Methodenartikel

Toepassingen van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie in onderzoek naar natuurlijke producten: tropaanalkaloïden als casestudy

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66620

⸱

8 maart 2024

 ,  , 
1Department of Chemistry, Northern Michigan University

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een methode voor snelle massaspectrometrie (MS)/massaspectrometrie (MS)-gebaseerde annotatie en classificatie van tropaanalkaloïden, nuttig voor zowel voorlopige dereplicatie van tropane-bevattende monsters als de ontdekking van nieuwe alkaloïden voor isolatie.

Samenvatting

Hoewel veel geneesmiddelen die tegenwoordig worden gebruikt van synthetische oorsprong zijn, bieden natuurlijke producten nog steeds een rijke bron van nieuwe chemische diversiteit en bioactiviteit, en kunnen ze veelbelovende aanknopingspunten opleveren voor resistente of opkomende ziekten. De uitdaging is echter tweeledig: onderzoekers moeten niet alleen natuurlijke producten vinden en hun structuren ophelderen, maar ze moeten ook identificeren wat de moeite waard is om te isoleren en te testen (en wat al bekend is - een proces dat bekend staat als dereplicatie). Met de komst van moderne analytische instrumenten is het tempo van de ontdekking en dereplicatie van natuurlijke producten versneld. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) is een bijzonder waardevolle techniek geworden voor het identificeren en classificeren van chemische structuren. Tropaanalkaloïden (TA's) zijn plantaardige verbindingen van grote medicinale en toxicologische betekenis. In deze studie ontwikkelden we een LC-MS/MS-gebaseerde screeningworkflow met behulp van de meerdere MS/MS-configuraties die beschikbaar zijn op een triple-quadrupool (QQQ) massaspectrometer om TA-structuren te annoteren en te classificeren op basis van hun verschillende fragmentatiepatronen. Door gebruik te maken van een combinatie van data-afhankelijke (DD) productionenscans, precursorionenscans (PrIS) en neutrale verliesscans (NLS), hebben we deze methode toegepast op TA-rijke extracten van de nachtschade Datura stramonium en Datura metel. Deze methode is snel, gevoelig en werd met succes gebruikt voor zowel voorlopige dereplicatie van complexe TA-bevattende monsters als voor de ontdekking van een nieuwe kandidaat voor isolatie, zuivering (en uiteindelijke bioassay).

Inleiding

Hoewel volledig synthetische moleculen de afgelopen decennia een prominentere plaats hebben gekregen bij de ontdekking van geneesmiddelen, is bijna tweederde van alle goedgekeurde geneesmiddelen van de afgelopen 39 jaar natuurlijke producten of geïnspireerd op natuurlijke producten,1,2  wat het voortdurende belang van onderzoek naar natuurlijke producten onderstreept. Alkaloïden, bepaalde stikstofhoudende natuurproducten, worden vooral gewaardeerd om hun geneeskrachtige eigenschappen. Tropaanalkaloïden (TA's) die de [3.2.1.]-bicyclisch stikstofhoudend systeem, worden voornamelijk geproduceerd door planten in de families Solanaceae (nachtschade), Erythroxylaceae en Convolvulaceae. Voorbeelden zijn atropine, scopolamine en cocaïne; Meerdere semi-synthetische of synthetische tropaanen worden ook klinisch gebruikt3. TA's en hun derivaten worden gebruikt om veel aandoeningen te behandelen 3,4 en verschillende van deze geneesmiddelen staan op de WHO-lijst vanessentiële geneesmiddelen 2023 5. Vanwege hun krachtige activiteiten worden TA's ook recreatief gebruikt (als stimulerende middelen of delirianten) en kunnen ze vergiftiging veroorzaken bij inname van planten (of preparaten) die ze bevatten 6,7. TA's zijn ongewenst in menselijke en dierlijke voeding8 en kunnen thee, kruiden, granen, honing en kruidensupplementen aantasten 9,10. Vanwege zowel hun medicinale belofte als hun vermogen om te vergiftigen, zijn analytische methoden die kunnen helpen bij de ontdekking van nieuwe TA's (en identificatie van bekende TA's) nuttig.

Bij tandem massaspectrometrie (MS/MS) worden "massafilters" (bijv. quadrupolen, time-of-flight-buizen) fysiek aan elkaar gekoppeld ("in-space"), of maakt een instrument gebruik van extra "in-time" reactie-/scheidingsstappen. In-space MS/MS gebruikt verschillende modi om verschillende ionen te selecteren en te fragmenteren bij de verschillende massafilters (bijv. de quadrupolen van een triple-quadrupool of QQQ-instrument). Deze verschillende modi kunnen worden gebruikt om te bepalen welke specifieke fragmenten door een bepaald ion worden gemaakt (productionenscan), welke ionen in een monster bepaalde fragmenten opleveren (precursor ionenscan of PrIS) of verliezen van een karakteristieke massa ondergaan (neutral loss scan of NLS), of welke specifieke verbindingen welke specifieke fragmenten bezitten (monitoring van meervoudige reacties). MS/MS levert daarom fragmenten die nuttig zijn voor het voorstellen van structuren voor nieuwe verbindingen of het bevestigen van de aanwezigheid van een bestaande verbinding. MS/MS wordt steeds vaker gebruikt op het gebied van geneesmiddelenontdekking, chemie van natuurlijke producten en metabolomics 11,12, en is gebruikt om alkaloïde-bevattende soorten te profileren (voor fytochemische karakterisering of chemotaxonomische analyse) en om specifieke alkaloïden in voedsel of geneeskrachtige planten te detecteren en te kwantificeren 10,13,14,15,16.

Ondanks de vele massaspectrometrietechnieken die beschikbaar zijn, zijn er uitdagingen bij het vinden van nieuwe alkaloïden. Naast het vinden van een kandidaat-organisme om te screenen, is een volledige structurele bevestiging van een alkaloïde een moeizaam proces dat veel verschillende analytische technieken kan omvatten. Bovendien kunnen onderzoekers een verbinding isoleren die al bekend is, waardoor arbeid, tijd en middelen worden verspild. Dit is vooral moeilijk voor TA's, waar honderden, zo niet duizenden TA's, waarvan er vele isomeer met elkaar zijn, worden gerapporteerd. Het proces van "het identificeren van de bekenden en het onderscheiden van de onbekenden" staat bekend als dereplicatie. Databases van de retentietijden (r.t.s) en massafragmenten van verschillende TA's en andere verbindingen worden gepubliceerd om te helpen bij dit proces17,18. Desalniettemin is dereplicatie arbeidsintensief; alleen het annoteren (d.w.z. toekennen van vermeende structuren aan) de alkaloïden in het gehele LC-MS/MS-chromatogram van een monster is tijdrovend. Onlangs zijn zowel moleculaire netwerken1 9,20 als handmatige dereplicatie 18,21,22 gebruikt voor benzylisoquinoline, monoterpeenindool en tropaanalkaloïden, en PrIS's zijn gebruikt voor "structurele filtering" van spectra om pyrrolizidine en solanine-type alkaloïden te identificeren 23,24. Er zijn echter geen specifieke methoden of workflows beschikbaar voor snelle LC-MS/MS-gebaseerde dereplicatie van TA-bevattende monsters, ook al bevatten TA's gewone, gemakkelijk identificeerbare fragmenten (Figuur 1). De hier beschreven methode maakt gebruik van een combinatie van data-afhankelijke (DD) productionenscans, PrIS's en NLS's om TA-structuren in planten te annoteren en te classificeren op basis van zowel de verschillende fragmentatiepatronen voor mono-, di- en trigesubstitueerde tropapen (Figuur 1A) als de verliezen van gemeenschappelijke estergroepen die in deze alkaloïden worden aangetroffen (Figuur 1B). De studie-organismen zijn verschillende soorten in het nachtschadegeslacht Datura. Datura, een rijke bron van diverse TA's, is door de hele geschiedenis heen gebruikt voor medicinale en culturele doeleinden17- en is een uitdagende matrix om te depliceren vanwege de talrijke, structureel vergelijkbare TA's, die ons aantrekkelijke voorbeelden bieden waarop we onze methode kunnen testen.

Protocol

LET OP: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voordat u de vermelde chemicaliën gebruikt.

1. Voorbereiding van het monster

LET OP: Vloeibare stikstof kan cryogene brandwonden veroorzaken. Gebruik cryogene handschoenen en oogbescherming in een goed geventileerde ruimte. Alkaloïde-bevattende plantenmonsters kunnen irriterend zijn voor de huid; Pak ze altijd met handschoenen aan. Methanol is giftig en ontvlambaar en moet worden gehanteerd in een zuurkast, uit de buurt van mogelijke ontstekingsbronnen.

OPMERKING: In theorie kan gekweekt of wild plantenweefsel worden gebruikt (gedroogd of vers gemalen); De onderstaande procedure is precies die welke wordt gebruikt tijdens de ontwikkeling van de methode.

  1. Als het plantenweefsel van belang vers is, vries het dan in door het in een conische buis van polypropyleen te plaatsen en het 2-3 minuten onder te dompelen in vloeibare stikstof.
  2. Plaats het bevroren plantenweefsel in een voorgekoelde vijzel (in een polystyreenkoeler met vloeibare stikstof) en maal het weefsel met een voorgekoelde stamper tot een uniform poeder.
  3. Weeg snel de gewenste hoeveelheid weefsel af in een getarreerde polypropyleen microcentrifugebuis met behulp van een voorgekoelde spatel en voeg onmiddellijk 20% methanol toe (bij kamertemperatuur [RT]) in een concentratie van 1 ml per 100 mg weefsel.
    OPMERKING: Methanol (20%) wordt vaak gebruikt om TA's25 te extraheren. Af en toe wordt 0,1% mierenzuur toegevoegd, hoewel er geen verschil in extractie-efficiëntie werd waargenomen tijdens de ontwikkeling van deze en andere methoden.
  4. Plaats de afgedekte buizen op een schommelschudder (gemiddelde snelheid) gedurende minimaal 3 uur bij RT.
  5. Centrifugeer de buisjes bij 9464 x g gedurende 10 minuten. Pipetteer het supernatans in een injectieflacon met LC-MS autosampler of, als het nog steeds troebel is, filtreer het eerst door een spuitfilter van 0,45 μm.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd, hoewel verwerkte verse plantenmonsters en extracten vóór de analyse in een vriezer van -80 °C moeten worden bewaard om mogelijke afbraak van alkaloïden te voorkomen.

2. Configuratie van LC-MS-instrumenten en gegevensverzameling

LET OP: Acetonitril is giftig en ontvlambaar; Blijf uit de buurt van ontstekingsbronnen en controleer dampen met behulp van een zuurkast. Mierenzuur is bijtend; Vermijd huid- en oogcontact en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.

  1. Gebruik een LC-MS-instrument met een elektrospray-ionisatiebron (ESI) en een HPLC-kolom met omgekeerde fase (C18, 4,6 x 100 mm).
  2. Gebruik voor HPLC 0,1% mierenzuur in H2O als oplosmiddel A en 0,1% mierenzuur in acetonitril als oplosmiddel B; breng de kolom in evenwicht met 99% A en 1% B. Configureer een gradiënt van 30 minuten van 1%-50% B gedurende 26 minuten, keer terug naar 1% B om 26,01 minuut en houd deze gedurende 4 minuten vast op 1% B. Gebruik een kolomoventemperatuur van 45 °C en een debiet van 0,5 ml/min.
  3. Gebruik bij de LC-MS-methode de volgende bedrijfsparameters voor de massaspectrometer: interfacespanning: 4,0 kV, vernevelingsgasstroom: 3 l/min, verwarmingsgasstroom: 10 l/min, DL-temperatuur: 250 °C, warmtebloktemperatuur: 400 °C, interfacetemperatuur: 300 °C, drooggasstroom: 10 l/min en botsingsgeïnduceerde dissociatiedruk (CID) gas (argon) van 17 kPa.
  4. Bouw een MS-methode in ESI-positieve modus die zowel een Q3-scan als een Q1-scan (100-1000 Da) omvat die functioneert als een onderzoeksgebeurtenis (ingesteld op de lengte van de LC-methode), waarbij automatische isotopenuitsluiting is ingeschakeld. Neem een productionenscan op als een afhankelijke gebeurtenis van de Q1-scan (DD-analyse), met een massavenster van 50-1000 Da, een botsingscelenergie van -20 V en een gebeurtenistijd van <0,2 s.
    OPMERKING: De teldrempel voor het activeren van de DD-productionenscan van Q1 kan variabel zijn, maar meestal wordt een niveau van 7.000-10.000 tellingen gebruikt. Op sommige instrumenten, zoals het instrument dat is gebruikt om de methode te ontwikkelen, biedt de Q3-scan een grotere massanauwkeurigheid en gevoeligheid dan Q1 en is deze opgenomen om ionen te bevestigen die in de Q1-scan zijn waargenomen, hoewel deze zonder problemen kan worden weggelaten uit stap 2.4.
  5. Voeg aan de bovenstaande MS-methode PrIS's in positieve modus toe die gelijk zijn aan de lengte van de LC-methode met botsingscelenergieën van -20 V en gebeurtenistijden van 0,75 s. Zorg ervoor dat in alle gevallen de functies Automatische isotopen uitsluiten of De-isotopen zijn ingeschakeld. Zorg ervoor dat de m/z-waarden die van belang zijn voor TA-fragmenten (in Da, zie figuur 1A) 124,1 zijn (voor monogesubstitueerde TA's, massavenster van 125-1000 Da), 122,1 en 140,1 (voor gedisubstitueerde TA's, massavensters beginnend bij respectievelijk 123 en 141 Da), en 156,1 en 138,1 (voor trigesubstitueerde TA's, massavensters beginnend bij 157 en 139 Da, respectievelijk).
    OPMERKING: Tijdens de ontwikkeling van de methode werden de PrIS opgesplitst over twee verschillende methoden, één voor mono- en digesubstitueerde TA's en één voor trigesubstitueerde TA's, hoewel ze op elke manier kunnen worden opgesplitst of gecombineerd.
  6. Bouw een tweede MS-methode die de parameters in stap 2.4 bevat.
    1. Voeg aan die MS/MS-methode plus-modus NLS toe die gelijk is aan de lengte van de LC-methode, met botsingscelenergieën van -20 V en gebeurtenistijden van 0,75 s. Zorg ervoor dat in alle gevallen de functies Automatische isotopen uitsluiten of De-isotopen zijn ingeschakeld.
    2. Zorg ervoor dat de neutrale verliesmassa's die van belang zijn voor esters op TA's (in Da, zie figuur 1B) 100,05 zijn (voor esters afgeleid van tivellezuur, massavenster van 110-1000 Da), 60,03 (voor acetylgroepen, massavenster van 100-1000 Da) en 166,06 (fenylmelkzuur- of tropenzuuresters, massavenster van 170-1000 Da).
  7. Download de LC-MS-methode en maak gegevensbestanden voor de monsters die u nodig heeft. Zodra de HPLC-kolom in evenwicht is bij 45 °C, voert u de monsters van belang uit in een batch of projectbestand met geschikte blanco extractieoplosmiddelen tussen verschillende soorten of weefseltypen. Een typisch injectievolume is 10-20 μL.
    OPMERKING: Bij bijzonder hoge volumes kan de massaspectrometerdetector verzadigd zijn. Als u zeer geconcentreerde monsters gebruikt, zorg er dan voor dat de ESI-bron wordt schoongemaakt en dat het instrument regelmatig wordt gestemd. Het protocol kan hier worden gepauzeerd nadat alle gegevens zijn verzameld.

3. Gegevensanalyse

  1. Onderzoek het totale ionenchromatogram van de Q1- en Q3-scans (en de DD-productionenscan) en noteer de moedermassa van eventuele overvloedige ionen die TA-achtige kenmerken hebben: a) massa <500 Da voor het [M+H]+ -ion, meestal een even massa, b) typische rts tussen 2-22 minuten met behulp van de bovenstaande LC-methode, en c) fragmenten uit de volgende lijst: m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 of 128 Da.
  2. Bestudeer het PrIS-chromatogram/kanaal voor m/z 124 en merk op bij welke pieken/ionen r.t.s (opgenomen in stap 3.1) dit fragment produceren. Klik scan voor scan door het chromatogram en onderzoek de volledige MS/MS-spectra die zijn verkregen in de DD-productionenscan, vooral voor soorten met een lagere abundantie.
    OPMERKING: Een echte soort die dit fragment bevat, zal bestaan voor meerdere scans en verschijnen in zowel de Q1- als de Q3-scans (als de laatste wordt gebruikt). Bij de ondersteunende informatie (aanvullend bestand 1) is een spreadsheet gevoegd om te helpen bij het maken van annotaties.
  3. Herhaal stap 3.2 met de andere PrIS-chromatogrammen. Aangezien zowel m/z 122 als 140 indicatief zijn voor gedisubstitueerde TA's en zowel m/z 138 als 156 indicatief zijn voor trigesubstitueerde TA's, moeten deze chromatogrammen/kanalen samen worden onderzocht.
  4. Onderzoek het NLS-chromatogram/de kanalen voor m/z 100, 60 en 166 en noteer welke pieken/ionen bij welke rt's (vastgelegd in stap 3.1) deze neutrale verliezen veroorzaken. Net als bij de PrIS, klik je scan voor scan door het chromatogram en vergelijk je met de fragmentatie die is verkregen in de DD-productionenscan, vooral voor soorten met een lagere abundantie.
  5. Met behulp van de combinatie van PrIS- en NLS-gegevens, ondersteund door de resultaten van de DD-productionenscan, maakt u vermeende annotaties van de waargenomen alkaloïden door de kleinste tropaanmassa (bijv. 124, 122 of 138) en het neutrale verlies toe te voegen en vervolgens rekening te houden met de resterende resterende massa.
    OPMERKING: Typische groepen die TA's (en hun massa's in Da) vervangen, zijn hydroxyl (18), acetyl (60), propionyl (74), isobutyryl (88), tigloyl (100), verzadigd tigloyl/2-methylbutyryl (102) of fenyllactaat/tropenzuur (166).
  6. Vergelijk annotaties voor alkaloïden met die gerapporteerd in de literatuur17 en databases (bijv. MoNA)26 om te bepalen welke TA-substitutiepatronen worden gerapporteerd (en welke mogelijk nieuw zijn). Gebruik bovendien standaarden van enkele veel voorkomende tropaanalkaloïden (bijv. atropine, littorine, scopolamine) die in de handel verkrijgbaar zijn voor bevestiging.
  7. Voor aanvullende structurele informatie voor monsters met een lage abundantie (de PrIS en NLS kunnen ionen oppikken onder de drempels voor afhankelijke gebeurtenissen), verzamelt u een specifieke productionenscan (waarbij de betreffende massa wordt gebruikt als het voorloperion) op een meer geconcentreerd monster.
    OPMERKING: Deze methode is ontwikkeld op een QQQ-instrument met lage resolutie. Voor alle vermeende nieuwe verbindingen moet een MS-instrument met hoge resolutie worden gebruikt om nauwkeurige massaspectra te verkrijgen.

Resultaten

Om de effectiviteit van de methode aan te tonen, werd een standaardmix van TA's (10 μg/ml elk van een acetyltropine/acetylpseudotropine-mix [monogesubstitueerd], 10 μg/ml elk van een mengsel van twee anisodamine-isomeren [gesubstitueerd], samen met hyoscyamine [monogesubstitueerd], littorine [monogesubstitueerd] en scopolamine [trigesubstitueerd]) geanalyseerd als positieve controle (Figuur 2). Een volledig Q1-scanchromatogram (weergegeven in de weergave van het basispiekchromatogram) wordt weergegeven in figuur 2A, waarbij de TA-standaardstructuren worden aangegeven door de bijbehorende pieken. De PrIS voor m/z 124 (figuur 2B) vertoont pieken in het chromatogram voor de monogesubstitueerde TA's; Ergo, de acetyltropine/pseudotropine-mix, hyoscyamine en littorine worden weergegeven. De pieken die overeenkomen met acetyltropine en pseudotropine in het m/z 124-chromatogram zijn klein (mogelijk omdat ze een lagere concentratie hebben dan de andere standaarden en mogelijk omdat ze een minder overvloedig m/z 124-fragment produceren dan de andere monogesubstitueerde TA's). Desalniettemin zijn ze nog steeds detecteerbaar in zowel dit chromatogram als in het bijbehorende PrIS-kanaal. Figuur 2C en Figuur 2D zijn PrIS-chromatogrammen voor respectievelijk m/z 122 en 140. Ze detecteren gedisubstitueerde TA-fragmenten en markeren beide de twee isomeren van anisodamine, met een sterker signaal zichtbaar op het m/z 140-kanaal. Aangezien verschillende TA's fragmenten van verschillende intensiteit kunnen bezitten, moeten de m/z 122- en 140-kanalen samen worden onderzocht. Ten slotte vertonen de kanalen m/z 156 (Figuur 2E) en m/z 138 (Figuur 2F), diagnostisch voor trigesubstitueerde TA's, beide één piek voor scopolamine (de enige trigesubstitueerde TA in de standaardmix).

NLS-chromatogrammen werden vervolgens gebruikt om de aanwezige estergroepen toe te wijzen. Figuur 2G toont het NLS-chromatogram voor 60 Da (verlies van azijnzuur uit acetaatesters): de twee geacetyleerde monogesubstitueerde TA-isomeren zijn zichtbaar. Het NLS-chromatogram voor 166 Da (figuur 2I), bedoeld om fenylmelkzuur- of tropische esters te identificeren, identificeert correct alle alkaloïden die een van deze groepen bevatten (hyoscyamine, littorine, de twee anisodamine-isomeren en scopolamine). Ten slotte, zoals voorspeld, is het chromatogram (figuur 2H) voor het verlies van 100 Da (diagnose van tigloylesters ) blanco met uitzondering van een kleine onzuiverheid bij r.t. 1,75 min, aangezien geen van de standaard alkaloïden deze groep bevat.

De methode werd vervolgens getest op valse positieven. Een water/methanol extract van tomatenblad (Solanum lycopersicum) diende als negatieve controle. Ondanks dat ze nachtschade zijn, produceren tomaten geen TA's. Een volledig Q1-scan base-peak chromatogram wordt weergegeven in figuur 3A. De PrIS voor m/z 124 (Figuur 3B) is grotendeels leeg, met kleine basislijnfluctuaties die waarschijnlijk detectorruis zijn (geen enkele signaal kwam overeen met die massa's in de Q1- of Q3-scans). Twee kenmerken met rt's van 2,6 en 3,4 min leveren een 124-fragment op, maar onderzoek van de DD-product-ionenscan onthult dat deze kenmerken geen andere monogesubstitueerde tropaanfragmenten produceren (m/z 93 of 142), wat suggereert dat het geen TA's zijn. Dit voorbeeld benadrukt ook het nut van het opnemen van de ionenscan van het DD-product in deze methode om valse positieven uit te sluiten. Evenzo vertoont het m/z 122-kanaal voor gedisubstitueerde TA's (figuur 3C) ook alleen ruis. De PrIS-chromatogrammen voor m/z 140, m/z 138 en m/z 156, en de drie NLS'en, die alleen niet-TA-kenmerken op de DD-scans suggereren, worden weergegeven in aanvullende figuur 1A-F.

Om het gebruik van deze methode bij het depliceren van een TA-bevattend monster aan te tonen, werd een extract van D. metel var. 'fastuosa'-wortel geanalyseerd. De wortels zijn de belangrijkste plaats van TA-biosynthese in nachtschade, en er werd voorspeld dat er veel verschillende TA's aanwezig zouden zijn. Het volledige Q1-scanchromatogram wordt weergegeven in figuur 4A. Zoals verwacht werden talrijke kenmerken van verschillende abundantie gedetecteerd op de PrIS's voor m/z 124 (Figuur 4B), m/z 122 (Figuur 4C), m/z 140 (Figuur 4D), m/z 156 (Figuur 4E) en m/z 138 (Figuur 4F). Veel van deze TA's waren ook geacetyleerd of getigloyeerd, of afgeleid van fenylmelkzuur/tropenzuur, zoals blijkt uit de talrijke signalen in de NLS-chromatogrammen in respectievelijk figuur 4G-I.

Een spreadsheet, geleverd als een .xls bestand (een leeg blad voor lezersgebruik is Aanvullend Bestand 1, D. metel root is in Aanvullend Bestand 2), werd gebruikt om eerst te documenteren welke functies (massa's of RT's) TA-achtig leken (met behulp van criteria in stap 3.1). Vervolgens werden fragmenten en neutrale verliezen genoteerd die bij deze kenmerken hoorden. De methode is uiterst gevoelig: de PrIS-kanalen detecteerden zelfs gemakkelijk TA's met een lage abundantie die geen zichtbare pieken opleverden op de bijbehorende chromatogrammen. Met behulp van de fragmenten en neutrale verliezen kan vervolgens een structuur voor de alkaloïde worden voorgesteld door stap 3.5 te volgen.

Een voorbeeld van het gebruik van de spectrale gegevens om alkaloïden te annoteren is te vinden in figuur 5. Het volledige Q1-scanchromatogram voor D. metelwortel is in figuur 5A. Er is gekozen voor een functie op 14,4 min; het Q1-scanspectrum (Figuur 5B) toont een moedermassa van m/z 224 voor deze piek. Het spectrum van de ionenscan van het DD-product wordt weergegeven in figuur 5C. Het PrIS-kanaal voor m/z 124 (figuur 5D) geeft aan dat het 224-ion dit fragment produceert (ook zichtbaar in de DD-productionenscan). Het NLS-kanaal voor 100 Da (om getigloyeerde TA's te detecteren) markeert ook m/z 224 (ook bevestigd door de DD-productionenscan). Het optellen van het neutrale verlies en het TA-fragment met de laagste massa (100 + 124 Da) is gelijk aan de moedermassa, 224, wat bevestigt dat de tigloylgroep de enige substitutie is; een waarschijnlijke structuur voor deze alkaloïde is aangegeven in figuur 5C. Voor di- en tri-gesubstitueerde TA's werden waargenomen neutrale verliesmassa's toegevoegd aan de laagste TA-massa, en vervolgens werd een andere substitutie voorgesteld om rekening te houden met de resterende massa: bijvoorbeeld m/z 222, met gedisubstitueerde TA-fragmenten van 140 en 122 en een neutraal verlies van 100 Da, heeft een resterende massa van 100 (222-122 = 100), Waarschijnlijk een tweede Tilloll-groep. Deze workflow kan intuïtief worden gebruikt voor het eliminatieproces: een functie zonder tropaanfragmenten (zelfs als het 60, 100 of 166 Da kan verliezen) is waarschijnlijk geen TA. In een voorbeeld van grondige en snelle dereplicatie met behulp van deze workflow werden 71 verschillende TA's van verschillende overvloed en polariteit geïdentificeerd in D. metel-wortel , waaronder meerdere isomere verbindingen (aanvullend bestand 2). Sommige van deze verbindingen hadden estergroepen die niet gemakkelijk konden worden toegewezen, en sommige extra verbindingen werden gemarkeerd als potentiële TA's, maar konden niet met hoge betrouwbaarheid worden geannoteerd.

Een methanol/water-extract van gemalen D. stramonium-zaden werd ook geanalyseerd. Het volledige Q1-scanbasis-piekchromatogram voor D. metelwortel wordt weergegeven in figuur 6A. De PrIS voor m/z 124 is weergegeven in figuur 6B en de PrIS voor m/z 122 is weergegeven in figuur 6C; de andere chromatogrammen zijn weergegeven in aanvullende figuur 2A-F. Figuur 6B toont een zeer overvloedige monogesubstitueerde tropaanalkaloïde bij een r.t. = 12,6 min, waarschijnlijk hyoscyamine. De spreadsheet met seed TA-annotaties is opgenomen in aanvullend bestand 3. De prestaties van de methode leken lager met dit specifieke monster: twee zeer overvloedige kenmerken met een m/z van 259 bij rts van 8,5 en 10,2 minuten leverden pieken op de NLS-chromatogrammen op voor 60 en 100 Da (aanvullende figuur 2 D,E) met een massa van m/z 260 (een M+1-isotoop) aangegeven op de overeenkomstige spectra. Deze verbindingen zijn geen TA's, maar in plaats daarvan gevormde fragmenten die consistent zijn met bèta-carboline-alkaloïden27. Ze zijn niet geacetyleerd of getigloyeerd, maar verliezen 60 of 100 van hun M+1-isotoop, waardoor hun verschijning op deze twee NLS-kanalen onjuist is. Bovendien leverde scopolamine (r.t. = 10,5 min) een m/z 122-fragment op van zijn m/z 305 M+1-isotooppiek, een isotoop van het verwachte m/z 121-fragment van scopolamine. Hoewel deze methoden gebruik maken van de-isotopenfuncties, is enige isotopenlekkage mogelijk bij deze hoge monsterconcentraties. Hoewel dit een gebeurtenis kan zijn die uniek is voor het instrument dat in dit onderzoek of deze steekproef is gebruikt, is het vermeldenswaard.

Veertig TA's werden geannoteerd in D. stramoniumzaden met behulp van deze methode, waaronder verschillende die geglycosyleerd lijken te zijn en massa's van 162 (hexose), 146 (deoxyhexose) of 132 Da (xylose of een vergelijkbare suiker) verliezen. Hoewel hexose-bevattende TA's zijn gerapporteerd in Merremia (Convolvulaceae)28, Duboisia29 en Atropa25, is dit de eerste melding van deoxyhexose- of xylose-bevattende TA's. Eén TA had een rt van 13,8 min (Figuur 7A) en een massa van m/z 436 (Q1-scan in Figuur 7B). Deze functie produceerde een signaal op het m/z 124-kanaal, wat wijst op een monogesubstitueerde TA (Figuur 7D), maar produceerde geen signalen op een ander PrIS- of NLS-kanaal. De DD-productionenscan (figuur 7C) gaf de verwachte m/z 124 aan, een verlies van 312 Da, mogelijk 166 + 146 Da, van het moederion. MS/MS met hoge resolutie werd verkregen op een quadrupool time-of-flight-instrument (spectrum in figuur 7E), dat een m/z 290-fragment aangaf, wat suggereert dat hyoscyamine of littorine geglycosyleerd is op het esterhydroxylgedeelte met rhamnose of een vergelijkbare suiker; de gemeten nauwkeurige massa lag ook zeer dicht bij de exacte massa berekend voor rhamnosyl-hyoscyamine of littorine (structuur in figuur 7E). Vanwege zijn ongekende structuur en overvloed verdient deze alkaloïde isolatie uit D. stramoniumzaden , een voorbeeld dat het gebruik van deze methode bij nieuwe alkaloïden aantoont.

figure-results-1
Figuur 1: Relevante fragmenten en verliezen waargenomen bij MS van TA's. (A) Karakteristieke fragmenten (en hun diagnostische massa's) gevormd uit monogesubstitueerde, digesubstitueerde en trisubgesitueerde TA's, evenals representatieve voorbeelden van alkaloïden in elke klasse. (B) Gemeenschappelijke neutrale verliezen waargenomen van estergroepen in TA's (en hun diagnostische massa's). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Positieve controle precursor ion en neutraal verlies scans. Voor alle chromatogrammen is de X-as de retentietijd en de Y-as de telling (ionenovervloed). (A) Het totale ionenchromatogram, in base-peak chromatogramweergave, van de alkaloïde standaardmix. Structuren van de normen worden aangegeven; De bijbehorende pieken worden aangeduid met rode pijlen. (B-F) zijn PrIS-chromatogrammen voor (B) m/z 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 en (F) 138. (G-I) NLS-chromatogrammen voor 60 Da (acetyl, G), 100 Da (tigloyl, H) en 166 Da (fenylmelkzuur/tropenzuur, I). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Negatieve controle precursor ionen en neutrale verliesscans. Voor alle chromatogrammen is de X-as de retentietijd en de Y-as de telling (ionenovervloed). (A) Het totale ionenchromatogram, in basis-piekchromatogramweergave, van een methanol/waterextract van het blad van S. lycopersicum . (B) Het PrIS-chromatogram voor m/z 124 met slechts twee niet-tropane kenmerken bij rt 2,6 en 3,4 min. (C) Het PrIS-chromatogram voor m/z 122, blanco behalve voor detectorruis. De gebruikte schalen zijn dezelfde als in figuur 2; de overige chromatogrammen staan in aanvullende figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Toepassing van de MS/MS-methode op D. metel var. 'fastuosa' wortels. Voor alle chromatogrammen is de X-as de retentietijd en de Y-as de telling (ionenovervloed). (A) Het totale ionenchromatogram, in base-peak chromatogramaanzicht, van een methanol/waterextract van D. metel var. "fastuosa" wortels. (B-F) zijn PrIS-chromatogrammen voor m/z (B) 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 en (F) 138. (G-I) zijn NLS-chromatogrammen voor 60 Da (acetyl, G), 100 Da (tigloyl, H) en 166 Da (fenylmelkzuur/tropenzuur, I). Let op de overvloedige signalen op elk chromatogram die overeenkomen met talrijke TA's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Toepassing van een gecombineerde DD-productionenscan, een voorloper-ionenscan en een neutrale verliesscanmethode voor het voorstellen van de structuur voor een TA. (A) Het totale ionenchromatogram, in basis-piekchromatogramweergave, van een methanol/waterextract van D. metel var. 'fastuosa' -wortels. Een piek op r.t. = 14,4 min wordt aangegeven door een rode pijl. (B) De Q1 (surveyscan), met een overvloedige massa van m/z 224 voor deze piek. Voor alle spectra is de X-as massa en de Y-as de intensiteit. (C) De ionenscan van het DD-product, die de fragmentatie van het m/z 224-ion aangeeft, wat een verlies van 100 Da en een m/z 124-fragment aangeeft (rode pijlen). Deze verbinding komt voor op zowel het (D) m/z 124 PrIS-kanaal als (E) het 100 Da NLS-kanaal, wat aangeeft dat het zowel monogesubstitueerd als tigloyaal is (structuur in paneel C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Toepassing van de MS/MS-methode op zaden van D. stramonium . Voor alle chromatogrammen is de X-as de retentietijd en de Y-as de telling (ionenovervloed). (A) Het totale ionenchromatogram, in basis-piekchromatogramaanzicht, van een methanol/waterextract van D. stramoniumzaden. (B) Het PrIS-chromatogram voor m/z 124; (C) geeft het PrIS-chromatogram voor m/z 140 weer. De overige chromatogrammen staan in aanvullende figuur 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Annoteren van een nieuwe alkaloïde in D. stramonium zaden. Voor alle chromatogrammen is de X-as de retentietijd en de Y-as de telling (ionenovervloed). (A) Het totale ionenchromatogram, in basis-piekchromatogramweergave, van een methanol/waterextract van D. stramoniumzaden. Een functie op r.t. = 13,7 min wordt aangegeven. (B) De Q1 (survey-scan) die een massa van m/z 436 voor deze piek laat zien. Voor alle spectra is de X-as massa en de Y-as de intensiteit. (C) De ionenscan van het DD-product die de fragmentatie van het m/z 436-ion aantoont. (D) Deze monogesubstitueerde TA-verbinding verschijnt op het m/z 124 PrIS-kanaal. (E) Het MS/MS-spectrum met hoge resolutie voor deze nieuwe TA, samen met de voorgestelde structuren en exacte massa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Aanvullende scans van negatieve controleprecursorionen en neutraal verlies. (A-C) PrIS-chromatogrammen voor m/z (A) 140, (B) 156 en (C) 138. (D-F) NLS-chromatogrammen voor 60 Da (acetyl, D), 100 Da (tigloyl, E) en 166 Da (fenylmelkzuur/tropenzuur, F). De gebruikte schalen zijn dezelfde als in figuur 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Toepassing van de MS/MS-methode op zaden van D. stramonium; aanvullende chromatogrammen. (A-C) zijn PrIS-chromatogrammen voor m/z (A) 140, (B) 156 en (C) 138. (D-F) NLS-chromatogrammen voor 60 Da (acetyl, D), 100 Da (tigloyl, E) en 166 Da (fenylmelkzuur/tropenzuur, F). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Lege spreadsheet gebruikt voor alkaloïde annotaties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Spreadsheet van alkaloïde annotaties en structuren voor D. metel var. 'fastuosa' wortels. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Spreadsheet van alkaloïde annotaties en structuren voor D. stramonium zaden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hoewel de instrumentparameters in het protocol bevredigende prestaties mogelijk maken, kan het succesvolle gebruik van deze methode zorgvuldige aandacht of optimalisatie van verschillende kritieke stappen vereisen. Hoewel de HPLC-oplosmiddelgradiënt in stap 2.2 over het algemeen geschikt is voor tropaanalkaloïden, kan het nodig zijn deze te wijzigen afhankelijk van het tropaanalkaloïdenprofiel van het onderzochte monster of de plantensoort. Het injectievolume van het monster kan ook worden gewijzigd, afhankelijk van de gevoeligheid van het instrument en de manier waarop de methode wordt gebruikt. "Diepe" metabole profilering of dereplicatie moet een groter injectievolume gebruiken (15-20 μL werd in deze studie gebruikt), terwijl eenvoudige detectie van alkaloïden kleinere volumes zou kunnen gebruiken. Bij het gebruik van grote monstervolumes moet ervoor worden gezorgd dat (a) de ionenbron regelmatig wordt gereinigd, (b) de HPLC-kolom wordt gecontroleerd op drukveranderingen of verstoppingen (er moet altijd een geschikte beschermkolom worden gebruikt), (c) overdracht tussen monsters wordt voorkomen, en (d) chromatogrammen worden onderzocht op mogelijke "isotopenlekkage" zoals hierboven beschreven. De temperaturen en spanningen van de interface mogen niet significant worden gewijzigd ten opzichte van die gespecificeerd in de methode om voortijdige fragmentatie in de bron te voorkomen. Bovendien, hoewel een botsingscelspanning van 20 V wordt aanbevolen, levert deze mogelijk niet het optimale chromatogramsignaal (of diagnostische DD-productionenscanfragmenten) voor alle TA's. Sommige instrumenten en functies van MS hebben een "collision energy ramping"-functie, of de mogelijkheid om scans te verzamelen met meerdere of geoptimaliseerde botsingsenergieën, die ook nuttig zouden kunnen zijn in een methode als deze30.

Deze MS-methode zelf is ook gemakkelijk te wijzigen: terwijl tiglic-, azijnzuur- en fenylmelkzuur/tropenzuuresters veel voorkomen in Datura-soorten, kunnen de substitutiepatronen van TA-esters anders zijn in andere planten of monsters. De NLS-massa's kunnen worden gewijzigd om andere estergroepen te detecteren (bijv. een verlies van 74 Da voor propionische esters) of mogelijk glycosylaties te detecteren (bijv. een verlies van 162 Da voor hexosen). De PrIS-massa's kunnen ook worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, een TA in beide Datura-monsters (r.t. = 12,5 min; zie aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2) werd geannoteerd als norhyoscyamine of norlittorine (hyoscyamine/littorine minus de tropaan N-methylgroep) op basis van de DD-product-ionscanfragmenten (m/z 110 en 93) en overeenkomen met de literatuurspectra31; deze TA verscheen niet op een van de PrIS-kanalen van het tropaanfragment. Voor deze twee massa's zou een kanaal kunnen worden toegevoegd om nortropane te detecteren. Het m/z 93-fragment is ook aanwezig in de meeste monogesubstitueerde TA's17; het toevoegen van dit kanaal kan extra bevestiging bieden voor de aanwezigheid van een monogesubstitueerde TA en helpen bij het verminderen van valse positieven.

Naast het aanpassingsvermogen voor verschillende soorten TA's, is een groot voordeel van dit protocol (ten opzichte van bestaande alkaloïde annotatiemethoden) de snelheid. Afhankelijk van hoe de MS-methode is geconfigureerd (en de HPLC-runtime die wordt gebruikt), kunnen alle MS/MS-gegevens voor een monster binnen 60-90 minuten worden verzameld. Tijdens onze studies werden bijvoorbeeld de mono- en di-gesubstitueerde TA PrIS's ingebouwd in de ene methode, de trigesubstitueerde TA PrIS's in een andere methode en de NLS's in een derde (alle methoden bevatten de DD-productionenscan), voor een totaal van drie injecties van dertig minuten per stuk. Volledige annotatie van het monster met behulp van de gecombineerde MS/MS-gegevens is veel sneller dan handmatig onderzoek van elke piek of het verzamelen van individuele productionenscans voor talloze interessante pieken. Deze methode kan worden uitgevoerd op elk instrument met productionenscan-, PrIS- en NLS-modi en kan worden gebruikt voor snelle kwalitatieve beoordeling (d.w.z. zijn TA's aanwezig of afwezig?), voor het onderscheiden of "fingerprinten" van verschillende plantengeslachten, soorten, variëteiten of cultivars, organen of groeistadia, en voor het vergelijken van waargenomen TA's met gerapporteerde TA's (als onderdeel van een dereplicatieworkflow). Zoals aangetoond, kan het protocol ook worden gebruikt voor de ontdekking van nieuwe TA's als aanknopingspunten voor isolatie, zuivering of bioassay, evenals voor de identificatie van kandidaat-soorten en weefsels om ze van te isoleren. Deze methode kan worden gebruikt op het gebied van natuurlijke producten en metabolomics, onder meer om te helpen bij het begrijpen van de biochemie van planten en voor onderzoek naar geneesmiddelen in een vroeg stadium. Aanvullende toepassingen kunnen worden gevonden in voedselveiligheid of forensisch onderzoek (bijv. detectie van TA's in voedsel, supplementen of biovloeistoffen).

De methode heeft wel een aantal nadelen die discussie rechtvaardigen. Ten eerste kan, afhankelijk van het gebruikte instrument en het doel van het gebruik van het protocol, een groot injectievolume van het monster nodig zijn, wat in sommige gevallen problemen met de prestaties van het instrument en de kans op valse positieven kan veroorzaken (zoals hierboven beschreven). Ten tweede is deze methode ontwikkeld op een QQQ-instrument met een lage resolutie, en valse positieven kunnen het gevolg zijn van de lage resolutie (bijv. het kenmerk dat een m/z 124-fragment bevat in de negatieve controle dat geen TA is). Een instrument met een hogere resolutie zou een beter diagnostisch vermogen bieden, en MS/MS-spectra met een nauwkeurige massa zouden moeten worden verkregen voor elke voorgestelde nieuwe alkaloïde. Bijkomende nadelen van deze methode zijn simpelweg de nadelen van MS/MS-analyse als geheel. Hoewel MS/MS nuttig is voor het voorstellen van structuren ("annotatie" zoals aangeduid door het Metabolomics Standards Initiative32), biedt het geen concrete toewijzingen van moleculaire connectiviteit ("identificatie"). In beide Datura-monsters vonden we bijvoorbeeld verschillende isomeren van een m/z 306 TA, die zowel m/z 124- als m/z 140-fragmenten leken te hebben (aanvullend bestand 2), waardoor het moeilijk was om het substitutiepatroon definitief toe te wijzen. Dit zou een nog onontdekt fragmentatiemechanisme kunnen vertegenwoordigen, en een andere techniek (zoals nucleaire magnetische resonantiespectroscopie) kan nuttig zijn bij het oplossen van dubbelzinnigheden. Op MS/MS gebaseerde methoden worstelen vaak met isomerisme: de fenylmelkzuurester littorine (of zijn derivaten) is moeilijk te onderscheiden van hyoscyamine (tropinezuurester), en andere Solanaceous-planten bevatten TA's gesubstitueerd met de isomere tigloyl-, senecioyl- en angeloylgroepen33,34; Bij gebrek aan normen kunnen deze verbindingen moeilijk, zo niet onmogelijk, uit elkaar te onderscheiden zijn. De methode zal ook geen onderscheid maken tussen enantiomeren (bijv. 3,6- vs. 3,7-dihydroxytropane; zie figuur 1 voor nummering) of regio-isomeren (bijv. het onderscheiden van 3-acetyl van 7-acetyl zonder standaard). We hebben de meeste monogesubstitueerde tropapen toegewezen als 3-gesubstitueerd op basis van eerdere patronen gerapporteerd in het geslacht Datura en andere Solanaceous planten17,35. Ergo, alle biochemische kennis of literatuur over het bestudeerde organisme (indien beschikbaar) moet altijd worden geraadpleegd naast elke instrumentele analyse.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door een Faculty Research Grant (Northern Michigan University, toegekend aan M.A.C.), een niet-gegradueerde onderzoeksbeurs (Northern Michigan University, toegekend aan JC) en het Department of Chemistry. De auteurs willen John Berger (NMU) bedanken voor zijn hulp bij de voorbereiding van plantenweefsel, Hannah Hawkins (NMU) voor het onderhoud van LC-MS en hulp bij het oplossen van problemen, en Dr. Ryan Fornwald en zijn CH 495 (Natural Products Synthesis) studenten voor hun bereiding van de acetyltropinemix. De auteurs willen ook Dr. Daniel Jones (Michigan State University) bedanken voor het verkrijgen van MS/MS-spectra met hoge resolutie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acetonitrile, voor UHPLC, geschikt voor massaspectrometrieSigma-Aldrich900667HPLC-oplosmiddel
Argon gasAirGasAR UHP300CID-gas
Mierenzuur, 99% voor analyseThermo ScientificAC270480010HPLC-additief
Guard column-houderRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC-kolom
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Massaspectrometer; we gebruikten LabSolutions-software, die standaard is voor Shimadzu-instrumenten
Vloeibare stikstofAirGasNI 180LT22
Methanol, voor HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400Voor het maken van extractie-oplosmiddel
Microcentrifuge VWR2400-37
Microcentrifugebuisjes, 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Morser Fisher ScientificFB961CVoor het malen van plantenweefsels
StofzuigerFisher ScientificFB961MVoor het malen van plantenweefsels
Pipet 1000 mLGilson F144059M
Pipettip 1000 mLFisher scientific02-707-404
PlantweefselsVerschillende bronnenN/AKan alles wild of gekweekt zijn
Polypropyleen conische buisjes, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Polystyreen koelerULINES-18312Het type koelboxen waarin reagentia voor moleculaire biologie worden verzonden, zou geschikt zijn
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4,6 mmRestek9534315HPLC-kolom
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Guard kolom
Schommelende shakerThemo Scientific11-676-680
Schroefdraad-buisjesconveniencekit (9 mm)Fisher scientific13-622-190LCMS-autosamplerbuisjes
Spuit, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Spuitfilter 0,45 µm Avantor/VWR76479-008
Water, voor gebruik in vloeistofchromatografie en massaspectrometrieJT Baker9831-03Voor het maken van extractie-oplosmiddel
Wateroplossing, bevat 0,1% v/v mierenzuur, voor UHPLC, geschikt voor massaspectrometrieSigma-Aldrich900687-1LHPLC-oplosmiddel

Referenties

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
  2. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
  3. Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production. Molecules. 24 (4), 796(2019).
  4. Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics. Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33(2022).
  5. Web Annex A. World Health Organization Model List of Essential Medicines - 23rd List, 2023. The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , World Health Organization. Geneva. 24-28 (2023).
  6. Kerchner, A., Farkas, A. Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura. Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).
  7. Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. Datura delirium. Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).
  8. Alexander, J., et al. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed. EFSA J. 691, 1-55 (2008).
  9. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances. Foods. 11 (3), 407(2022).
  10. Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall'Asta, C., Bruni, R. A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts. Food Control. 105, 285-291 (2019).
  11. Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles. Prasain, J. , InTech. London. (2012).
  12. Xing, J., Xie, C., Lou, H. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis. J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).
  13. Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae. J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).
  14. Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families. Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872(2017).
  15. Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS. J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).
  16. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS. Toxins. 14 (10), 650(2022).
  17. Cinelli, M. A., Jones, A. D. Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery. Molecules. 26, 2629(2021).
  18. Gonçalves Dantas, C., et al. Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629(2023).
  19. Santos, C. L. G., et al. Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683(2020).
  20. Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication. Molecules. 28, 157(2023).
  21. Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).
  22. Agnes, S. A., et al. Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites. Sci Data. 9 (1), 270(2022).
  23. Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum. Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).
  24. Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry. LWT- Sci Technol. 154, 112329(2022).
  25. Parks, H. M., et al. Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna. New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).
  26. MassBank of North America. , Available from: https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu (2024).
  27. Maier, I., et al. Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin - zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium. Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).
  28. Jennett-Siems, K., et al. Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids. Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).
  29. Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R. Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).
  30. Guan, P., et al. Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS. Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).
  31. Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots. Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).
  32. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
  33. Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii. Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).
  34. Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus. Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).
  35. Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. , Academic Press. New York, NY. (1993).

Herprints en machtigingen

Tags

LC MS MSprecursor ionscanneutrale verliesscanproduct ionscanDatura stramoniumDatura metel
Toepassingen van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie in onderzoek naar natuurlijke producten: tropaanalkaloïden als casestudy
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.