaals, twee keer per poort, zuig 1 ml ddH2O door de biochipholte. Ververs de ddH2O in de petrischaal en herhaal de procedure.
- Verwijder al het vocht uit de petrischaal. Bewaar de volledig gesteriliseerde biochips hierna in de gesloten petrischaal wanneer ze zich buiten een steriele omgeving bevinden. Voeg een klein reservoir (bijv. het deksel van een tube van 50 ml) van 2-5 ml ddH2O toe aan de petrischaal om de verdamping van vloeistof in de biochip te verminderen.
OPMERKING: Biochips kunnen tot 3 dagen van tevoren worden gesteriliseerd als ze tot gebruik in een steriele omgeving worden bewaard. Dit zorgt voor flexibiliteit in de werklast op één dag.
3. HUVEC's oogsten en zaaien
OPMERKING: De menselijke navelstreng veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden geïsoleerd uit navelstrengen zoals gepubliceerd vóór10.
- Voordat u de HUVEC's zaait, smeer u het membraan in met humaan collageen IV. Bereid hiervoor een verdunning van 1:100 van een collageenbouillonoplossing (tabel 1) in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing die magnesium en calcium bevat (PBS +/+). Voeg 350 μL van de verdunde stockoplossing toe aan de betreffende kamer. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
OPMERKING: Als u de biochip in de steriele kap hanteert, raden we aan om er een steriel doekje onder te leggen om overmatig medium op te vangen. - Spoel alle kamers twee keer door met 350 μL PBS +/+ om het resterende collageen en azijnzuur weg te spoelen. Voeg vervolgens 350 μL endotheelcelgroei (EC)-medium toe aan elke kamer.
OPMERKING: Vanaf hier zijn de biochips klaar voor celzaaien en kunnen ze tot gebruik bij 37 °C worden bewaard. - Gebruik HUVEC's bij passages 1-3 bij 80-90% celconfluentie. Kweek HUVEC's in EC-medium met een gedefinieerde supplementenmix die door de fabrikant wordt geleverd. Een representatief helderveldbeeld van een HUVEC-celcultuur wordt weergegeven in figuur 3A.
OPMERKING: Afhankelijk van de donor kunnen HUVEC's met hogere passages beginnen te dedifferentiëren en kunnen ze niet op betrouwbare wijze een dichte en samenvloeiende monolaag in de biochip vormen. Het gebruik van antibiotica, d.w.z. 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine, is optioneel, maar wordt aanbevolen als aanvulling op het EC-medium om microbiële besmetting te voorkomen. - Verwijder het celkweekmedium uit een T25-celkweekkolf en was de cellen voorzichtig met 3-5 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder magnesium en calcium (PBS -/-). Verwijder de PBS -/- en voeg 1 ml trypsinedissociatiereagens toe (tabel 1). Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C tot de cellen loskomen van de celkweekkolf.
- Breng de losgemaakte cellen over in een buisje met 9 ml 5% foetaal runderserum (FBS) in PBS -/-. Centrifugeer bij 350 × g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml EC-medium en bepaal het aantal cellen. Stel de celconcentratie in op 0,4 × 106 cellen per 150 μL (zaaien in de onderste kamer) of per 250 μL (zaaien in de bovenste kamer).
- Voeg het respectieve volume van de cellen toe aan de kamer. Als er in de onderste kamer wordt gezaaid, sluit dan alle poorten en plaats de biochip onmiddellijk ondersteboven zodat de cellen op het PET-membraan vallen. Incubeer de biochips in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 .
- Voer na 24 uur een mediumvervanging uit van de HUVEC-bevattende kamer met 350 μL EC-medium. Het medium in de tegenoverliggende kamer hoeft niet te worden vervangen.
4. Verzameling van menselijk serum en isolatie van perifere mononucleaire cellen (PBMC) van monocyten
OPMERKING: De PBMC's werden geïsoleerd zoals beschreven in Mosig et al.11.
- Menselijk veneus bloed afnemen van gezonde donoren. Koop per biochip minimaal 10 ml volbloed in silicaathoudende bloedafnamebuisjes voor serumafname. Centrifugeer na volledige coagulatie de bloedafnamebuisjes bij 2.500 × g gedurende 10 minuten bij RT. Verzamel het serum, aliquot, en bewaar bij -20 °C tot verder gebruik.
- Koop minimaal 10 ml volbloed van dezelfde donor in EDTA-bevattende bloedafnamebuisjes voor PBMC-isolatie. Meng het niet-gecoaguleerde bloed voorzichtig 1:1 met isobuffer (tabel 1) door inversie en leg langzaam 35 ml van dit mengsel op 15 ml van een dichtheidsgradiëntmedium met een dichtheid van 1,077 g/ml in een buisje van 50 ml.
- Centrifugeer bij 800 × g gedurende 20 minuten zonder rem bij RT. Trek voorzichtig de resulterende immuuncellaag terug, die bovenop het dichtheidsgradiëntmedium verschijnt, en breng deze over in een nieuwe buis van 50 ml. Vul tot 50 ml met koude isobuffer en was de cellen door middel van zachte inversie.
- Centrifugeer bij 200 × g gedurende 8 minuten zonder rem bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer in 10 ml isobuffer per dichtheidsgradiënt. Optioneel: Pool PBMC's van één donor als er meerdere gradiënten parallel worden uitgevoerd.
- Centrifugeer bij 150 × g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 10 ml isobuffer per dichtheidsgradiënt. Herhaal centrifugatiestap 4.4. Gooi ten slotte het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 2 ml monocytendifferentiatiemedium (tabel 1).
OPMERKING: De toevoeging van M-CSF en GM-CSF versterkt de differentiatie van de geïsoleerde monocyten naar van monocyten afgeleide macrofagen en van monocyten afgeleide dendritische cellen (in combinatie met lipopolysaccharide [LPS], dat op een later punt van dit protocol wordt toegevoegd). Het gebruik van antibiotica, d.w.z. 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine, is optioneel, maar wordt aanbevolen als aanvulling op het medium om microbiële besmetting te voorkomen. - Bepaal het celaantal en zaad ~10 × 106 cellen per putje van een plaat met 6 putjes in 2 ml monocytendifferentiatiemedium (tabel 1). Incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 °C gedurende 1 uur om bevestiging van monocyten aan het plastic van de plaat met 6 putjes mogelijk te maken.
- Gooi het supernatans voorzichtig weg en was 2x met voorverwarmd 2 ml hematopoëtisch celmedium om de ongebonden cellen te verwijderen. Incubeer bij 37 °C gedurende nog eens 24 uur in monocytendifferentiatiemedium.
- Om de monocyten te oogsten, gooit u het supernatans voorzichtig weg en wast u één keer met 2 ml voorverwarmd PBS -/-. Zie figuur 3B voor een voorbeeld van een helderveldopname van de monocytencultuur op dit punt. Incubeer de cellen vervolgens gedurende 7 minuten in 1 ml voorverwarmd reagens voor monocytloslating (tabel 1) bij 37 °C om loslating van de monocyten van het plastic van de plaat met 6 putjes te forceren.
- Breng de losgemaakte monocyten over naar een buis met een lage binding. Optioneel: om een hogere celopbrengst te bereiken, wast u de 6-wells plaat meerdere keren zorgvuldig met PBS -/-.
- Centrifugeer bij 300 × g gedurende 8 minuten bij RT. Gooi het supernatans weg en repuseer het in een EG-geconditioneerd medium (tabel 1). Bepaal het aantal cellen en stel de celconcentratie in op 0,1 × 106 cellen per 150 μL (zaaien in de onderste holte) of per 250 μL (zaaien in de bovenste holte).
OPMERKING: Wees voorzichtig bij alle stappen van de isolatie van immuuncellen en verminder de schuifkrachten om activering van immuuncellen te voorkomen. Controleer bij het instellen van deze isolatie de zuiverheid van de PBMC-afgeleide monocyten (bijv. via flowcytometrie). Meer dan 95% van alle cellen zou positief moeten zijn voor typische monocytmarkers zoals CD14.
5. Pofocyten zaaien
- Voer een mediumuitwisseling uit in de HUVEC-bevattende kamer met 350 μL voorverwarmd EC-geconditioneerd medium.
- Voeg 150 μl (onderste kamer) of 250 μl (bovenste kamer) van de bereide monocytensuspensie (zie stap 4.10) toe aan dezelfde kamer. Als er in de onderste kamer wordt gezaaid, sluit dan alle poorten en plaats de biochip onmiddellijk ondersteboven zodat de cellen op de HUVEC-laag kunnen vallen. Incubeer de biochip in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 .
- Voer elke 24 uur een mediumuitwisseling uit in de HUVEC + monocytenbevattende kamer met 350 μL EC-geconditioneerd medium.
6. C2BBe1 oogsten en zaaien
OPMERKING: Caco-2 penseelrand die cellen 1 (C2BBe1)12 tot expressie brengt, wordt gebruikt tot passage 35 en is afkomstig uit kolven met een confluentie van 80-90%. Een representatief helderveldbeeld van een C2BBe1-cultuur wordt weergegeven in figuur 3C.
- Kweek C2BBe1-cellen in C2-medium (Tabel 1).
OPMERKING: Het gebruik van antibiotica, d.w.z. 20 μg/ml gentamicine, is optioneel, maar wordt aanbevolen als aanvulling op het C2-medium om microbiële besmetting te voorkomen. - Verwijder het celkweekmedium van een T25-celkweekkolf en was de cellen voorzichtig met 3-5 ml PBS -/-. Verwijder de PBS -/- en voeg 1 ml trypsinedissociatiereagens toe (tabel 1). Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C tot de cellen loskomen van de celkweekkolf.
- Breng de losgemaakte cellen over naar een buis met behulp van 9 ml 5% foetaal runderserum (FBS) in PBS -/-. Centrifugeer bij 350 × g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml C2-medium en bepaal het aantal cellen. Stel de celconcentratie in op 0,5 × 106 cellen per 150 μL (zaaien in de onderste kamer) of per 250 μL (zaaien in de bovenste kamer).
- Was voor het zaaien van de C2BBe1 de betreffende kamer voorzichtig met 350 μL C2-medium.
- Voeg 150 μL (onderste kamer) of 250 μL (bovenste kamer) van de bereide C2BBe1-suspensie (zie stap 6.3) toe aan de betreffende kamer. Als het in de onderste kamer wordt gezaaid, sluit dan alle poorten en plaats de biochip onmiddellijk ondersteboven zodat de cellen op het PET-membraan kunnen vallen. Incubeer de biochips in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 .
Figuur 3: Celmorfologie van HUVEC's, monocyten en C2BBe1 voordat ze in de biochip worden gezaaid. Deze afbeelding toont representatieve helderveldbeelden van de verschillende celbronnen die in het hele protocol worden gebruikt. De foto's zijn gemaakt met een omgekeerde helderveldmicroscoop met een vergroting van 10x. Alle celtypen, (A) HUVEC's, (B) monocyten en (C) C2BBe1 werden gekweekt in 2D mono-layer celcultuur zoals beschreven in hun specifieke protocolsecties. Schaal balken = 200 μm. Afkortingen: HUVEC's = menselijke navelstreng veneuze endotheelcellen; PBMC's = perifere mononucleaire bloedcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Aansluiting op peristaltische pomp en circulaire perfusie
- Bereid een lege couveuse voor met behulp van een peristaltische pomp. Reinig alle delen van de couveuse en pomp grondig met ontsmettingsmiddel om een quasi-steriele omgeving te creëren.
OPMERKING: Peristaltische pompen kunnen tijdens het gebruik veel warmte produceren. In goed geïsoleerde incubatoren of laboratoria met slecht geklimatiseerde laboratoria kan het aantal bruikbare pompen per incubator beperkt zijn, omdat incubatoren de neiging hebben oververhit te raken. Twee slangenpompen per couveuse zouden voldoende moeten zijn. - Voordat u de gesteriliseerde buisjes op de biochip bevestigt, spoelt u elke slang door met 700 μL PBS +/+ gevolgd door 500 μL C2-medium of EC-geconditioneerd medium. Bereid van elke symmetrie één slang per medium voor (zie stap 1.2). Gebruik de slang met de korte afstand van de luer-lock tot de peristaltische pompstop voor de linker holte en de slang met de andere symmetrie voor de rechterholte.
- Haal de biochip uit de incubator en voer een mediumwissel uit met 350 μL voor elke kamer. Verwijder alle stekkers en vul alle poorten helemaal tot aan de bovenkant.
- Begin bij de linkerholte en sluit de eerste slang aan op de rechterpoort van de bovenste kamer door de luer lock-adapter in de poort van de biochip te steken. Sluit vervolgens de tweede slang aan op de linkerpoort van de onderste kamer. Herhaal deze procedure voor de juiste microfluïdische holte.
- Neem een reservoir en voeg een klein druppeltje celkweekmedium toe aan de bodem van het reservoir. Plaats vervolgens het reservoir aan de andere kant van de eerste slang en herhaal dit voor de andere kamer. Zodra alle poorten zijn aangesloten op een slang of reservoir, vult u de reservoirs met 3,5 ml celkweekmedium.
- Plaats de losse kant van de slang, waaraan het deksel is bevestigd, op het reservoir om het microfluïdische systeem van elke kamer te sluiten. Transporteer in deze toestand de biochip naar de peristaltische pomp.
OPMERKING: Afhankelijk van de afstand tot de incubator en de laboratoriumomgeving kan een eerder gereinigde en geautoclaveerde doos worden gebruikt om de chips naar de incubator over te brengen. - Gebruik de peristaltische pompstoppers om de slang op de pomp aan te sluiten. Sluit elke slang zo aan op de peristaltische pomp dat het medium vanuit het reservoir in de holte stroomt, in de slang en via de pomp terug in het reservoir (Figuur 4). Het reservoir dient als bellenvanger in de cirkelvormige perfusie en voorkomt dat lucht vast komt te zitten in het systeem. Perfuseer elke kamer met een debiet van 50 μL/min, wat resulteert in een schuifspanning van 0.013 dyn/cm2 in de bovenste kamer en 0.006 dyn/cm2 in de onderste kamer8.
OPMERKING: Als het medium van de onderste en bovenste holtes in tegengestelde richting wordt bewogen, kan een hogere driedimensionale uitgroei van het darmweefsel worden bereikt13. Daarom worden de reservoirs van de bovenste en onderste holtes aan tegenoverliggende zijden geplaatst (Figuur 4). De circulaire perfusie vermindert de hoeveelheid benodigde celkweekmedium, maar kan mogelijk leiden tot de verrijking van cytokinen en metabolieten. Indien gewenst is ook een lineaire perfusie van de biochip mogelijk. - Perfuseer de biochip gedurende 72 uur bij 37 °C en 5% CO2 .
Figuur 4: Biochip aangesloten op peristaltische pomp. Er wordt een voorbeeld gegeven van een biochip die is aangesloten op een peristaltische pomp. Epitheliale C2BBe1-cellen worden gekweekt in de onderste kamer (rood C2-medium bevindt zich in de reservoirs aan de voorkant), terwijl de HUVEC's worden gekweekt in de bovenste kamer (geelachtig EC-geconditioneerd medium bevindt zich in de reservoirs aan de achterkant). De verschillende celkweekmedia mengen zich niet vanwege de barrièrefunctie van het gekweekte weefsel. De biochip is zo verbonden met de slangenpomp dat het medium vanuit het reservoir de holte in stroomt. Vanaf hier stroomt het medium via de slang via de pomp terug het reservoir in. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
8. LPS-conditionering van de epitheelbarrière
- Stop na 72 uur voorbereiding de peristaltische pomp en verwijder het deksel dat is aangesloten op de slang van elk reservoir. Leg het op een steriel doekje naast de pomp.
- Verwijder al het medium en vul de reservoirs met 2 ml vers bereid medium. Voor de epitheelzijde die de C2BBe1-cellen bevat, voeg je 100 ng/ml LPS toe aan het medium.
OPMERKING: De LPS verhoogt de barrièrefunctie van het weefsel, stimuleert de van monocyten afgeleide macrofagen om naar het epitheelweefsel te migreren en maakt differentiatie van van monocyten afgeleide dendritische cellen mogelijk. - Sluit de slang en deksels weer aan op het reservoir en zet de cirkelvormige perfusie voort met een debiet van 50 μl/min gedurende nog eens 24 uur.
OPMERKING: Vanaf dit punt kan het chipmodel worden gebruikt in experimenten, het testen van verbindingen of infectiestudies. We raden aan om elke 24 uur een mediumvervanging van 2 ml per reservoir uit te voeren.
9. Toegang tot het weefsel voor verschillende uitleesmethoden
- Verzamel op elk moment van de perfusie supernatanten uit de reservoirs van de celcultuur. Open het reservoir en verzamel het gewenste volume (zie stappen 8.1-8.3). Gebruik deze supernatanten voor de detectie van metabolieten, cytokines of andere moleculen.
- Om toegang te krijgen tot het weefsel, gebruikt u een scalpel om een nauwkeurige snede langs de buitenkant van de bovenste kamer te maken en verwijdert u de hechtfolie om de microfluïdische holte te openen. Het weefsel van het darm-biochipmodel is nu toegankelijk. Snijd voorzichtig langs de buitenkant van de microfluïdische kamer om het membraan los te maken van de biochip. Verzamel het weefselbevattende membraan met een pincet.
LET OP: Houd rekening met de plaatsing van de vingers tijdens deze stap en werk voorzichtig om ongelukken te voorkomen. Snijbestendige handschoenen worden aanbevolen. - U kunt ook de cellen uit afzonderlijke lagen in de biochip oogsten met behulp van enzymoplossingen, d.w.z. trypsine of cellen die zijn gelyseerd met behulp van Triton X-100-bevattende buffers.
10. Beoordeling van de permeabiliteit via FITC-dextraan-diffusie
OPMERKING: De barrièrefunctie van het weefsel kan worden geanalyseerd via een FITC-dextran-permeabiliteitstest na loskoppeling van de peristaltische pomp. De beoordeling van de FITC-dextranpermeabiliteit is overgenomen van Deinhardt-Emmer et al.4.
- Bereid een stockoplossing van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran (molecuulgewicht van 3-5 kDa, tabel 1).
- Leeg de reservoirs en koppel de chip los van de perfusie.
- Voer een mediumuitwisseling uit in de bovenste en onderste kamer met fenolroodvrij medium.
OPMERKING: Deze stap is niet nodig als er tijdens het experiment al fenolroodvrij medium is gebruikt. - Voeg 350 μL 1 mg/ml FITC-dextraanoplossing toe aan de kamer met de C2BBe1-cellen.
- Sluit de poorten en incubeer de chip gedurende 60 minuten bij 37 °C met de epitheelzijde naar boven.
- Verzamel na de incubatietijd het kweekmedium uit beide kamers van de chip afzonderlijk en bewaar het bij 4 °C, beschermd tegen licht tot de meting.
- Maak voor de meting een standaardcurve in C2-medium en het EC-geconditioneerde medium zonder fenolrood in het bereik van 1.000 μg/ml tot 0 μg/ml FITC-dextran met 11 opeenvolgende 1:2 seriële verdunningen.
- Breng 200 μL van elk monster over in een zwarte plaat met 96 putjes en een doorzichtige bodem. Meet de fluorescentie met een microplaatlezer bij een excitatiegolflengte van 495 nm en een emissiegolflengte van 517 nm.
- Gebruik de standaardcurve om de FITC-dextraanconcentratie van de monsters te berekenen en daarmee de permeabiliteitscoëfficiënt.
11. Immunofluorescentie kleuring
OPMERKING: Het levende weefsel kan microscopisch worden onderzocht. Voor een eenvoudigere bediening raden wij aan om de biochip los te koppelen van de peristaltische pomp en het gebruik van langeafstandsobjectieven op een omgekeerde microscoop. Als eindpuntanalyse kan het weefsel in de biochip worden gefixeerd voor procedures zoals immunofluorescentiekleuring.
- Stop de peristaltische pomp en open de reservoirs van alle holtes. Leeg de reservoirs en koppel de slang los, evenals de reservoirs van de biochip.
- Was de microfluïdische holtes twee keer per kamer met 500 μL koude PBS +/+. Voeg 500 μL ijskoude methanol toe aan alle holtes en incubeer gedurende 15 minuten bij -20 °C. Was vervolgens tweemaal per holte de microfluïdische kamer met 500 μL PBS +/+.
OPMERKING: Andere fixatiemethoden, zoals fixatie met 4% paraformaldehyde of het fixeermiddel van Carnoy, zijn ook geschikt. Na fixatie kunnen de chips worden bewaard bij 4 °C of direct overgaan tot immuunfluorescentiekleuring. LET OP: Fixerende chemicaliën zoals methanol of paraformaldehyde zijn giftig. Voer de respectievelijke taken uit onder een zuurkast en verzamel het afval dienovereenkomstig. - Open de chip zoals beschreven in stap 9.2 om toegang te krijgen tot het weefsel. Snijd het weefselbevattende PET-membraan in maximaal drie stukken om parallel met verschillende immunopanels te kleuren.
- Breng elk van de membraanstukken over naar een aparte plaat met 24 putjes met een blokkeer- en permeabiliserende oplossing (tabel 1) met behulp van een precisiepincet. Zorg ervoor dat de betreffende cellaag tijdens het hele kleuringsproces altijd naar boven wijst. Incubeer de membraanstukken gedurende 30 minuten bij RT.
OPMERKING: De beste kleuringsresultaten worden verkregen wanneer het serum wordt afgestemd op het secundaire antilichaam. Als er bijvoorbeeld secundaire antilichamen worden verkregen van geitensoorten, raden we het gebruik van normaal geitenserum aan. - Breng de membraanstukken over op een schoon glasplaatje in een vochtige kamer. Bereid het primaire antilichaampaneel voor in de kleuroplossing (tabel 1) en voeg 50 μl toe aan elk membraanstuk. Incubeer een nacht bij 4 °C.
OPMERKING: De optimale antilichaamconcentratie en kleuringswerkzaamheid kunnen verschillen tussen fabrikanten en klonen. We raden aan om de kleurplaten vooraf te testen in een 2D-celcultuur. - Breng de monsters na incubatie over naar een plaat met 24 putjes en was de membranen voorzichtig gedurende 3 x 5 minuten met wasoplossing (tabel 1).
- Breng de membraanstukken opnieuw over op een schoon glasplaatje in een vochtige kamer. Bereid het secundaire antilichaampaneel voor in kleuringsoplossing (tabel 1) en voeg 50 μl toe aan elk stuk membraan. Voeg indien nodig een nucleaire tegenvlek toe, zoals 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) of Hoechst. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
OPMERKING: Houd tijdens het werken met fluoroforen monsters beschermd tegen licht om fotobleken te voorkomen om de beeldkwaliteit te verbeteren. - Breng de monsters na incubatie over naar een plaat met 24 putjes en was de membranen voorzichtig 2 x 5 minuten met wasoplossing (tabel 1). Was vervolgens eenmaal met PBS +/+ gedurende 5 minuten.
- Monteer de membraanstukken op een schoon glasplaatje met behulp van een fluorescentie-montagemedium en een afdekglas. Bewaren bij 4 °C tot microscopische beeldvorming.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze representatieve resultaten tonen de verschillende weefsellagen van het darm-op-chip-model. Ze zijn immunofluorescerend gekleurd zoals beschreven in protocolsectie 11. De beelden werden gemaakt met een epifluorescentie- of confocale fluorescentiemicroscoop als z-stacks en verwerkt tot een orthogonale projectie. Zie de Tabel met Materialen voor details over de microscopische opstelling en software. Figuur 5 toont de vasculaire laag, een barrièrevormende endotheliale monol...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gepresenteerde protocol beschrijft de noodzakelijke stappen voor het genereren van een immunocompetent darm-op-chip-model. We beschreven specifieke technieken en mogelijke uitleesmethoden zoals immunofluorescentiemicroscopie, cytokine- en metabolietanalyse, flowcytometrie, eiwit- en genetische analyse en permeabiliteitsmeting.
Het beschreven model bestaat uit primaire HUVEC's, van monocyten afgeleide macrofagen en van monocyten afgeleide dendritische cellen die samen zijn gekweekt met een ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
M.R. is CEO van Dynamic42 GmbH en heeft aandelen in het bedrijf. A.S.M. is wetenschappelijk adviseur van Dynamic 42 GmbH en heeft aandelen in het bedrijf.
Dankbetuigingen
Het werk werd financieel ondersteund door het Collaborative Research Center, PolyTarget 1278 (projectnummer 316213987) aan V.D.W. en A.S.M., A.F. en A.S.M. erkennen verder de financiële steun van het Cluster of Excellence "Balance of the Microverse" in het kader van de Duitse Excellence Strategy - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860. We willen Astrid Tannert en het Jena Biophotonic and Imaging Laboratory (JBIL) bedanken voor het feit dat ze ons toegang hebben gegeven tot hun confocale laserscanmicroscoop ZEISS LSM980. Figuur 1C en Figuur 2 zijn gemaakt met Biorender.com.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96-well plate black, clear bottom | Thermo Fisher | 10000631 | Consumables |
| Acetic acid | Roth | 3738.4 | Chemicals |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Axiocam ERc5s camera | Zeiss | 426540-9901-000 | Technical equipment |
| Basal Medium MV, phenol red-free | Promocell | C-22225 | Cell culture consumables |
| Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Microfluidic consumables |
| BSA fraction V | Gibco | 15260-037 | Cell culture consumables |
| C2BBe1 (clone of Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Epithelial Cell Source |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Chemicals |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i | Technical equipment |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | Cell culture consumables |
| Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | Consumables |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose | Gibco | 41965-062 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose w/o phenol red | Gibco | 31053028 | Cell culture consumables |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Cell culture consumables |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Cell culture consumables |
| EDTA solution | Invitrogen | 15575-038 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | Cell culture consumables |
| Ethanol 96%, undenatured | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemicals |
| Fetal bovine Serum | invitrogen | 10270106 | Cell culture consumables |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemicals |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | Chemicals |
| Gentamycin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Cell culture consumables |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | Cell culture consumables |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell culture consumables |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epithelial Staining |
| Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma | Millipore | 616397 | Cell culture consumables |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Cell culture consumables |
| Human recombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Cell culture consumables |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | Fluorescence Microscope Setup |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | CLSM980 | Fluorescence Microscope Setup |
| Lidocain hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | Cell culture consumables |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630 | Cell culture consumables |
| Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Consumables |
| Low attachment tubes (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Consumables |
| Luer adapter for the top cap (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Microfluidic consumables |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | Microfluidic consumables |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140 | Cell culture consumables |
| Methanol | Roth | 8388.2 | Chemicals |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | Fluorescence Microscope Setup |
| Microscope slides | Menzel | MZ-0002 | Consumables |
| Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Multiskan Go plate reader | Thermo Fisher | 51119300 | Technical equipment |
| Normal donkey serum | Biozol | LIN-END9010-10 | Chemicals |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | Fluorescence Microscope Setup |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Cell culture consumables |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Microfluidic consumables |
| Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody | R&D Systems | AF938 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody | Dako | A0082 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | Fluorescence Microscope Setup |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1101-000 | Technical equipment |
| Reglo ICC peristaltic pump | Ismatec | ISM4412 |
Referenties
- Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
- Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model. BMC Res Notes. 16 (1), 285(2023).
- Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with Staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Kaden, T., et al. Generation & characterization of expandable human liver sinusoidal endothelial cells and their application to assess hepatotoxicity in an advanced in vitro liver model. Toxicology. 483, 153374(2023).
- Maurer, M., et al. A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies. Biomaterials. 220, 119396(2019).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Kaden, T., et al. Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity. Biomaterials. 307, 122525(2024).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nat Commun. 7, 11535(2016).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Mosig, S., et al. Different functions of monocyte subsets in familial hypercholesterolemia: Potential function of cd14+ cd16+ monocytes in detoxification of oxidized ldl. FASEB J. 23 (3), 866-874 (2009).
- Peterson, M., Mooseker, M. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeieton of the c2bbe clones of the human intestinal cell line, caco-2. J Cell Sci. 102, Pt 3 581-600 (1992).
- Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol (Camb). 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. The effect of membrane properties on cell growth in an 'airway barrier on a chip'. Organs-on-a-Chip. 5, 10025(2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
