Dit protocol beschrijft een unieke methode voor het detecteren van de binding tussen verbindingen en eiwitmoleculen, en biedt de voordelen van minimaal verlies van eiwitmonsters en een hoge nauwkeurigheid van de gegevens.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van CD40-eiwit-umbelliferon-interactie via differentiële scanfluorescentie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het onderzoek naar interacties tussen verschillende moleculen is een cruciaal aspect van het begrijpen van de pathogenese van ziekten en het screenen op doelwitten van geneesmiddelen. Umbelliferone, een actief ingrediënt in de Tibetaanse geneeskunde Vicatia thibetica, vertoont een immunomodulerend effect met een onbekend mechanisme. Het CD40-eiwit is een belangrijk doelwit in de immuunrespons. Daarom maakt deze studie gebruik van het principe van differentiële scanningfluorescentietechnologie om de interacties tussen CD40-eiwit en schermschaduw te analyseren met behulp van fluorescerende enzymmarkers. Aanvankelijk werd de stabiliteit van de fluorescerende oranje kleurstof van het eiwit experimenteel geverifieerd en werd de optimale verdunningsverhouding van 1:500 bepaald. Vervolgens werd waargenomen dat de temperatuursmeltwaarde (Tm) van CD40-eiwit de neiging had af te nemen met een toename van de concentratie. Interessant is dat de interactie tussen CD40-eiwit en schermschaduw de thermische stabiliteit van CD40-eiwit bleek te verbeteren. Deze studie vertegenwoordigt de eerste poging om het bindingspotentieel van kleine molecuulverbindingen en eiwitten te detecteren met behulp van fluorescentie-microplaten en fluorescerende kleurstoffen. De techniek wordt gekenmerkt door een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid, veelbelovende vooruitgang op het gebied van eiwitstabiliteit, eiwitstructuur en eiwit-ligandinteracties, waardoor verder onderzoek en exploratie worden vergemakkelijkt.
Inleiding
Vicatia thibetica H. Boissieu, een plant uit de schermbloemigenfamilie, wordt veel gebruikt in de Tibetaanse geneeskunde en vertegenwoordigt een van de essentiële componenten van de vijf basisingrediënten (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., en Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. Voornamelijk gedistribueerd in het zuidwesten van China, zoals het noordwesten van Yunnan, het westen van Sichuan, Tibet en andere gebieden, dient de gedroogde wortel als een lokale vervanger voor Angelica1. De wortel, bekend om zijn geur, wordt vaak gebruikt als smaakmaker voor stoofpotten, en de bladeren, ook wel Tibetaanse selderij genoemd, dragen bij aan verrukkelijke gerechten. Vicatia thibetica is dus niet alleen van belang als unieke geneeskrachtige plant, maar ook als voedselbron in Tibet.
Zowel nationaal als internationaal onderzoek wijst uit dat Vicatia thibetica bloedvullende en qi (kracht of energie)-verkwikkende eigenschappen bezit, gunstig voor het reguleren van de menstruatie. Het wordt gebruikt om symptomen van onregelmatige menstruatiedysmenorroe veroorzaakt door hartkloppingen en bloedtekort aan te pakken, en vertoont farmacologische effecten zoals antioxidantregulatie van de immuniteit van het lichaam. Het alcoholextract van Vicatia thibetica heeft aangetoond dat het de lichaamsmassa en orgaanindex kan herstellen bij immuungecompromitteerde muizen geïnduceerd door cyclofosfamide. Bovendien verhoogt het de activiteit van superoxide dismutase in serum en vermindert het het gehalte aan malondialdehyde, wat wijst op een verbetering van de antioxidantcapaciteit en een balancerend effect op lipideperoxidatie 2,3. Tegelijkertijd verhoogt het het aantal bloedcellen en hemoglobine, wat niet alleen objectief de hematopoëtische functie van het lichaam weerspiegelt, maar ook een cruciale rol speelt in het immuunsysteem 2,3.
Umbelliferon, gekenmerkt door naaldvormige kristallen en een bittere smaak, heeft een klein molecuulgewicht, is vluchtig en kan worden gedestilleerd met stoom. Het sublimeert gemakkelijk, heeft een lage oplosbaarheid in water en een hoge oplosbaarheid in organisch materiaal. Als een van de belangrijkste chemische componenten van Vicatia thibetica vertoont umbelliferone immunomodulerende effecten op cellulaire immuniteit, humorale immuniteit en niet-specifieke immuniteit in door hydrocortison geïnduceerde immunosuppressiemuismodellen 4,5.
Het celoppervlakmolecuul CD40, een lid van de superfamilie van de tumornecrosefactorreceptor, wordt op grote schaal tot expressie gebracht in immuuncellen6. Het homologe ligand, CD154, ook bekend als CD40L, is een type II transmembraaneiwit dat tot expressie wordt gebracht door geactiveerde T-lymfocyten. CD40-activering heeft het vermogen om de expressie van co-stimulerende moleculen op het oppervlak van dendritische cellen (DC) en monocyten te verhogen. Dit proces bevordert de antigeenpresentatiefunctie van belangrijke histocompatibiliteitscomplex (MHC)-moleculen en activeert verder CD8+ T-cellen7.
Macrofagen spelen een cruciale rol bij de vorming en regulatie van de micro-omgeving van de tumor, en CD40-activering kan de hermodellering van de micro-omgeving van de tumor door macrofagen verbeteren8. De activering van het CD40-signaal heeft een aanzienlijke invloed op de proliferatie en activering van B-cellen. B-cellen kunnen, wanneer ze worden geactiveerd door CD40, functioneren als effectieve antigeenpresenterende cellen. Ze presenteren antigenen, genereren effector T-celactiviteit en dragen daardoor bij aan antitumoreffecten9. Bovendien kan CD40-activering in tumorcellen apoptose induceren en tumorgroei remmen10. CD40 transduceert voornamelijk signalen door de activiteit van niet-receptor tyrosine-eiwitkinasen te beheersen, waaronder Lyn, Fyn, Syk en andere. Bovendien heeft het het vermogen om Bcl-xL-, Cdk4- en Cdk6-eiwitten te stimuleren, Rel/NF-kB-transcriptiefactoren te activeren en CG-2 en PI3K10 te fosforylaten.
De Differential Scanning Fluorescence (DSF)-methode wordt veel gebruikt om de impact van verschillende omgevingsomstandigheden, zoals buffersamenstelling, temperatuur en liganden van kleine moleculen, op de thermische stabiliteit van eiwitstructuren te beoordelen. De meest gebruikte kleurstof voor DSF is een oranje, milieugevoelige, hydrofobe kleurstof. Onder normale omstandigheden is de eiwitstructuur gevouwen, waardoor het hydrofobe segment intern wordt verborgen. Naarmate de temperatuur stijgt, wordt het hydrofobe gebied van het eiwit meer blootgesteld, wat resulteert in een geleidelijke afbraak van de natuurlijke eiwitstructuur. De kleurstof bindt selectief aan dit blootgestelde eiwitgedeelte, waardoor de fluorescentie wordt versterkt. Tm-waarden worden vervolgens berekend door veranderingen in de fluorescentiesignaaldetectie11 te monitoren. Tot op zekere hoogte kunnen variaties in Tm-waarden verschuivingen in eiwitstabiliteit meten als gevolg van mutaties, veranderingen in buffers of ligandbinding. Bovendien kan het wijzen op structurele veranderingen tijdens het eiwitvouwproces12. Deze aanpak biedt nauwkeurige gegevens, een breed temperatuurbereik, een hoge gevoeligheid en minimaal verlies vaneiwitmonsters13.
In deze studie werd de fluorescentiebepaling uitgevoerd met behulp van een fluorescerende microplaatlezer in plaats van een fluorescentie kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR) -apparaat. Deze aanpassing maakt DSF-detectie mogelijk in laboratoria die geen fluorescerend kwantitatief PCR-instrument hebben, waardoor de methode minder complex wordt en de stappen die nodig zijn voor het instellen van het instrument worden verminderd, waardoor het experimentele proces wordt vereenvoudigd. Er zijn echter bepaalde nadelen aan deze aanpak. Terwijl de complexiteit wordt verminderd, wordt de procedure omslachtiger. Handmatige fluorescentiedetectie bij verschillende temperaturen is noodzakelijk en automatische en continue verzameling van fluorescentie uit het systeem kan niet worden bereikt. Deze studie maakte dus gebruik van de DSF-techniek om de interactie tussen CD40-eiwit en umbelliferon te onderzoeken, wat nieuwe inzichten opleverde in de moleculaire mechanismen van de Tibetaanse geneeskunde.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De samengestelde oplossing, eiwitoplossing en kleurstof werden in een PBS-oplossing geïntroduceerd. Vervolgens ondergingen de monsters een geleidelijke verhitting met behulp van een digitaal verwarmingsschud-droogbad en werd de thermische stabiliteit van de eiwitten geëvalueerd door de verandering in fluorescentie-intensiteit binnen het complexe systeem te meten. De gedetailleerde stappen worden hieronder beschreven en figuur 1 illustreert een overzicht van het protocol.
1. Voorbereiding van de oplossing
- Bereid een 1 mM umbelliferonoplossing door 0,1 mg umbelliferone toe te voegen aan 616,75 μL DMSO-oplossing (zie Materiaaltabel).
- Bereid een 200 μg/ml CD40-eiwitoplossing door 0,1 mg CD40 toe te voegen aan 500 μl ddH2O-oplossing (zie materiaaltabel).
- Bereid een 500x oranje kleurstofoplossing voor door 1 μL 5000x oranje kleurstof toe te voegen aan 9 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Voer de bovenstaande bewerkingen uit op ijs en aangezien de pipet een minimumbereik van 0,1 μl heeft, verdunt u de oranje eiwitkleurstof in eerste instantie met een factor 10 om het latere gebruik te vergemakkelijken.
2. Testen van kleurstofprestaties
- Voeg de 500x oranje kleurstof toe aan een PBS-oplossing en verdun deze om kleurstof te bereiken: PBS-verhoudingen van 1:500, 1:1000, 1:2000 en 1:4000.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de eindconcentratie van DMSO niet hoger is dan 2% (v/v). - Zet de fluorescerende microplaatlezer aan en verwarm deze 10 minuten voor.
- Open de computer en de data-acquisitiesoftware achtereenvolgens (zie Materiaaltabel).
- Klik op Instrument, kies het bijbehorende fluorescentie-microplaatmodel en selecteer OK in de data-acquisitiesoftware.
NOTITIE: Wacht tot de fluorescentie-microplaat klaar is met voorverwarmen en geef de temperatuur weer op het paneel voordat u de data-acquisitiesoftware opent om een succesvolle verbinding tussen het instrument en de software te garanderen. - Klik op Acquisitie-instellingen en selecteer Fluorescentie in de data-acquisitiesoftware.
- Bewerk het programma in de golflengteninterface: Lm1 = 470 nm, 570 nm en selecteer vervolgens OK.
OPMERKING: De oranje kleurstof kan worden geëxciteerd met UV-licht bij 300 nm of zichtbaar licht bij 470 nm, en de emissie kan worden gemeten bij 570 nm. - Voeg verschillende concentraties oranje kleurstof (1:500, 1:1000, 1:2000 en 1:4000) en PBS toe aan platen met 96 putjes bij 100 μL/putje.
OPMERKING: Los de oplossing op in DMSO voordat u deze aan PBS toevoegt en draai deze tijdens het bereidingsproces grondig rond op 2000 x g om ervoor te zorgen dat deze volledig oplost vanwege de neiging van de kleurstof om neer te slaan. - Plaats de plaat met 96 putjes in de detectiefase van het instrument, klik op de knop Lezen in de data-acquisitiesoftware en meet de fluorescentie van elke kleurstofconcentratie 13 keer bij kamertemperatuur, met een interval van 2 minuten per keer.
- Klik na elke bepaling op de knop Exporteren , selecteer Exporteren naar XML XLS TXT, kies Alle platen, selecteer vervolgens Plaat in uitvoerformaat en klik ten slotte op OK om de gegevens op te slaan in een map in "XLS"-formaat voor verdere analyse.
OPMERKING: Deze stappen helpen bij het bepalen van de impact van continue meting op de autofluorescentie van de oranje kleurstof bij kamertemperatuur en het identificeren van de optimale kleuringsconcentratie. - Zet het digitale verwarmings-schud-droogbad aan, stel de verwarmingstemperatuur in op 35 °C en de opwarmtijd op 2 minuten.
- Bereid de optimale verdunningsverhouding van de kleurstof voor in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en plaats deze gedurende 2 minuten in het digitale verwarmings-schud-droogbad.
- Voeg de PBS-oplossing en de kleuringsoplossing, verwarmd tot 35 °C, toe aan de plaat met 96 putjes met een volume van 100 μl per putje.
- Plaats de plaat met 96 putjes in de detectiefase van het instrument en klik op de knop Lezen in de data-acquisitiesoftware.
- Stel de verwarmingstemperatuur in op 40 °C en de opwarmtijd op 2 min.
- Pipeteer de kleurstofoplossing in de plaat met 96 putjes terug in de microcentrifugebuis van 1,5 ml en verwarm deze gedurende 2 minuten in het instrument.
- Herhaal de handelingen van stap 2.12-2.15 en stap 2.9 om de absorptie van de kleurstofoplossing te testen bij respectievelijk 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C en 95 °C.
OPMERKING: Deze stappen helpen bij het bepalen van de stabiliteit van de autofluorescentie van de oranje kleurstof onder continue verhitting in een gradiënt van 35 °C tot 95 °C. Het is van cruciaal belang om snel te werken om snelle temperatuurdalingen of het toevoegen van de verkeerde vloeistof te voorkomen, wat tot experimentele fouten kan leiden.
3. Detectie van de smelttemperatuur (Tm) van het eiwit
- Combineer CD40-eiwit en oranje kleurstof met PBS-oplossing om eindconcentraties van respectievelijk 5 μg/ml, 10 μg/ml, 15 μg/ml, 20 μg/ml en 1:500 te bereiken.
- Herhaal de handelingen in de stappen 2.2-2.6 en 2.10-2.16 om de absorptie van de CD40-eiwitoplossing te beoordelen bij temperaturen van respectievelijk 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C en 95 °C.
- Herhaal stap 2.9 om de gegevens op te slaan en te analyseren en bereken vervolgens de Tm-waarde met behulp van gegevensanalysesoftware (zie Materiaaltabel).
- Voeg CD40-eiwit, umbelliferon en oranje kleurstof toe aan de PBS-oplossing om eindconcentraties van respectievelijk 5 μg/ml, 10 μg/ml, 15 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μm en 1:500 te verkrijgen.
OPMERKING: Krachtige vortexen tijdens de bereiding van de oplossing zijn essentieel om een gelijkmatige verdeling van de kleurstof, het CD40-eiwit en schermschaduw in PBS te garanderen. - Herhaal de handelingen van stap 3.2-3.3 om de absorptie van de oplossing van CD40-umbelliferoncomplexen te meten bij temperaturen van respectievelijk 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C en 95 °C.
OPMERKING: Deze stappen werden uitgevoerd om de Tm-waarden van CD40-eiwit- en CD40-umbelliferoncomplexen te bepalen, met als doel de optimale CD40-eiwitbindingsconcentratie aan umbelliferon te identificeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De oranje kleurstof vertoonde consequent een stabiele fluorescentie-excitatie bij Ex = 470 nm en Em = 570 nm, zowel bij kamertemperatuur als bij verhoogde temperaturen. Er werd een optimale verdunningsverhouding van 1:500 bepaald (figuur 2A,B). Detectie van de Tm-waarde bleek een uitdaging wanneer de concentratie van CD40-eiwit lager was dan 15 μg/ml (Figuur 3A,B). Bij een concentratie van 15 μg/ml was echter een stabiele Tm-wa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
DSF, ook bekend als de thermische verschuivingstest of thermische fluorescentietest, is een techniek die wordt gebruikt om het proces van thermische denaturatie van eiwitten in monsters te detecteren door veranderingen in het fluorescentiesignaal van het testmonster of de kleurstof te volgen tijdens een langzame, geprogrammeerde temperatuurstijging. DSF werd oorspronkelijk opgericht door Pantoliano14 en dient als een high-throughput-methode. De belangrijkste procedure omvat het verhogen van de tem...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We spreken onze oprechte waardering uit voor de financiële steun die we hebben ontvangen van het Connotation Construction Project van het 14e vijfjarenplan van de Universiteit voor Tibetaanse Geneeskunde (2022ZYYGH12), de 2022 Open Vakken van het Key Laboratory of Tibetan Medicine en het basisonderwijs van het Ministerie van Onderwijs aan de Universiteit voor Tibetaanse Geneeskunde (ZYYJC-22-04), het Key Research and Development Program van Ningxia (2023BEG02012), en het Xinglin Scholar Research Promotion Project van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (XKTD2022013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CD40 eiwit | MedChemExpress | HY-P75408 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| FlexStation 3 multifunctionele microplaatlezer | Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD | FlexStation 3 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x) | Gibco | 8120485 | |
| SoftMax Pro 7.1 | Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD | SoftMax Pro 7.1 | |
| SSYPRO oranje kleurstof | Sigma | S5942 | |
| Umbelliferoon | Shanghai Yuanye Biotechnology Co. | B21854 |
Referenties
- Cairang, N. Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine "five roots". Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136(2022).
- Li, L., et al. Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide. Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).
- Lu, H., et al. Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice. J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).
- Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui. Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).
- Lu, Z., Zhang, L. Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice. Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).
- Vonderheide, R. H. CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).
- Grewal, I. S., Flavell, R. A. CD40 and CD154 in cell-mediated immunity. Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).
- Long, K. B., et al. IFNγ and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma. Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).
- He, Y., et al. The roles of regulatory B cells in cancer. J Immunol Res. 2014, 215471(2014).
- Eliopoulos, A. G., et al. CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily. Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
- Rosa, N., et al. Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry. J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).
- Hellman, L. M., et al. Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes. J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
- Gorny, H., et al. Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules. J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821(2023).
- Freire, E. Thermal denaturation methods in the study of protein folding. Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).
- Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites. Heliyon. 9 (11), 21238(2023).
- Zhou, C., Yu, M., Li, W. Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein. Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
- Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases. Int J Mol Sci. 23 (14), 7672(2022).
- Kamat, V., Rafique, A. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
- Sharma, R., et al. Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD. Int J Biol Macromol. 253, 127208(2023).
- Grädler, U., et al. Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding. J Biol Chem. 299 (11), 105328(2023).
- Xu, Y., et al. Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein. Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
