Het huidige protocol beschrijft een ratmodel van occlusie/reperfusie van de middelste hersenslagader dat de anatomische structuur van hersenvaten behoudt zonder schade te veroorzaken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een rattenmodel van middelste cerebrale arteriële occlusie/reperfusie zonder de anatomische structuur van cerebrale vaten te beschadigen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ischemische beroerte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van langdurige invaliditeit en sterfte bij volwassenen. Diermodellen van ischemische beroerte hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van de pathologische mechanismen en de ontwikkeling van mogelijke behandelingen. Momenteel zijn er twee veelgebruikte methoden met filament (endovasculaire naald) technieken om diermodellen van cerebrale ischemie te induceren. Deze methoden hebben echter inherente beperkingen, zoals verminderde bloedperfusie naar de hersenen, schade aan het externe sleutelbeenslagader systeem, verminderde voedsel- en/of waterinname, en sensorische disfunctie van het gezicht. Dit artikel introduceert een nieuwe methode om een ischemische beroerte bij ratten te induceren zonder de vasculaire anatomie van de hersenen te compromitteren. In deze studie werd de halsslagader (CCA) van Sprague-Dawley ratten blootgelegd en er werd een incisie gemaakt. Vervolgens werd een filament door de incisie in de halsslagader ingebracht om de middelste hersenslagader te occluderen. Na 1,5 uur van geïnduceerde ischemie werd het occluderende filament volledig verwijderd uit zowel de halsslagader als de CCA. De incisie in de CCA werd vervolgens genaaid met 11-0 microchirurgische hechtingen onder een microscoop (vergroting 4x). Door het gebruik van microchirurgische technieken om de CCA te repareren, ontwikkelde deze studie met succes een unieke methode om een ischemische beroerte model bij ratten te induceren terwijl de anatomische integriteit van de hersenvaten behouden bleef.
Inleiding
Beroerte, de belangrijkste doodsoorzaak en oorzaak van langdurige neurologische disfunctie bij volwassenen wereldwijd, omvat verschillende typen, waarbij ischemische beroerte ongeveer 81,9% van de gevallen uitmaakt, terwijl hersenzelfhemoragie en subarachnoïdale bloeding respectievelijk 14,9% en 3,1% uitmaken1. Ischemische beroerte ontstaat vaak door atherosclerose of occlusie van de arteria cerebri media (MCA), wat leidt tot lokale vermindering van de hersenbloedstroom en daaropvolgende hersenbeschadiging. Deze vermindering van de voedingstoevoer naar ischemische cellen veroorzaakt energiedepletie, wat leidt tot verlies van membraanintegriteit, celzwelling en uiteindelijke lysering. Bovendien dragen factoren zoals verhoogde intracellulaire calcium, vrijlating van prikkelende aminozuren, verhoogde productie van vrije radicalen en activering van ontstekingscellen bij aan schade aan hersenweefsel na een beroerte2.
De behandelingsdoelen voor ischemische beroerte zijn veelzijdig: vermindering van aanhoudende neurologische schade en vermindering van mortaliteit en langdurige invaliditeit; voorkomen van complicaties die voortvloeien uit immobiliteit en neurologische disfunctie; en minimaliseren van het risico op recidief van beroerte. Gezien de complexiteit van de pathofysiologie van ischemische beroerte, is een robuust beroertemodel essentieel voor het onderzoek en de ontwikkeling van behandelingen die gericht zijn op ischemische beroerte.
Momenteel is occlusie van de arteria cerebri media (MCAo) een veelgebruikt diermodel voor ischemische beroerte3. MCAo wordt meestal uitgevoerd door een monofiliment met een siliconentip of vlamgebluste punt door de cervicale vaten te steken totdat het de oorsprong van de arteria cerebri media (MCA) bereikt. In 1986 ontwikkelden Koizumi en collega's een techniek waarbij een monofiliment met een siliconentip werd ingebracht via een incisie in de arteria carotis communis (CCA), waardoor het de ingang van de MCA bereikte en de bloedstroom blokkeerde4. In 1989 rapporteerde Longa's groep een andere MCAo-methode waarbij een monofiliment werd ingebracht via een incisie in de arteria carotis externa (ECA). Het monofiliment passeert vervolgens de bifurcatie van de arteria carotis interna (ICA) en ECA voordat het het startpunt van de MCA bereikt5.
De beperkingen van de twee bestaande methoden voor het induceren van MCAo zijn duidelijk. De methode van Koizumi vereist de permanente blokkering van de ipsilaterale CCA, wat leidt tot verminderde MCA-perfusie aangezien reperfusion uitsluitend afhankelijk is van de cirkel van Willis4. Daarentegen omvat Longa's methode het doorsnijden van de ECA, wat resulteert in schade aan het ECA-systeem en daaropvolgende beperking van de functie van de gezichtsspieren5. Deze schade kan invloed hebben op voedsel- en wateropname, evenals zintuiglijke disfunctie van het gezicht, wat de revalidatie en de beoordeling van neurologische functie na ischemische beroerte beïnvloedt6.
Het huidige protocol probeert deze beperkingen aan te pakken door een nieuwe methode te ontwikkelen om een ischemische beroertemodel te induceren zonder de anatomische structuur van de hersenvaten te beschadigen. Deze nieuwe aanpak maakt gebruik van microchirurgische technieken om de CCA te repareren, waardoor de nadelen van eerdere methoden worden vermeden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimentele procedure kreeg goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee van de Yantai University (Goedkeuringsnummer: YTDX20230410) en hield zich aan de richtlijnen van de National Institutes of Health voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren. Voor dit onderzoek werden mannelijke Sprague-Dawley-ratten gebruikt met een gewicht tussen de 300-350 g. Een volledige lijst van de gebruikte dieren, reagentia en apparatuur is te vinden in de Tabelle der Materien.
1. Diervoorbereiding
- Houd de dieren in een omgeving met een 12 uur licht/duisterniscyclus, gecontroleerde temperatuur en vochtigheid. Zorg ervoor dat ze onbeperkte toegang hebben tot voedsel en water.
2. Anesthesie
- Anesthesieer de ratten via intraperitoneale injectie met een mengsel dat ketamine (80 mg/kg) en xylazine (20 mg/kg) bevat.
OPMERKING: Kantel het hoofd en lichaam van de ratten naar beneden. De injectieplaats bevindt zich in de onderste rechterkwadrant van de buik. Trek de plunjer terug voordat u injecteert. Het gemiddelde injectievolume is 0,4 ml. - Bevestig de inductie van anesthesie door de onttrekkingsreflex van de achterpoot en de knipperreflex te beoordelen. Als de adequate diepte van anesthesie niet wordt bereikt, voeg dan isofluraan toe tijdens de chirurgische procedure.
3. Ischemische modelleringsprocedure
- Steriliseer de chirurgische hulpmiddelen met behulp van een autoclaaf. Desinfecteer de operatietafels en aanverwante apparatuur met 70% ethanol.
- Bereid de chirurgische plaats voor door de vacht rond de verwachte incisieplaats te scheren. Desinfecteer de huid op de chirurgische plaats driemaal met betadine en 70% ethanol.
- Maak een middenincisie op de ventrale zijde, ongeveer 1,5 cm lang, en open de oppervlakkige fascia.
- Voer een scherpe en stompe dissectie uit om de externe halsslagader (ECA), interne halsslagader (ICA) en gemeenschappelijke halsslagader (CCA) bloot te leggen volgens de eerder beschreven methode7.
- Plaats drie 4-0 zijden hechtingen rond de CCA en nog een zijden hechting door de ECA nabij de ICA-bifurcatie. Knoop een los te maken glijdende knoop op de proximale CCA. Draai de hechting op de distale CCA strak met behulp van een hemostaat om de bloedstroom te blokkeren. Bind los een andere glijdende knoop rond de CCA tijdens het hechten om ervoor te zorgen dat het vat niet gesloten is.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de glijdende knoop niet te strak is, alleen voldoende om de bloedstroom te blokkeren, aangezien deze tijdens het vasculaire hechten moet worden losgemaakt. - Maak een 0,5 mm incisie tussen de proximale zijden hechting en de middelste hechting op de CCA met behulp van een schaar.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de incisie toestaat dat het filament (silicoombeklede punt) het CCA kan binnendringen. - Breng een 3 cm lang 4-0 filament (silicoombeklede punt) in het CCA. Draai de zijden hechtingen rond de CCA strak om het intraluminale filament vast te zetten en bloeding te voorkomen; verwijder vervolgens de hechting van de distale CCA.
- Breng het filament verder in het lumen van de MCA in, terwijl de hechtingen rond de ECA worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat het filament de ECA niet binnendringt. De inbrenglengte is typisch 18 mm tot 20 mm.
- Start een timer en noteer het tijdstip waarop de occlusie begint. Hecht de neksnede met 3-0 zijden hechtingen en plaats het dier voorzichtig in een herstelkooi. Dien 0,5 ml fysiologische zoutoplossing intraperitoneaal toe.
4. Microchirurgische hechting van de CCA
- Anesthesieer de rat 1,5 uur na ischemie opnieuw. Desinfecteer de incisieplaats driemaal met 70% ethanol en open de incisie opnieuw.
- Trek voorzichtig het occluderende filament terug totdat de witte punt duidelijk zichtbaar is nabij de CCA-incisie. Plaats een microklem horizontaal dicht bij het bevestigde intraluminale hechtingsknooppunt nabij de CCA-bifurcatie.
OPMERKING: Vermijd het klemmen van de witte filamentpunt om siliconenloslating en daaropvolgende trombose te voorkomen. - Los het bevestigde intraluminale hechtingsknooppunt en verwijder het filament volledig.
- Plaats een andere microklem dicht bij de hartzijde van de proximale CCA-knoop. Verwijder vervolgens de hechtingsknoop rond de proximale CCA.
OPMERKING: De juiste plaatsing van klemmen is cruciaal voor het verhogen van vaste vaten in latere stappen om microvasculaire hechting te vergemakkelijken. Plaats klemmen horizontaal op de omliggende spieren om glijderigheid te voorkomen. - Spuit de incisieplaats met fysiologische zoutoplossing en droog het gebied met een steriele katoenen bal om het bloed te verwijderen en een duidelijk chirurgisch veld te verkrijgen.
- Onder een microscoop (4x vergroting), hecht de CCA-incisie met 11-0 microchirurgische hechtingen in een onderbroken patroon, meestal twee steken vereist, afhankelijk van de incisiegrootte.
- Verwijder na het hechten de microklemmen van beide uiteinden van de CCA om de bloedstroom te herstellen.
- Oefen druk uit met een steriele katoenen bal op de CCA-hechtingsplaats gedurende 30 s. Observeer de CCA gedurende 2 min om ervoor te zorgen dat er geen bloeding optreedt. Hecht de neksnede van de rat en plaats het dier in een zorgdoos van 35 °C voor anesthesieherstel voordat het wordt teruggeplaatst in de kooi.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het proces van microsutureren
De filament werd teruggetrokken nabij de incisie van de CCA totdat de witte filamentpunt zichtbaar was (Figuur 1A). Vervolgens werden microklemmen op de CCA geplaatst (Figuur 1B). Onder een microscoop bij een 4x vergroting werd de incisie van de CCA gehecht met microsurgische hechtingen in een onderbroken patroon (Figuur 1C). Daarna werden de microklemmen van de CCA verwijderd, waar...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
MCAo is een veelgebruikte methode om diermodellen van beroerte te creëren, waardoor het beroerteproces dat bij patiënten wordt waargenomen effectief wordt gerepliceerd door de bloedstroom na ischemie te herstellen10,11,12. Ons laboratorium heeft een ischemiek beroertemodel ontwikkeld dat reperfusion van de CCA mogelijk maakt zonder schade aan de ECA te veroorzaken. Na het induceren van ischemie wordt microchirurgische reparatie ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen enkele potentiële belangenconflicten om openbaar te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het Hebei Province Introducing Foreign Intelligence Project in 2023. We danken Lisa Kreiner, PhD, van Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), voor het redigeren van de Engelse tekst van een versie van dit manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10% formalin | Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. | BL913A | |
| 11-0 microsurgical sutures | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 3/8 1×5 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | SIGMA | T8877 | |
| 3-0 silk suture | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 3-0 | |
| 4% isoflurane | Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Ltd. | 20221102 | |
| 6-0 silk suture | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 6-0 | |
| 70% ethanol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. | 20230408 | |
| Filament | Xinong Technologies Co Ltd. | 2838-A5 | |
| Ketamine | Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. | 230613BL | |
| Male Sprague Dawley rats | Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. | SCXK (Lu) 20190003 | |
| Microclips | Shanghai Jinzhong Medical Device Factory | W40150 | |
| Microscope | ZEISS | S100 OPMI pico | |
| Nursing box | Beijing Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd. | FYL-YS-100L | |
| Xylazine | SIGMA | PHR3263 |
Referenties
- Tu, W. J., et al. China stroke surveillance report 2021. Mil Med Res. 10 (1), 33(2023).
- Wu, L., et al. Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion injury. Front in Mol Neurosci. 13, 28(2020).
- Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. E. Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jap J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).
- Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in mice. J Vis Exp. (51), e2879(2011).
- Yu, Z., et al. Icaritin inhibits neuroinflammation in a rat cerebral ischemia model by regulating microglial polarization through the GPER-ERK-NF-κB signaling pathway. Mol Med. 28 (1), 142(2022).
- Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological Deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26 (4), 627-634 (1995).
- Bracko, O., et al. 3-Nitropropionic acid-induced ischemia tolerance in the rat brain is mediated by reduced metabolic activity and cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (9), 1522-1530 (2014).
- Goldmacher, G. V., et al. Tracking transplanted bone marrow stem cells and their effects in the rat MCAO stroke model. PLoS One. 8 (3), e60049(2013).
- Lee, H. J., et al. The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 481 (1), 30-35 (2010).
- Connolly, E. S., Winfree, C. J., Solomon, R. A. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
- Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
