Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een rattenmodel van pouchitis na proctocolectomie en ileale pouch-anale anastomose met behulp van dextransulfaatnatrium

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66623

⸱

31 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, Tianjin Medical University General Hospital, 2Tianjin General Surgery Institute, 3Department of General Surgery, Zibo Municipal Hospital, 4Department of General Surgery, Binzhou Medical University Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de methode voor het opstellen van een rattenmodel van pouchitis. Het ileumpouch-model is gemaakt door ileumpouch-anale anastomose (IPAA) chirurgie uit te voeren met behulp van microchirurgische technieken. Na de operatie werd de rat gedurende 4 dagen behandeld met 4% dextraansulfaatnatrium (DSS).

Samenvatting

Colitis ulcerosa (UC) is een chronische immuungemedieerde ziekte die de hele dikke darm en het rectum aantast met een recidiverend en remitterend beloop, waardoor levenslange morbiditeit ontstaat. Wanneer medische behandeling niet effectief is, vooral in gevallen van massale gastro-intestinale bloedingen, perforatie, toxisch megacolon of carcinogenese, wordt chirurgie de laatste verdedigingslinie om CU te genezen. Totale colorectale resectie en ileale pouch-anale anastomose (IPAA) bieden de beste kans op langdurige behandeling. Pouchitis is de meest voorkomende en lastige postoperatieve complicatie. In dit onderzoek wordt microchirurgie gebruikt om via IPAA-chirurgie een ileumzakmodel te maken bij experimentele ratten. Vervolgens wordt een duurzaam rattenmodel van pouchitis vastgesteld door ontsteking van de ileumzak met dextraansulfaatnatrium (DSS) te induceren. De succesvolle vaststelling van pouchitis bij ratten wordt gevalideerd door analyse van de postoperatieve algemene status, het gewicht, de voedsel- en waterinname, fecale gegevens, evenals de pathologie van het zakweefsel, immunohistochemie en analyse van ontstekingsfactoren. Dit experimentele diermodel van pouchitis biedt een basis voor het bestuderen van de pathogenese en behandeling van de aandoening.

Inleiding

Pouchitis is een niet-specifieke ontsteking die de ileumzak aantast en is een veel voorkomende complicatie na totale proctocolectomie en ileumzak-anale anastomose (IPAA) bij personen met colitis ulcerosa (UC)1,2,3. Deze aandoening komt relatief vaak voor bij maximaal 50% en kan verschillende klinische manifestaties veroorzaken, waaronder diarree, buikpijn, fecaal bloedverlies en koorts. De exacte oorzaak van pouchitis blijft ongrijpbaar, hoewel sommige onderzoekers geloven dat een verschuiving in de pouch-flora immuunactivering en daaropvolgende ontsteking kan veroorzaken 4,5,6,7.

Vanwege de uitdagingen die gepaard gaan met het uitvoeren van klinische proeven met pouchitis, kunnen diermodellen dienen als waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van medicijnen en mechanismen voor pouchitis. Er zijn groeiende zorgen over het maken van ileumzakjes voor ratten, met meldingen die wijzen op mogelijke ontsteking8. Onderzoek op dit gebied blijft echter schaars vanwege de ingewikkelde aard van het productieproces, waarvoor geen duidelijke richtlijnen gelden 9,10. In 1998 was Lichtman de eerste die een ileumzakmodel ontwikkelde bij Lewis-ratten en Sprague-Dawley (SD) ratten door totale colectomie11 uit te voeren. Ze observeerden macrofaaginfiltratie, slijmvlieszweren en een toename van de anaërobe bacteriële flora in de darmen van deze ratten, wat een solide basis vormde voor verder onderzoek naar ontsteking van de ileumzak. Dit experimentele model van pouchitis bij ratten bootst de fysieke tekenen en onderliggende mechanismen die worden waargenomen bij menselijke pouchitis nauw na.

Veel toegepaste preklinische modellen voor colitis ulcerosa zijn de DSS- en TNBS-modellen. De inducerende chemische stof 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) simuleert typisch de ziekte van Crohn12. Het DSS-model, gerespecteerd vanwege zijn werkzaamheid, veiligheidsprofiel en betaalbaarheid, wordt vaak gebruikt als een betrouwbaar hulpmiddel voor UC-inductie vanwege de waargenomen duidelijke symptomen. Gezien de kolonisatie van het pouchweefsel, hebben we met succes een pouchitis-model geïnduceerd met behulp van DSS13,14.

In de huidige studie werd microchirurgie gebruikt om met succes een ileumzakmodel te creëren bij experimentele ratten via IPAA-chirurgie. Vervolgens werd een model voor aanhoudende buidelontsteking bij ratten opgesteld door ontsteking van de ileumzak met DSS te induceren. Nauwkeurigheid tijdens de operatie is essentieel voor een succesvolle modelvorming, en ook postoperatieve zorg is cruciaal. Dit model kan worden gebruikt om de pathogenese van pouchitis te onderzoeken, potentiële therapeutische middelen te evalueren en ons begrip van deze complexe aandoening te vergroten. De studie stroomlijnt het productieproces van de ileumzak, verkort de operatieduur en verhoogt de efficiëntie, waardoor een robuuste basis wordt gelegd voor fundamenteel onderzoek naar postoperatieve buidelaandoeningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van de ethische commissies van het Tianjin Medical University General Hospital. Voor dit onderzoek werden mannelijke Sprague-Dawley-ratten tussen 9 en 12 weken oud, met een gewicht van ongeveer 320-360 g, gebruikt. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Selectie en onderhoud van dieren

  1. Selecteer een gezond dier (lichaamsgewicht van ~220-240 g).
  2. Zorg ervoor dat ze voldoen aan de criteria van het specifieke pathogeenvrije (SPF)15-niveau en minimaal 2 weken adaptief worden gekweekt in een omgeving met voldoende ventilatie (8 tot 12 luchtverversingen per uur), een comfortabele temperatuur (20-25 °C), geschikte vochtigheid (40%-70%), minimaal geluid (minder dan 70 decibel) en een natuurlijke lichtcyclus (12 uur licht en 12 uur duisternis).
  3. Huisvest ze gedurende deze periode in standaard schone kooien met een dichtheid van drie tot vijf per kooi en verschoon de bodembedekking twee keer per week. Zorg voor ad libitum toegang tot voedsel en water, evenals standaard onderhoudsvoer voor laboratoriumratten.

2. Preoperatieve voorbereiding

  1. Selecteer een gezonde rat met een lichaamsgewicht van ongeveer 320 g tot 360 g. Vast de rat 8-12 uur voor de operatie en zorg voor toegang tot een oplossing van fysiologische zoutoplossing en 5% glucose in een verhouding van 1:1 voor vrijwillige consumptie.
  2. Bereid de geautoclaveerde microchirurgische instrumenten voor (preoperatief weken in alcohol gedurende 1 uur), een microscoop, een rattenontleedtafel, 8-0 niet-resorbeerbare hoogmoleculaire hechtdraad, 4-0 niet-resorbeerbare hechtdraad, steriel gaas, steriele wattenstaafjes, enz.

3. Vaststelling van het model van de ileumzak voor ratten

  1. Injecteer intraperitoneaal een 1% pentobarbital-natriumoplossing in een dosis van 6 ml/kg en incisie-infiltratie van lokale anesthesie met 0,5% ropivacaïne om de rat te verdoven. Houd de rat tijdens de anesthesie op een comfortabele temperatuur met een elektrische lamp.
  2. Voer een totale colorectale resectie uit volgens de onderstaande stappen:
    1. Zet de rat in dorsale ligging vast op een anatomische bank volgens een bevredigend anesthesieprotocol. Bevestig de diepte van de anesthesie door in de tenen te knijpen. Gebruik een scheertondeuse om haarresten te verwijderen en breng tweemaal jodoforoplossing aan voor sterilisatie in het operatieveld.
    2. Maak een incisie in de middellijn, ongeveer 6 cm lang, om door de huid, de witte lijn fascia en het buikvlies te ontleden en toegang te krijgen tot de buikholte. Gebruik een retractor om het peritoneale oppervlak bloot te leggen en bedek het met bacteriostatisch steriel gaas met zoutoplossing.
    3. Isoleer de vasculaire stroom van het terminale jejunum, bevestig de oorsprong ervan met behulp van een 8-0 hechtdraad en snijd deze vervolgens door. Zet de blindedarmstomp, die zich op 1-2 cm van de ileocecale klep bevindt, in rust en snijd deze vervolgens door.
    4. Begin met resectie van de rechterhersenhelft, waarbij de rechterhersenhelft en de middelste koliekader conservatief worden afgebonden.
    5. Segratie verder de inferieure mesenteriale slagader en isoleer de inferieure rectale slagader. Ga door met isolatie langs het rectum tot een interval dat gelijk is aan twee centimeter vanaf de anale rand. Snijd het distale rectum schuin terug in een hoek van ongeveer 45 graden om postoperatieve stenose te voorkomen.
  3. Voer de constructie van de J-zak uit.
    1. Gebruik een microtoomscalpel om het dwarse gedeelte van het terminale ileum te scheiden van de mesenteriumdarm, die ongeveer 6-7 cm moet meten.
    2. Vouw het terminale ileum in een J-vormige vorm om een zakje voor het ileum te maken. Voer anastomose van de achterwand uit via een in elkaar grijpende steek. Vergroot de voorwand met behulp van een gewijzigde Connell-steek en behoud een geschikte darm die past bij de dwarsdoorsnede van de distale rectale stomp.
    3. Versterk de J-vormige buidel met 8-0 stikken indien nodig. De lengte van de J-pouch moet binnen het bereik van 2,5 cm tot 3,5 cm vallen.
  4. Voer ileale pouch-anale anastomose uit, IPAA.
    1. Bevestig de afwezigheid van torsie in het mesenterium en hecht de zijwanden van de mierenwand van de opening van de buidel en de zijwand van de rectale stomp met tussenpozen met een 8-0 Hechtdraad voor grip.
    2. Breng ten slotte een volledige laag doorlopende slothechting aan op zowel de voorste als de achterste wand.
    3. Controleer de afwezigheid van actieve bloedingen en reinig de buikholte fysiologisch met normale zoutoplossing. Sluit achtereenvolgens de fascia van de buikspier en de huid met 4-0 hechtingen.
  5. Voer postoperatief beheer uit.
    1. Dien ketoprofen toe als postoperatieve analgesie (40 mg/kg, subcutaan) aan alle ratten na sluiting van de buik. Zorg ervoor dat de rat wordt opgewarmd met een elektrische lamp totdat herstel plaatsvindt.
    2. Beperk de voedselconsumptie van het dier gedurende een periode van minimaal 72 uur postoperatief om het risico op darmobstructie te verminderen. Zorg voor toegang tot een dieet van 5% glucose ad libitum om snel energie en lichaamsvloeistoffen aan te vullen, en pas de voedingsfrequentie aan op basis van ontlastingspatronen.
    3. Begin een week na de operatie met beperkte voeding en verhoog geleidelijk de geconsumeerde hoeveelheid. Geef de ratten vervolgens regelmatig knaagdiervoer om vrij te consumeren, terwijl u dagelijks hun voedingsinname, waterinname en lichaamsgewicht bijhoudt.

4. Vaststelling van een model voor ileale pouchitis bij ratten met DSS

  1. Voer de experimentele groepering uit.
    1. Wijs willekeurig 12 ratten toe die een totale colorectale resectie en IPAA-operatie hebben ondergaan in de IPAA-groep (Groep A, n = 6) en de pouchitisgroep (Groep B, n = 6).
    2. Bereid een 4% DSS-oplossing door 4 g DSS toe te voegen aan 100 ml zuiver water, dagelijks vers bereid.
    3. Dien de IPAA-groep en de pouchitis-groep toe met zuiver water of 4% DSS op respectievelijk postoperatieve dag 31 tot dag 35. Laat ratten gedurende de vier opeenvolgende dagen van toediening vrijelijk rattenvoer drinken en eten.
  2. Voer de bemonstering van het zakje uit.
    1. Verdoof de ratten op de ochtend van dag 35 na de operatie met een intraperitoneale injectie van 1% pentobarbital-natriumoplossing, waarbij een dosis van 6 ml/kg wordt toegediend (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
    2. Snijd het opvangzakje loodrecht af van de stoma van het opvangzakje tot de kruising van de invoer- en uitvoerzakjes in elke groep. Verkrijg het monster van het zakje.
    3. Open het zakje langs de hechtlijn van de voorwand en was het darmkanaal met zoutoplossing.
    4. Plaats een fragment van het zakje in een microcentrifugebuisje en zet het onmiddellijk in de koelkast bij -80 °C. Gebruik dit onderdeel voor ELISA-detectie van ontstekingsindicatoren. Fixeer het resterende deel van het zakje met 10% formaldehyde voor histopathologische scores en immunohistochemische kleuring.
    5. Euthanaseer ten slotte de rat door middel van een luchtembolie onder diepe narcose (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).

5. Histologische analyse

  1. Nadat u zakpapier van de rat hebt verkregen, dompelt u het gedurende 24 uur onder in 4% paraformaldehyde. Ga vervolgens verder met uitdrogings- en inbeddingsprotocollen. Sectie van het bewerkte weefsel voor histologisch onderzoek16.
  2. Pas hematoxyline- en eosinekleuring toe om histopathologische verschillen tussen groepen te identificeren. Onderzoek de monsters microscopisch en maak foto's voor documentatie.

6. Immunohistochemische test

  1. Ontwax en dehydrateer de weefselsecties zorgvuldig. Voer vervolgens het ophalen van antigeen uit door de secties af te koelen in een natriumcitraatoplossing en ze gedurende 20 minuten te blokkeren met blokkerend serum.
  2. Stel de plakjes vervolgens bloot aan het primaire anti-occludine-antilichaam en incubeer ze een nacht bij 4 °C. Behandel ze daarna gedurende 30 minuten met secundaire antilichamen voordat hematoxyline tegenkleuring16.
  3. Zodra de plakjes zijn opgedroogd, observeert en fotografeert u ze onder een lichtmicroscoop.

7. ELISA-test

  1. 7.1 Hak de weefselfragmenten fijn en homogeniseer ze in lysisbuffer met behulp van sonicatie om een grondige homogenisatie te garanderen. Gebruik het resulterende supernatans voor detectie.
  2. Wijs putjes toe voor blanco's, monsters en replicaten per groep. Bepaal de eiwitconcentratie door de extinctie af te lezen bij 450 nm (OD-waarde) en een lineaire regressieanalyse uit te voeren16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Algemene conditiebeoordeling van ileumzakmodel ratten na vestiging
Nadat de operator de IPAA-chirurgische leercurve had doorstaan, verdroegen de ratten de operatie goed, met een chirurgische duur van 192,94 min ± 27,15 min, en traden er minder postoperatieve complicaties op. Tijdens de vroege postoperatieve periode ervoeren ratten een afname van de inname via de voeding, maar hun preoperatieve eetlust werd binnen 10 dagen tot 14 dagen na de operatie hersteld. De vroeg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Colitis ulcerosa (UC) is een chronische darmontsteking die wordt gekenmerkt door terugkerende epigastrische pijn, diarree en bloederige ontlasting met slijm. Het beïnvloedt voornamelijk het rectum en kan in verschillende mate betrekking hebben op de voortschrijdende dikke darm. Chirurgie speelt een cruciale rol bij het beheersen van UC 17,18,19. Sinds Parks et al.20 in 19...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anhydrous ethanolTianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., LtdChinaHematoxin-eosin Staining
Dextran Sulfate Sodium  Yeasen 60316ES76Wordt gebruikt om ontsteking van de buidel te induceren
Formaldehyde-oplossingTianjin Zhiyuan Reagent CompanyChinaHematoxin-eosin Staining
GaasJiangxi Zhonggan Medical Equipment CompanyChinaWordt gebruikt voor microchirurgie bij dieren
HematoxylineBeijing Zhongshan Jinqiao CompanyChinaHematoxin-eosin Staining
Interferon γ  Detectiereagent kitCloud-cloneSEA049RaDetectie van ontstekingsfactoren
Interleukine-10 detectiekitCloud-cloneSEA056RaDetectie van ontstekingsfactoren
Interleukine-17 detectiekitCloud-cloneSEA063RaDetectie van ontstekingsfactoren
Interleukine-6 detectiekitCloud-cloneSEA079RaDetectie van ontstekingsfactoren
JodofoorTangpai Medical Equipment Co., LtdChinaWordt gebruikt voor microchirurgie bij dieren
Microscopische manipulatie-instrumentenAesculapDuitslandWordt gebruikt voor microchirurgie bij dieren
Occludinabcamab216327Immunohistochemische testen
NaainaaldYangzhou Fuda Medical Equipment Co., LtdChinaWordt gebruikt voor microchirurgie bij dieren
tumornecrosefactor α Detectiereagent kitCloud-cloneSEA133RaDetectie van ontstekingsfactoren
Tweepersoons binoculaire chirurgisch microscoopOPTONDuitslandWordt gebruikt voor microchirurgie bij dieren
XYleenTianjin Yingda Rare and Precious Reagent FactoryChinaHematoxin-eosin Staining

Referenties

  1. Yang, M. L., Brar, M. S., Kennedy, E. D., De Buck Van Overstraeten, A. Laparoscopic versus transanal IPAA for ulcerative colitis: A patient-centered treatment trade-off study. Dis Colon Rectum. 67 (1), 107-113 (2024).
  2. Aktas, M. K., et al. Current status and surgical technique for restorative proctocolectomy with ileal pouch-anal anastomosis. Balkan Med J. 40 (4), 236-243 (2023).
  3. Zhao, L., et al. Microbiota DNA translocation into mesentery lymph nodes is associated with early development of pouchitis after ipaa for ulcerative colitis. Diseases of the Colon & Rectum. 66 (11), e1107-e1118 (2022).
  4. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: A systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  5. Pardi, D. S., D'haens, G., Shen, B., Campbell, S., Gionchetti, P. Clinical guidelines for the management of pouchitis. Inflamm Bowel Dis. 15 (9), 1424-1431 (2009).
  6. Shen, B., et al. Treatment of pouchitis, Crohn's disease, cuffitis, and other inflammatory disorders of the pouch: Consensus guidelines from the international ileal pouch consortium. Lancet Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 69-95 (2022).
  7. Dalal, R. L., Shen, B., Schwartz, D. A. Management of pouchitis and other common complications of the pouch. Inflamm Bowel Dis. 24 (5), 989-996 (2018).
  8. Li, K. Y., et al. A new rat model of pouchitis after proctocolectomy and ileal pouch-anal anastomosis using 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid. J Gastrointest Surg. 25 (6), 1524-1533 (2021).
  9. Drzymala-Czyz, S., et al. Discrepancy between clinical and histological effects of dha supplementation in a rat model of pouchitis. Folia Histochem Cytobiol. 50 (1), 125-129 (2012).
  10. Santiago, P., Barnes, E. L., Raffals, L. E. Classification and management of disorders of the J pouch. Am J Gastroenterol. 118 (11), 1931-1939 (2023).
  11. Lichtman, S. N., Wang, J., Hummel, B., Lacey, S., Sartor, R. B. A rat model of ileal pouch-rectal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 4 (3), 187-195 (1998).
  12. Guarner, F. Inulin and oligofructose: Impact on intestinal diseases and disorders. Br J Nutr. 93, Suppl 1 S61-S65 (2005).
  13. Kim, C. J., et al. L-tryptophan exhibits therapeutic function in a porcine model of dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis. J Nutr Biochem. 21 (6), 468-475 (2010).
  14. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  15. Letson, H. L., Morris, J., Biros, E., Dobson, G. P. Conventional and specific-pathogen free rats respond differently to anesthesia and surgical trauma. Sci Rep. 9 (1), 9399(2019).
  16. Gu, Y., et al. Saccharomyces boulardii, a yeast probiotic, inhibits gut motility through upregulating intestinal serotonin transporter and modulating gut microbiota. Pharmacol Res. 181, 106291(2022).
  17. Akiyama, S., et al. Endoscopic phenotype of the j pouch in patients with inflammatory bowel disease: A new classification for pouch outcomes. Clin Gastroenterol Hepatol. 20 (2), 293-302 (2022).
  18. Hata, K., et al. Pouchitis after ileal pouch-anal anastomosis in ulcerative colitis: Diagnosis, management, risk factors, and incidence. Dig Endosc. 29 (1), 26-34 (2017).
  19. Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
  20. Parks, A. Proctocolectomy without ileostomy for ulcerative colitis. BMJ. 2, 85-88 (1978).
  21. Shebani, K. O., et al. Pouchitis in a rat model of ileal J pouch-anal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 8 (1), 23-34 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Ratmodel voor pouchitisColitis ulcerosaExperimenteel diermodelPathogenese van pouchitisMicrochirurgische techniekAnalyse van inflammatoire factorenImmunohistochemiePostoperatieve zorg
Een rattenmodel van pouchitis na proctocolectomie en ileale pouch-anale anastomose met behulp van dextransulfaatnatrium
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.