Method Article

Kwantificering van de activiteit van het Yersinia pseudotuberculose type III secretiesysteem na ijzerhonger en anaërobe groei

DOI:

10.3791/66642

⸱

May 31st, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Environmental Toxicology, University of California, Santa Cruz

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriën koloniseren gastheerweefsels die variëren in biologische beschikbaarheid van zuurstof en ijzer, maar de meeste benaderingen voor het bestuderen van bacteriën gebruiken beluchte, rijke media. Dit protocol beschrijft het kweken van de menselijke ziekteverwekker Yersinia pseudotuberculose onder variërende ijzerconcentraties en zuurstofspanning, en het kwantificeren van de activiteit van het Yersinia type III secretiesysteem, dat een belangrijke virulentiefactor is.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een belangrijk virulentiemechanisme voor veel Gram-negatieve pathogenen is het type III secretiesysteem (T3SS), een naaldachtig aanhangsel dat cytotoxische of immunomodulerende effectoreiwitten in gastheercellen transloceert. De T3SS is een doelwit voor antimicrobiële ontdekkingscampagnes, omdat het extracellulair toegankelijk is en grotendeels afwezig is van niet-pathogene bacteriën. Recente studies hebben aangetoond dat de T3SS van Yersinia en Salmonella worden gereguleerd door factoren die reageren op ijzer en zuurstof, wat belangrijke niche-specifieke signalen zijn die worden aangetroffen tijdens infectie bij zoogdieren. Hier wordt een methode beschreven voor ijzeruithongering van Yersinia pseudotuberculosis, met daaropvolgende optionele suppletie van anorganisch ijzer. Om de impact van de beschikbaarheid van zuurstof te beoordelen, wordt dit ijzerhongeringsproces gedemonstreerd onder zowel aërobe als anaërobe omstandigheden. Ten slotte induceert het incuberen van de culturen bij de temperatuur van de zoogdiergastheer van 37 °C T3SS-expressie en maakt het mogelijk om de Yersinia T3SS-activiteit te kwantificeren door effectoreiwitten te visualiseren die vrijkomen in het supernatant. De hier beschreven stappen bieden een voordeel ten opzichte van het gebruik van ijzerchelatoren bij afwezigheid van ijzergebrek, wat onvoldoende is om robuuste ijzeruithongering te veroorzaken, vermoedelijk als gevolg van efficiënte Yersinia-ijzeropname - en opruimingssystemen. Evenzo is zuurspoelend laboratoriumglaswerk gedetailleerd om ervoor te zorgen dat achtergebleven ijzer wordt verwijderd, wat essentieel is voor het induceren van robuuste ijzerhonger. Bovendien wordt het gebruik van een chelaatvormer beschreven om achtergebleven ijzer uit media te verwijderen en het kweken van de bacteriën gedurende meerdere generaties in afwezigheid van ijzer om de bacteriële ijzervoorraden uit te putten. Door standaardprotocollen van door trichloorazijnzuur geïnduceerde eiwitprecipitatie, SDS-PAGE en zilverkleuring op te nemen, demonstreert deze procedure toegankelijke manieren om T3SS-activiteit te meten. Hoewel deze procedure is geoptimaliseerd voor Y. pseudotuberculosis, biedt het een kader voor onderzoek naar pathogenen met vergelijkbare robuuste ijzeropnamesystemen. In het tijdperk van antibioticaresistentie kunnen deze methoden worden uitgebreid om de werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen gericht tegen de T3SS te beoordelen onder gastheerrelevante omstandigheden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel klinisch relevante Gram-negatieve pathogenen zoals Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas en Shigella coderen voor het type III secretiesysteem (T3SS) om effectoreiwitten in gastheercellen te injecteren1. In veel bacteriesoorten staat de T3SS onder strikte regelgevende controle2. Translocatie van Yersinia T3SS-effectoreiwitten naar doelgastheercellen is bijvoorbeeld van cruciaal belang om de afweermechanismen van de gastheer te ondermijnen en bacteriële kolonisatie van gastheerweefsels mogelijk te maken. De activiteit van Yersinia T3SS is echter metabolisch belastend en kan herkenning door immuunreceptoren van de gastheer veroorzaken3. Dienovereenkomstig regelen regulatoren die specifieke omgevingssignalen waarnemen de expressie van T3SS-genen in veel bacteriesoorten. Aangezien pathogenen zoals Yersinia tijdens hun infectiecyclus veranderingen in de omgeving ervaren die van invloed zijn op de expressie van kritische virulentiefactoren, is het belangrijk om laboratoriumomstandigheden te ontwikkelen die opvallende kenmerken nabootsen van gastheerniches die worden bezet door bacteriële pathogenen. In het bijzonder verschillen zuurstofspanning en beschikbaarheid van ijzer tussen verschillende weefselplaatsen op een spatiotemporele manier en beïnvloeden ze de expressie van virulentiegenen zoals de T3SS 4,5,6. Daarom is het doel van deze methode om te beoordelen hoe zuurstof en ijzer de expressie van de Yersinia T3SS beïnvloeden. Dit zal inzicht geven in de dynamiek van de gastheer-pathogeen interactie.

De hier beschreven methode beschrijft hoe Yersinia pseudotuberculose aëroob en anaëroob kan worden gekweekt, en hoe Yersinia-ijzervoorraden kunnen worden uitgeput tijdens aërobe of anaërobe groei. Er zijn hier een paar belangrijke overwegingen met betrekking tot het succesvol kweken van bacteriën onder deze variabele omstandigheden. Ten eerste vereist anaërobe kweek extra glucosesuppletie, een wijziging die wordt vermeld in het mediarecept. Ten tweede, aangezien Y. pseudotuberculosis gebruik maakt van sideroforen en andere ijzeropnamesystemen die ijzer robuust uit de omgeving kunnen opruimen, wordt speciale aandacht besteed aan het waarborgen dat de kweekmedia en het laboratoriumglaswerk zo vrij mogelijk zijn van ijzer7. Eerdere studies hebben ijzerchelatoren zoals dipyridyl gebruikt om ijzer uit rijke bacterieculturen te halen om ijzerhonger na tebootsen 8,9. Het uitputten van de ijzervoorraden van Yersinia om ijzergebrek te veroorzaken, vereist echter de verwijdering van achtergebleven ijzer in glaswerk en media, evenals een langdurige groei in afwezigheid van ijzer. Dit protocol beschrijft hoe glaswerk en chelaatmedia met zuur moeten worden gewassen om achtergebleven ijzer te verwijderen, naast het kweken van de bacteriën gedurende meerdere generaties om een grondige ijzerhonger te garanderen. IJzerhonger kan worden gegarandeerd door relatieve transcriptieniveaus van goed gekarakteriseerde ijzerresponsieve genen onder verschillende omstandigheden te meten, zoals hier wordt aangetoond met yfeA en bfd.

Het hoogtepunt van dit protocol laat zien hoe uitgescheiden T3SS-effectoreiwitten van elk van deze aandoeningen kunnen worden neergeslagen door het kweeksupernatans te behandelen met trichloorazijnzuur (TCA) en uitgescheiden eiwitten te visualiseren via SDS-PAGE. Ten slotte wordt de relatieve T3SS-activiteit beoordeeld door uitgescheiden eiwitten te visualiseren via zilverkleuring en door relatieve niveaus van T3SS-effectoreiwitten te kwantificeren, ook wel Yersinia-buiteneiwitten (Yops)10 genoemd.

T3SS-activiteitstesten maken over het algemeen gebruik van specifieke antilichamen om T3SS-effectoreiwitniveaus in het kweeksupernatant te detecteren. Antilichamen tegen westerse blotting voor T3SS-effectoreiwitten zijn echter vaak niet in de handel verkrijgbaar. Daarom is er speciale aandacht besteed om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke visualisatie van T3SS-activiteit in deze methode geen specifieke antilichamen vereist, maar in plaats daarvan gebruik kan maken van zilverkleuring, waardoor alle uitgescheiden eiwitten kunnen worden gevisualiseerd. Hoewel deze methode specifiek op maat is gemaakt en geoptimaliseerd voor Y. pseudotuberculosis, kan deze worden aangepast aan andere bacteriesoorten, hoewel de exacte mediaomstandigheden en incubatietijden zullen variëren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De details van de reagentia, de samenstelling van de media, de primersequenties en de apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel. Figuur 1 illustreert de algemene experimentele workflow.

1. Bereiding van zuurgewassen glaswerk en gechelateerde M9-media

OPMERKING: Raadpleeg voordat u begint het hoofdstuk over materiaal voor de exacte reagentia en recepten die zullen worden gebruikt. M9-media werd voor het eerst gebruikt voor Yersinia T3SS-assays in Cheng et al.11.

  1. Giet 100 ml 6 N HCl in een glazen kolf van 250 ml.
    LET OP: HCl is uiterst gevaarlijk; Zorg ervoor dat de juiste voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het hanteren van deze stof.
  2. Sluit de opening van de glazen container af met een glazen stop en draai de kolf voorzichtig gedurende 1 minuut rond om de HCl grondig te verdelen, waarbij u af en toe van richting verandert.
  3. Gooi de 6 N HCl op de juiste manier weg.
  4. Spoel de glazen container door 100 ml gedeïoniseerde H2O toe te voegen, de mond af te sluiten, 20 s te schudden en vervolgens het water weg te gooien.
  5. Herhaal de spoelstap in totaal 3 keer.
  6. Laat aan de lucht drogen. Autoclaaf om te steriliseren.
  7. Om media te cheleren, mengt u M9-componenten samen met het chelaatvormeragens en roert u met een magnetische roerstaaf bij kamertemperatuur gedurende ~18 uur. Filter-steriliseer en voeg MgSO4 toe tot een eindconcentratie van 1 mM.

2. Kweken van Y. pseudotuberculose onder wisselende ijzergehaltes en zuurstofspanning

  1. Streep Y. pseudotuberculosis (stam IP2666pIB1 wordt in deze studie gebruikt) op Lysogeny Broth (LB) agarplaten en incubeer bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Incubatie van Yersinia bij 37 °C, met name in een medium met een laag calciumgehalte, leidt tot T3SS-activiteit, groeistop en selecteert uiteindelijk voor verlies van het plasmide voor Yersinia virulence (pYV) dat codeert voor de T3SS12. Daarom maakt dit protocol gebruik van 26 °C incubatie van Yersinia totdat de T3SS-activiteit moet worden gemeten.
  2. Na 48 uur, zodra er zichtbare kolonies zijn gevormd, inoculeer 4 ml M9-media met 0,2% glucose, 1 mg/L FeSO4,7 uur2O en aangevuld met casaminozuren (hier aangeduid als M9-media) uit een enkele, geïsoleerde kolonie en kweek 's nachts bij 26 °C met beluchting bij 250 rpm gedurende ongeveer 18 uur.
    NOTITIE: Gebruik met zuur gewassen glaswerk, te beginnen met de volgende stap en verder te gaan.
  3. Subcultuur in gechelateerde M9-media volgens de onderstaande stappen.
    OPMERKING: Voor alle volgende stappen wordt M9-media met 0,9% glucose gebruikt in plaats van de standaard 0,2% glucose.
    1. Meet met behulp van een spectrofotometer de optische dichtheid (OD600) van de nachtelijke cultuur.
    2. Verdun de nachtcultuur tot een OD600-waarde van 0,1 in een totaal van 14 ml steriel gechelateerd M9-medium met 0,9% glucose en geen FeSO4,7 uur2O in een zuurspoelfles van 250 ml zonder ijzersuppletie.
    3. Incubeer gedurende 8 uur bij 26 °C met beluchting bij 250 tpm.
  4. Subcultuur in aërobe en anaërobe culturen parallel.
    1. Meet de OD600 van de teeltculturen.
    2. Voor verdere aërobe incubatie worden de groeiculturen subgekweekt tot een OD600-waarde van 0,1 in 14 ml steriele gechelateerde M9-media met 0,9% glucose en geen FeSO4,7 uur2O in een zuurspoelbare kolf van 250 ml en gekweekt met beluchting bij 26 °C gedurende 12 uur zonder ijzersuppletie.
    3. Voor anaërobe kweek subcultuur tot een OD600-waarde van 0,1 in 14 ml steriel gechelateerd M9-medium in twee met zuur gewassen glazen buizen. Voeg in de eerste buis het met een filter gesteriliseerde (met 0,22 μm polyethersulfonmembraan) FeSO4,7 H2O toe voor een eindconcentratie van 1 mg/L (ook wel "hoog ijzergehalte" genoemd). Voeg in de tweede tube FeSO4.7H 2O toe voor een eindconcentratie van 0,01 mg/L (ook wel "laag ijzergehalte" genoemd). Dit kan worden gedaan door een 10 mg/ml FeSO 4.7H 2O bouillonoplossing te gebruiken. Incubeer beide buisjes anaeroob in een anaërobe kamer bij kamertemperatuur gedurende 12 uur.
      OPMERKING: 1 mg/L FeSO4,7 H2O biedt ijzerrijke omstandigheden voor een robuuste Yersinia-groei . Omgekeerd zorgt het toevoegen van slechts 0,01 mg/L FeSO4,7H 2O aan anaërobe culturen voor voldoende groei onder anaërobe omstandigheden, maar maakt het nog steeds ijzerhongerreacties mogelijk, terwijl aërobe culturen gedurende 12 uur worden gekweekt in afwezigheid van toegevoegd ijzer om ijzerhongerreacties te stimuleren voorafgaand aan stimulatie van T3SS-activiteit.
  5. Induceer activiteit van het type III secretiesysteem.
    1. Verplaats de anaërobe culturen naar 37 °C en ga door met de anaërobe incubatie gedurende 4 uur om de T3SS te induceren.
    2. Meet de OD600 van de aëroob groeiende cultuur.
    3. Subcultureer de aëroob groeiende culturen in twee met zuur gewassen kolven tot een OD600-waarde van 0,2 in 14 ml steriel gechelateerd M9-medium. Voeg in de eerste kolf het met filters gesteriliseerde FeSO4,7 H2O toe voor een eindconcentratie van 1 mg/L. Voeg in de tweede kolf FeSO4,7 H2O toe voor een eindconcentratie van 0,01 mg/L. Incubeer beide kolven met beluchting bij 26 °C bij 250 tpm gedurende 2 uur.
    4. Verschuif na 2 uur de aërobe culturen naar 37 °C met beluchting bij 250 tpm en incubeer gedurende 4 uur om de T3SS te induceren.

3. Trichloorazijnzuur (TCA) precipitatie van T3SS-effectoreiwitten

  1. Zodra de anaërobe incubatie is voltooid, meet u de OD600 van de culturen.
  2. Normaliseer alle anaërobe monsters om een gelijke celmassa te bereiken (zie het voorbeeld in tabel 1). Verwacht voor anaërobe teelt over het algemeen een OD600-waarde van ~0,5 in culturen met een ijzertekort en ~1 voor culturen met een ijzerrijke cultuur. Gebruik in dit geval 6 ml van de ijzerarme culturen en 3 ml van de ijzerrijke culturen.
    OPMERKING: De resterende cultuur kan voor andere doeleinden worden gebruikt, zoals het oogsten van totaal RNA en het gebruik van kwantitatieve PCR om steady-state niveaus van doel-mRNA te meten (hier niet beschreven).
  3. Breng de genormaliseerde volumes van elke cultuur over in buisjes van 15 ml.
  4. Om de efficiëntie van de uitgescheiden eiwitprecipitatie te controleren, voegt u 4 μl 0,5 mg/ml runderserumalbumine (BSA) toe aan elk buisje.
  5. Pelletculturen bij 3200 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  6. Sluit een PVDF-filter van 0,22 μm aan op een spuit van 10 ml en filtreer het bovenstaande van elke gepelleteerde cultuur in een nieuwe buis van 15 ml.
    OPMERKING: Deze filtratiestap minimaliseert de kans op overdracht van hele bacteriële cellen, wat zou resulteren in ongewenste cytoplasmatische eiwitten in het monster.
  7. Voeg 10% van het bovenstaande volume van 6,1 N TCA toe aan elk monster.
  8. Draai krachtig gedurende 1 min. Incubeer de buisjes 's nachts op ijs in een koude ruimte van 4 °C.
    OPMERKING: De duur van de incubatie kan worden geoptimaliseerd op basis van de behoefte. Slechts een incubatie van 1 uur kan werken voor aandoeningen of stammen waar de secretie robuust is.
  9. Herhaal de stappen voor het verzamelen van pellets en TCA-precipitatie met de aerobe culturen zodra de incubatie van 4 uur is voltooid.
    OPMERKING: Normaliseer de aërobe culturen door volumes te pelleteren met equivalente celmassa.
  10. Voeg 2 ml van elk monster toe aan een verse buis van 2 ml en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 21.000 x g bij 4 °C.
  11. Zuig het bovenstaande aan met behulp van een vacuümhulpstuk en zorg ervoor dat u de bodem of zijkanten van de buis niet aanraakt.
    OPMERKING: De pellet kan moeilijk te visualiseren zijn en kan over de lengte van de buis als een waas verschijnen.
  12. Herhaal stap 3.10 en 3.11 totdat alle inhoud van elke precipitatiereactie in een enkele buis van 2 ml is neergeslagen. Dit kan drie of vier opeenvolgende centrifugatiestappen duren, maar maakt de concentratie van alle uitgescheiden eiwitten van elk monster in een buis van 2 ml mogelijk.
  13. Om de pellets te wassen, voegt u voorzichtig 1 ml ijskoude 100% aceton toe aan elke tube. Om verlies van het monster te voorkomen, mag u de buis niet opnieuw suspenderen en niet aanraken.
  14. Centrifugeer de monsters bij 21.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  15. Zuig het bovenstaande op en zorg ervoor dat u de bodem of zijkanten van de buis niet aanraakt.
  16. Herhaal ijskoude aceton wasstappen 3.13 en 3.14.
  17. Nadat u het bovenstaande voor de laatste keer hebt opgezogen, opent u de buisjes en laat u de pellet ongeveer 1 uur volledig drogen op de bank.
  18. Voeg 50 μL FSB: DTT-oplossing toe aan elk gedroogd monster. Om eiwitverlies te voorkomen, niet resuspenderen.
  19. Draai elk monster gedurende 1 minuut grondig en zorg ervoor dat de FSB: DTT-oplossing de wanden van de hele buis bedekt. Dit kan worden geoptimaliseerd door gebruik te maken van een vortex-hulpstuk dat in staat is om meerdere buizen tegelijk vast te houden.
  20. Kook de monsters gedurende 15 minuten bij 95 °C.
  21. Centrifugeer de monsters kort gedurende 30 s op de maximale snelheid bij kamertemperatuur.
  22. Bewaren bij -80 °C tot toekomstig gebruik.

4. SDS-PAGE en zilverkleuring om T3SS-effectoreiwitten te visualiseren

  1. Laad 15 μL van elk anaëroob monster en 10 μL van elk aëroob monster in een 12,5% SDS-PAGE gel, samen met 3 μL van een in de handel verkrijgbare ongekleurde standaard als de ladder.
  2. Laat de gel ongeveer 90 minuten draaien op 100 V. Deze instellingen kunnen variëren, afhankelijk van het gebruikte apparaat.
  3. Volg het protocol voor het kleuren van zilver volgens de instructies van de fabrikant, wat resulteert in een gel, zoals weergegeven in afbeelding 2.

5. Kwantificeren van relatieve T3SS-activiteit

  1. Plaats de gel in het beeldvormingssysteem en zorg ervoor dat alle banden die bedoeld zijn voor kwantificering zich in het beeldkader bevinden.
    OPMERKING: Het molecuulgewicht van BSA is ~66 kDa, terwijl het molecuulgewicht van het T3SS-effectoreiwit YopE ~23 kE is.
  2. Selecteer in de software alle YopE-banden in alle putjes.
  3. Stel de YopE-referentieband in op de juiste sample.
  4. Exporteer de relatieve kwantificeringswaarden die door de software zijn berekend voor alle YopE-banden.
  5. Ga terug naar de software en selecteer alle BSA-banden in alle putjes.
  6. Stel de referentie BSA-band in om er zeker van te zijn dat deze afkomstig is van dezelfde steekproef als de referentie YopE-band.
  7. Exporteer de relatieve kwantificeringswaarden die door de software zijn berekend voor alle BSA-banden.
  8. Als u de relatieve YopE-expressieniveaus wilt berekenen, deelt u de waarde van de relatieve hoeveelheid YopE door de relatieve hoeveelheidswaarde van BSA voor elk monster.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode maakt het mogelijk om uitgescheiden Yops relatief te vergelijken onder verschillende omstandigheden ten opzichte van een referentieconditie van belang. De algemene experimentele workflow is weergegeven in figuur 1. Tabel 1 geeft een weergave van hoe normalisatie van de celcultuur doorgaans zou plaatsvinden in het geval van elke kweekconditie en het volume TCA dat aan elke supernatant zou worden toegevoegd. Hier worden representatieve resultaten getoond met behulp van wildtype (WT) Y. pseudotuberculose IP2666pIB1 en twee congene mutanten, ΔyscNU en ΔyopE. De ΔyopE-mutant wordt gebruikt als een controle zonder YopE, terwijl de ΔyscNU-mutant wordt gebruikt als een volledige T3SS-negatieve controle omdat deze niet in staat is om een functionele T3SS13,14 samen te stellen. Een representatief beeld van een met zilver bevlekte 12,5% SDS-PAGE-gel die de uitgescheiden eiwitten bevat, is afgebeeld in figuur 2. Zoals hierboven beschreven, bevatte elk monster BSA met spikes als controle voor de efficiëntie van eiwitneerslag. Bij het analyseren van de gegevens moeten anaërobe en aërobe datasets worden behandeld als onafhankelijke datasets, aangezien ze elk afzonderlijk zijn genormaliseerd. In de anaërobe monsters was ~38 keer meer YopE aanwezig in de monsters met een laag ijzergehalte in vergelijking met de monsters met een hoog ijzergehalte, in overeenstemming met eerdere resultaten15,16. In de aërobe monsters werd een vergelijkbare hoeveelheid uitgescheiden YopE waargenomen in monsters met een laag en een hoog ijzergehalte, in overeenstemming met eerdere resultaten16. Over het algemeen worden ten minste drie biologische replicaten van elke aandoening gebruikt om statistische significantie vast te stellen.

Om te bevestigen dat dit protocol leidt tot voldoende ijzerhonger, werd qPCR-analyse uitgevoerd op ijzerresponsieve genen yfeA en bfd in de wildtype-stam onder alle omstandigheden. YfeA is het periplasmatisch bindende eiwit van een ABC-transportsysteem dat verantwoordelijk is voor ijzertransport, terwijl Bfd een bacterioferritine-geassocieerde ferredoxine is die betrokken is bij de mobilisatie van ijzervoorraden 17,18,19,20. RNA werd geïsoleerd zoals eerder beschreven21, en zoals verwacht werden yfeA en bfd significant opgereguleerd in ijzerarme omstandigheden ten opzichte van ijzerrijke omstandigheden, zowel aëroob als anaeroob, zoals weergegeven in figuur 3. Bovendien kwantificeerden we yopE-mRNA steady-state niveaus met behulp van qPCR om te bevestigen dat de waargenomen resultaten voor relatieve YopE op eiwitniveau consistent waren met yopE-transcriptniveaus (zie figuur 3).

Ten slotte, aangezien bacteriën vatbaar zijn voor lysing in stressvolle kweekomstandigheden, was het belangrijk om aan te tonen dat de stappen in dit protocol niet resulteren in bacteriële lysis die de resultaten mogelijk zou kunnen verwarren. Om dit te bevestigen, werden TCA-geprecipiteerde supernatantmonsters onderworpen aan western blotting en onderzocht op YopE en RpoA, een subeenheid van RNA-polymerase en een cytoplasmatisch eiwit. Zoals te zien is in Figuur 4, was er geen bewijs van RpoA aanwezig in monstersupernatanten, wat suggereert dat er geen waarneembare lysis was die cytoplasmatisch RpoA in het supernatant zou afgeven.

figure-results-1
Figuur 1: Experimentele workflow voor het kweken van Yersinia pseudotuberculose onder wisselende beschikbaarheid van ijzer en zuurstof. Grafische weergave van de teeltstappen. Houd er rekening mee dat met zuur gewassen glaswerk vanaf dag 4 moet worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Resultaten van zilver gekleurd 12,5% SDS-PAGE gel van TCA-geprecipiteerd eiwit uit kweeksupernatanten. Geprecipiteerde cultuursupernatanten werden op een 12,5% SDS-PAGE-gel geladen en met zilver bevlekt. (A) Secretieprofiel van WT-, ΔyscNU- en ΔyopE-stammen die anaëroob zijn gekweekt. Representatieve relatieve waarden van YopE genormaliseerd naar het anaërobe WT-ijzerhoudende monster. (B) Secretieprofiel van aëroob gekweekte WT-, ΔyscNU- en ΔyopE-stammen . Representatieve relatieve waarden van YopE genormaliseerd naar het aërobe WT ijzer-replete monster. Witte pijlen geven YopE aan (~23 kDa). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Relatieve mRNA-niveaus van ijzerresponsieve genen tonen ijzergebrek aan. RNA werd geïsoleerd uit WT Y. pseudotuberculose gekweekt onder de omstandigheden beschreven in figuur 1. qPCR werd gebruikt om de relatieve expressie van yfeA-, bfd- en yopE-niveaus te meten, genormaliseerd naar 16S rRNA in anaërobe (AC) en aërobe (DF) omstandigheden. ****p < 0,0001 zoals bepaald door een ongepaarde t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Het ontbreken van cytoplasmatisch RpoA in bovenstaande monsters toont het gebrek aan cellyse in kweekomstandigheden aan. 5 μL geprecipiteerde supernatanten van (A) anaërobe en (B) aerobe monsters uit figuur 3 werden uitgevoerd op een 12,5% SDS-PAGE-gel samen met een pelletcontrole. Eiwitten werden overgebracht op een PVDF-membraan voor western blotting. Het membraan werd doorgesneden en de bovenste helft werd onderzocht op RpoA met behulp van een anti-RpoA-antilichaam, en de onderste helft werd onderzocht op YopE met behulp van een anti-YopE-antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

(EEN)
ANAËROOB
ConditieODTe verzamelen volume (ml)Volume van 6,1 N TCA toegevoegd aan Sup (ml)
WT Laag ijzer0.560.6
WT Hoog ijzer130.3
(B)
AËROOB
ConditieODTe verzamelen volume (ml)Volume van 6.1N TCA toegevoegd aan Sup (ml)
WT Laag ijzer0.960.6
WT Hoog ijzer1.43.8570.386

Tabel 1: Representatieve workflow voor het verzamelen van monsters. Op dag 5, (A) zodra de incubatie van 4 uur bij 37 °C voor de anaërobe monsters is voltooid, werd 6 ml van het monster met de laagste OD600-waarde verzameld en werd de rest van de monstervolumes dienovereenkomstig genormaliseerd. Na het filteren van de supernatant werd 6.1 N TCA toegevoegd. (B) Nadat de aërobe incubaties (2 uur bij 26 °C en 4 uur bij 37 °C) waren voltooid, werd 6 ml van het monster met de laagste OD600-waarde verzameld en werd de rest van de monstervolumes dienovereenkomstig genormaliseerd. Na het filteren van de supernatant werd 6.1 N TCA toegevoegd.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De T3SS is een belangrijke virulentiefactor in veel pathogene bacteriën; Daarom is het ontwikkelen van laboratoriumtechnieken om de regulatie ervan te bestuderen belangrijk voor het begrijpen van pathogenese en het ontwikkelen van potentiële therapieën1. IJzer en zuurstof staan bekend als belangrijke signalen van de gastheer die door bacteriële pathogenen worden gedetecteerd om de expressie van T3SS te reguleren5; daarom presenteert deze methode een strategie voor het kweken van Y. pseudotuberculosis onder anaërobe of aërobe omstandigheden, met ijzergebrek of -repletie, en laat zien hoe relatieve T3SS-activiteit onder deze verschillende omstandigheden kan worden gekwantificeerd door relatieve hoeveelheden uitgescheiden YopE T3SS-effectoreiwitniveaus te beoordelen.

Hoewel de workflow voor dit experiment relatief eenvoudig is, zijn er een paar punten die goed moeten worden overwogen om de resultaten te optimaliseren. Tijdens de TCA-gemedieerde eiwitprecipitatiestap is het belangrijk om te voorkomen dat de eiwitpellet wordt opgezogen, wat moeilijk te zien kan zijn. Het is van cruciaal belang om extra voorzorgsmaatregelen te nemen om te voorkomen dat de aspiratorpunt de wanden of de bodem van de buis raakt. Bovendien is het raadzaam om bij het omgaan met mutante stammen met een lager niveau van T3SS-activiteit een groter monster te verzamelen om te verwerken. Ten slotte, als de banen na de verwerking van het monster en de gelkleuring besmeurd lijken in plaats van duidelijke banden te produceren, kan dit te wijten zijn aan cellyse tijdens het kweken of aan de overdracht van hele bacteriën van de pellet naar de bovenstaande fractie. In dit geval moet het experiment worden herhaald en moet er meer aandacht aan worden besteed om te voorkomen dat de pellet wordt opgenomen bij het verwijderen van de supernatant. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol mogelijk niet gevoelig genoeg is om eiwitten te detecteren die in zeer lage hoeveelheden worden uitgescheiden, in welk geval mogelijk andere detectiemethoden moeten worden gebruikt. Omdat veel chelaatvormers andere tweewaardige kationen dan ijzer en magnesium uit de media verwijderen, kunnen andere tweewaardige kationen na chelatie weer aan de media worden toegevoegd om hun effect op de secretie te bepalen.

Een ander belangrijk punt om in overweging te nemen bij deze experimenten is de neiging van zouten in de M9-media om neer te slaan, wat resulteert in variabiliteit tussen experimentele batches. Om dit probleem te verhelpen, is het mogelijk om direct voor het kweken met filters gesteriliseerde MgSO4 aan de media toe te voegen.

Over het algemeen bieden deze methoden een robuust kader voor het kwantificeren van relatieve Yersinia T3SS-activiteit door eiwitniveaus te meten. Samen met parallelle benaderingen die gericht zijn op het beoordelen van T3SS-expressie, maken de hier gepresenteerde methoden een uitgebreid begrip mogelijk van de T3SS-dynamiek als reactie op gastheerrelevante omgevingssignalen. Dit protocol kan ook worden aangepast aan andere bacteriën die kunnen worden gekweekt in een gedefinieerd medium waar een ijzerbron kan worden weggelaten en voor toepassingen waarbij het meten van uitgescheiden eiwitten relevant is voor de wetenschappelijke vraag.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grafische afbeeldingen gemaakt met behulp van BioRender.com. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (www.NIH.gov) subsidie R01AI119082.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Luer-Lok Tip syringeBD301029
10x SDS Running Buffer Home made0.25 M Tris base, 1.92 M Glycine, 1% SDS in 1 L volume
12.5% SDS-Page GelHome made
15 mL culture tubesFalcon352059For initial overnight 
15 mL Falcon tubesFalcom352196For supernatant collection
250 mL culture flaskBelco251000250
500 mL Filter SystemCorning431097
6 N Hydrochloric acid solutionFisher Scientific7732185
AcetoneFisher ChemicalA949-44 L
Bio Rad ChemiDoc MP Imaging SystemBio RadModel Number: Universal Hood III
Borosilicate glass culture tubesFisherbrand14-961-34For anaerobic culturing
Chelex 100 ResinBio Rad142-1253
Chelex M9 +0.9% Glucose mediaHome made6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1% casamino acids, 0.9% dextrose, 0.0005% thiamine, 5 g/L Chelex 100 Resin. Stir media for 18 h at room temp, filter using 500 mL Corning filtration unit, then add MgSO4 for 1 mM MgSO4 final solution
Final Sample Buffer (FSB)Home made0.1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% glycerol, 0.2% of Bromophenol Blue
FSB:DTT solutionHome madeFSB+0.2M DTT
Image Lab SoftwareBio Radhttps://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8ZSoftware
Isotemp Heat BlockFisher Scientific88860021
LB Agar PlatesHome made10 g Tryptone, 5 g Yeast extract, 10 g NaCl, 15 g Agar in 1 L total volume. Autoclaved
M9+0.2% Glucose MediaHome made6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 1 mg/L FeSO47H2O, 1% casamino acids, 0.2% dextrose, 0.0005% thiamine 
Millex-GP PES 0.22um filter attachment for syringeMilliporeSLGPR33RSFor FeSO47H2O filtration
Millex-GV PVDF 0.22um filter attachment for syringeMilliporeSLGVR33RSFor supernatant filtration
Precision Plus Protein Unstained StandardBio Rad1610363
SDS-PAGE Gel ApparatusBio RadModel Number: Mini PROTEAN Tetra Cell
SilverXpress Silver Staining Kit InvitrogenLC6100
The BellyDancer ShakerIBI ScientificBDRAA1155
Trichloroacetic acid solution 6.1NSigma AldrichT0699
Vinyl Anaerobic ChamberCoy Lab Productshttps://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details
qPCR Primer sequences 
yfeA forward - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T
yfeA reverse - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A
bfd forward - ccagcatcagccccatacag
bfd reverse - tggcttgtcggatgcacttc
yopE forward - CCATAAACCGGTGGTGAC
yopE reverse - CTTGGCATTGAGTGATACTG

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems. Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Springer International Publishing. Bacterial Type III Protein Secretion Systems. 427, Springer International Publishing. Cham. (2020).
  3. Schubert, K. A., Xu, Y., Shao, F., Auerbuch, V. The Yersinia type III secretion system as a tool for studying cytosolic innate immune surveillance. Annu Rev Microbiol. 74, 221-245 (2020).
  4. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  5. Singhal, R., Shah, Y. M. Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine. J Biol Chem. 295 (30), 10493-10505 (2020).
  6. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  7. Rakin, A., Schneider, L., Podladchikova, O. Hunger for iron: the alternative siderophore iron scavenging systems in highly virulent Yersinia. Front Cell Infect Microbiol. 2, (2012).
  8. Lesic, B., Carniel, E. Horizontal Transfer of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis. J Bacteriol. 187 (10), 3352-3358 (2005).
  9. Green, E. R., et al. Fis is essential for Yersinia pseudotuberculosis virulence and protects against reactive oxygen species produced by phagocytic cells during infection. PLOS Pathog. 12 (9), e1005898(2016).
  10. Cornelis, G. R. The Yersinia Ysc-Yop "Type III" weaponry. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 742-753 (2002).
  11. Cheng, L. W., Anderson, D. M., Schneewind, O. Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica. Mol Microbiol. 24 (4), 757-765 (1997).
  12. Straley, S. C. The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae. Microbial Pathog. 10 (2), 87-91 (1991).
  13. Balada-Llasat, J. -M., Mecsas, J. Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system. PLoS Pathog. 2 (9), e86(2006).
  14. Adams, W., Morgan, J., Kwuan, L., Auerbuch, V. Yersinia pseudotuberculosis YopD mutants that genetically separate effector protein translocation from host membrane disruption: YopD central region promotes Yop translocation. Mol Microbiol. 96 (4), 764-778 (2015).
  15. Hooker-Romero, D., et al. Iron availability and oxygen tension regulate the Yersinia Ysc type III secretion system to enable disseminated infection. PLOS Pathog. 15 (12), e1008001(2019).
  16. Balderas, D., et al. Genome scale analysis reveals IscR directly and indirectly regulates virulence factor genes in pathogenic Yersinia. mBio. 12 (3), e00633-00721 (2021).
  17. Bearden, S. W., Perry, R. D. The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague. Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).
  18. Zhou, D., et al. Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis. FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).
  19. Wijerathne, H., et al. a new class of [2Fe-2S] protein that functions in bacterial iron homeostasis, requires a structural anion binding site. Biochemistry. 57 (38), 5533-5543 (2018).
  20. Bearden, S. W., Staggs, T. M., Perry, R. D. An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11. J Bacteriol. 180 (5), 1135-1147 (1998).
  21. Miller, H. K., et al. IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence. PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Type III SecretionYersinia PseudotuberculosisIron StarvationAnaerobic GrowthEffector Protein SecretionSDS PAGE AnalysisSilver StainingOxygen AvailabilityProtein PrecipitationBacterial Virulence

Related Articles