Dit protocol beschrijft een robuuste methode voor het ontwikkelen van pellicle biofilm. De methode is schaalbaar naar verschillende kweekvolumes, waardoor ze gemakkelijk kunnen worden toegepast voor verschillende experimentele doeleinden. Het ontwerp van de methode maakt een kwalitatieve of kwantitatieve beoordeling van het biofilmvormend potentieel van verschillende mycobacteriële soorten mogelijk.
Methodenartikel
Mycobacteriële biofilm kweken als model om antimicrobiële resistentie te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel bacteriën gedijen goed in ingewikkelde natuurlijke gemeenschappen en vertonen belangrijke kenmerken van meercelligheid, zoals communicatie, samenwerking en competitie. De meest voorkomende manifestatie van bacterieel meercellig gedrag is de vorming van biofilms, vaak gekoppeld aan pathogeniteit. Biofilms bieden een toevluchtsoord tegen antimicrobiële middelen en bevorderen het ontstaan van antimicrobiële resistentie. De conventionele praktijk van het kweken van bacteriën in vloeibare culturen van schudkolven slaagt er niet in om hun juiste fysiologische groei in de natuur weer te geven, waardoor ons begrip van hun ingewikkelde dynamiek wordt beperkt. Met name de metabole en transcriptionele profielen van bacteriën die zich in biofilms bevinden, lijken sterk op die van natuurlijk groeiende cellen. Dit parallellisme onderstreept het belang van biofilms als een ideaal model voor fundamenteel en translationeel onderzoek. Dit artikel richt zich op het gebruik van Mycobacterium smegmatis als modelorganisme om een techniek voor het kweken van pellicle-biofilms te illustreren. De aanpak kan worden aangepast aan verschillende kweekvolumes, waardoor de implementatie ervan voor diverse experimentele doeleinden, zoals antimicrobiële studies, wordt vergemakkelijkt. Bovendien maakt het ontwerp van de methode de kwalitatieve of kwantitatieve evaluatie van het biofilmvormend vermogen van verschillende mycobacteriële soorten mogelijk met kleine aanpassingen.
Inleiding
Bacteriën kunnen overleven als eencellige entiteiten; In de meeste fysiologisch relevante omstandigheden organiseren ze zich echter in gemeenschapsmimetica. Biofilm is een algemeen erkende gemeenschapsorganisatie van bacteriën gevormd door geaggregeerde cellen die zijn ingekapseld in een zelfgeproduceerde matrix1. Een dergelijke assemblage bezit kenmerken van vroege meercelligheid en biedt een hogere stressbestendigheid aan bacteriële systemen. Biofilms zijn vaak tolerant voor antimicrobiële stoffen en zijn naar schatting verantwoordelijk voor bijna 80% van de microbiële infecties 2,3.
Shakekolven en plaatculturen zijn van oudsher de gebruikelijke praktijken voor het kweken van bacteriën. Hun enorme acceptatie en succes kunnen worden toegeschreven aan hun gebruiksgemak, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid. Het gebrek aan fysiologische context beperkt echter het translationele potentieel van de kennis die met behulp van dergelijke systemen wordt gegenereerd4. Daarom worden biofilms een aantrekkelijk modelsysteem om bacteriële pathofysiologie te bestuderen. Biofilms bieden een dynamisch modelsysteem, dat de natuurlijke omstandigheden nauw weerspiegelt, waardoor onderzoekers fysiologische aspecten zoals nutriëntengradiënten en ruimtelijke heterogeniteit kunnen repliceren 5,6.
De biofilmlevensstijl is met name relevant in mycobacteriële studies, aangezien mycobacteriën, waaronder de beruchte Mycobacterium tuberculosis, bedreven biofilmvormers zijn7. Hun vermogen om te gedijen in biofilms draagt bij aan hun persistentie in gastheerweefsels tijdens infecties. Het vormt een formidabele uitdaging bij de behandeling van mycobacteriële ziekten, gezien de inherente antibioticaresistentie die gepaard gaat met biofilmlevensstijlen8. Biofilms bieden ook een ideaal modelsysteem om het mycobacterieel metabolisme te bestuderen, omdat ze het mogelijk maken om de unieke metabole aanpassingen en strategieën voor het gebruik van voedingsstoffen door mycobacteriën binnen complexe microbiële gemeenschappen te onderzoeken.
Hoewel biofilm steeds meer wordt geaccepteerd als een beter modelsysteem voor mycobacteriële studies10, is er behoefte aan consistente en reproduceerbare standaard operationele procedures, vooral voor het trekken van parallellen tussen studies die in verschillende laboratoria worden uitgevoerd. De hier beschreven methode beschrijft biofilmvormingsprocedures voor een mycobacteriële soort, M. smegmatis. M. smegmatis is een toegankelijker model voor het bestuderen van mycobacteriële biofilms, gezien de niet-pathogeniteit en snellere biofilmvormingskinetiek. De methode kan worden aangepast voor toepassingen zoals antimycobacteriële screening, metabolietextractie en omics-studies.
Protocol
De details van alle reagentia en apparatuur die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. De mediavoorbereiding van Sauton
- Bereid 50 ml 2,5% kaliumdiwaterstoffosfaatoplossing voor door 1,25 g kaliumdiwaterstoffosfaat zorgvuldig af te wegen en op te lossen in 50 ml gedeïoniseerd water.
- Bereid 50 ml 2,5% magnesiumsulfaatoplossing voor door 2,56 g magnesiumsulfaat af te wegen en op te lossen in 50 ml gedeïoniseerd water.
- Bereid 10 ml 5% ijzerammoniumcitraatoplossing door 0,5 g ijzerammoniumcitraat af te wegen en op te lossen in 10 ml gedeïoniseerd water. Bewaar het in een amberkleurige buis.
- Bereid 100 ml 20% glucoseoplossing door 20 g glucose af te wegen en op te lossen in 100 ml gedeïoniseerd water. Filtreer met een steriele spuit van 50 ml en een PVDF-spuitfilter van 0,2 μM in een buis.
- Bereid 10 ml steriele 1% zinksulfaatoplossing voor door 0,1 g zinksulfaat zorgvuldig af te wegen en op te lossen in 10 ml gedeïoniseerd water. Filtreer met een steriele spuit van 10 ml en een PVDF-spuitfilter van 0,2 μM in de laminaire kap.
- Meng de bereide componenten in 750 ml gedeïoniseerd water zoals beschreven in tabel 1. Meet de pH van de oplossing en stel deze in op 7. Vul het volume aan tot 900 ml met gedeïoniseerd water.
- Autoclaaf de media bij 15 PSI en 121 °C gedurende 15-20 minuten. Laat het afkoelen. Voeg vervolgens 100 μL gefilterd 1% zinksulfaat toe. Voeg 100 ml gefilterde 20% glucose toe en los het goed op.
2. Bereiding van filter-gesteriliseerde 5% Tween-80
- Los 0,5 ml Tween-80 op in 9,5 ml gedeïoniseerd water.
- Filtreer de oplossing met een steriele spuit van 10 ml en een PVDF-spuitfilter van 0,2 μM in de laminaire kap.
3. Voorbereiding van de primaire cultuur
- Gebruik in de laminaire kap een serologische pipet om 2 ml geautoclaveerd LB-medium in twee steriele reageerbuisjes van 14 ml te doseren.
- Voeg 20 μL gefilterde 5% Tween-80 toe aan de reageerbuisjes met behulp van een micropipet.
- Inoculeer M. smegmatis in een van de buisjes door de cryo-voorraad toe te voegen met behulp van een inoculatielus. De andere reageerbuis dient als mediabesturing.
- Incubeer de buizen gedurende 48 uur in een schudincubator bij 300 rpm en 37 °C.
NOTITIE: De mediabedieningsbuis mag geen groei vertonen.
4. Voorbereiding van de secundaire cultuur
- Gebruik in de laminaire kap een serologische pipet om 2 ml geautoclaveerd LB-medium in twee steriele reageerbuisjes van 14 ml te doseren.
- Voeg 20 μL gefilterde 5% Tween-80 toe aan de reageerbuisjes met behulp van een micropipet.
- Voeg 20 μL van de primaire cultuur toe aan een van de buisjes met behulp van een micropipet. Bewaar de andere buis als mediabediening.
- Incubeer de culturen in een schudincubator bij 300 tpm en 37 °C tot ze een OD600 van 0,6 tot 0,8 bereiken.
OPMERKING: Het duurt over het algemeen 12 tot 14 uur om een OD600 van 0,6 tot 0,8 te bereiken. Andere celdichtheden kunnen ook worden gebruikt, maar een gedefinieerde OD600-waarde helpt bij vergelijkende studies.
5. Opzetten van de biofilm
- Doseer in de laminaire kap 6 ml Sauton's media aangevuld met 2% glucose in elk putje van een plaat met 6 putjes met behulp van een serologische pipet.
- Inoculeer de respectieve putjes met 120 μl (d.w.z. 2%) van het secundaire inoculum met behulp van een micropipet. Houd er een niet-geïnoculeerd goed als mediacontrole.
- Meng de media en de cultuur door op en neer te pipetteren met een micropipet van 1 ml. Dek het deksel af en sluit de plaat voorzichtig af met paraffinefolie.
- Incubeer de plaat gedurende 7 dagen ongestoord in een statische incubator bij 37 °C.
6. Opzetten van biofilms voor fase-specifieke observaties
OPMERKING: De algehele biofilmopstelling is hetzelfde als beschreven in stap 5. Om biofilm op verschillende tijdstippen te oogsten of in beeld te brengen, wordt voorgesteld om dezelfde biofilm in meerdere sets op afzonderlijke platen op te stellen.
- Om biofilms tussen dag 3 en dag 6 te observeren, bereidt u vier platen voor met identieke omstandigheden en gebruikt u één plaat per dag voor beeldvorming.
NOTITIE: De biofilmlaag begint te verschijnen op de lucht-medium-interface vanaf de derde dag van het instellen van de plaat.
7. Inschatten van de ontwikkeling van de biofilm
- Visuele schatting
- Breng de platen in beeld met behulp van een geldocumentatiesysteem met epi-wit lichtverlichting (Figuur 1).
OPMERKING: Beeldvorming geeft een grove kwalitatieve en kwantitatieve schatting van de gevormde biofilm. Elke camera van goede kwaliteit kan als alternatief worden gebruikt.
- Breng de platen in beeld met behulp van een geldocumentatiesysteem met epi-wit lichtverlichting (Figuur 1).
- Schatting van het drooggewicht
- Voer een meting van het drooggewicht uit voor een nauwkeurigere kwantificering.
- Om het drooggewicht te meten, begint u met het wegen van een vloeipapier.
OPMERKING: Filtreerpapier kan ook worden gebruikt in plaats van vloeipapier. - Verwijder de biofilm van de plaat met 6 putjes en breng deze met een spatel over op het papier.
- Verzamel zorgvuldig het grootste deel van de biofilm van de cultuur en zorg ervoor dat u niet te veel van de media op het papier overbrengt.
- Leg de biofilm op het vloeipapier.
- Plaats het in een incubator bij 50 °C gedurende 0,5-1 uur totdat de biofilm volledig is opgedroogd.
- Meet het gecombineerde gewicht van het papier en de biofilm.
OPMERKING: Droog gewicht van biofilm = (Gewicht van biofilm + papier)-(Gewicht van papier)
8. Antibioticatolerantietest in biofilms
- Schat de MIC90 van rifampicine in M . smegmatis planktonische cultuur volgens het protocol beschreven door Irith Wiegand et al. met behulp van Sauton's media11. Voeg het antibioticum toe wanneer de culturen een OD600 van 0,2 bereiken.
- Stel de platen in voor biofilmgroei zoals beschreven in stap 5 van het protocol.
- Voeg op de vierde dag van de incubatie rifampicine toe aan culturen met een MIC90-concentratie (64 μg/ml) vanaf de zijkanten van het putje met behulp van een micropipet in de laminaire kap.
LET OP: Doe dit voorzichtig zonder de biofilm te veel te verstoren. Laat een van de putjes met biofilm onbehandeld. - Draai de platen langzaam rond om de antibiotica te mengen.
- Bedek de zijkanten van de platen met paraffinefolie en bewaar ze in de incubator voor verdere groei.
- Verwijder na 24 uur de platen van de laminaire kap en voeg Tween-80 toe tot een eindconcentratie van 0,2% in alle putjes die biofilm bevatten.
- Bedek de platen opnieuw met paraffinefolie en houd ze gedurende 12 uur op 4 °C en 100 tpm.
- Haal de platen eruit in een laminaire kap en homogeniseer de bestanddelen met een micropipet van 1 ml.
- Was de bestanddelen met Sauton's media volgens het protocol beschreven in Anand et al.12.
- Resuspendeer ten slotte de cellen in 6 ml Sauton's media en verdun ze tot eindconcentraties van 10-4, 10-5, 10-6 en 10-7.
- Verdeel 100 μL van elke verdunning over LB-agar-platen met behulp van geautoclaveerde glasparels.
- Sluit alle platen af met paraffinefolie en bewaar ze in een incubator bij 37 °C.
- Tel na 3 dagen incubatie kolonies op elk bord. Beschouw alleen de platen met een kolonietelling tussen 30 en 300.
- Bereken kve/ml en de relatieve afname van kve/ml met behulp van de gegeven formules13.
OPMERKING: CFU/ml = (Aantal kolonies × verdunningsfactor) / (Volume verguld (in ml))
Relatieve afname in kve/ml = ((kve/ml in onbehandeld - kve/ml in behandeld)) / ((kve/ml in onbehandeld)) × 100
Resultaten
Biofilm pellicles worden vanaf de derde dag zichtbaar voor het blote oog. Hoewel biofilm groeit op Sauton's media zonder 2% glucose, werd een verbetering waargenomen in de reticulatie wanneer deze werd toegevoegd. We verkregen 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) biofilm droog gewicht uit elk putje van een plaat met 24 putjes met 1,5 ml Sauton's media (aangevuld met 2% glucose) gekweekt gedurende vier dagen. In figuur 2 was de ontwikkeling van biofilm zichtbaar van dag 3 tot dag 6. Het begint op dag 3 een film te vormen met lichte reticulatie en op dag 5 is het volledig gerijpt. Vanaf dag 6 begint de biofilm uiteen te vallen. De MIC90 van rifampicine (64 μg/ml) verminderde de CFU van de biofilm met 25% ± 12% (n = 3) alleen.
Figuur 1: Biofilms van M. smegmatis na 4 dagen incubatie in Sauton's media. (1) Zonder glucose en geënt met 2% inoculum. (2) Zonder glucose en geënt met 4% inoculum. (3) Met 2% glucose en geënt met 2% inoculum. (4) Met 2% glucose en geënt met 4% inoculum. (5) en (6) zijn mediabedieningselementen. Hier zitten de monsters in standaard platen met 6 putjes. De foto's worden zonder enige vergroting gemaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologie van de biofilm van M. smegmatis vanaf de 3e dag na inoculatie tot de 6e dag. Hier zitten de monsters in standaard platen met 24 putjes. De foto's worden zonder enige vergroting gemaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| S. Nee. | Bestanddeel | Werkconcentratie (w/v) | Concentratie van de voorraadoplossing | Volume/gewicht van de voorraadoplossing | |||||
| 1 | Kaliumdiwaterstoffosfaat | 0.05% | 2.50% | 20 ml | |||||
| 2 | Magnesiumsulfaat | 0.05% | 2.50% | 20 ml | |||||
| 3 | IJzerammoniumcitraat | 0.01% | 5% | 1 ml | |||||
| 4 | Glycerol | 6% | 100% | 60 ml | |||||
| 5 | L- Asparagine | 0.40% | N.v.t. | 4 gr | |||||
| 6 | Citroenzuur | 0.20% | N.v.t. | 2 gr | |||||
Tabel 1: Componenten voor de mediabereiding van Sauton.
Discussie
De meercellige levensstijl van microben werd bijna een eeuw geleden beschreven; Klinische studies blijven echter schaars, vooral vanwege het ontbreken van robuuste methoden14. Methoden die worden beschreven in werken over biofilmbiologie zijn vaak moeilijk aan te passen. Hier wordt verwacht dat de gedetailleerde methodologie, geholpen door demonstraties van kritieke stappen, de reproduceerbaarheid van de protocollen zal verbeteren.
De methode van biofilmproductie die in dit artikel wordt beschreven, is schaalbaar en vereist een evenredige toename van het gemiddelde volume en de inoculumgrootte. Toepassingen zoals metabolietextractie vereisen een hoger kweekvolume, terwijl antimicrobiële gevoeligheidstests een kleinere biomassavereisen12. Bovendien kan de grootte van het inoculum worden aangepast om de snelheid van biofilmvorming aan te passen. Deze flexibiliteit stelt onderzoekers in staat om de duur van experimenten op de juiste manier te controleren.
Groeiomstandigheden en de micro-omgeving spelen een cruciale rol in de biofilmfysiologie15. Met name de aanwezigheid van glucose is niet verplicht voor het vormen van een biofilm; Desalniettemin is waargenomen dat de opname van 2% glucose de reticulatie en stabiliteit van de biofilm verbetert. Een andere interessante observatie is het biofilmversterkende potentieel van het plaatsen van een glazen dekglaasje op de bodem van de kweekputten. De toevoeging van Tween-80 in zowel primaire als secundaire culturen is cruciaal voor het verminderen van celaggregatie.
De ontwikkeling van biofilm omvat verschillende groeifasen zoals aanhechting, rijping en verspreiding. Terwijl de hier beschreven biofilmopstelling doorgaans 7 dagen wordt geïncubeerd, worden pellicles vanaf de 3edag zichtbaar voor het blote oog. Deze opstelling maakt het mogelijk om de temporele dynamiek van de ontwikkeling van biofilm te bestuderen. Hoewel dit artikel de schatting van het drooggewicht beschrijft om de biomassa van biofilm te beoordelen, is de opstelling ook geschikt voor conventionele kristalvioletkleuring of op microscopie gebaseerde schatting12,16.
De productie van biofilms door mycobacteriën speelt een belangrijke rol in hun pathogeniteit en zorgt voor een verhoogde resistentie tegen geneesmiddelen 8,17. We zagen een zeven tot acht keer hogere antibioticatolerantie in biofilmculturen in vergelijking met schudflesculturen. Verschillende groepen gebruiken biofilms als modelsysteem voor het bestuderen van bacteriële fysiologie; Een bredere acceptatie van deze groeiwijze door de mycobacteriële onderzoeksgemeenschap kan nieuwere inzichten opleveren in de pathofysiologie van verschillende pathogene soorten binnen dit geslacht.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de DBT-Ramalingaswami Fellowship toegekend aan Amitesh Anand.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0,2 µM PVDF spuitfilter | Axiva | SFNY04 R | |
| 1 mL tips | Genetix | GXM-611000 C | |
| 10 µL tips | Genetix | GXM-6110 C | |
| 200 µL tips | Genetix | GXM-61200C | |
| 6-wels polypropyleen platen | Tarsons | 980010 | |
| Amber buizen | Tarsons | 546051 | |
| Autoclaaf | Hospharma | ||
| Bioveiligheidskast A II | MSET | ||
| Vloeipapier | Elke geschikte leverancier | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Citroenzuur | Sigma | 251275 | |
| Cuvettes | Bio-Rad | 2239955 | |
| Ferric ammoniumcitraat | Sigma | F5879 | |
| Gel documentatiesysteem | Bio-Rad | ||
| Glasmalen | Sigma | G8772 | |
| Glucose | Sigma | 49139 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Inoculatiesluizen | Genaxy | HS81121C | |
| L-Asparagine | Sigma | A0884 | |
| LB-agar | Himedia | M1151 | |
| LB-media | Himedia | M575 | |
| M. smegmatis mc2155 cryo-stock | ATCC | 700084 | |
| Magnesiumsulfaat | Sigma | M2643 | |
| Micropipetten | Gilson | ||
| Parafilm | Tarsons | ||
| Petrischaal | Tarsons | 460020 | |
| pH meter | Labman Scientific Instruments | ||
| Plate Reader | Tecan | ||
| Polypropyleen testbuisjes | Genaxy | GEN-14100-PS | |
| Kaliumfosfaat monobasisch | Sigma | P5379 | |
| Rifampicine | MedchemExpress | HY-B0272 | |
| Serologische pipette | SPL Life Sciences | 95210 | |
| Schudler Incubateur | Eppendorf | ||
| Spatel | |||
| Spectrofotometer | Thermo Scientific | ||
| Statische Incubateur | CARON | ||
| Steriele 10 mL spuit | Becton Dickinson | 309642 | |
| Steriele 50 mL spuit | Becton Dickinson | 309653 | |
| Tween-80 | Sigma | P1754 | |
| Weegschaal | Sartorius | ||
| Zinksulfaat | Sigma | Z0251 |
Referenties
- Davey, M. E., O'toole, G. A. Microbial biofilms: From ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
- Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2 (2), 114-122 (2003).
- Hernández-Jiménez, E., et al. Biofilm vs. planktonic bacterial mode of growth: Which do human macrophages prefer. Biochem Biophys Res Commun. 441 (4), 947-952 (2013).
- Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).
- Jo, J., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. Gradients and consequences of heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 593-607 (2022).
- Keating, T., et al. Mycobacterium tuberculosis modifies cell wall carbohydrates during biofilm growth with a concomitant reduction in complement activation. Cell Surf. 7, 100065(2021).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol Microbiol. 69 (1), 164-174 (2008).
- Dietrich, L. E. P., et al. Bacterial community morphogenesis is intimately linked to the intracellular redox state. J Bacteriol. 195 (7), 1371-1380 (2013).
- Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms. J Vis Exp. (60), e3820(2012).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
- Anand, A., et al. Polyketide quinones are alternate intermediate electron carriers during mycobacterial respiration in oxygen-deficient niches. Mol Cell. 60 (4), 637-650 (2015).
- Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements. , Available from: https://www.jove.com/v/10511/growth-curves-cfu-and-optical-density-measurements (2019).
- Høiby, N. A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections. Pathog Dis. 70 (3), 205-211 (2014).
- Rajewska, M., Maciąg, T., Jafra, S. Carbon source and surface type influence the early-stage biofilm formation by rhizosphere bacterium Pseudomonas donghuensis P482. bioRxiv. , (2023).
- O'Toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis exp. (47), e2437(2011).
- Chakraborty, P., Bajeli, S., Kaushal, D., Radotra, B. D., Kumar, A. Biofilm formation in the lung contributes to virulence and drug tolerance of Mycobacterium tuberculosis. Nat Comm. 12 (1), 1606(2021).
Herprints en machtigingen
