Dit protocol beschrijft de methode voor het opstellen van een rattenmodel van pouchitis. Het ileumpouch-model is gemaakt door ileumpouch-anale anastomose (IPAA) chirurgie uit te voeren met behulp van microchirurgische technieken. Na de operatie werd de rat gedurende 4 dagen behandeld met 4% dextraansulfaatnatrium (DSS).
Methodenartikel
Een rattenmodel van pouchitis na proctocolectomie en ileale pouch-anale anastomose met behulp van dextransulfaatnatrium
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Colitis ulcerosa (UC) is een chronische immuungemedieerde ziekte die de hele dikke darm en het rectum aantast met een recidiverend en remitterend beloop, waardoor levenslange morbiditeit ontstaat. Wanneer medische behandeling niet effectief is, vooral in gevallen van massale gastro-intestinale bloedingen, perforatie, toxisch megacolon of carcinogenese, wordt chirurgie de laatste verdedigingslinie om CU te genezen. Totale colorectale resectie en ileale pouch-anale anastomose (IPAA) bieden de beste kans op langdurige behandeling. Pouchitis is de meest voorkomende en lastige postoperatieve complicatie. In dit onderzoek wordt microchirurgie gebruikt om via IPAA-chirurgie een ileumzakmodel te maken bij experimentele ratten. Vervolgens wordt een duurzaam rattenmodel van pouchitis vastgesteld door ontsteking van de ileumzak met dextraansulfaatnatrium (DSS) te induceren. De succesvolle vaststelling van pouchitis bij ratten wordt gevalideerd door analyse van de postoperatieve algemene status, het gewicht, de voedsel- en waterinname, fecale gegevens, evenals de pathologie van het zakweefsel, immunohistochemie en analyse van ontstekingsfactoren. Dit experimentele diermodel van pouchitis biedt een basis voor het bestuderen van de pathogenese en behandeling van de aandoening.
Inleiding
Pouchitis is een niet-specifieke ontsteking die de ileumzak aantast en is een veel voorkomende complicatie na totale proctocolectomie en ileumzak-anale anastomose (IPAA) bij personen met colitis ulcerosa (UC)1,2,3. Deze aandoening komt relatief vaak voor bij maximaal 50% en kan verschillende klinische manifestaties veroorzaken, waaronder diarree, buikpijn, fecaal bloedverlies en koorts. De exacte oorzaak van pouchitis blijft ongrijpbaar, hoewel sommige onderzoekers geloven dat een verschuiving in de pouch-flora immuunactivering en daaropvolgende ontsteking kan veroorzaken 4,5,6,7.
Vanwege de uitdagingen die gepaard gaan met het uitvoeren van klinische proeven met pouchitis, kunnen diermodellen dienen als waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van medicijnen en mechanismen voor pouchitis. Er zijn groeiende zorgen over het maken van ileumzakjes voor ratten, met meldingen die wijzen op mogelijke ontsteking8. Onderzoek op dit gebied blijft echter schaars vanwege de ingewikkelde aard van het productieproces, waarvoor geen duidelijke richtlijnen gelden 9,10. In 1998 was Lichtman de eerste die een ileumzakmodel ontwikkelde bij Lewis-ratten en Sprague-Dawley (SD) ratten door totale colectomie11 uit te voeren. Ze observeerden macrofaaginfiltratie, slijmvlieszweren en een toename van de anaërobe bacteriële flora in de darmen van deze ratten, wat een solide basis vormde voor verder onderzoek naar ontsteking van de ileumzak. Dit experimentele model van pouchitis bij ratten bootst de fysieke tekenen en onderliggende mechanismen die worden waargenomen bij menselijke pouchitis nauw na.
Veel toegepaste preklinische modellen voor colitis ulcerosa zijn de DSS- en TNBS-modellen. De inducerende chemische stof 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) simuleert typisch de ziekte van Crohn12. Het DSS-model, gerespecteerd vanwege zijn werkzaamheid, veiligheidsprofiel en betaalbaarheid, wordt vaak gebruikt als een betrouwbaar hulpmiddel voor UC-inductie vanwege de waargenomen duidelijke symptomen. Gezien de kolonisatie van het pouchweefsel, hebben we met succes een pouchitis-model geïnduceerd met behulp van DSS13,14.
In de huidige studie werd microchirurgie gebruikt om met succes een ileumzakmodel te creëren bij experimentele ratten via IPAA-chirurgie. Vervolgens werd een model voor aanhoudende buidelontsteking bij ratten opgesteld door ontsteking van de ileumzak met DSS te induceren. Nauwkeurigheid tijdens de operatie is essentieel voor een succesvolle modelvorming, en ook postoperatieve zorg is cruciaal. Dit model kan worden gebruikt om de pathogenese van pouchitis te onderzoeken, potentiële therapeutische middelen te evalueren en ons begrip van deze complexe aandoening te vergroten. De studie stroomlijnt het productieproces van de ileumzak, verkort de operatieduur en verhoogt de efficiëntie, waardoor een robuuste basis wordt gelegd voor fundamenteel onderzoek naar postoperatieve buidelaandoeningen.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van de ethische commissies van het Tianjin Medical University General Hospital. Voor dit onderzoek werden mannelijke Sprague-Dawley-ratten tussen 9 en 12 weken oud, met een gewicht van ongeveer 320-360 g, gebruikt. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.
1. Selectie en onderhoud van dieren
- Selecteer een gezond dier (lichaamsgewicht van ~220-240 g).
- Zorg ervoor dat ze voldoen aan de criteria van het specifieke pathogeenvrije (SPF)15-niveau en minimaal 2 weken adaptief worden gekweekt in een omgeving met voldoende ventilatie (8 tot 12 luchtverversingen per uur), een comfortabele temperatuur (20-25 °C), geschikte vochtigheid (40%-70%), minimaal geluid (minder dan 70 decibel) en een natuurlijke lichtcyclus (12 uur licht en 12 uur duisternis).
- Huisvest ze gedurende deze periode in standaard schone kooien met een dichtheid van drie tot vijf per kooi en verschoon de bodembedekking twee keer per week. Zorg voor ad libitum toegang tot voedsel en water, evenals standaard onderhoudsvoer voor laboratoriumratten.
2. Preoperatieve voorbereiding
- Selecteer een gezonde rat met een lichaamsgewicht van ongeveer 320 g tot 360 g. Vast de rat 8-12 uur voor de operatie en zorg voor toegang tot een oplossing van fysiologische zoutoplossing en 5% glucose in een verhouding van 1:1 voor vrijwillige consumptie.
- Bereid de geautoclaveerde microchirurgische instrumenten voor (preoperatief weken in alcohol gedurende 1 uur), een microscoop, een rattenontleedtafel, 8-0 niet-resorbeerbare hoogmoleculaire hechtdraad, 4-0 niet-resorbeerbare hechtdraad, steriel gaas, steriele wattenstaafjes, enz.
3. Vaststelling van het model van de ileumzak voor ratten
- Injecteer intraperitoneaal een 1% pentobarbital-natriumoplossing in een dosis van 6 ml/kg en incisie-infiltratie van lokale anesthesie met 0,5% ropivacaïne om de rat te verdoven. Houd de rat tijdens de anesthesie op een comfortabele temperatuur met een elektrische lamp.
- Voer een totale colorectale resectie uit volgens de onderstaande stappen:
- Zet de rat in dorsale ligging vast op een anatomische bank volgens een bevredigend anesthesieprotocol. Bevestig de diepte van de anesthesie door in de tenen te knijpen. Gebruik een scheertondeuse om haarresten te verwijderen en breng tweemaal jodoforoplossing aan voor sterilisatie in het operatieveld.
- Maak een incisie in de middellijn, ongeveer 6 cm lang, om door de huid, de witte lijn fascia en het buikvlies te ontleden en toegang te krijgen tot de buikholte. Gebruik een retractor om het peritoneale oppervlak bloot te leggen en bedek het met bacteriostatisch steriel gaas met zoutoplossing.
- Isoleer de vasculaire stroom van het terminale jejunum, bevestig de oorsprong ervan met behulp van een 8-0 hechtdraad en snijd deze vervolgens door. Zet de blindedarmstomp, die zich op 1-2 cm van de ileocecale klep bevindt, in rust en snijd deze vervolgens door.
- Begin met resectie van de rechterhersenhelft, waarbij de rechterhersenhelft en de middelste koliekader conservatief worden afgebonden.
- Segratie verder de inferieure mesenteriale slagader en isoleer de inferieure rectale slagader. Ga door met isolatie langs het rectum tot een interval dat gelijk is aan twee centimeter vanaf de anale rand. Snijd het distale rectum schuin terug in een hoek van ongeveer 45 graden om postoperatieve stenose te voorkomen.
- Voer de constructie van de J-zak uit.
- Gebruik een microtoomscalpel om het dwarse gedeelte van het terminale ileum te scheiden van de mesenteriumdarm, die ongeveer 6-7 cm moet meten.
- Vouw het terminale ileum in een J-vormige vorm om een zakje voor het ileum te maken. Voer anastomose van de achterwand uit via een in elkaar grijpende steek. Vergroot de voorwand met behulp van een gewijzigde Connell-steek en behoud een geschikte darm die past bij de dwarsdoorsnede van de distale rectale stomp.
- Versterk de J-vormige buidel met 8-0 stikken indien nodig. De lengte van de J-pouch moet binnen het bereik van 2,5 cm tot 3,5 cm vallen.
- Voer ileale pouch-anale anastomose uit, IPAA.
- Bevestig de afwezigheid van torsie in het mesenterium en hecht de zijwanden van de mierenwand van de opening van de buidel en de zijwand van de rectale stomp met tussenpozen met een 8-0 Hechtdraad voor grip.
- Breng ten slotte een volledige laag doorlopende slothechting aan op zowel de voorste als de achterste wand.
- Controleer de afwezigheid van actieve bloedingen en reinig de buikholte fysiologisch met normale zoutoplossing. Sluit achtereenvolgens de fascia van de buikspier en de huid met 4-0 hechtingen.
- Voer postoperatief beheer uit.
- Dien ketoprofen toe als postoperatieve analgesie (40 mg/kg, subcutaan) aan alle ratten na sluiting van de buik. Zorg ervoor dat de rat wordt opgewarmd met een elektrische lamp totdat herstel plaatsvindt.
- Beperk de voedselconsumptie van het dier gedurende een periode van minimaal 72 uur postoperatief om het risico op darmobstructie te verminderen. Zorg voor toegang tot een dieet van 5% glucose ad libitum om snel energie en lichaamsvloeistoffen aan te vullen, en pas de voedingsfrequentie aan op basis van ontlastingspatronen.
- Begin een week na de operatie met beperkte voeding en verhoog geleidelijk de geconsumeerde hoeveelheid. Geef de ratten vervolgens regelmatig knaagdiervoer om vrij te consumeren, terwijl u dagelijks hun voedingsinname, waterinname en lichaamsgewicht bijhoudt.
4. Vaststelling van een model voor ileale pouchitis bij ratten met DSS
- Voer de experimentele groepering uit.
- Wijs willekeurig 12 ratten toe die een totale colorectale resectie en IPAA-operatie hebben ondergaan in de IPAA-groep (Groep A, n = 6) en de pouchitisgroep (Groep B, n = 6).
- Bereid een 4% DSS-oplossing door 4 g DSS toe te voegen aan 100 ml zuiver water, dagelijks vers bereid.
- Dien de IPAA-groep en de pouchitis-groep toe met zuiver water of 4% DSS op respectievelijk postoperatieve dag 31 tot dag 35. Laat ratten gedurende de vier opeenvolgende dagen van toediening vrijelijk rattenvoer drinken en eten.
- Voer de bemonstering van het zakje uit.
- Verdoof de ratten op de ochtend van dag 35 na de operatie met een intraperitoneale injectie van 1% pentobarbital-natriumoplossing, waarbij een dosis van 6 ml/kg wordt toegediend (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
- Snijd het opvangzakje loodrecht af van de stoma van het opvangzakje tot de kruising van de invoer- en uitvoerzakjes in elke groep. Verkrijg het monster van het zakje.
- Open het zakje langs de hechtlijn van de voorwand en was het darmkanaal met zoutoplossing.
- Plaats een fragment van het zakje in een microcentrifugebuisje en zet het onmiddellijk in de koelkast bij -80 °C. Gebruik dit onderdeel voor ELISA-detectie van ontstekingsindicatoren. Fixeer het resterende deel van het zakje met 10% formaldehyde voor histopathologische scores en immunohistochemische kleuring.
- Euthanaseer ten slotte de rat door middel van een luchtembolie onder diepe narcose (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
5. Histologische analyse
- Nadat u zakpapier van de rat hebt verkregen, dompelt u het gedurende 24 uur onder in 4% paraformaldehyde. Ga vervolgens verder met uitdrogings- en inbeddingsprotocollen. Sectie van het bewerkte weefsel voor histologisch onderzoek16.
- Pas hematoxyline- en eosinekleuring toe om histopathologische verschillen tussen groepen te identificeren. Onderzoek de monsters microscopisch en maak foto's voor documentatie.
6. Immunohistochemische test
- Ontwax en dehydrateer de weefselsecties zorgvuldig. Voer vervolgens het ophalen van antigeen uit door de secties af te koelen in een natriumcitraatoplossing en ze gedurende 20 minuten te blokkeren met blokkerend serum.
- Stel de plakjes vervolgens bloot aan het primaire anti-occludine-antilichaam en incubeer ze een nacht bij 4 °C. Behandel ze daarna gedurende 30 minuten met secundaire antilichamen voordat hematoxyline tegenkleuring16.
- Zodra de plakjes zijn opgedroogd, observeert en fotografeert u ze onder een lichtmicroscoop.
7. ELISA-test
- 7.1 Hak de weefselfragmenten fijn en homogeniseer ze in lysisbuffer met behulp van sonicatie om een grondige homogenisatie te garanderen. Gebruik het resulterende supernatans voor detectie.
- Wijs putjes toe voor blanco's, monsters en replicaten per groep. Bepaal de eiwitconcentratie door de extinctie af te lezen bij 450 nm (OD-waarde) en een lineaire regressieanalyse uit te voeren16.
Resultaten
Algemene conditiebeoordeling van ileumzakmodel ratten na vestiging
Nadat de operator de IPAA-chirurgische leercurve had doorstaan, verdroegen de ratten de operatie goed, met een chirurgische duur van 192,94 min ± 27,15 min, en traden er minder postoperatieve complicaties op. Tijdens de vroege postoperatieve periode ervoeren ratten een afname van de inname via de voeding, maar hun preoperatieve eetlust werd binnen 10 dagen tot 14 dagen na de operatie hersteld. De vroege postoperatieve activiteit nam enigszins af en er waren geen duidelijke afscheidingen uit de ogen en neus. Het gewichtsverlies voor en na de operatie was 21,17 g ± 1,59 g. Het aanvankelijke postoperatieve gewicht vertoonde een dalende trend, met een maximale afname van 69,58 g ± 33,19 g. De stabiele groei begon op de 8,25 dag ± 2,53 dagen na de operatie, en op de 31edag na de operatie overschreed het gewicht 9,35% ± 4,7% van het gewicht op de dag na de operatie. Ratten waren in staat om binnen 24 uur na de operatie te poepen, met dunne ontlasting maar geen bloederige ontlasting. De vorming van zachte ontlasting vond plaats op de 9etot 12edag na de operatie.
Compenserende verhoging van de ileumzak
Op de 35edag na de operatie werd de buikholte van de rat onder narcose geopend, waarbij ernstige verkleving tussen de ileumzak en de bekkenholte aan het licht kwam. Na zorgvuldige scheiding van de hechting tussen het opvangzakje en de omliggende weefsels werden compenserende vergroting van het ileumzakje, verdikking van de darmwand en milde dilatatie van de distale dunne darm waargenomen (figuur 1). De lengte van de ileumzak was 2,89 cm ± 0,28 cm op het moment van de operatie, terwijl deze op de 35edag na de operatie 3,86 cm ± 0,87 cm meet, wat een significant statistisch verschil van P = 0,000 aangeeft). Het slijmvliesgebied (cm2) van de ileumzak was ook significant vergroot in vergelijking met de chirurgische meting (6,46 ± 0,85 vs. 17,02 ± 4,61, P = 0,000). Er was geen significant verschil tussen de IPAA-groep en de ileale pouchitisgroep (P > 0,05).
Evaluatie van de algemene toestand en fecale score van ratten met ileale pouchitis
Op de 31edag na de operatie werd DSS toegediend aan de groep met ileale pouchitis. Aan het begin van de toediening hadden zowel de IPAA-groep als de ileale pouchitisgroep een gelijk lichaamsgewicht (352,00 g ± 30,03 g vs. 352,00 g ± 25,92 g, P = 1) en waren over het algemeen in goede conditie. De hoeveelheid voedsel en water die werd geconsumeerd in de ileale pouchitisgroep nam echter af, wat resulteerde in mentale vermoeidheid, dof haar, afscheiding in de ogen en neus, verminderde mobiliteit en er werden geen significante veranderingen waargenomen in de IPAA-groep. Op de 35edag na de operatie was het gewicht van de groep met ileale pouchitis significant lager dan dat van de IPAA-groep (322,83 g ± 29,24 g vs. 364,83 g ± 30,13 g, P = 0,028) (Figuur 2).
De ileale pouchitisgroep ervoer significante diarree op de eerste dag na toediening van DSS en op de tweede dag na toediening van DSS hadden ze slijm, pus en bloederige ontlasting (Figuur 3). Op de 35edag na de operatie waren de ontlastingsscores11 van de IPAA-groep en de ileale pouchitisgroep (respectievelijk 4,33 ± 0,82 vs. 2,17 ± 0,75, P = 0,001). De ratten van de IPAA-groep hadden een schone en vervuilingsvrije anus, terwijl de ileale pouchitis-ratten zwelling van de anus hadden, vergezeld van slijm, pus en bloederige ontlasting.
Histopathologische veranderingen van het ileumzakje
Macroscopische observatie van ileumzakmonsters
In de IPAA-groep werd de darmwand van de ileumzak dikker en werd er geen erosie, zweer of bloedingspunt waargenomen. In de groep van de ileale pouchitis worden de bloedvaten in het mesenterium van de opbergzak dikker en is het slijmvlies van de ileumzak uitgebreid of lokaal ontstoken, met zichtbare erosie, zweren en bloedingspunten, waarvan sommige gepaard gaan met aanzienlijke distale verwijding van de dunne darm (Figuur 4).
Microscopische observatie van ileumzakweefsel
In de IPAA-groep ratten werd de punt van sommige darmvlokken in het zakweefsel stomp, vergezeld van een kleine hoeveelheid neutrofieleninfiltratie, en af en toe werd een kleine hoeveelheid exsudatie waargenomen op het slijmvliesoppervlak.
Daarentegen was de opstelling van darmvlokken in het ileumzakweefsel van ratten in de ileale pouchitisgroep extreem ongeordend. Sommige darmvlokken ontbraken en uitgebreide erosie en meerdere fragmentarische zweren waren zichtbaar zonder de spierlaag te betrekken. Dit ging gepaard met een groot aantal infiltratie van neutrofielen en lymfocyten, overmatige exsudatie en zichtbare crypte-ontsteking. De pathologische score van het ileumzakweefsel in de ileale pouchitisgroep was significant hoger dan die in de IPAA-groep, met een significant statistisch verschil waargenomen (8,50 ± 1,76 vs. 1,33 ± 0,52, P = 0,000) (Figuur 5).
Expressieniveau van functioneel eiwit van de darmbarrière occludine
Occludine, een belangrijk functioneel eiwit van de darmbarrière, komt tot expressie op het celmembraan van het ileumzakweefsel in zowel de IPAA- als de ileumpouchitisgroep van ratten11. Het expressieniveau van occludine-eiwit in de ileale pouchitisgroep was echter significant lager dan dat in de IPAA-groep (0,25 ± 0,03 vs. 0,15 ± 0,02, P = 0,000) (Figuur 6).
Detectie van ontstekingsfactoren in ileumzak
De expressieniveaus van IL-6, IL-17, TNF-α en INF-γ in het ileumzakweefsel van ratten in de ileale pouchitisgroep waren significant hoger dan die in de IPAA-groep (zoals bepaald door de ELISA-test16). Omgekeerd liet IL-10 de tegenovergestelde resultaten zien, waarbij statistische verschillen werden waargenomen (P = 0,000) (Tabel 1).
Figuur 1: De toestand van de ileumzak. De pijl geeft de ileumzak aan (A) op het moment van de operatie en (B) de compenserende vergroting van de ileumzak op de 35edag na de operatie (tijdens het afnemen van het monster). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Trend van veranderingen in lichaamsgewicht bij ratten na IPAA-chirurgie. De foutbalk is gerelateerd aan de standaarddeviatie, n = 6 in elke groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Foto van uitwerpselen van ratten. (A) IPAA-groep. (B) Ileale pouchitis groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Macroscopische waarneming van ileumzakjes. (A) IPAA-groep. (B) Ileale pouchitis groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Pathologische veranderingen van het weefsel van de ileumzak van de rat. (A) IPAA-groep. (B) Ileale pouchitis groep. Schaalbalken: 60 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Immunohistochemische detectie van occludine-eiwitexpressie in ileumzakweefsel van ratten. (A) IPAA-groep. (B) Ileale pouchitis groep. Schaalbalken: 60 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Groep | n | IL-6 | IL-10 | IL-17 | TNF-α | INF-γ |
| IPAA-groep | 6 | 2,60 ± 0,36 | 5,81 ± 0,66 | 17.48 ± 4.81 | 86,94 ± 24,06 | 4,08 ± 0,56 |
| Pouchitis groep | 6 | 6,94 ± 1,18 | 2,77 ± 0,60 | 34.82 ± 2.41 | 213.00 ± 26.11 | 9,67 ± 1,70 |
| P | 0 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
Tabel 1: Expressieniveau van ontstekingsfactoren in ileumzakweefsel van ratten (pg/ml).
Discussie
Colitis ulcerosa (UC) is een chronische darmontsteking die wordt gekenmerkt door terugkerende epigastrische pijn, diarree en bloederige ontlasting met slijm. Het beïnvloedt voornamelijk het rectum en kan in verschillende mate betrekking hebben op de voortschrijdende dikke darm. Chirurgie speelt een cruciale rol bij het beheersen van UC 17,18,19. Sinds Parks et al.20 in 1978 totale colectomie introduceerden met een ileale pouch-anale anastomose (IPAA) procedure om veranderd weefsel te verwijderen en de darmcontinuïteit te herstellen, is deze operatie de internationale standaard geworden voor chirurgische behandeling van UC. Inflammatoire aandoeningen van het zakje zijn de meest voorkomende complicaties na een IPAA-operatie.
Vanwege de uitdagingen waarmee we worden geconfronteerd bij het uitvoeren van klinische proeven met pouchitis, zijn diermodellen gebruikt als aanvullende experimenten voor het bestuderen van geneesmiddelen en mechanismen die verband houden met pouchitis. In 1998 ontwikkelden Lichtman et al.11 een rattenmodel waarbij de dikke darm volledig werd verwijderd en het zakje opnieuw werd aangesloten op het rectum. Dit model vertoonde tekenen van ontsteking, zoals mononucleaire celinfiltratie, luminale exsudatie, slijmvlieszweren en serosale ontsteking binnen vier weken na de operatie. Het ontstekingsniveau was gecorreleerd met een verhoogd aantal bacteriën in het zakje en er kon een duidelijke genetische gevoeligheid van de gastheer worden waargenomen. In 2002 construeerden Shebani et al.21 met succes een IPAA-chirurgisch rattenmodel via SDD, dat effectief pouchitis induceerde. Dit model bevestigde de werkzaamheid van het gebruik van dieren om de pathogenese van pouchitis te bestuderen en bood een robuust experimenteel platform voor fundamenteel onderzoek naar pouchitis. Ze identificeerden ook vergelijkbare patronen van overvloedige bacteriegroei in reservoirs van zowel mensen als knaagdieren, wat het nut ervan valideerde bij het onderzoeken van bacteriële onevenwichtigheid in de darm en het identificeren van potentiële ziekteverwekkers die verband houden met pouchitis.
Met eerdere ervaring in het voeren van muizen en het modelleren van IPAA-chirurgie, is het mogelijk om de leercurve terug te brengen tot ongeveer tien onderwerpen. Een cruciale stap in dit proces is de constructie en anastomose van de J-pouch. Gezien het feit dat het darmkanaal van muizen relatief slank is, 8-0 Voor de hechtingen werd hechtdraad gebruikt. Doorlopende hechtingen en een Connel-steek werden afzonderlijk gebruikt voor de hechtingen van de achterwand en de voorwand van de buidel. Tijdens de anastomose van het zakje en het anale kanaal kan het creëren van een hellend oppervlak de stenose op de plaats van de anastomose effectief verminderen door de rectale stomp als voorbeeld te nemen. In eerste instantie wordt door twee hechtingen aan elke kant van de anastomoseplaats vast te zetten, en vervolgens door te gaan met continue vergrendelingshechtingen om de achterste en voorste wanden afzonderlijk te hechten, de integriteit van de anastomose te waarborgen en de operatietijd te verkorten.
Postoperatieve behandeling speelt ook een cruciale rol bij succesvolle modellering. Een vastenperiode van 72 uur postoperatief kan het optreden van darmobstructie effectief verminderen. Aan de andere kant kan een vroeg matig vloeibaar dieet zorgen voor de voedings- en vochtbehoeften van de muizen. Nadat ze de leercurve onder de knie hebben, kunnen chirurgen een efficiënter en consistenter slagingspercentage behalen bij het opstellen van modellen.
Deze studie heeft voortgebouwd op deze basis en, door middel van voorlopige exploratie en verfijning, met succes een ileumzakmodel voor ratten opgezet met behulp van microchirurgie. Dit model werd vervolgens gebruikt om de status van zakontsteking en darmbarrière-indicatoren te onderzoeken. De resultaten toonden aan dat ratten opmerkelijke symptomen vertoonden, zoals bloederige ontlasting, diarree en gewichtsverlies na blootstelling aan DSS. Dit leidde tot oedeem en erosie van het slijmvlies van de buidel, ontsteking zoals aangegeven door histopathologische scores, en verhoogde niveaus van pro-inflammatoire factoren, waaronder interleukine-6 (IL-6), IL-17, tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) en interferon-gamma (INF-γ), samen met verminderde niveaus van de ontstekingsremmende factor interleukine-10 (IL-10). Bovendien nam de eiwitexpressie van de darmbarrière-indicator occludine af. Deze bevindingen komen overeen met eerdere studies11 en bevestigen de succesvolle oprichting van het rat pouchitis-model, dat een solide basis biedt voor verder onderzoek naar geneesmiddelen en mechanismen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anhydrous ethanol | Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., Ltd | China | Hematoxin-eosin Staining |
| Dextran Sulfate Sodium | Yeasen | 60316ES76 | Wordt gebruikt om ontsteking van de buidel te induceren |
| Formaldehyde-oplossing | Tianjin Zhiyuan Reagent Company | China | Hematoxin-eosin Staining |
| Gaas | Jiangxi Zhonggan Medical Equipment Company | China | Wordt gebruikt voor microchirurgie bij dieren |
| Hematoxyline | Beijing Zhongshan Jinqiao Company | China | Hematoxin-eosin Staining |
| Interferon γ Detectiereagent kit | Cloud-clone | SEA049Ra | Detectie van ontstekingsfactoren |
| Interleukine-10 detectiekit | Cloud-clone | SEA056Ra | Detectie van ontstekingsfactoren |
| Interleukine-17 detectiekit | Cloud-clone | SEA063Ra | Detectie van ontstekingsfactoren |
| Interleukine-6 detectiekit | Cloud-clone | SEA079Ra | Detectie van ontstekingsfactoren |
| Jodofoor | Tangpai Medical Equipment Co., Ltd | China | Wordt gebruikt voor microchirurgie bij dieren |
| Microscopische manipulatie-instrumenten | Aesculap | Duitsland | Wordt gebruikt voor microchirurgie bij dieren |
| Occludin | abcam | ab216327 | Immunohistochemische testen |
| Naainaald | Yangzhou Fuda Medical Equipment Co., Ltd | China | Wordt gebruikt voor microchirurgie bij dieren |
| tumornecrosefactor α Detectiereagent kit | Cloud-clone | SEA133Ra | Detectie van ontstekingsfactoren |
| Tweepersoons binoculaire chirurgisch microscoop | OPTON | Duitsland | Wordt gebruikt voor microchirurgie bij dieren |
| XYleen | Tianjin Yingda Rare and Precious Reagent Factory | China | Hematoxin-eosin Staining |
Referenties
- Yang, M. L., Brar, M. S., Kennedy, E. D., De Buck Van Overstraeten, A. Laparoscopic versus transanal IPAA for ulcerative colitis: A patient-centered treatment trade-off study. Dis Colon Rectum. 67 (1), 107-113 (2024).
- Aktas, M. K., et al. Current status and surgical technique for restorative proctocolectomy with ileal pouch-anal anastomosis. Balkan Med J. 40 (4), 236-243 (2023).
- Zhao, L., et al. Microbiota DNA translocation into mesentery lymph nodes is associated with early development of pouchitis after ipaa for ulcerative colitis. Diseases of the Colon & Rectum. 66 (11), e1107-e1118 (2022).
- Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: A systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
- Pardi, D. S., D'haens, G., Shen, B., Campbell, S., Gionchetti, P. Clinical guidelines for the management of pouchitis. Inflamm Bowel Dis. 15 (9), 1424-1431 (2009).
- Shen, B., et al. Treatment of pouchitis, Crohn's disease, cuffitis, and other inflammatory disorders of the pouch: Consensus guidelines from the international ileal pouch consortium. Lancet Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 69-95 (2022).
- Dalal, R. L., Shen, B., Schwartz, D. A. Management of pouchitis and other common complications of the pouch. Inflamm Bowel Dis. 24 (5), 989-996 (2018).
- Li, K. Y., et al. A new rat model of pouchitis after proctocolectomy and ileal pouch-anal anastomosis using 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid. J Gastrointest Surg. 25 (6), 1524-1533 (2021).
- Drzymala-Czyz, S., et al. Discrepancy between clinical and histological effects of dha supplementation in a rat model of pouchitis. Folia Histochem Cytobiol. 50 (1), 125-129 (2012).
- Santiago, P., Barnes, E. L., Raffals, L. E. Classification and management of disorders of the J pouch. Am J Gastroenterol. 118 (11), 1931-1939 (2023).
- Lichtman, S. N., Wang, J., Hummel, B., Lacey, S., Sartor, R. B. A rat model of ileal pouch-rectal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 4 (3), 187-195 (1998).
- Guarner, F. Inulin and oligofructose: Impact on intestinal diseases and disorders. Br J Nutr. 93, Suppl 1 S61-S65 (2005).
- Kim, C. J., et al. L-tryptophan exhibits therapeutic function in a porcine model of dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis. J Nutr Biochem. 21 (6), 468-475 (2010).
- Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
- Letson, H. L., Morris, J., Biros, E., Dobson, G. P. Conventional and specific-pathogen free rats respond differently to anesthesia and surgical trauma. Sci Rep. 9 (1), 9399(2019).
- Gu, Y., et al. Saccharomyces boulardii, a yeast probiotic, inhibits gut motility through upregulating intestinal serotonin transporter and modulating gut microbiota. Pharmacol Res. 181, 106291(2022).
- Akiyama, S., et al. Endoscopic phenotype of the j pouch in patients with inflammatory bowel disease: A new classification for pouch outcomes. Clin Gastroenterol Hepatol. 20 (2), 293-302 (2022).
- Hata, K., et al. Pouchitis after ileal pouch-anal anastomosis in ulcerative colitis: Diagnosis, management, risk factors, and incidence. Dig Endosc. 29 (1), 26-34 (2017).
- Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
- Parks, A. Proctocolectomy without ileostomy for ulcerative colitis. BMJ. 2, 85-88 (1978).
- Shebani, K. O., et al. Pouchitis in a rat model of ileal J pouch-anal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 8 (1), 23-34 (2002).
Herprints en machtigingen
