Methodenartikel

Alternatieve methoden voor de detectie van superoxide-anionvorming in bloedplaatjes

DOI:

10.3791/66647

⸱

29 maart 2024

 ,  ,  , 
1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vorming van superoxide-anionen is essentieel voor de stimulatie van bloedplaatjes en, indien ontregeld, van cruciaal belang voor trombotische aandoeningen. Hier presenteren we drie protocollen voor de selectieve detectie van superoxide-anionen en de studie van redox-afhankelijke bloedplaatjesregulatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn zeer onstabiele zuurstofbevattende moleculen. Hun chemische instabiliteit maakt ze extreem reactief en geeft ze het vermogen om te reageren met belangrijke biologische moleculen zoals eiwitten, nucleïnezuren en lipiden. Superoxide-anionen zijn belangrijke ROS die worden gegenereerd door de vermindering van moleculaire zuurstofreductie (d.w.z. acquisitie van één elektron). Ondanks hun aanvankelijke betrokkenheid uitsluitend bij veroudering, degeneratieve en pathogene processen, is hun deelname aan belangrijke fysiologische reacties onlangs duidelijk geworden. In het vasculaire systeem is aangetoond dat superoxide-anionen de differentiatie en functie van vasculaire gladde spiercellen, de proliferatie en migratie van vasculaire endotheelcellen bij angiogenese, de immuunrespons en de activering van bloedplaatjes bij hemostase moduleren. De rol van superoxide-anionen is vooral belangrijk bij de ontregeling van bloedplaatjes en de cardiovasculaire complicaties die gepaard gaan met een overvloed aan aandoeningen, waaronder kanker, infectie, ontsteking, diabetes en obesitas. Het is daarom uiterst relevant geworden in cardiovasculair onderzoek om de vorming van superoxide-anionen door menselijke bloedplaatjes effectief te kunnen meten, de redox-afhankelijke mechanismen te begrijpen die de balans tussen hemostase en trombose reguleren en, uiteindelijk, nieuwe farmacologische hulpmiddelen te identificeren voor de modulatie van bloedplaatjesreacties die leiden tot trombose en cardiovasculaire complicaties. Deze studie presenteert drie experimentele protocollen die met succes zijn aangenomen voor de detectie van superoxide-anionen in bloedplaatjes en de studie van de redox-afhankelijke mechanismen die hemostase en trombose reguleren: 1) op dihydroethidium (DHE) gebaseerde superoxide-anionendetectie door flowcytometrie; 2) Visualisatie en analyse van superoxide-anionen op basis van DHE door beeldvorming van enkele bloedplaatjes; en 3) kwantificering op basis van een spinsonde van de output van superoxide-anionen in bloedplaatjes door paramagnetische resonantie met elektronen (EPR).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het superoxide-anion (O2•-) is de meest functioneel relevante ROS die in bloedplaatjes wordt gegenereerd1. O2•- is het product van de reductie van moleculaire zuurstof en de voorloper van veel verschillende ROS 2. De dismutatie van O2•- leidt tot de vorming van waterstofperoxide (H2O2) via spontane reacties in waterige oplossing of reacties gekatalyseerd door superoxide dismutasen (SOD's3). Hoewel verschillende enzymatische bronnen zijn gesuggereerd (bijv. xanthine-oxidase4, lipoxygenase5, cyclo-oxygenase6 en stikstofmonoxidesynthase7), zijn mitochondriale ademhaling 8,9 en nicotinamide-adenine dinucleotide-fosfaatoxidasen (NOX's)10 de meest prominente bronnen van superoxide-anion in eukaryote cellen. Dit lijkt ook het geval te zijn bij bloedplaatjes, waar elektronenlekkage uit mitochondriale ademhaling11,12 en de enzymatische activiteit van NOX'en13,14 zijn beschreven als de belangrijkste bijdragen aan de output van superoxide-anionen.

Hoewel verschillende studies zich hebben gericht op de regulatie van bloedplaatjes door O2•-, is er geen consensus over de moleculaire mechanismen die hiervoor verantwoordelijk zijn. De modulatie van de activiteit van oppervlaktereceptoren via directe oxidatie en vorming van disulfidebindingen is voorgesteld voor verschillende bloedplaatjesreceptoren. De positieve regulatie van integrine αIIbβ3 door ROS via directe oxidatie van cysteïneresiduen is gesuggereerd 15,16,17. Evenzo, aangezien de reacties van bloedplaatjes op collageen afhankelijk zijn van disulfide-afhankelijke dimerisatie en de daaruit voortvloeiende dimerisatie van het glycoproteïne VI (GPVI)18, is versterking van receptoractiviteit door ROS-afhankelijke oxidatie voorgesteld19, hoewel niet volledig experimenteel bewezen. Ten slotte werd aangetoond dat ROS-geïnduceerde oxidatie van de sulfhydrylgroepen van glycoproteïne Ib (GPIb) de hechting van bloedplaatjes en de interactie tussen bloedplaatjes en leukocyten tijdens ontsteking bevordert20. Omgekeerd, als een mogelijk gevolg van verminderde oxidatie van de sulfhydrylgroep en receptoractivering, wordt de afstoting van het ectodomein van zowel GPVI als GPIb verminderd door de omstandigheden te verminderen21.

Er zijn ook werkingsmechanismen voorgesteld die onafhankelijk zijn van een directe oxidatie van receptoren op het oppervlak van bloedplaatjes. Van ROS, waaronder O2•-, is aangetoond dat het de collageenreceptor GPVI positief moduleert door de activiteit van het Src-homologiegebied 2-bevattende eiwit tyrosinefosfatase 2 (SHP-2) te verzwakken, dat de signaalcascade van deze receptor negatief reguleert22. Bovendien kan O2•- ONOO- (peroxynitriet) genereren door een snelle reactie met stikstofmonoxide (NO), dat normaal gesproken bloedplaatjes remt door het NO-gevoelige guanylylcyclase (NO-GC) en de generatie van de negatieve bloedplaatjesregulator cyclisch GMP (cGMP)23,24. De resulterende afname van het NO-gehalte kan leiden tot potentiëring van bloedplaatjes. Als alternatief is gesuggereerd dat de aanmaak van O2•- door NOX2 bijdraagt aan lipideperoxidatie en isoprostanvorming, wat essentieel is voor de activering en hechting van bloedplaatjes25. Ten slotte wordt mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) extracellulaire signaalgereguleerde kinase 5 (ERK5), een eiwitkinase voorgesteld als een redoxstresssensor in bloedplaatjes26, geactiveerd door O2•- en induceert een procoagulerend fenotype in bloedplaatjes (zoals geschat door op flowcytometrie gebaseerde meting van fosfatidylserine-externalisatie)27.

De ontregeling van O2•- en andere ROS-generatie in bloedplaatjes is in verband gebracht met de overdreven hemostatische respons die leidt tot trombotische cardiovasculaire complicaties geassocieerd met atherosclerose, diabetes mellitus, hypertensie, obesitas en kanker28,29. In deze pathologische omgevingen wordt de ROS-output van bloedplaatjes verhoogd, wat leidt tot een versterking van hun adhesieve en aggregatoire reacties. Naast het effect op de reacties van bloedplaatjes, kan de output van vrije radicalen van bloedplaatjes gevolgen hebben voor andere bloedcellen en vasculaire structuren, wat een slecht begrepen en onderbelicht gebied van cardiovasculaire gezondheid is30. Ondanks ons beperkte begrip van de moleculaire mechanismen die oxidatieve stress koppelen aan trombotische aandoeningen, heeft de klinische relevantie van antioxidanten voor de bescherming tegen hart- en vaatziekten veel aandacht gekregen. Van plasma-antioxidantniveaus is aangetoond dat ze omgekeerd correleren met het risico op het ontwikkelen van cardiovasculaire aandoeningen, en het is aangetoond dat de consumptie van antioxidanten via de voeding beschermt tegen coronaire hartziekte31,32. Daarom is het gebruik van antioxidanten in de voeding bepleit als een veelbelovende aanpak voor de preventie van hart- en vaatziekten 33,34,35. Onder de effecten van ROS-generatie in bloedplaatjes kan de toename van apoptose belangrijke pathofysiologische effecten hebben 36,37. Over het algemeen worden betrouwbare protocollen voor het detecteren en kwantificeren van de O2•- output door bloedplaatjes steeds relevanter in cardiovasculair onderzoek.

Momenteel hebben de beschikbare technieken voor de detectie van ROS belangrijke beperkingen op het gebied van specificiteit (d.w.z. de chemische aard van de gedetecteerde oxidantmoleculen is onbekend) en betrouwbaarheid (d.w.z. de ongewenste interactie met biologische moleculen en experimentele reagentia leidt tot vertekende niet-fysiologische resultaten)38,39. De meest gebruikte benadering voor de detectie van ROS in bloedplaatjes is gebaseerd op het gebruik van dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFDA), dat wordt omgezet in dichloordihydrofluoresceïne (DCFH) door intracellulaire esterasen en vervolgens in het sterk fluorescerende dichloorfluoresceïne (DCF) door cellulaire oxidanten, waaronder hydroxylradicalen en peroxidase-H2O2-tussenproducten 40,41. Ondanks het brede gebruik ervan zijn er ernstige vragen gerezen over de betrouwbaarheid van deze benadering voor de meting van intracellulair ROS38. De oxidatie van DCFH naar DCF kan in feite worden geïnduceerd door overgangsmetaalionen (bijv. Fe2+) of heembevattende enzymen (bijv. cytochromen) in plaats van ROS42. Bovendien wordt DCFDA door celperoxidasen omgezet in zijn semichinonvorm van vrije radicalen (DCF•-), die op zijn beurt wordt geoxideerd tot DCF door reactie met moleculaire zuurstof (O2) met de afgifte van O2•-, wat leidt tot de kunstmatige versterking van oxidatieve reacties 41,43,44. Daarom is de detectie van intracellulaire ROS door DCFDA nuttig voor het verkrijgen van eerste inzichten, maar vereist voorzichtige overweging en uitgebreide experimentele controles38,39.

Deze studie presenteert drie alternatieve technieken voor de detectie en meting van de belangrijkste regulator van de bloedplaatjesfunctie O2•-1. De eerste techniek is de detectie met behulp van DHE en flowcytometrie, die voordelen biedt van betrouwbaarheid en specificiteit ten opzichte van DCFDA. De tweede techniek die hier wordt voorgesteld, maakt ook gebruik van DHE, maar de detectiemethode is live-bloedplaatjesfluorescentiebeeldvorming, die de studie van de generatie van O2•- bij bloedplaatjessignalering mogelijk maakt met snelle kinetiek en resolutie van één cel. Ten slotte biedt een protocol gebaseerd op het gebruik van de hydroxylamine-spinsonde 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) in EPR-resonantie-experimenten de mogelijkheid om de snelheid van O2•- generatie door bloedplaatjes te kwantificeren en onder verschillende omstandigheden te vergelijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De inzameling van perifeer bloed van instemmende vrijwilligers wordt goedgekeurd door de lokale ethische commissie en de National Health Service Health Research Authority (REC-referentie: 21/SC/0215; IRAS-ID: 283854).

1. Methode 1: Detectie van superoxide-anionen met behulp van DHE door middel van flowcytometrie

  1. Verwarm (37 °C) natriumcitraatoplossing (4% m/v) voor en gebruik het als antistollingsmiddel door het direct aan het bloed toe te voegen op het moment van venapunctie in een verhouding van 1:7 (0,5% w/v definitief).
  2. Neem perifeer menselijk bloed af van gezonde vrijwilligers door middel van mediane cubitale veneuze venapunctie.
  3. Verkrijg bloedplaatjesrijk plasma (PRP) uit volbloed door een eerste centrifugatiestap bij 200 x g gedurende 20 minuten.
  4. Centrifugeer PRP bij 500 x g gedurende 10 minuten met de omkeerbare bloedplaatjesremmers indomethacine (10 μM) en PGE1 (40 ng/ml).
  5. Resuspendeer de resulterende bloedplaatjespellet in de buffer van gemodificeerde tyrode (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), 1 mM MgCl2, 5 mM glucose, pH 7,3) (37 °C) met een dichtheid van 2 x 108 bloedplaatjes/ml.
  6. Laat de bloedplaatjes na isolatie 30 minuten rusten bij 37 °C.
  7. Bereid DHE in dimethylsulfoxide (DMSO) in een bouillonconcentratie van 5 mM.
  8. Voeg DHE toe aan de bloedplaatjessuspensie in een eindconcentratie van 5 μM (verdun de standaardoplossing 1 tot 1.000, met een eind-DMSO-concentratie van 0,1% v/v) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
  9. Behandel bloedplaatjes met farmacologische middelen en/of ROS-aaseters gedurende 15 minuten vóór stimulatie met de gewenste fysiologische stimuli en concentraties (bijv. 0,1 eenheid/ml trombine of 3 μg/ml collageen).
  10. Verdun na stimulatie de bloedplaatjessuspensies 1 tot 10 in ijskoud gemodificeerde HEPES-buffer.
  11. Stel voor de flowcytometrie de zijverstrooiing (SSC) en voorwaartse verstrooiing (FSC) versterking in op respectievelijk 40 mV en 220 mV en gebruik logaritmische schaalspreidingsdiagrammen om de deeltjespopulatie in de suspensie te visualiseren (voorbeeld in figuur 1A).
  12. (OPTIONEEL) Immunokleuring van één aliquot bloedplaatjessuspensie met behulp van een anti-CD41-antilichaam om de populatie van voorvallen te identificeren die overeenkomen met bloedplaatjes (voorbeeld in figuur 1B).
  13. Analyseer monsters door middel van flowcytometrie met behulp van excitatie bij 405 nm (violette laser) en emissie bij een golflengte van 580 nm, waarbij selectief het superoxide-anionspecifieke product 2-hydroxy-ethidium (2OH-Et+) wordt gedetecteerd (Figuur 2).
    OPMERKING: Fixatie met paraformaldehyde en langdurige opslag van monsters zijn niet aan te raden.

2. Methode 2: Detectie van superoxide-anionen met behulp van DHE door middel van fluorescentiebeeldvorming met enkelvoudige bloedplaatjes

  1. Smeer op de dag van het experiment een μ-glaasje met 8 putjes in met 0,1 mg/ml fibrillair collageen I van paardenpezen (Horm collageen), 0,2 mg/ml fibrinogeen of 1 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in de buffer van gemodificeerde tyrode gedurende 2 uur bij 37 °C.
  2. Was twee keer met gemodificeerde Tyrode's buffer (elk 10 minuten).
  3. Blus niet-specifieke adhesie door incubatie in gemodificeerde Tyrode's buffer plus 5 mg/ml runderserumalbumine (BSA) gedurende minimaal 30 minuten (of tot het experiment).
  4. Verwarm (37 °C) natriumcitraatoplossing (4% m/v) voor en gebruik het als antistollingsmiddel door het direct aan het bloed toe te voegen op het moment van venapunctie in een verhouding van 1:7 (0,5% w/v definitief).
  5. Neem perifeer menselijk bloed af van gezonde vrijwilligers door middel van mediane cubitale veneuze venapunctie.
  6. Verkrijg bloedplaatjesrijk plasma (PRP) uit volbloed door een eerste centrifugatiestap bij 200 x g gedurende 20 minuten.
  7. Centrifugeer PRP bij 500 x g gedurende 10 minuten met de omkeerbare bloedplaatjesremmers indomethacine (10 μM) en PGE1 (40 ng/ml).
  8. Resuspendeer de resulterende bloedplaatjespellet in de buffer van gemodificeerde tyrode (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glucose, pH 7,3) (37 °C) met een dichtheid van 4 x 107 bloedplaatjes/ml.
  9. Laat de bloedplaatjes na isolatie 30 minuten rusten bij 37 °C.
  10. Bereid DHE voor in dimethylsulfoxide (DMSO) in een bouillonconcentratie van 10 mM.
  11. Voeg DHE in een eindconcentratie van 10 μM toe aan de bloedplaatjessuspensie (verdun de stockoplossing 1 tot 1.000, met de uiteindelijke DMSO-concentratie 0,1% v/v) en incubeer gedurende 1 minuut (37 °C).
  12. Verwijder na de incubatie van 1 minuut met DHE de blokkerende oplossing uit de gekozen putjes, plaats het μ-glaasje op de microscooptafel klaar voor beeldvorming en doseer voorzichtig de bloedplaatjes.
  13. Bewaak DHE-conversie naar 2OH-Et+ door omgekeerde confocale beeldvorming gedurende 10 minuten (405/580 nm ex/em), waarbij beelden elke 10 s worden verzameld met een 40x olie-immersielens.
  14. (OPTIONEEL) Voor putjes die zijn gecoat met PLL, controleert u de superoxide-aniongeneratie als reactie op een oplosbare agonist (bijv. 0,1 eenheid/ml trombine of 3 μg/ml collageen) door de agonist 10 minuten na de afgifte van bloedplaatjes en het verzamelen van fluorescentiebeelden gedurende nog eens 10 minuten toe te voegen, zoals beschreven in stap 2.13.
  15. (OPTIONEEL) Voeg indien nodig superoxide-anionenvangers of selectieve remmers (bijv. NOX-remmer) toe door deze gedurende het tijdsverloop voorzichtig aan de zijkant van de put te doseren en verzamel fluorescentiebeelden zoals beschreven in 2.13 gedurende nog eens 10 minuten.
  16. Kwantificeer eencellige fluorescentieanalyse door het interessegebied (ROI) te selecteren dat representatieve enkelvoudige bloedplaatjes bevat en de fluorescentie-intensiteit in verschillende frames te analyseren met de meettool van de beeldvormingssuite ImageJ 1.53t.

3. Methode 3: Detectie van superoxide-anionen door bloedplaatjes met behulp van elektronenparamagnetische resonantie (EPR)

  1. Verwarm (37 °C) natriumcitraatoplossing (4% m/v) voor en gebruik het als antistollingsmiddel door het direct aan het bloed toe te voegen op het moment van venapunctie in een verhouding van 1:7 (0,5% w/v definitief).
  2. Neem perifeer menselijk bloed af van gezonde vrijwilligers door middel van mediane cubitale veneuze venapunctie.
  3. Verkrijg bloedplaatjesrijk plasma (PRP) uit volbloed door een eerste centrifugatiestap bij 200 x g gedurende 20 minuten.
  4. Centrifugeer PRP bij 500 x g gedurende 10 minuten met de omkeerbare bloedplaatjesremmers indomethacine (10 μM) en PGE1 (40 ng/ml).
  5. Resuspendeer de resulterende bloedplaatjespellet in de buffer van gemodificeerde tyrode (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glucose, pH 7,3) (37 °C) met een dichtheid van 2 x 108 bloedplaatjes/ml.
  6. Laat de bloedplaatjes na isolatie 30 minuten rusten bij 37 °C.
  7. Voeg 5 μM diethyldithiocarbamaat (DETC) en 25 μM deferoxamine toe aan de bloedplaatjessuspensie.
  8. Voeg zonder incubatie 200 μM 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) toe.
  9. Laad monsters op de aggregometer in aggregatiecuvetten (inclusief met teflon beklede roermagneten).
  10. Voeg na 1 minuut de stimuli toe in de gewenste concentratie (bijv. 1 eenheid/ml trombine of 3 μg/ml collageen). Incubeer gedurende 10 min.
  11. (OPTIONEEL) Verkrijg superoxide-aniongeneratie op verschillende tijdstippen door op het gewenste tijdstip door te gaan naar stap 3.12.
  12. Breng de bloedplaatjessuspensie over van de aggregatiecuvet naar een microcentrifugebuis en draai snel naar beneden bij 6.000 x g gedurende 10 s.
  13. Laad 50 μl van het supernatans in capillaire micropipetten en sluit af met EPR-zegellak.
  14. Breng monsters over naar de EPR-scanner.
  15. Stel de EPR-scanner als volgt in: middenveld 3.492,5 G, veldbereik 60 G, modulatie-amplitude 2 G, veegtijd 10 s, aantal scans 10, microgolffrequentie 9.39 GHz, microgolfvermogen 20 mW, conversietijd 327.68 ms, tijdconstante 5242.88 ms.
  16. Schat de CMH-oxidatie tot CM● als het gebied onder de curve (AUC) van de EPR-pieken geregistreerd met behulp van de bovenstaande parameters.
  17. Bouw een kalibratiecurve waarin de EPR-intensiteit wordt uitgezet die is gemeten zoals beschreven in stap 3.16 op de y-as en de concentraties van de in de handel verkrijgbare CM● op de x-as (bijv. 0, 0,3, 1, 3, 10 en 30 μM).
  18. Verkrijg uit de CM● -concentratie in de monsters de hoeveelheid superoxide-anion die door de bloedplaatjes in de monsters wordt gegenereerd met behulp van de formules die worden beschreven in de sectie Representatieve resultaten.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor flowcytometriedetectie van DHE-fluorescentie tonen we representatieve resultaten voor bloedplaatjes die in rust zijn (Figuur 3A) of gestimuleerd zijn met 0,1 eenheid/ml trombine (Figuur 3B). De O2•- output werd gekwantificeerd als de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van bloedplaatjes (MFI), zoals weergegeven voor stimulatie met 0,1 eenheid/ml trombine (Figuur 3C) of 3 μg/ml collageengerelateerd peptide (CRP) (Figuur 3D). Een twee-/drievoudige toename van DHE-kleuring werd waargenomen als gevolg van stimulatie van bloedplaatjes. Om te bevestigen dat O2•- wordt gemeten, stellen we het gebruik van de celdoorlatende O2•- scavenger gepegyleerde-superoxide dismutase (PEG-SOD, 100 eenheden/ml) voor, terwijl we om de bron van O2•- te identificeren de NOX-remmer VAS2870 (10 μM) hebben gebruikt. Voor zowel collageen als trombine hebben PEG-SOD en VAS2870 de toename van DHE-fluorescentie veroorzaakt door activering van bloedplaatjes opgeheven, wat bevestigt dat de meting specifiek is voor O2•- en dat hun bronnen in deze omstandigheden NOX-enzymen zijn.

Voor beeldvormende detectie van DHE-fluorescentie presenteren we gegevens van experimenten die de aanmaak van O2•- beoordelen op het moment van hechting aan collageen of fibrinogeen (en de volgende 10 minuten) (Figuur 4A) of van experimenten die gericht zijn op het beoordelen van de O2•- generatie van bloedplaatjes die eerder aan PLL zijn gehecht bij stimulatie met trombine (Figuur 4B). Zoals verwacht leidt hechting aan PLL niet tot een robuuste productie van O2•-. Hoogstwaarschijnlijk omdat deze vorm van adhesie afhankelijk is van elektrostatische interactie zonder het initiëren van enige signaalrespons45, wat deze benadering geschikt maakt om de O2•- output te meten als reactie op de toevoeging van oplosbare agonisten. Om te bevestigen dat dit protocol de detectie van O2•- mogelijk maakt, kunnen aaseters of selectieve remmers worden gebruikt. In eerdere studies hebben we aangetoond dat N-acetyl-cysteïne (NAC) O2•- kan opruimen en de fluorescentie van bloedplaatjes kan opheffen in deze experimenten46. Hier laten we zien dat de selectieve NOX-remmer de fluorescentie effectief en onmiddellijk VAS2870 verminderen in bloedplaatjes die zich hechten aan collageen of fibrinogeen (Figuur 4A) of reageren op trombine (Figuur 4B). Dit suggereert dat NOX's de bron zijn van O2•- in deze experimentele omstandigheden. Representatieve films voor DHE-fluorescentie (405 nm excitatie) als reactie op hechting aan collageen of fibrinogeen of de stimulatie door trombine van bloedplaatjes die aan PLL hechten, zijn opgenomen als respectievelijk aanvullend bestand 1, aanvullend bestand 2 en aanvullend bestand 3. Merk op dat PEG-SOD, dat met succes is gebruikt in andere experimentele opstellingen als een O2•- aaseter is, niet effectief is in dit soort experimenten. Daar hebben we op dit moment geen duidelijke verklaring voor. We kunnen veronderstellen dat PEG-SOD de cellulaire compartimenten bereikt waarin O2•- verhoogde fluorescentie induceert in de op beeldvorming gebaseerde assays, hetzij met een slechte efficiëntie of een trage kinetiek. Verder gericht onderzoek kan nodig zijn om dit punt op te helderen.

De meting van O2•- door EPR in bloedplaatjes hebben we toegepast in verschillende eerder gepubliceerde studies 1,13,47,48,49,50. Een cruciale stap voor deze techniek is het opstellen van een kalibratiecurve met behulp van in de handel verkrijgbare CM● (d.w.z. het product van de reactie tussen de spinsonde CMH en O2•- en de resonantiespecies gemeten met EPR). De reactie van CMH en O2•- wordt weergegeven in figuur 5A, en representatieve voorbeelden van het EPR-signaal dat wordt geïnduceerd door verschillende concentraties CM● worden weergegeven in figuur 5B. De gegevens van verschillende CM●-concentraties werden gebruikt om een kalibratiecurve op te stellen die de lineaire correlatie beschrijft tussen de hoeveelheid geoxideerd CMH en de EPR-signaalintensiteit in monsters (Figuur 5C). De onderstaande vergelijking beschrijft de correlatie tussen CM●-concentratie en EPR-signaalintensiteit en is het uitgangspunt voor de berekening van de kalibratiecurve voor de experimenten in deze studie (vergelijking 1):

figure-results-1

Aangezien zowel de CM● -concentraties als de bijbehorende EPR-intensiteit experimenteel zijn verkregen, kunnen de helling en het snijpunt van de Y-as van de kalibratiecurve worden berekend. In het voorbeeld in figuur 5C is Helling = 1.002.169 en Intercept = 596.383. Daarom kan de vergelijking voor de kalibratiecurve worden herschreven als:

figure-results-2

Door de bovenstaande vergelijking te herschikken, is het mogelijk om de CM● -concentratie voor verschillende monsters te berekenen op basis van hun EPR-intensiteitswaarden (vergelijking 2):

figure-results-3

Zodra de concentratie van CM● in de monsters bekend is, is het mogelijk om de generatiesnelheid per bloedplaatje en tijdseenheid te berekenen met de onderstaande vergelijking (vergelijking 3):

figure-results-4

Met behulp van vergelijking 2 kan vergelijking 3 worden herschreven als (vergelijking 4):

figure-results-5

Die in het voorbeeld in figuur 5C kan worden herschreven als:

figure-results-6

De CMH-oxidatiesnelheid wordt uitgedrukt als attomol CM● gegenereerd per bloedplaatje per minuut. Deze waarde kan worden gebruikt om de O2•- generatiesnelheid tussen experimenten en donoren te vergelijken, wat niet mogelijk is met fluorescentiesondes zoals DHE (of DCFDA). Fluorescentiesondes maken over het algemeen alleen een schatting mogelijk van het effect van verschillende omstandigheden op de O2•- generatie als veranderingen in fluorescentie-intensiteit binnen hetzelfde experiment. Zoals voor alle technieken die in dit artikel worden beschreven, werd de specificiteit van de detectie bevestigd met ROS-aaseters (bijv. PEG-SOD, NAC) of selectieve remmers van enzymen die superoxide-anionen genereren (bijv. VAS2870 om NOX's te remmen). Hier presenteren we gegevens voor stimulatie van bloedplaatjes (Figuur 6) met trombine (Figuur 6A,C,E) of collageen (Figuur 6B,D,F). Voor beide agonisten werd PEG-SOD gebruikt om te bevestigen dat O2•- wordt gedetecteerd, terwijl het ontbreken van effect voor gepegyleerd-catalase (PEG-Cat.) suggereert dat waterstofperoxide niet wordt gedetecteerd door deze techniek (respectievelijk figuur 6C,D). VAS2870 schaft trombine- (Figuur 6E) en collageen-geïnduceerde (Figuur 6F) EPR-signalen af, wat suggereert dat NOX's de belangrijkste bron zijn van bloedplaatjes O2•- als reactie op beide agonisten.

figure-results-7
Figuur 1: flowcytometrie-analyse van bloedplaatjessuspensies. (A) Typische presentatie van voorwaartse (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) grafieken voor geïsoleerde bloedplaatjes. (B) De immunokleuring van de bloedplaatjessuspensie met een anti-CD41-antilichaam bevestigt >98% van de deeltjes in het preparaat als bloedplaatjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 2: Chemische reactie van DHE met superoxide-anion en andere ROS- en spectrale eigenschappen van zijn producten. Structuur en spectrale eigenschappen van DHE en zijn twee oxidatieproducten 2-hydroxy-ethidium (2OH-Et+), gegenereerd door reactie met superoxide-anionen, en ethidium (Et+), gegenereerd door reactie met andere soorten ROS (bijv. hydroxylradicaal en waterstofperoxide). De excitatiepiek bij 405 nm, gemarkeerd door een blauwe stippellijn in de figuur, is specifiek voor 2OH-Et+ en kan daarom worden gebruikt om O2•- te detecteren/meten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 3: Trombine- en collageenafhankelijke superoxide-aniongeneratie gedetecteerd door DHE en flowcytometrie. Representatieve histogrammen voor DHE-kleuring van (A) rustende en (B) trombine-gestimuleerde bloedplaatjes. De balk geeft DHE-kleuringswaarden onder de 500 aan, wat neerkomt op 70,7% en 16,1% voor respectievelijk door rust en trombine gestimuleerde bloedplaatjes. Deze techniek werd gebruikt om de vorming van superoxide-anionen te schatten in (C) 0,1 eenheid/ml trombine en (D) 3 μg/ml collageengestimuleerde bloedplaatjes. PEG-SOD (100 eenheden/ml) werd gebruikt om te bevestigen dat superoxide-anionen in dit experiment worden gemeten, terwijl 10 μM VAS2870 werd gebruikt om NOX-enzymen te identificeren als de bron van superoxide-anionen. Elk datapunt werd berekend als gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van 50.000 bloedplaatjes, en elk experiment werd vijf onafhankelijke keren herhaald (n = 5), waarbij de gemiddelde ± SEM in de grafieken werd weergegeven. De statistische significantie werd beoordeeld door eenrichtings-ANOVA met Tukey post-test voor paarsgewijze vergelijkingen (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 4: Collageen-, fibrinogeen- en trombine-afhankelijke superoxide-aniongeneratie gedetecteerd door DHE-fluorescentiebeeldvorming. (A) De kinetiek van de superoxide-aniongeneratie werd beoordeeld op bloedplaatjes die zich hechten aan collageen of fibrinogeen. Bloedplaatjes werden 1 minuut na het begin van de beeldvorming gedoseerd op gecoate μ-glaasjes, terwijl 5 minuten na het begin van de beeldverzameling 10 μM VAS2870 werd toegevoegd. (B) Kinetiek voor het genereren van superoxide-anionen voor bloedplaatjes bij stimulatie met trombine. Bloedplaatjes mochten zich 10 minuten voor het begin van de beeldverzameling hechten aan PLL-gecoate μ-glaasjes. Na 2 minuten werd 0,1 eenheid/ml trombine toegevoegd en na nog eens 5 minuten werd 10 μM VAS2870 toegevoegd (d.w.z. 7 minuten vanaf het begin van de beeldvorming). Het experimentele schema wordt bovenaan de panelen gepresenteerd, terwijl in het midden van de panelen representatieve beelden van 0 min, 1 min, 3 min, 6 min en 9 min worden getoond. Kwantificering van DHE-fluorescentie met enkele bloedplaatjes wordt weergegeven aan de onderkant van de panelen en werd verkregen door fluorescentie-intensiteitsanalyse met behulp van ImageJ. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM van 8-12 bloedplaatjes per aandoening in 4 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-11
Figuur 5: Kalibratiecurve en berekeningen van de CMH-oxidatiesnelheid. (A) Chemische structuur en EPR-eigenschappen van CMH en CM●. (B) Representatieve voorbeelden van EPR-gegevens voor verschillende concentraties van CM● (100 nM tot 10 μM). (C) Kalibratiecurve van EPR-intensiteit versus CM● -concentratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-12
Figuur 6: Detectie van de productie van superoxide-anionen door bloedplaatjes bij stimulatie van trombine of collageen. De output van superoxide-anionen werd gemeten door EPR met de spinsonde CMH in bloedplaatjes gestimuleerd met ofwel (A) 0,1 eenheid/ml trombine of (B) 3 μg/ml collageen. (C, D) Een concentratie van 100 eenheden/ml van de superoxide-anionenvanger PEG-SOD of 100 eenheden/ml van de waterstofperoxide-scavenger gepegyleerd catalase (PEG-Cat.) werd opgenomen in de geteste omstandigheden voor beide agonisten. De bron van superoxide-anion werd onderzocht door co-incubatie met de NOX-remmer VAS2870 (10 μM). Zowel (E) trombine als (F) collageen zijn afhankelijk van NOX-activiteit voor de aanmaak van superoxide-anion. In de hele figuur werd de reactiesnelheid van CMH/superoxide-anionen berekend op basis van de EPR-sporen, zoals beschreven in het manuscript (vergelijking 4). De gegevens zijn gemiddeld ± SEM van 5 (C,D) en 4 onafhankelijke experimenten (E,F). De statistische significantie werd beoordeeld door eenrichtings-ANOVA met Tukey post-test voor paarsgewijze vergelijkingen (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: Representatieve film voor DHE-fluorescentie (405 nm excitatie) als reactie op hechting aan collageen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Representatieve film voor DHE-fluorescentie (405 nm excitatie) als reactie op adhesiefibrinogeen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Representatieve film voor DHE-fluorescentie (excitatie van 405 nm) als reactie op de stimulatie door trombine van bloedplaatjes die aan PLL hechten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit manuscript presenteren we drie verschillende technieken met het potentieel om de mogelijkheid te vergroten om de redox-afhankelijke regulatie van de bloedplaatjesfunctie te onderzoeken via de selectieve detectie van O2•-. De eerste twee methoden zijn een verbetering ten opzichte van bestaande technieken vanwege de gebruikte redox-sonde (DHE in plaats van de meer gebruikelijke maar minder betrouwbare DCFDA). Deze technieken zijn daarom gemakkelijk toegankelijk en de meeste laboratoria kunnen ze effectief toepassen zonder specifieke apparatuur of trainingskosten. De derde techniek is gebaseerd op het gebruik van gespecialiseerde apparatuur voor de analyse van de oxidatie van de spinsonde CMH door EPR. Deze techniek vereist de aanschaf van gespecialiseerde apparatuur en reagentia en de toegewijde training van de laboratoriumgebruiker. Daarom lijkt het geschikt voor laboratoria die zich specifiek richten op de studie van redox-afhankelijke gebeurtenissen in bloedplaatjes (of andere cellen).

Voor technieken die gebruik maken van DHE is de selectie van de golflengte voor de excitatie cruciaal om de specifieke detectie van O2•- te verkrijgen. 2-hydroxy-ethidium (2OH-Et+) gegenereerd door de reactie van DHE met O2•- wordt geëxciteerd bij 405 nm, terwijl ethidium (Et+) gegenereerd door de algemene reactie van DHE met ROS (bijv. hydroxylradicaal en waterstofperoxide) een excitatiepiek heeft rond 520 nm maar geen excitatie bij 405 nm (Figuur 1)51. Het gebruik van DHE in plaats van DCFDA beschermt tegen de artefacten die worden veroorzaakt door de directe reactie van deze sonde met cellulaire componenten zoals peroxidasen, andere heembevattende enzymen en reductiemiddelen voor metaalionen 42,43,44. DHE is gesuggereerd als een veiliger hulpmiddel voor cellulaire redoxstudies38,39. Hier stellen we het gebruik van DHE voor met twee verschillende uitleestechnieken: 1) flowcytometrie en 2) fluorescentiebeeldvorming.

Flowcytometrie is over het algemeen een techniek die gelijktijdige behandeling van meerdere monsters met een lage tot gemiddelde doorvoer mogelijk maakt52. Helaas staat de in dit onderzoek gebruikte aanpak geen monsterfixatie toe. Hoewel de verdunning van de monsters met ijskoud gemodificeerde tyrodebuffer de fluorescentie in de monsters tot 30 minuten stabiliseert, moet de analyse van alle monsters in dit tijdsbestek worden uitgevoerd. Dit beperkt het aantal monsters per experiment aanzienlijk. Meerdere intern gecontroleerde experimentele runs binnen dezelfde dag en met hetzelfde bloedplaatjespreparaat zijn mogelijk, hoewel de resultaten moeten worden genormaliseerd naar controles en niet als onafhankelijke experimenten moeten worden beschouwd. Deze techniek is door de auteurs van dit manuscript gebruikt om de rol van redoxafhankelijke bloedplaatjesmodulatie in de reacties op verschillende agonisten en modulatoren te benadrukken46,50. Deze methode kan worden gewijzigd door het gebruik van een chemisch gemodificeerde versie van DHE die het mogelijk maakt om mitochondriën (d.w.z. Mitosox)53 te targeten, die is gebruikt voor bloedplaatjesstudies gericht op NOX254. Dit is een interessante opportuniteit die nog niet is nagestreefd door onze laboratoria.

De hier voorgestelde fluorescentiebeeldvormingstechniek met behulp van DHE heeft het voordeel dat het tijdsverloop van O2•- generatie in bloedplaatjes wordt bepaald bij adhesie (agonisten geabsorbeerd op het oppervlak van het beeldvormingsputje) of stimulatie (agonisten in suspensie). Dit maakt het mogelijk om het samenspel van verschillende fasen van het activeringsproces van bloedplaatjes te interpreteren en de bijdrage van verschillende O2•- bronnen te evalueren (bijv. verschillende ROS-genererende enzymen, bijv. NOX'en). Geen enkele bestaande techniek maakt dit soort onderzoek mogelijk. Dit brengt kosten met zich mee in termen van analysedoorvoer, waarbij elke geteste toestand 30 minuten in beslag neemt (inclusief μ-dia-instelling, scherpstellen en veldselectie, beeldvorming en gegevensopslag). Daarom maakt deze techniek het mogelijk om een klein aantal omstandigheden per werkdag (d.w.z. onder de 10) te testen. Hoewel voor de hier getoonde gegevens een confocale microscoop is gebruikt, hebben we bevestigd dat even goede resultaten kunnen worden verkregen met een epifluorescentiemicroscoop met een excitatievermogen van 405 nm. Dit vermindert de behoefte aan dure confocale microscopie-opstellingen en maakt deze techniek betaalbaarder.

Het EPR-protocol is ontwikkeld op basis van eerdere studies in verschillende celtypen55. Deze techniek wordt algemeen erkend als het meest betrouwbare hulpmiddel voor de studie van ROS-generatie en het onderzoek naar redox-afhankelijke gebeurtenissen in cellen38. Naast de superieure betrouwbaarheid in vergelijking met andere technieken vanwege de specificiteit van de reactie van hydroxylamine-spinsondes met vrije zuurstofradicalen56, maakt EPR de kwantificering van de O2•- generatiesnelheid en de vergelijking tussen verschillende individuen en experimenten mogelijk. Dit is niet mogelijk met op fluorescentie gebaseerde technieken, die ons alleen in staat stellen om het effect van geselecteerde omstandigheden op de fluorescentie-intensiteit binnen een enkel experiment en bloedplaatjesvoorbereiding te schatten. Hoewel dit EPR-protocol is ontwikkeld als een techniek om te combineren met bloedplaatjesaggregatie voor de parallelle monitoring van bloedplaatjesactivering en O2•- generatie1, kunnen deze experimenten worden uitgevoerd zonder de parallelle analyse van aggregatie. Zelfs zonder parallelle analyse van de bloedplaatjesaggregatie, raden we aan om de incubatie in een aggregometer uit te voeren om een effectieve bloedplaatjesstimulatie te garanderen, waarvoor de schuifspanning vereist die wordt geleverd door continu roeren. Als de experimenten moeten worden uitgevoerd in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml zonder te roeren, zijn de niveaus van O2•- productie aanzienlijk lager. Als voor deze experimentele aanpak wordt gekozen, stellen we daarom voor om de CMH-incubatie uit te voeren op een roterend wiel en met dichter geconcentreerde bloedplaatjes (d.w.z. 1 x 109/ml), wat leidt tot een signaal dat sterk genoeg is voor detectie door de EPR-spectrometer.

Samenvattend presenteren we hier drie gevalideerde technieken voor de detectie van O2•- in bloedplaatjes. Ze bieden verschillende voordelen en kunnen worden gekozen op basis van experimentele doelstellingen en prioriteiten. De eerste techniek die gebaseerd is op het gebruik van DHE door middel van flowcytometrie is de minst bewerkelijke en tijdrovende en kan daarom worden gekozen als analyse op instapniveau. De tweede techniek, gebaseerd op het gebruik van DHE door middel van fluorescentiemicroscopie, maakt het mogelijk om de snelle kinetiek van O2•- generatie te waarderen en te bestuderen hoe verschillende signaalcascades de oxidatieve respons in de secondentijdschaal kunnen beïnvloeden (terwijl andere technieken alleen eindpuntonderzoek toestaan van gebeurtenissen die binnen enkele minuten na stimulatie optreden). Ten slotte maakt EPR het mogelijk om de O2•- generatiesnelheid te kwantificeren en de vergelijking tussen experimenten en individuen te vergelijken. Om deze reden is deze laatste techniek bijzonder nuttig voor klinische studies die gericht zijn op het karakteriseren van de oxidatieve respons in bloedplaatjes van verschillende individuen (bijv. vergelijking tussen patiënten of patiënten versus gezonde controles). Over het algemeen bieden deze drie technieken aanzienlijke voordelen ten opzichte van bestaande methoden en vertegenwoordigen ze een aanzienlijke vooruitgang in de experimentele hulpmiddelen die we tot onze beschikking hebben voor het bestuderen van redox-afhankelijke gebeurtenissen in bloedplaatjes.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de British Heart Foundation (PG/15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) en subsidies van de European Research Council (#10102507) aan G. Pula.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagens voor EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlowcytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030Voor μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethyleenglycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Waterstofperoxide scavenger (specificiteitscontrole)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicaalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagens voor EPR (kalibratiecontrole)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagens voor EPR
diethyldithiocarbamaat (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagens voor EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide-anion probe
DimethylsulfoxideMerck/Sigma34869Voor stockoplossing bereiding 
EPR sealing wax platenNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumptieartikel voor EPR
EPR-kwaliteit waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagens voor EPR
Fibrinogeen uit menselijk plasmaMerck/SigmaF4883Voor μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntilichaamBioLegend303704Trombocyt-specifieke kleuring voor flowcytometrie
Glazen cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumptieartikel voor incubatie in aggregometer
Horm CollageenLabmedics/ChronologP/N 385Voor trombocytstimulatie
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacineMerck/SigmaI7378Voor trombocytenisolatie
Micropipetten DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumptieartikel voor EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658Voor μ-slide coating
Prostaglandine E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515Voor trombocytenisolatie
Natriumcitraat (4% w/v oplossing)Merck/SigmaS5770Voor trombocytenisolatie
Roerstaven (Teflon-gecoat)Labmedics/ChronologP/N 313Consumptieartikel voor incubatie in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethyleenglycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide-anion scavenger (specificiteitscontrole)
Thrombine uit menselijk plasmaMerck/SigmaT6884Voor trombocytenstimulatie en μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX-remmer
Zeiss 510 LSM confocale microscoopZeissNAConfocale microscoop

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vara, D., Cifuentes-Pagano, E., Pagano, P. J., Pula, G. A novel combinatorial technique for simultaneous quantification of oxygen radicals and aggregation reveals unexpected redox patterns in the activation of platelets by different physiopathological stimuli. Haematologica. 104 (9), 1879-1891 (2019).
  2. Fridovich, I. Superoxide radical: An endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 239-257 (1983).
  3. Keele, B. B., Mccord, J. M., Fridovich, I. Superoxide dismutase from Escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme. J Biol Chem. 245 (22), 6176-6181 (1970).
  4. Berry, C. E., Hare, J. M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications. J Physiol. 555, Pt 3 589-606 (2004).
  5. Kim, C., Kim, J. Y., Kim, J. H. Cytosolic phospholipase a(2), lipoxygenase metabolites, and reactive oxygen species. BMB Rep. 41 (2), 555-559 (2008).
  6. Armstead, W. M., Mirro, R., Busija, D. W., Leffler, C. W. Postischemic generation of superoxide anion by newborn pig brain. Am J Physiol. 255 (2), Pt 2 H401-H403 (1988).
  7. Mayer, B., et al. Nitric oxide synthase-catalyzed activation of oxygen and reduction of cytochromes: Reaction mechanisms and possible physiological implications. J Cardiovasc Pharmacol. 20, Suppl 12 S54-S56 (1992).
  8. Du, G., Mouithys-Mickalad, A., Sluse, F. E. Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and reoxygenation in vitro. Free Radic Biol Med. 25 (9), 1066-1074 (1998).
  9. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  10. Jiang, F., Zhang, Y., Dusting, G. J. Nadph oxidase-mediated redox signaling: Roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol Rev. 63 (1), 218-242 (2011).
  11. Wang, Z., et al. The role of mitochondria-derived reactive oxygen species in hyperthermia-induced platelet apoptosis. PLoS One. 8 (9), e75044(2013).
  12. Wachowicz, B., Olas, B., Zbikowska, H. M., Buczynski, A. Generation of reactive oxygen species in blood platelets. Platelets. 13 (3), 175-182 (2002).
  13. Vara, D., et al. Nadph oxidases are required for full platelet activation in vitro and thrombosis in vivo but dispensable for plasma coagulation and hemostasis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 41 (2), 683-697 (2021).
  14. Violi, F., Pignatelli, P. Platelet nox, a novel target for anti-thrombotic treatment. Thromb Haemost. 111 (5), 817-823 (2014).
  15. Begonja, A. J., et al. Platelet NAD(P)H-oxidase-generated ros production regulates alphaiibbeta3-integrin activation independent of the NO/CGMP pathway. Blood. 106 (8), 2757-2760 (2005).
  16. Vara, D. S., et al. Autocrine amplification of integrin αIIbβ3 activation and platelet adhesive responses by deoxyribose-1-phosphate. Thromb Haemost. 109 (6), 1108-1119 (2013).
  17. Essex, D. W. The role of thiols and disulfides in platelet function. Antioxid Redox Signal. 6 (4), 736-746 (2004).
  18. Arthur, J. F., et al. Ligand binding rapidly induces disulfide-dependent dimerization of glycoprotein vi on the platelet plasma membrane. J Biol Chem. 282 (42), 30434-30441 (2007).
  19. Arthur, J. F., Gardiner, E. E., Kenny, D., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet receptor redox regulation. Platelets. 19 (1), 1-8 (2008).
  20. Kim, K., Li, J., Tseng, A., Andrews, R. K., Cho, J. Nox2 is critical for heterotypic neutrophil-platelet interactions during vascular inflammation. Blood. 126 (16), 1952-1964 (2015).
  21. Hosseini, E., Solouki, A., Roudsari, Z. O., Kargar, F., Ghasemzadeh, M. Reducing state attenuates ectodomain shedding of GPVI while restoring adhesion capacities of stored platelets: Evidence addressing the controversy around the effects of redox condition on thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 50 (1), 123-134 (2020).
  22. Jang, J. Y., et al. Reactive oxygen species play a critical role in collagen-induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal. 20 (16), 2528-2540 (2014).
  23. Beckman, J. S., Koppenol, W. H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271 (5), Pt 1 C1424-C1437 (1996).
  24. Koppenol, W. H., Kissner, R., Beckman, J. S. Syntheses of peroxynitrite: To go with the flow or on solid grounds. Methods Enzymol. 269, 296-302 (1996).
  25. Cammisotto, V., et al. Nox2-mediated platelet activation by glycoprotein (GP) VI: Effect of rivaroxaban alone and in combination with aspirin. Biochem Pharmacol. 163, 111-118 (2019).
  26. Yang, M., et al. Platelet CD36 promotes thrombosis by activating redox sensor ERK5 in hyperlipidemic conditions. Blood. 129 (21), 2917-2927 (2017).
  27. Yang, M., et al. Platelet CD36 signaling through ERK5 promotes caspase-dependent procoagulant activity and fibrin deposition in vivo. Blood Adv. 2 (21), 2848-2861 (2018).
  28. Freedman, J. E. Oxidative stress and platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), s11-s16 (2008).
  29. Masselli, E., et al. ROS in platelet biology: Functional aspects and methodological insights. Int J Mol Sci. 21 (14), 4866(2020).
  30. Madamanchi, N. R., Vendrov, A., Runge, M. S. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (1), 29-38 (2005).
  31. Riemersma, R. A., et al. Risk of angina pectoris and plasma concentrations of vitamins a, c, and e and carotene. Lancet. 337 (8732), 1-5 (1991).
  32. Rimm, E. B., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med. 328 (20), 1450-1456 (1993).
  33. Zhang, W., Zheng, Y., Yan, F., Dong, M., Ren, Y. Research progress of quercetin in cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 10, 1203713(2023).
  34. Russell, C., Keshavamurthy, S., Saha, S. Nutraceuticals in the management of cardiovascular risk factors: Where is the evidence. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 21 (3), 150-161 (2021).
  35. Rotariu, D., et al. Oxidative stress - complex pathological issues concerning the hallmark of cardiovascular and metabolic disorders. Biomed Pharmacother. 152, 113238(2022).
  36. Hosseini, E., Ghasemzadeh, M., Atashibarg, M., Haghshenas, M. R. O. S. scavenger, n-acetyl-l-cysteine and NOX specific inhibitor, VAS2870 reduce platelets apoptosis while enhancing their viability during storage. Transfusion. 59 (4), 1333-1343 (2019).
  37. Hosseini, E., Nodeh, F. K., Ghasemzadeh, M. Gamma irradiation induces a pro-apoptotic state in longer stored platelets, without progressing to an overt apoptosis by day 7 of storage. Apoptosis. 28 (7-8), 1141-1153 (2023).
  38. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: A scientific statement from the American heart association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  39. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  40. Hempel, S. L., Buettner, G. R., O'malley, Y. Q., Wessels, D. A., Flaherty, D. M. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: Comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med. 27 (1-2), 146-159 (1999).
  41. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: Challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  42. Burkitt, M. J., Wardman, P. Cytochrome c is a potent catalyst of dichlorofluorescin oxidation: Implications for the role of reactive oxygen species in apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 282 (1), 329-333 (2001).
  43. Rota, C., Fann, Y. C., Mason, R. P. Phenoxyl free radical formation during the oxidation of the fluorescent dye 2',7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase. Possible consequences for oxidative stress measurements. J Biol Chem. 274 (40), 28161-28168 (1999).
  44. Rota, C., Chignell, C. F., Mason, R. P. Evidence for free radical formation during the oxidation of 2'-7'-dichlorofluorescin to the fluorescent dye 2'-7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase: Possible implications for oxidative stress measurements. Free Radic Biol Med. 27 (7-8), 873-881 (1999).
  45. Rodig, S. J. Attaching suspension cells to slides for staining. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).
  46. Abubaker, A. A., Vara, D., Eggleston, I., Canobbio, I., Pula, G. A novel flow cytometry assay using dihydroethidium as redox-sensitive probe reveals NADPH oxidase-dependent generation of superoxide anion in human platelets exposed to amyloid peptide beta. Platelets. 30 (2), 181-189 (2019).
  47. Gaspar, R. S., et al. Protein disulphide isomerase and NADPH oxidase 1 cooperate to control platelet function and are associated with cardiometabolic disease risk factors. Antioxidants (Basel). 10 (3), 497(2021).
  48. Gaspar, R. S., Ferreira, P. M., Mitchell, J. L., Pula, G., Gibbins, J. M. Platelet-derived extracellular vesicles express NADPH oxidase-1 (NOX-1), generate superoxide and modulate platelet function. Free Radic Biol Med. 165, 395-400 (2021).
  49. Vara, D., et al. NADPH oxidase 1 is a novel pharmacological target for the development of an antiplatelet drug without bleeding side effects. FASEB J. 34 (10), 13959-13977 (2020).
  50. Lopes-Pires, M. E., et al. Zinc regulates reactive oxygen species generation in platelets. Platelets. 32 (3), 368-377 (2021).
  51. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and mitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: Another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
  52. Linden, M. D. Platelet flow cytometry. Methods Mol Biol. 992, 241-262 (2013).
  53. Kauffman, M. E., et al. MitoSOX-based flow cytometry for detecting mitochondrial ROS. React Oxyg Species (Apex). 2 (5), 361-370 (2016).
  54. Sonkar, V. K., et al. NOX2 NADPH oxidase is dispensable for platelet activation or arterial thrombosis in mice. Blood Adv. 3 (8), 1272-1284 (2019).
  55. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radic Res. 45 (4), 417-430 (2011).
  56. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Superoxide Anion DetectionPlatelet FunctionReactive Oxygen SpeciesFlow CytometryDihydroethidium ImagingElectron Paramagnetic ResonancePlatelet Rich PlasmaSpin Probe QuantificationPlatelet AdhesionNADPH Oxidases

Gerelateerde artikelen