Neonatale beenmergisolatie bij muizen en bereiding van van beenmerg afgeleide macrofagen

Summary

Dit protocol beschrijft een niet-enzymatische en eenvoudige methode voor het isoleren van 7-9 dagen oude neonatale beenmergcellen van muizen en het genereren van gedifferentieerde macrofagen met behulp van een supernatans van L929-cellen als bron van granulocytkoloniestimulerende factor (M-CSF). De van beenmerg afgeleide macrofagen werden verder geanalyseerd op oppervlakteantigenen F4/80, CD206, CD11b en functionele competentie.

Abstract

Verschillende technieken voor het isoleren van beenmerg van volwassen muizen zijn goed ingeburgerd. Het isoleren van beenmerg van neonatale muizen is echter uitdagend en tijdrovend, maar voor sommige modellen is het translationeel relevant en noodzakelijk. Dit protocol beschrijft een efficiënte en ongecompliceerde methode voor het bereiden van beenmergcellen van pups van 7-9 dagen oud. Deze cellen kunnen vervolgens verder worden geïsoleerd of gedifferentieerd tot specifieke celtypen die van belang zijn. Macrofagen zijn cruciale immuuncellen die een belangrijke rol spelen bij ontstekingen en infecties. Tijdens de ontwikkeling dragen neonatale macrofagen aanzienlijk bij aan de hermodellering van weefsel. Bovendien verschillen het fenotype en de functies van neonatale macrofagen van die van hun volwassen tegenhangers. Dit protocol schetst ook de differentiatie van neonatale macrofagen van de geïsoleerde beenmergcellen in aanwezigheid van L929-geconditioneerd medium. Oppervlaktemarkers voor gedifferentieerde neonatale macrofagen werden beoordeeld met behulp van flowcytometrische analyse. Om de functionaliteit aan te tonen, werd de fagocytische efficiëntie ook getest met behulp van pH-gevoelige kleurstofgeconjugeerde Escherichia coli.

Introduction

Beenmerg omsluit zowel hematopoëtische als mesenchymale stamcelpopulaties die zichzelf hernieuwbaar zijn en kunnen worden gedifferentieerd in verschillende cellijnen. Hematopoëtische stamcellen in het beenmerg geven aanleiding tot myeloïde en lymfoïde lijnen¹. Mesenchymale stamcellen produceren osteoblasten (bot), adipocyten (vet) of chondrocyten (kraakbeen)². Deze cellen hebben meerdere toepassingen op het gebied van celbiologie en weefselmanipulatie, waaronder gentherapie ^3,4. Voorlopercellen die in het beenmerg aanwezig zijn, differentiëren tot specifieke celtypen in aanwezigheid van afstammingsspecifieke groeifactoren. Erytropoëtine bevordert de proliferatie van erytroïde voorlopercellen, granulocytkoloniestimulerende factor (G-CSF) stimuleert de groei van neutrofielenkolonies en trombopoëtine reguleert de productie van bloedplaatjes als enkele voorbeelden van afstammingsspecifieke groeifactoren⁵. Celoppervlakteantigeen gelabeld FACS en magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) zijn gevestigde methoden voor isolatie en zuivering van de specifieke van beenmerg afgeleide celtypen⁶.

Hoewel neonatale studies vooruitgang boeken in de richting van het vinden van de oorzaken van neonatale sterfgevallen en het aanpakken van de complicaties tijdens vroeggeboorten, blijft directe therapeutische ontwikkeling een onvervulde medische behoefte. Smith en Davis verklaarden: "Pediatrische patiënten blijven therapeutische weeskinderen"⁷. Er zijn verschillende uitdagingen, zoals kleine steekproeven, levenslange effecten van de uitkomst en ethische kwesties bij het verkrijgen van toestemming in klinische onderzoeken naar pasgeborenen⁸. Daarom is er een grote vraag naar in vivo en in vitro onderzoeksmodellen die specifiek zijn voor pasgeborenen om translationele relevantie te bereiken. Vanwege de overeenkomsten tussen anatomische en weefselniveaus, korte zwangerschapsperioden en worpgroottes, zijn knaagdieren het meest bestudeerde zoogdiermodelsysteem.

Hier beschrijven we een gedetailleerde, zeer haalbare en reproduceerbare procedure voor het isoleren van beenmerg van 7-9 dagen oude muizenpups en hun vermogen om te differentiëren in macrofagen. Een verscheidenheid aan cellijnen kan echter worden bereikt met behulp van verschillende differentiatiesignalen. We tonen ook de aanwezigheid aan van merkers op het celoppervlak en de aanwezigheid van in vitro fagocytische activiteit die wordt verwacht voor van beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM's).

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de West Virginia Institutional Animal Care and Use Committees en werden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van de National Research Council. Voor dit onderzoek werden C57BL/6J muizenpups gebruikt. De details van alle gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Voorbereiding van de media

1. Bereid 3 ml MEM-kweekmedia aangevuld met 10% FBS, 2 mM glutamine, 25 mM HEPES en penicilline (100 E/ml)/streptomycine (100 μg/ml) in een centrifugebuis van 5 ml en bewaar het op ijs.
2. Indien nodig voor het bewaren van beenmergvoorlopercellen in vloeibare stikstof, bereid dan vriesmedia voor die 10% DMEM, 80% FBS en 10% DMSO bevatten.
3. Voor volledige DMEM bereidt u DMEM aangevuld met 10% FBS, 2 mM glutamine, 25 mM HEPES en penicilline (100 E/ml)/streptomycine (100 μg/ml).
4. Voor macrofaagdifferentiatie bereidt u DMEM aangevuld met 10% FBS, 2 mM glutamine, penicilline (100 E/ml)/streptomycine (100 μg/ml) en 10% L929-cel supernatans ^9,10,11.

2. Bovendrijvend preparaat met L929-cellen

1. Ontdooi L929-cellen die zijn opgeslagen in vloeibare stikstof en breng ze over naar een centrifugebuis van 15 ml met 5 ml volledige DMEM. Centrifugeer op 350 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
2. Resuspendeer de cellen in 5 ml volledige DMEM-media en zaai ze in een T25-weefselkweekkolf met een dichtheid van 2×10⁵ cellen. Tel de cellen met een geautomatiseerde cellenteller met 0,4% trypanblauw. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ tot ze 70% confluentie bereiken.
3. Om de cellen los te maken, wast u ze eerst met 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Zuig de PBS op en vervang deze door 2,5 ml 0,05% trypsine-EDTA.
4. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 5 minuten en voeg 5 ml volledige DMEM toe.
5. Verzamel de cellen en centrifugeer op 350 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
6. Resuspendeer de celpellet in 15 ml volledig DMEM-medium en breng het over in een T75-kolf.
7. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ tot de cellen 90% confluentie bereiken, verzamel vervolgens het medium en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Filtreer de media die M-CSF bevatten door een filter van 0,45 μm en vries in bij -80 °C in aliquots van 5 ml.

3. Voorbereiding van dieren

1. Scheid onder een bioveiligheidskast de 7-9 dagen oude C57BL/6J muizenpups (een nest van 6 pups) voorzichtig van de moeder en plaats ze in een aparte kooi.
2. Week een watje in 2 ml isofluraan van veterinaire kwaliteit in een stolp of een andere insluitingskamer.
3. Plaats een pup in de kamer en sluit het deksel. Houd de pasgeborene ongeveer 90 seconden in de gaten om ervoor te zorgen dat deze onbeweeglijk en bewusteloos wordt.
4. Verwijder de pup snel en onthoofd hem met een scherpe schaar (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) voordat de pup weer bij bewustzijn kan komen.
   OPMERKING: Pasgeborenen ademen niet diep genoeg voor euthanasie door inhalatie van isofluraan alleen.
5. Zorg ervoor dat u het deksel van de container sluit nadat elke pup is verwijderd. Hetzelfde watje kan worden gebruikt voor 5-7 pups.

4. Isolatie van neonataal beenmerg

1. Steriliseer het lichaam van de pasgeborene met 70% ethanol.
2. "Maak met een tang en een chirurgische schaar met fijne punt een incisie tussen de
   buik en achterpoten. Verwijder de huid door naar de voet van de achterpoten te trekken.
3. Schraap het bindweefsel en de spier die aan de botten vastzit met een tang met scherpe randen.
4. Knip het scheenbeen en het dijbeen, zoals weergegeven in afbeelding 1, af met een schaar om ze los te maken en te verwijderen. Plaats deze botten met een tang in de mediabuis op ijs. Herhaal het proces voor elke pup.
5. Breng de botten met behulp van een tang over in een zeef van 40 μm met een verzamelbuis. Plet de botten en laat het merg los door met een zuiger van 3 ml tegen de zeef te drukken.
6. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
7. Aspireer het supernatans op en resuspendeer de cellen door voorzichtig pipetteren in 0,2% NaCl, een hypotone oplossing voor de lysis van erytrocyten. Voeg onmiddellijk een gelijk volume van 1,6% NaCl toe om de oplossing isotoon te maken.
8. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder de lysisoplossing.
9. Resuspendeer in volledige DMEM voor onmiddellijk gebruik of vriesmedia voor opslag en tel de cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller.
   OPMERKING: Voor de huidige studie leverde deze methode 6,55 (± 1,44) × 10⁶ beenmergcellen/pup op (Figuur 1E).
10. Bewaar de cellen bij -80 °C in vriesmedia of gebruik ze onmiddellijk zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Vanwege de ouderdom zijn botten transparant en helder genoeg om het merg erdoorheen te visualiseren. Het is belangrijk om voorzichtig te zijn bij het trekken aan de botten, omdat het uitoefenen van lichte druk erop voldoende kan zijn om het merg los te laten. Het merg in de neonatale botten heeft de vorm van vloeistof in plaats van een intacte draad die wordt aangetroffen in volwassen botten. Het is moeilijk om het merg te verzamelen als het ontsnapt tijdens het verzamelen van de botten.

5. Differentiatie van neonatale beenmerg-afgeleide macrofagen

1. Zaad 2 × 10⁷ beenmergcellen per T75-kolf in 10 ml volledige DMEM die 10% L929-celsupernatans (2,5 ml) bevat als bron van M-CSF. Incubeer de kweekschalen bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 5 dagen. Voeg 2 ml L929-geconditioneerde media toe op dag 3 van de differentiatie.
2. Bekijk de cellen dagelijks onder de microscoop met behulp van een omgekeerde microscoop en een beeldvormingssysteem met een vergroting van 20x. Bij differentiatie zouden macrofagen aanhangend, langwerpig en heterogeen moeten lijken (Figuur 2).
3. Om de macrofagen te oogsten voor stroomafwaartse tests, zuigt u de differentiatiemedia op.
4. Was de cellen met 5 ml PBS om niet-klevende cellen en serumeiwitten te verwijderen die de loslating verstoren. Zuig de PBS op.
5. Oogst de cellen door 5 ml 0,05% trypsine-EDTA aan de kolf toe te voegen. Zet de kweekkolf gedurende 5 minuten op 37 °C met 5% CO₂ -incubator en voeg 5 ml DMEM toe.
6. Pipeteer de cellen om ze los te maken en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 350 x g .
7. Dissocieer de celpellet in 1 ml volledige DMEM en tel en controleer de levensvatbaarheid van de cel met behulp van trypan blue. BMDM's geïsoleerd met deze methode zijn 7,05 (± 2,52) ×10⁵ cellen/pup (Figuur 1E).
   OPMERKING: Let op de aanwezigheid van spoelvormige cellen die op dag twee van de differentiatie beginnen te verschijnen (Figuur 1B, rode pijlen). Als de kleur van de media geel wordt, wat aangeeft dat ze op zijn, voeg dan meer L929-geconditioneerde media toe op dag 4 van differentiatie; Volledige vervanging van media wordt niet aanbevolen.

6. Immunolabeling en flowcytometrische analyse

1. Blokkeer niet-specifieke antilichaamlabeling van de BMDM's (2x10⁵/label) door behandeling met 10 μL/10⁷ cellen FcR-blokkerend reagens volgens de aanbevelingen van de fabrikant in een volume van 100 μL/label flowcytometriebuffer (PBS aangevuld met 2 mM EDTA en 0,5% runderserumalbumine). Blijf 10 minuten op het ijs staan.
   OPMERKING: De cellen kunnen in bulk of in individuele putjes of buizen worden geblokkeerd. Alle volgende stappen geven hoeveelheden en volumes aan per individueel celmarkerlabel bij een eindvolume van 100 μL.
2. Was de cellen door 200 μL flowcytometriebuffer toe te voegen en centrifugeer op 525 x g gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
3. Verwijder het supernatans en zaai de cellen in een U-bodem 96 putjes met een dichtheid van 5 × 10⁵ cellen per putje. Kleurcellen door FVS780-Live/Dead cell-telling kleurstof verdund tot 3,000-voudig en 0.625 μL BV786-CD11b, PE-F4/80 en AlexaFluor488-CD206 toe te voegen in 100 μL flowcytometriebuffer hetzij afzonderlijk of in combinatie 12,13,14,15. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten op ijs bedekt met folie.
4. Voeg 100 μL flowcytometriebuffer toe en was de cellen door 7 minuten bij kamertemperatuur te centrifugeren op 525 x g .
5. Zuig het supernatans op en draai de celpellet voorzichtig rond. Voeg 100 μl 0,4% paraformaldehyde toe aan elk putje en incubeer een nacht bij 4 °C.
6. Was de cellen door 100 μL flowcytometriebuffer en pellet toe te voegen door centrifugatie op 525 x g gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
7. Resuspendeer de cellen in 400 μL flowcytometriebuffer en analyseer met behulp van een flowcytometer.

7. In-vitrotest om de fagocytische werkzaamheid van neonatale beenmerg-afgeleide macrofagen te evalueren

1. Resuspendeer de BMDM's in volledige DMEM zonder fenolrood of antibiotica en zaai ze met een dichtheid van 2 × 10⁵/ kwadrant in een 35 mm quad schaal met een volume van 500 μL.
2. Om het bacteriële inoculum te bereiden bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 25 of een ander gewenst MOI, verwijdert u een vooraf berekende voorraad Escherichia coli O1:K1:H7 die bij -80 °C is bewaard.
3. Aliquot het gewenste volume bacteriën in een microcentrifugebuisje van 1,7 ml. Was de bacteriën door PBS toe te voegen aan een totaal volume van 1 ml. Pelleteer de bacteriën door centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap.
4. Resuspendeer de bacteriekorrel in 50 μL PBS en voeg groene fluorescerende pH-gevoelige kleurstof toe tot een eindconcentratie van 500 μM. Dit is een pH-gevoelige kleurstof zonder fluorescerend signaal bij neutrale pH en fluoresceert helder in zure omgevingen, zoals aangezuurde fagosomen, tijdens het proces van fagocytose.
5. Incubeer de bacteriecellen 20 minuten in het donker voor kleurstofconjugatie.
6. Was de bacteriën vier keer met 1 ml PBS door centrifugeren bij 1000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
7. Resuspendeer de bacteriën in 500 μL volledige DMEM zonder fenolrood en voeg toe aan de BMDM-culturen.
8. Incubeer de BMDM's bij 37 °C in 5% CO₂ -incubator gedurende 4 uur en voeg vervolgens 200 ng van een celdoorlatende rode fluorescerende kleurstof toe die de lysosomen kleurt.
   OPMERKING: Fagocytaire bacteriën kunnen worden gevisualiseerd door fluorescerende microscopie.

Results

Met behulp van de methode die in deze studie wordt beschreven, kunnen 25 tot 37 miljoen beenmergcellen met succes worden geïsoleerd uit een worpgrootte van vijf C57BL/6 muizenjongen. Deze methode is gevalideerd met worpgroottes variërend van 5 tot 7 pups. De minimumleeftijd voor isolatie in onze experimenten is 7 dagen oud. Afhankelijk van de worpgrootte en het aantal cellen dat nodig is voor het experiment van minder dan een miljoen, kunnen onderzoekers dit protocol proberen voor muizen jonger dan 7 dagen oud. In aanwezigheid van L929-cel supernatans als bron van M-CSF, werden beenmergcellen in 5 dagen gedifferentieerd tot macrofagen (Figuur 2). De vorming van spoelvormige cellen werd waargenomen op de tweede dag van differentiatie (Figuur 2B), bijna de helft van de cellen vertoonde een spoelvorm op dag drie (Figuur 2C), en de meeste cellen hechtten zich en vormden langwerpige spoelvormen op dag vijf van de differentiatie (Figuur 2D). De opbrengst van beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDM's) met deze methode was 2,5-5 miljoen cellen van 5 pups van 7 dagen oud.

Om de gedifferentieerde BMDM's fenotypisch te karakteriseren, werden cellen uit 5-daagse culturen immunogelabeld voor CD11b, CD206 en F4/80. Voorwaartse/zijwaartse verstrooiingsschema's en single-marker gating-schema's zijn te zien in aanvullende figuur 1. De resultaten van de flowcytometrie-analyse toonden aan dat 76,4% van de BMDM's positief is voor zowel CD11b als F4/80 (Figuur 3A). De F480-CD11b^+-populatie komt overeen met het geschatte aantal cellen dat positief is voor CD206 (Figuur 3B). Dit laatste wordt over het algemeen beschouwd als een marker die consistent is met M2-achtige macrofagen, en hoewel de overvloed aan CD206-labeling wel twee keer zo groot kan zijn, is een hoger aandeel F4/80-labeling consistent met het vermogen van M-CSF om differentiatie naar een M1-achtig fenotype te bevorderen^16,17 (Figuur 3).

We evalueerden verder het vermogen van de gedifferentieerde neonatale BMDM's om bacteriën te fagocytoseren en ze naar verzuurde compartimenten te transporteren als een functionele maatregel. De bacteriën die zijn gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof mogen alleen groen fluoresceren wanneer ze worden gefagagocytoseerd en naar aangezuurde compartimenten worden getransporteerd. Overvloedige groene fluorescerende bacteriën die in de BMDM's waren gefagocytoseerd, werden gedetecteerd na infectie (Figuur 4A). De groene fluorescentie lokaliseert verder met rode fluorescentie die wijst op verzuurde lysosomen (Figuur 4B,C). De fagocytose en het verschijnen van groene pH-gevoelige kleurstofpositieve neonatale BMDM's werden ook waargenomen gedurende de 4 uur durende infectie (Figuur 4D en aanvullende video). De functionele activiteit die hier wordt weergegeven, komt overeen met M1-achtige inflammatoire macrofaagactiviteit.

Figuur 1: Isolatie van 7 dagen oude C57BL/6J muizenjongen beenmerg. (A) Botten van de achterpoten van 7 dagen oude jongen in een schaal van 100 mm. (B) Achterpoot van een pup van 7 dagen oud na verwijdering van de huid en het onderhuidse weefsel; Zwarte stippellijnen geven de plaats aan waar moet worden gesneden voor de beenmergextractie. (C) De neonatale achterpoot bewerkte botten met merg voordat ze werden verpletterd. (D) De neonatale achterpoot bewerkte botten na het pletten met behulp van een spuitzuiger in een zeef. (E) Het gemiddelde aantal ± standaardfout van beenmerg (BM) en beenmerg-afgeleide macrofaagcellen verkregen uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Differentiatie van BMDM's van neonatale beenmergcellen van 7 dagen oud. Beenmergcellen op dag 1 (A), dag 2 (B), dag 3 (C) en dag 5 van differentiatie (D). Rode pijlen op paneel B geven spoelvormige aangehechte cellen aan op dag 2 van differentiatie. Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Detectie van macrofaagmarkers in muizen met behulp van flowcytometrische analyse. Gedifferentieerde neonatale, van beenmerg afgeleide macrofagen die de expressie van F4/80 en CD11b (A) of CD206 en CD11b (B) oppervlakteantigenen vertonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Fagocytose van pH-gevoelige kleurstof-gelabelde E. coli door neonatale BMDM's. (A) Beenmerg-afgeleide macrofagen die gefagocytoseerde pH-gevoelige kleurstof-gelabelde (groene) E. coli vertonen na 4 uur infectie. (B) BMDM's gelabeld met kleurstof voor verzuurde lysosomen (rood). (C) Samengevoegde afbeelding van panelen (A) en (B). Schaalbalken: 20 μm. (D) Een overlay van groene fluorescerende bacteriën op macrofagen weergegeven in fasecontrast. De vergroting in (D) is hetzelfde als die in (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video. Een video van 4 uur van live celbeeldvorming van groene fluorescerende bacteriën door neonatale BMDM's zoals in figuur 4 paneel A. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Flowcytometrie-analyse van BMDM's. (A) BMDM's werden eerst afgeschermd op FSC en SSC om puin en doubletten te verwijderen. Enkelvoudige kleuring van F4/80 (B), CD11b (C) en CD206 (D) wordt getoond. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Onderzoek met neonatale muismodellen kan een aantal uitdagingen met zich meebrengen. Pasgeborenen hebben een zich ontwikkelend immuunsysteem dat uniek is in vergelijking met volwassenen⁸. Als zodanig mogen gegevens die zijn gegenereerd uit volwassen diermodellen niet worden verondersteld van toepassing te zijn op pasgeborenen, en verschillende gepubliceerde werken hebben dit idee goed verwoord^18,19. Daarom zijn neonatale-specifieke modellen en bronnen van cellen nodig om de fijne kneepjes van de immuunrespons in het vroege leven te bestuderen. Vanwege de grootte, gevoeligheid en delicate aard van neonatale muizen kan de hoeveelheid biologische monsters echter beperkt zijn en kan het verzamelproces tijdrovend zijn. Dit protocol stelt een eenvoudige en tijdbesparende procedure vast voor het extraheren van beenmerg van neonatale muizen.

Volwassen muizenbotten zijn groot genoeg om een naald in te steken en het merg gemakkelijk weg te spoelen. Omgekeerd is toegang tot neonataal beenmerg met een naald een uitdaging vanwege de grootte en kwetsbaarheid ervan. Sommige studies hebben enzymatische vertering toegepast met collagenase type II en dispase²⁰. Hier hebben we, vanwege de zachte en kleine aard van neonatale botten, een verpletterende methode toegepast om het beenmerg vrij te maken. Na zuivering kunnen deze cellen, afhankelijk van de onderzoekstoepassing die van belang is, worden gedifferentieerd in specifieke celtypen.

Pasgeborenen vertonen verschillende fenotypische macrofaagpopulaties²¹. Deze studie verhelderde de differentiatie van BMDM's van de beenmergcellen van pups op dag 7-9 zonder enzymen te gebruiken. Cruciale stappen die bij de methodologie betrokken zijn, zijn onder meer de algehele delicate aard van neonatale muizenpups, het verzamelen van de kleine botten op een manier die het vrijkomen van beenmerg niet mogelijk maakt, en het lokaliseren van de juiste plaats in het scheenbeen en dijbeen om schaarsneden te maken. We zagen dat neonatale BMDM's gevoeliger zijn dan volwassen BMDM's bij het kweken, en een langere duur van isolatie van beenmerg van pasgeborenen verhinderde hun differentiatievermogen. Daarom wordt extractie van meer dan 7 pups tegelijk niet aanbevolen. Bovendien resulteerde de toevoeging van BMDM-differentiatiemedia op dag twee van de differentiatie ook in slechte resultaten, zoals slechte differentiatie en lagere levensvatbaarheid.

Dit protocol gebruikte L929-celsupernatans als bron van M-CSF voor de differentiatie van beenmergcellen in macrofagen. L929-cellen zijn fibroblasten van muizen waarvan bekend is dat ze grote hoeveelheden M-CSF¹⁰ produceren. Macrofagen zullen naar verwachting worden blootgesteld aan andere stoffen die worden uitgescheiden in de L929 supernatant, samen met M-CSF. Commercieel gezuiverd M-CSF kan ook worden gebruikt voor macrofaagdifferentiatie; we hebben het echter niet direct vergeleken met het gebruik van L929 cultuursupernatant. Het is ook belangrijk op te merken dat L de Brito Monteiro et al. verschillende metabolische profielen hebben waargenomen tussen macrofagen gegenereerd met behulp van L929 en commercieel M-CSF²².

Deze methode zorgde voor een tijdbesparende, economische aanpak zonder het gebruik van spijsverteringsenzymen. De techniek leverde een betrouwbare isolatie van neonataal beenmerg op, wat resulteerde in een duidelijke differentiatie van neonatale BMDM's. Geïsoleerde neonatale BMDM's kunnen verder worden gebruikt om de dynamiek van neonatale macrofagen tijdens verschillende infecties en de regulatie van ontsteking door deze cellen te bestuderen. Beperkingen van de methode zijn onder meer een leercurve voor de eerste vestiging en aanpassing aan het trekproces van de kleine botten, die uiteindelijk verbetert met ervaring en de duur van het proces minimaliseert met een verhoogde levensvatbaarheid van de cellen. De worpgrootte van pups is een extra overweging voor het aantal macrofagen dat kan worden gedifferentieerd afhankelijk van de experimentele behoefte.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal