Kwantificering van microgliale inslokking van synaptisch materiaal met behulp van flowcytometrie

Summary

Hier presenteren we twee protocollen om microgliale inslokking van vGLUT1-positieve synapsen en pHRodo Red-gelabelde ruwe synaptosomen te kwantificeren met behulp van flowcytometrie.

Abstract

Microglia spelen een cruciale rol bij synaptische verfijning in de hersenen. Analyse van microgliale inslokking van synapsen is essentieel om dit proces te begrijpen; de momenteel beschikbare methoden voor het identificeren van microgliale overspoeling van synapsen, zoals immunohistochemie (IHC) en beeldvorming, zijn echter arbeidsintensief en tijdrovend. Om deze uitdaging aan te gaan, presenteren we hier in vitro en in vivo* assays die een snelle en high-throughput kwantificering van microgliale inslokking van synapsen mogelijk maken met behulp van flowcytometrie.

In de in vivo* benadering voerden we intracellulaire vGLUT1-kleuring uit na verse celisolatie uit volwassen muizenhersenen om de verzwelging van vGLUT1^+- synapsen door microglia te kwantificeren. In de in vitro synaptosoomoverspoelingstest gebruikten we vers geïsoleerde cellen uit de hersenen van volwassen muizen om de overspoeling van pHrodo Red-gelabelde synaptosomen door microglia te kwantificeren. Deze protocollen samen bieden een tijdbesparende benadering voor het kwantificeren van microgliale overspoeling van synapsen en vertegenwoordigen veelbelovende alternatieven voor arbeidsintensieve op beeldanalyse gebaseerde methoden. Door de analyse te stroomlijnen, kunnen deze testen bijdragen aan een beter begrip van de rol van microglia in synaptische verfijning in verschillende ziektemodellen.

Introduction

Microglia zijn de residente immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS)¹. Ze scannen voortdurend hun micro-omgeving en zorgen voor bewaking ^1,2. Bovendien interageren ze vaak met synapsen en bemiddelen ze een fijnafstemming van de synaptische activiteit³. Ze zijn dus naar voren gekomen als een sleutelspeler in het proces van synaptische verfijning.

De rol van microglia in synaptische verfijning door het opslokken van synapsen is aangetoond door verschillende onderzoeksgroepen 3,4,5,6,7. Verstoringen in dit proces kunnen bijdragen aan de pathologie van neurologische ontwikkelingsstoornissen en neurodegeneratieve aandoeningen zoals schizofrenie en de ziekte van Alzheimer⁸. Afwijkende synaptische verfijning door microglia is al gedetecteerd in verschillende muizenmodellen van neurologische aandoeningen ^5,9,10. Daarom is de identificatie van verschillende mechanismen die ten grondslag liggen aan microgliale inslokking van synapsen van het grootste belang voor het begrijpen van de pathofysiologie van neurologische ontwikkelings- en neurodegeneratieve aandoeningen⁸.

Het aanpakken van microgliale inslokking van synapsen heeft een groot potentieel voor zowel het ingrijpen in ziekteprogressie als het verkrijgen van inzicht in de onderliggende mechanismen van neurologische ontwikkelings- en neurodegeneratieve aandoeningen. Om dergelijke onderzoeken te vergemakkelijken, is er behoefte aan snelle en high-throughput benaderingen. De huidige methodologische benaderingen omvatten in vivo, ex vivo en in vitro assays die de detectie van synaptisch materiaal binnen microglia mogelijk maken. Over het algemeen is de detectie van microgliale overspoeling van synapsen sterk afhankelijk van immunohistochemie (IHC) en op microscopie gebaseerde benaderingen ^5,6,11, die arbeidsintensief zijn en beperkingen vertonen bij het analyseren van een groot aantal microglia.

Gezien deze technische beperkingen is het absoluut noodzakelijk om alternatieve methodologieën te verkennen. Om dit te verhelpen, hebben we een op flowcytometrie gebaseerde aanpak geoptimaliseerd, die een efficiënte, onbevooroordeelde en high-throughput analyse van microgliale overspoeling van synapsen mogelijk maakt. We kozen de hippocampus als het belangrijkste interessegebied vanwege de hoge mate van synaptische remodellering en plasticiteit¹², maar het protocol kan worden aangepast aan verschillende hersengebieden. Hoewel flowcytometrie al in eerdere studies is gebruikt om microgliale overspoeling van synapsen 13,14,15 te detecteren, bieden we hierin een stapsgewijze methodologie waarbij gebruik wordt gemaakt van een momenteel in de handel verkrijgbaar, fluorofoor-geconjugeerd vGLUT1-antilichaam. Bovendien bieden we een aanvullende in vitro benadering voor high-throughput screening van microgliale inslokking van synaptisch materiaal door gebruik te maken van ruwe synaptosomen.

Protocol

Een algemeen overzicht van de experimentele procedure wordt grafisch geïllustreerd in figuur 1A. Alle gebruikte experimenten met betrekking tot het hanteren van levende dieren werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Duitse wet op de dierenbescherming en werden goedgekeurd door het regionale bureau voor gezondheids- en sociale diensten in Berlijn (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlijn, Duitsland). De muizen werden gehuisvest in geventileerde kooien onder standaard laboratoriumomstandigheden met een licht/donkercyclus van 12:12 uur in de dierkernfaciliteit van het Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC). Voedsel en water werden ad libitum verstrekt. Zie Tabel 1 voor de samenstelling van buffers en reagentia en de Tabel met materialen voor details met betrekking tot alle reagentia, instrumenten en materialen die in dit protocol worden gebruikt. Voor de vGLUT1-specifieke test gebruikten we de term in vivo* in het hele manuscript om te erkennen dat flowcytometrie weefselhomogenisatie en celisolatie vereist, en dat microglia ongeveer 95% levensvatbaarheid vertonen na de isolatieprocedure (Figuur 1B en aanvullende figuur S1). Daarom behouden ze hun vermogen om synaptisch materiaal ex vivo op te slokken, gedurende een korte periode, tot de fixatie. De kwantificering van vGLUT1⁺ microglia omvat dus zowel in vivo als ex vivo slokatie op korte termijn tot aan de fixatiestap.

1. Intracellulaire vGLUT1-kleuring voor de detectie van in vivo* inslokking van glutamaterge synapsen door microglia

OPMERKING: De volgende procedure voor celisolatie is aangepast van¹⁶. Alle stappen van celisolatie moeten op ijs worden uitgevoerd.

1. Verdoof de muizen met behulp van intraperitoneale injectie van pentobarbital. Doordrenk de muizen intracardiaal met 10 ml ijskoude Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) gedurende ~2 min.
   OPMERKING: Per monster (n) wordt één muis gebruikt.
2. Haal de hersenen uit de schedel en bewaar ze in 1 ml neuraal celmedium.
   OPMERKING: Neuraal celmedium, zoals Hibernate-A-medium, wordt gebruikt om een hoge levensvatbaarheid van cellen te garanderen na het weefseldissociatieproces.
3. Breng de hersenen over naar een petrischaal gevuld met 1 ml ijskoud neuraal celmedium en ontleed de hippocampi zoals eerder beschreven¹⁷.
4. Breng de hippocampi over naar een Dounce-homogenisator gevuld met 1 ml neuraal celmedium en dissocieer het weefsel met behulp van de losse stamper met ongeveer ~ 25 zachte bewegingen.
5. Plaats een zeef van 70 μm op een buis van 5 ml polypropyleen en voeg 500 μl neuraal celmedium toe. Breng het weefselhomogenaat over naar de polypropyleen buis van 5 ml door de zeef.
6. Spoel de Dounce homogenisator 2x met 1 ml koud neuraal celmedium en centrifugeer de monsters op 400 × g gedurende 8 min.
7. Aspireer het supernatans en resuspendeer de pellet in 500 μl ijskoud DPBS via zacht pipetteren. Zorg voor een homogene suspensie en vul het uiteindelijke volume aan tot 1,5 ml met behulp van DPBS.
8. Voeg 500 μL isotone Percoll-oplossing toe aan het monster, resuspendeer het voorzichtig en bedek het met nog eens 2 ml koud DPBS.
9. Centrifugeer de monsters bij 3.000 × g gedurende 10 minuten met volledige acceleratie en zonder rem. Zuig zowel de bovenste laag als de myelineschijf op in de middelste fase.
   NOTITIE: Alle volgende centrifugeerstappen worden uitgevoerd bij 4 ^°C, tenzij anders aangegeven.
10. Voeg 4 ml koude DPBS toe en centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 400 × g . Zuig het supernatans op en resuspendeer de cellen in 100 μl fixeerbare levensvatbaarheidskleuringsoplossing en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 4 °C.
11. Voeg 1 ml koude DPBS toe aan het monster en centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 300 × g . Gooi het supernatans weg en voeg 100 μl CD16/CD32-kleuringsoplossing toe (1/200 in FACS-buffer). Vortex gedurende ~5 s en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: CD16/CD32-kleuring is een voorbehandeling om niet-specifieke binding van antilichamen aan FcR-dragende cellen, zoals microglia, voorafgaand aan toepassingen zoals flowcytometrie te minimaliseren.
12. Voeg 1 ml FACS-buffer toe aan het monster en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g . Aspireer het supernatans en voeg 100 μL kleuringsmastermix-I toe (1/100 anti-CD11b/ anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C/ anti-Ly6G in 1x FACS Buffer). Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 4°C in het donker.
13. Voeg 1 ml FACS-buffer toe aan het monster en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g .
14. Resuspendeer de pellet in 250 μL fixatiebuffer. Incubeer bij 4 °C gedurende 25 min.
15. Voeg 2 ml 1x permeabilisatie (PERM) Buffer toe en centrifugeer 300 × g gedurende 5 min.
16. Gooi het supernatans weg en voeg 100 μl vGLUT1 of isotypecontrolekleuringsoplossing toe. Vortex gedurende ~5 s en incubeer de monsters bij 4 °C gedurende 50 min.
17. Voeg 2 ml 1x PERM Buffer toe en centrifugeer 300 × g gedurende 5 min. Gooi het supernatans weg en voeg 2 ml FACS-buffer toe aan de monsters.
18. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 250 μL FACS-buffer en leid de monsters door een zeeffilter van 40 μm.
19. Analyseer de vGLUT1-fluorescentie-intensiteit van enkele/levensvatbare/CD11b⁺⁺/CD45⁺ microglia met behulp van flowcytometrie. Gebruik miltmacrofagen als negatieve controle voor elk experiment.
    1. Isoleer splenocyten door fijngehakt miltweefsel twee keer voorzichtig door een zeeffilter van 70 μm te persen. Spoel de filters af met 40 ml DPBS en vang de suspensie op in een conische buis van 50 ml.
    2. Centrifugeer 350 × g gedurende 10 minuten en resuspendeer de resulterende pellet in een 1 ml oplossing van lysisbuffer voor rode bloedcellen. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
    3. Voeg na de incubatie 10 ml DPBS toe aan het monster en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 350 × g .
    4. Ga verder met de kleuringsstappen die tussen stap 1.11 en 1.17 worden uitgelegd.
       OPMERKING: De gating-strategie is opgenomen in aanvullende figuur S2 om miltmacrofagen te definiëren als CD11b ⁺⁺/ CD45 ⁺⁺/ Levensvatbare celpopulatie.
    5. Gating-strategie (Figuur 1)
       1. Primaire poort: Pas het voorwaartse verstrooiingsgebied (FSC-A) [x-as] en het zijverstrooiingsgebied (SSC-A) [y-as] aan om de microgliapopulatie in het omheinde gebied op te nemen en het cellulaire puin uit te sluiten.
       2. Pas het voorwaartse verstrooiingsgebied (FSC-A) [x-as] en de voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H) [y-as] aan om doubletten uit te sluiten. Singlets worden weergegeven als een diagonaal op deze stippenteken.
       3. Pas CD11b-PECy7 [y-as] en CD45-APC [x-as] aan en poort de populatie met een hoog oppervlakteniveau van CD11b en een gemiddeld niveau van CD45 als microglia.
       4. Sluit dode cellen in de FITC[y-as] negatieve poort uit. OPTIONEEL: Sluit ook cellen uit die positief zijn voor Ly6C- en Ly6G-FITC in de FITC-negatieve poort om CZS-geassocieerde macrofagen uit te sluiten van de analyse.
          OPMERKING: In tegenstelling tot levende cellen, zorgen dode cellen met gecompromitteerde membranen ervoor dat de fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof het cytoplasma binnendringt, waardoor de hoeveelheid eiwitetikettering toeneemt¹⁸. Dode cellen zullen dus helderder zijn dan levende cellen, die zijn opgenomen in de gedefinieerde poort.
       5. Pas CD45-APC [x-as] en vGLUT1-PE [y-as] aan; de populatie die zich boven de drempelpoort bevindt, waarbij er geen positieve gebeurtenissen zijn gedetecteerd in het miltmonster (interne biologische negatieve controle, figuur 1E) wordt beschouwd als de vGLUT1-positieve fractie in het monster.

2. Detectie van in vitro inslokking van ruwe synaptosomen door microglia

1. Ruwe synaptosoombereiding en pHrodo Red-etikettering
   OPMERKING: Alle volgende stappen moeten op ijs plaatsvinden.
   1. Volg de stappen 1.1 tot en met 1.2.
   2. Breng de hersenen over naar een petrischaal gevuld met 1 ml ijskoud neuraal celmedium en ontleed de hippocampi zorgvuldig. Bewaar de petrischaal altijd op ijs. Gebruik hippocampi voor microglia-isolatie in de volgende stap.
   3. Breng de rest van de hersenen (met uitzondering van het cerebellum en de bulbus olfactorius) over naar een Dounce-homogenisator gevuld met 1 ml synaptisch eiwitextractiereagens en dissocieer het weefsel voorzichtig met behulp van de losse stamper met ongeveer ~30 slagen. Vul de proteaseremmer van één tablet per 10 ml van het extractiereagens aan en isoleer de synaptosomen volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Synaptische eiwitextractiereagentia, zoals SynPER¹⁹, worden gebruikt om synaptosomen te bereiden die biologisch actieve pre- en postsynaptische eiwitten bevatten.
   4. Los de ruwe synaptosoomkorrel op in 500 μl 0,1 M Na₂CO₃ -oplossing. Kleur het synaptosoommonster met 10 μL 0,2 mM pHrodo Rood. Incubeer de ruwe synaptosoommonsters bij kamertemperatuur (24-25 °C) gedurende 1,5 uur met zachte agitatie.
   5. Voeg 1 ml koude DPBS toe aan het monster, centrifugeer gedurende 1 minuut op volle snelheid (20.815 × g) en zuig het supernatant op.
   6. Herhaal stap 2.1.5 in totaal 7x om ongebonden overmatig pHrodo Rood uit de monsters te verwijderen.
   7. Voer na de laatste centrifuge een standaard BCA-test uit om de eiwitconcentraties van het monster te kwantificeren.
   8. Optioneel: klik de synaptosoommonsters in DPBS met 5% DMSO in met vloeibare stikstof en bewaar ze gedurende 3 weken bij -80 °C. Dek de buizen af met aluminiumfolie om de blootstelling aan licht tot een minimum te beperken.
2. In vitro Ruwe synaptosoomoverspoelingstest met behulp van vers geïsoleerde microglia voor volwassenen
   1. Bereid aCSF voor en breng het in evenwicht met 95% O₂:5%CO₂ gedurende 30 min.
      OPMERKING: Volg voor de stappen 2.2.2-2.2.4 de instructies van de fabrikant voor de bereiding van een verteringsoplossing op basis van papaïne.
   2. Voeg 4 ml aCSF toe aan injectieflacon 2 in de papaïneset. Plaats de injectieflacon in een waterbad van 37 °C gedurende ~10 minuten totdat de papaïneoplossing helder lijkt.
   3. Voeg 400 μL aCSF toe aan injectieflacon 3 in de papaïnekit. Meng voorzichtig gedurende ~10 keer door langzaam te pipetteren.
   4. Voeg 200 μl uit injectieflacon 3 toe aan injectieflacon 2 (gereconstrueerd in stap 2.2.3). Bewaar de rest van de injectieflacon 3.
   5. Neem de hippocampi die in stap 2.1.2 zijn ontleed en hak de ontlede hippocampi fijn met een scalpel.
   6. Breng de fijngehakte hippocampi over in een weefseldissociatorbuisje gevuld met 2 ml enzymoplossing bereid in stap 2.2.5. Plaats de buis in de weefseldissociator en voer het programma uit: 37C_ABDK_01 (duurt ~30 min).
   7. Plaats de monsters in een waterbad op 37 °C gedurende ~20 minuten en trituer het mengsel elke 5 minuten met een pipet van 1 ml zonder belletjes te maken.
      OPMERKING: Dit proces moet worden voortgezet totdat het weefsel volledig is gedissocieerd en volledig homogeen lijkt om een efficiënte dissociatie te garanderen. Alle volgende centrifugatiestappen worden uitgevoerd bij 4 ^°C, tenzij anders aangegeven.
   8. Verwijder de troebele celsuspensie voorzichtig in een nieuw buisje van 15 ml en centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten.
   9. Bereid gedurende deze periode van 5 minuten de volgende wasmix (5 ml) per monster; voeg 500 μl gereconstitueerde albumine-ovomucoïdremmeroplossing in de papaïnekit toe aan 4,5 ml aCSF. Voeg de resterende oplossing in injectieflacon 3 uit stap 2.2.5 toe aan de wasmix.
   10. Gooi het supernatans uit stap 2.2.8 weg en suspendeer de celkorrel onmiddellijk opnieuw in de wasmengoplossing.
   11. Breng het monster door een filter van 70 μm naar een nieuwe microcentrifugebuis van 5 ml. Centrifugeer de monsters bij 300 × g gedurende 5 minuten.
   12. Ga verder met de Percoll-gradiëntcentrifugatiestap die eerder is uitgelegd in stappen 1.7-1.9.
   13. Resuspendeer de cellen voorzichtig in de MACS-kleuringsbuffer door langzaam op en neer te pipetteren. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 4 °C.
   14. Voeg 1 ml MACS-buffer toe aan elk monster en centrifugeer bij 300 × g gedurende 8 minuten.
   15. Resuspendeer de cellen in 500 μL MACS-buffer.
   16. Plaats de positieve selectiekolommen in de magnetische scheider. Breng de kolommen in evenwicht door ze te spoelen met 3 ml MACS Buffer.
   17. Meng voorzichtig en breng 500 μL van de celsuspensie aan op de kolom. Was de kolommen 3x met 3 ml MACS Buffer.
   18. Verwijder de kolommen van de magnetische scheider en plaats ze op conische buizen van 15 ml. Voeg 5 ml MACS-buffer toe aan de kolom en spoel de cellen onmiddellijk weg met een plumper. Centrifugeer de monsters bij 300 × g gedurende 10 minuten.
   19. Bereid gedurende deze periode 20 ml 40% FBS in DPBS. Verwarm 1 ml DMEM per monster voor tot 37 °C in een waterbad.
   20. Los de uiteindelijke celkorrel op in 1 ml voorverwarmde DMEM. Zaad ongeveer ~150.000-200.000 cellen in 500 μL voorverwarmde DMEM per put in een plaat met 24 putjes. Zaai als controle een vergelijkbaar aantal cellen in 1-2 extra putjes. Controleer de samenvloeiing van cellen in alle putjes met behulp van een lichtmicroscoop.
       OPMERKING: Als het doelhersengebied de hippocampus of vergelijkbaar kleine hersengebieden is, kunnen 5 muizen per monster (n) worden samengevoegd om ~150.000 microglia te isoleren. Voor het hele brein is 1 muis per n voldoende om een vergelijkbaar aantal cellen te verkrijgen met behulp van beide isolatieprotocollen. Als alternatief kunnen ~40.000 cellen worden geplateerd in platen met 96 putjes in een eindvolume van 100 μL om de sloktest te starten. Dit vermindert het aantal geanalyseerde cellen, maar vermindert ook het aantal gebruikte muizen per n. Eiwitdeprivatie door gebrek aan FCS in DMEM zal fagocytose veroorzaken.
   21. Incubeer de plaat gedurende 1-2 uur in de incubator (37 °C en 5% CO_{2 ).}
       OPMERKING: Deze stap is bedoeld om de cellen te laten herstellen van de stressgevoelige effecten van de isolatieprocedure voorafgaand aan de start van de functionele overspoelingstest.
   22. Haal heel langzaam 250 μl medium uit elk putje, voeg 250 μl vers voorverwarmd DMEM toe aan elk putje en voeg 3 μg pHRodo roodgelabelde synaptosomen toe aan de bovenkant. Controleer de samenvloeiing van cellen in alle putjes met behulp van een lichtmicroscoop.
       1. Voeg voor de negatieve controleputjes dezelfde hoeveelheid niet-gelabelde synaptosomen toe aan het extra goed bezaaide met cellen.
       2. Zorg er bij testputjes voor dat putje 1 alleen cellen bevat; WELL 2 bevat cellen+ niet-gelabelde synaptosomen; well-3 bevat cellen+ 3 μg pHrodo Rood; goed 4 bevat DMEM + 3 μg pHrodo Red.
   23. Incubeer de cellen met synaptosomen gedurende 2 uur in de incubator (37 °C en 5% CO_{2 ).}
   24. Haal het medium eruit en was de kuiltjes met koud DPBS. Voeg 200 μL trypsine/EDTA-oplossing per putje toe om de cellen gedurende 35 s los te maken.
   25. Voeg 1 ml 40% FBS toe aan DPBS per putje en breng de cellen over in een polypropyleen buis van 5 ml door de zeef. Houd tijdens dit proces zowel de plaat als de buis op ijs om het loskomen van cellen te vergemakkelijken.
   26. Was elk putje 2x met 500 μL ijskoud DPBS. Centrifugeer de verzamelde monsters bij 500 × g gedurende 5 minuten.
   27. Resuspendeer de cellen in de kleuringsoplossing met 1/200 CD16/CD32 in 100 μL FACS-buffer en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
   28. Voeg na de incubatie CD11b en CD45 toe aan de kleuroplossing met een eindconcentratie van 1/100 van elk. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 4 °C in het donker.
   29. Was de monsters met 1 ml FACS-buffer en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 300 × g .
   30. Resuspendeer de pellet in 250 μL FACS-buffer en registreer ten minste 100.000 totale events met behulp van flowcytometrie. Analyseer de pHrodo Rode fluorescentie-intensiteit van CD11b⁺⁺/CD45⁺ microglia.
   31. Poortstrategie (Figuur 2C)
       1. Pas de primaire poort aan: Forward Scatter Area (FSC-A) [x-as] en Side Scatter Area (SSC-A) [x-as] om de microglia-populatie in het omheinde gebied op te nemen en het cellulaire puin uit te sluiten.
       2. Pas het voorwaartse verstrooiingsgebied (FSC-A) [x-as] en de voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H) [y-as] aan om doubletten uit te sluiten. Singlets worden weergegeven als een diagonaal op deze stippenteken.
       3. Pas CD11b-PECy7 [y-as] en CD45-APC [x-as] aan en poort de populatie met CD11b met een hoog oppervlak en een gemiddeld niveau van CD45 als microglia.
       4. Bereken de mediane fluorescentie-intensiteit van pHrodo-PE uit deze populatie. Gebruik dezelfde cellen die zijn uitgebroed met niet-gelabelde synaptosomen als de negatieve controle.

Results

In dit project optimaliseerden en presenteerden we twee protocollen om in vivo* en in vitro inslokking van synapsen door microglia te meten. In het eerste protocol richtten we ons op in vivo* inslokking van vGLUT1-positieve synapsen. Als uitgangspunt hebben we een eerder gepubliceerd protocol¹⁴ gebruikt. De FACS-antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, worden echter stopgezet en we hebben veel optimalisatiestappen toegevoegd, evenals een nieuwe methode voor microglia-isolatie¹⁶. Daarom is het hier gepresenteerde protocol de moeite waard om met de wetenschappelijke gemeenschap te delen als een uitgebreide update van de protocollen die al zijn gepubliceerd.

Om de microgliale overspoeling van synapsen te kwantificeren, gebruikten we C57BL/6N mannelijke muizen van 11-14 weken oud. De hippocampus werd geselecteerd als het belangrijkste interessegebied vanwege de hoge mate van synaptische remodellering en plasticiteit¹². We analyseerden %vGLUT1-positieve microglia en microglia-specifieke vGLUT1-PE fluorescentie-intensiteit (MFI) in de hippocampus van C57BL/6N muizen. Miltmacrofagen afkomstig van dezelfde dieren werden per experiment gebruikt als biologische negatieve controle. We hebben het vGLUT1-antilichaam getest door een hoger vGLUT1-PE-fluorescentiesignaal van de hippocampusmicroglia aan te tonen in vergelijking met de isotypecontrole- en miltmacrofagen (Figuur 1B-E)

Verder vergeleken we de microgliale inslokking van synapsen in het cerebellum en in de bulbus olfactorius (als een andere referentie voor hoge synaptische plasticiteit)²⁰. We vonden een hoger vGLUT1-fluorescentiesignaal in de microglia van de bulbus olfactorius en een lager signaal in het cerebellum in vergelijking met de hippocampus (Figuur 1F). De laagste signaalintensiteit werd gedetecteerd in de miltmacrofagen, die dienen als de interne negatieve controle (Figuur 1E). Daarnaast gebruikten we Vglut-IRES-Cre/ChR2-YFP-muizen om de immunoreactiviteit van ons vGLUT1-antilichaam te testen. YFP wordt tot expressie gebracht door de glutamaterge neuronen van deze muizen, wat aangeeft dat de YFP-positieve populatie ook een vGLUT1-positieve fractie moet bevatten. Met behulp van dit kleuringsprotocol detecteerden we 98,7% van de YFP-positieve populatie als vGLUT1-positief, wat de efficiëntie van ons antilichaam valideerde (aanvullende figuur S3).

Over het algemeen valideren deze resultaten de efficiëntie van het vGLUT1-antilichaam en het gepresenteerde kleuringsprotocol. We tonen aan dat dit protocol en het antilichaam met vertrouwen kunnen worden gebruikt om in vivo* slokving van synapsen op een high-throughput en snelle manier te kwantificeren in vergelijking met andere experimentele benaderingen.

We gaan verder met de in vitro methode, we hebben volwassen microglia geïsoleerd en geïncubeerd met vers geïsoleerde pHrodo Red-label synaptosomen geïsoleerd uit dezelfde dieren om hun in vitro overspoeling te kwantificeren (Figuur 2A). We hebben synaptosomen gelabeld met pHrodo Red, dat op natuurlijke wijze het fluorescentiesignaal verhoogt in zure omringende pH²¹. We hebben de synaptosomen vers geïsoleerd en blootgesteld aan verschillende pH-waarden (pH = 4 en pH = 11). Na bevestiging van de toename van het fluorescentiesignaal bij lage pH als een proof-of-principle-experiment (Figuur 2B), hebben we deze synaptosomen gedurende 1,5-2 uur geïncubeerd met vers geïsoleerde microglia. Als controle hebben we microglia geïncubeerd met niet-gelabelde synaptosomen. Vervolgens analyseerden we het pHrodo Red-PE-fluorescentiesignaal van CD11b⁺⁺/CD45⁺ microglia en observeerden we een positieve PE-fluorescentie, die vergelijkbaar was met die verkregen uit synaptosomen bij pH = 4 (Figuur 2C). Deze methode biedt dus een snelle en high-throughput analyse van de in vitro inslokking van synaptosomen en kan worden uitgebreid tot amyloïde plaques of de inslokking van andere potentiële doelwitten na de nodige optimalisatiestappen. Inderdaad, Rangaraju et al. gekwantificeerden de verzwelging van amyloïde bèta door microglia met behulp van een vergelijkbare op flowcytometrie gebaseerde benadering²². Concluderend kunnen we stellen dat deze twee methoden een robuuste, efficiënte en high-throughput kwantificering bieden van microgliale inslokking van synapsen, zowel in vivo* als in vitro.

Figuur 1: Analyse van microgliale inslokking van vGLUT1⁺ synapsen in vivo*. (A) Grafische illustratie van de experimentele workflow die de stappen van intracellulaire vGLUT1-kleuring weergeeft. (B) Gating-strategie om enkele/CD11b⁺⁺/CD45⁺/ levensvatbare celpopulatie uit de hippocampus te definiëren. Deze populatie werd gebruikt om vGLUT1-MFI te analyseren en om het percentage vGLUT1⁺ microglia in de hippocampus te kwantificeren. De poort die met de rode rechthoek wordt weergegeven, geeft de vGLUT1^+- celfractie in het totale monster aan. (C) Het histogram geeft de vGLUT1-PE-fluorescentie-intensiteit aan. (D) De poort die met de rode rechthoek wordt weergegeven, geeft aan dat er geen positieve celfractie is die Isotype-PE-immunoreactiviteit vertoont. Het histogram geeft de fluorescentie-intensiteit van Isotype-PE aan. (E) De poort die met de rode rechthoek wordt weergegeven, geeft aan dat er geen positieve celfractie is die vGLUT1-PE-immunoreactiviteit vertoont in de miltmacrofagen. Het histogram geeft de vGLUT1-PE-fluorescentie-intensiteit aan. De poort die op het histogram wordt aangegeven, begint op het niveau waar de vGLUT1-MFI van de milt eindigt (~10⁴) en wordt gebruikt om de vGLUT1-positieve fractie in de hersenmonsters te analyseren. (F) Het overlappende histogram toont de vergelijking van de PE-fluorescentie-intensiteit van miltmacrofagen (grijs) en microglia van de hippocampus (rood), het cerebellum (paars) en de bulbus olfactorius (lichtblauw). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Analyse van microgliale inslokking van synaptosomen synapsen in vitro. (A) Grafische illustratie van de experimentele workflow die de stappen van de in vitro synaptosoomoverspoelingstest weergeeft. (B) Synaptosomen geïncubeerd bij twee verschillende pH-waarden vertonen een laag pHrodo Red-PE fluorescentiesignaal bij pH = 11 en een hoge pHrodoRed-PE fluorescentie bij pH = 4. (C) Enkele/CD11b⁺⁺/CD45⁺ celpopulatie werd gebruikt om de pHrodo Red-PE fluorescentie-intensiteit te analyseren. Microglia geïncubeerd met ongekleurde synaptosomen werden gebruikt als negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Lijst van buffers en reagentia die in dit protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Representatief beeld van pas geïsoleerde volwassen microglia. Beeld verkregen met behulp van een lichtmicroscoop met 20x objectief, volgens het op papaïne gebaseerde weefseldissociatieprotocol en MACS-gebaseerde isolatie van CD11b+ microglia. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Representatieve FACS-grafieken die de gating-strategie demonstreren om miltmacrofagen te definiëren. Milt werd gebruikt als negatieve controle in de experimenten per experimentele run tijdens het testen van microgliale inslokking van synapsen in de hippocampus. De hierboven gegeven FACS-diagrammen definiëren de miltmacrofagen als CD11b⁺⁺/CD45⁺⁺/levensvatbare populatie. Deze populatie werd gebruikt om een drempel vast te stellen voor het kwantificeren van vGLUT1^+- microglia in de hersenmonsters die zich boven deze drempelpoort bevinden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Representatieve FACS-grafieken die de poortstrategie demonstreren om de efficiëntie van het vGLUT1-antilichaam te testen. (A) Grafische illustratie van de experimentele workflow met de stappen van de vGLUT1-kleuring. YFP⁺ glutamaterge neuronen werden gebruikt om de immunoreactiviteit van het vGLUT1-antilichaam te testen. (B) Gating-strategie om de YFP⁺ -populatie te definiëren op basis van de hippocampus van Vglut-IRES-Cre//ChR2-YFP-muizen die werden gebruikt als positieve controle voor het testen van de efficiëntie van het vGLUT1 FACS-antilichaam. De YFP^+- fractie werd afgeschermd om glutamaterge synapsen te specificeren. In deze populatie werd de immunoreactiviteit van het vGLUT1-antilichaam geanalyseerd om de immunoreactiviteit van het antilichaam te testen. Vergeleken met de (C) Isotypecontrole; 97,9% van de YFP-positieve celfractie wordt gedetecteerd als (D) vGLUT1-positief. (E) Het overlappende histogram geeft de vergelijking van de PE-fluorescentie tussen het isotype en het vGLUT1-antilichaam aan. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Synaptische verfijning door interactie tussen microglia en synaps is een intrigerend studiegebied binnen de neuro-immunologie en biedt veelbelovende inzichten in de rol van microglia bij neurodegeneratieve en neurologische ontwikkelingsstoornissen. In 2011; Paolicelli et al. leverden bewijs van de aanwezigheid van synaptisch materiaal in microglia, wat licht werpt op hun betrokkenheid bij het proces van synaptische inslokking⁴. Een andere intrigerende studie maakte gebruik van time-lapse-beeldvorming en een ex vivo organotypisch hersenplakcultuurmodel en meldde dat microglia zich bezighouden met een fagocytisch proces dat bekend staat als trogocytose, waarbij ze presynaptische structuren overspoelen in plaats van de volledige synaptische structuur²³. Een zeer recente publicatie, waarbij gebruik werd gemaakt van een nieuw transgeen muismodel dat het mogelijk maakt om fagocytose in intact weefsel te meten, toonde snoeien door Bergmann-glia in vivo bij motorisch leren²⁴. Er is dus voldoende bewijs dat wijst op de betrokkenheid van gliacellen bij synaptische overspoeling, waaronder microglia. De mate waarin deze microgliale functie het dynamische en selectieve proces van synaptisch snoeien beïnvloedt, vereist echter verder bewijs.

Niettemin dient de kwantificering van microgliale inslokking van synapsen als een waardevolle indicator en geeft gedeeltelijk inzicht in de complexe dynamiek van microglia-synapsinteracties, met name synaptische verfijning. Een uitgebreid overzicht heeft een samenvatting gegeven van de huidige protocollen die worden gebruikt om microglia-overspoeling van synapsen te onderzoeken²⁵. We willen benadrukken dat onze protocollen zijn geoptimaliseerd op basis van bestaande protocollen die al in gebruik zijn. De methoden die in deze studie worden gepresenteerd, zorgen voor een snelle en high-throughput kwantificering van microgliale inslokking van synapsen in verschillende ontlede hersengebieden. Afhankelijk van het hersengebied is voor beide methodologieën een analyse van ten minste 10.000 microgliacellen in maximaal twee dagen mogelijk, waardoor ze waardevol zijn voor het parallel testen van meerdere muismodellen.

We erkennen dat de kwantificering van vGLUT1⁺ microglia zowel in vivo als op korte termijn ex vivo slokatie omvat tot de fixatiestap. Daarom stellen we voor dat onze test een snelle en betrouwbare manier biedt om synaptisch materiaal in microglia te kwantificeren als een eerste stap voorafgaand aan in vivo validatie met behulp van benaderingen zoals IHC.

Een ander nadeel van de flowcytometrie-analyse is de beperkte beschikbaarheid van antilichamen voor synaptische markers, met name voor remmende synapsen. Het is een uitdaging om in de handel verkrijgbare, direct geconjugeerde antilichamen te vinden die een helder signaal voor deze markers laten zien. Gezien de uitgebreide optimalisatietijd die nodig is om verschillende antilichamen gericht op synaptische markers te testen, is het belangrijk om de goed geoptimaliseerde procedures te delen met de wetenschappelijke gemeenschap voor intracellulaire kleuring met verschillende antilichamen, zoals we hier doen met deze studie.

Wat de gegevensanalyse in deze studie betreft, gebruikten we isotypecontroles als technische negatieve controles om rekening te houden met niet-specifieke bindingen van het vGLUT1-antilichaam, aangezien ze een schatting geven voor niet-specifieke binding van een antilichaam in een monster, terwijl ze op flowcytometrie gebaseerde assays optimaliseren²⁶. De isotypecontroles zijn echter meestal geoptimaliseerd om het niet-specifieke achtergrondsignaal van de oppervlaktekleuringsprocedures te detecteren en zijn niet optimaal voor intracellulaire kleuringscontroles^27,28. Daarom mag er niet op worden vertrouwd om onderscheid te maken tussen de negatieve en positieve populaties bij het uitvoeren van intracellulaire kleuring, waarbij fixatie- en permeabilisatiestappen nodig zijn die van invloed kunnen zijn op antigeendetectie, autofluorescentie en fluorofoorhelderheid²⁹. Dergelijke intracellulaire kleuringsprocedures vereisen het gebruik van geschikte biologische interne controles om de positieve celpopulatie te definiëren die voor een intracellulaire marker is gekleurd²⁹. Dus, gezien het feit dat we een intracellulair kleuringsprotocol gebruiken, gebruikten we een interne biologische negatieve controle (miltmacrofagen) en definieerden we de grens tussen de positieve en negatieve populaties volgens de miltmacrofagen geïsoleerd uit dezelfde muizen. We maakten een onderscheid tussen de positieve populatie boven de poort, waarbij er geen vGLUT1-positieve gebeurtenissen zijn, en de miltmacrofagen die dienen als de biologische negatieve controle (Figuur 1).

Beide methoden die in deze studie worden gepresenteerd, bieden een groot potentieel voor de eerste analyse van microgliale overspoeling van synapsen op een snelle en high-throughput manier, waarbij meer dan 10.000 cellen uit kleine hersengebieden worden geanalyseerd en dit is niet haalbaar met standaard microscopietechnieken. Daarom bieden deze methoden een aanzienlijk voordeel ten opzichte van arbeids- en tijdrovende methoden en bieden ze verder een uitgebreidere analyse van synaptische overspoeling door een analyse van een groter aantal microglia mogelijk te maken. Bovendien is de in vitro methode die in deze studie wordt gepresenteerd bijzonder nuttig voor het testen van de impact van verschillende behandelingen op de microgliale overspoeling van synapsen. Het maakt directe kwantificering van het effect van de behandeling op microglia mogelijk zonder de verstorende factoren die geassocieerd zijn met andere celtypen. Bovendien dient het als een indirecte benadering om een mogelijk effect van micro-omgeving of andere celtypen op het proces van synaptische overspoeling aan te tonen. Daarom concluderen we dat deze methoden, vooral wanneer ze parallel worden gebruikt, intuïtieve en voordelige alternatieven bieden voor de analyse van microgliale overspoeling van synaptische materialen.

De analyse van vers geïsoleerde microglia door FACS-gebaseerde fagocytische assays ex vivo kan echter enkele nadelen opleveren. Ten eerste is het van cruciaal belang om goed geoptimaliseerde protocollen te gebruiken die vers geïsoleerde microglia uit de volwassen hersenen genereren, terwijl ex vivo activering en stressrespons van microglia worden vermeden. Dissing-Olesen et al. gebruikten het gebruik van transcriptionele en translationele remmers om dit probleem op te lossen door gebruik te maken van een weefseldissociatieprocedure bij 37 ^oC³⁰. Mattei et al., aan de andere kant, presenteerden een koud, mechanisch weefseldissociatieprotocol om ex vivo expressie van stress-geassocieerde genen¹⁶ te voorkomen en we hebben dit protocol in het eerste deel aangepast om ex vivo activering van stress-geassocieerde microglia-respons voorafgaand aan intracellulaire vGLUT1-kleuring te voorkomen. We gebruikten een enzymatisch weefseldissociatieprotocol in de tweede sectie voorafgaand aan de in vitro synaptosoomverzwelgingstest, rekening houdend met de hogere opbrengst van microglia na op papaïne gebaseerde weefseldissociatie (gegevens niet getoond). Microglia blijven onvermijdelijk op 37 ^°C onder kweekomstandigheden wanneer ze worden geïncubeerd met synaptosomen, en incubatie bij 37 ^°C kan inderdaad veranderingen in microglia veroorzaken als veel voorkomende nadelen van alle in-vitrotests en celkweekprocedures. Daarom stellen we voor om beide gepresenteerde protocollen parallel te gebruiken om tot een bredere conclusie te komen in termen van microgliale inslokking van synapsen.

Bovendien is het belangrijk om de poortstrategie voor het selecteren van CD11b⁺⁺/CD45⁺ microglia zorgvuldig te definiëren door rekening te houden met de aanwezigheid van andere immuuncellen in het hersenparenchym die deze markers ook tot expressie brengen³¹. Wat nog belangrijker is, is dat bij het kiezen van markers die specifiek gericht zijn op microglia (bijv. TMEM119, P2RY12), het belangrijk is om te bedenken dat ze veranderingen in hun expressieniveaus kunnen ondergaan tijdens pathologische en inflammatoire aandoeningen³², en dergelijke veranderingen moeten worden overwogen voordat het FACS-panel wordt opgericht om microgliale overspoeling van synapsen te kwantificeren. Ten slotte is het essentieel om te benadrukken dat geen van de eerder besproken methoden, inclusief de op IHC en microscopie gebaseerde in vivo benaderingen, alleen het actief en selectief snoeien van synapsen door microglia kan vastleggen. Deze methoden zijn niet in staat om het actieve snoeien door microglia te onderscheiden van het passief opruimen van synaptisch puin in het hersenparenchym. Daarom is het bij het evalueren en bespreken van de gegevens absoluut noodzakelijk om een duidelijk onderscheid te maken tussen deze verschillende concepten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Dounce Homogenizer	Active Motif	Cat# 40401
5 mL Tubes	Eppendorf	Cat# 0030119452
Anti-CD11b	ThermoFisher Scientific	Cat# 25-0112-82
Anti-CD45	BD	Cat# 559864
Anti-Ly6C	BD	Cat# 553104
Anti-Ly6G	BD	Cat# 551460
BCA Protein Assay Kit	Pierce	Cat# 23227
C-Tubes	Miltenyi Biotech	Cat# 130-096-334
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotech	Cat# 130-093-634
CD16/CD32 Antibody	Thermo Fisher Scientific	Cat#14-0161-82
Cytofix/Cytoperm Kit	BD	Cat# 554714
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	Cat# 41966029
Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline  (DPBS)	Gibco	Cat# 14190144
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Thermo Fisher Scientific	Cat# 08-771-23
fixable viability dye	Thermo Fisher Scientific	Cat# L34969
Hibernate A medium	ThermoFisher	Cat# A1247501
LS-columns	Miltenyi Biotech	Cat# 130-042-401
Papain Dissociation System	Worthington	Cat# LK003150
Percoll	Th.Geyer	Cat# 17-0891-02
Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	Cat# 11339283
pHrodoRed	Thermo Fisher Scientific	Cat# P36600
Protease inhibitor	Roche	Cat# 5892970001
Red Blood Cell Lysis Buffer	Sigma	Cat# 11814389001
Steritop E-GP Sterile Filtration System	Merck	Cat# SEGPT0038
SynPer Solution	ThermoFisher	Cat# 87793
vGLUT1 Antibody	Miltenyi Biotech	Cat# 130-120-764