Een protocol voor femorale osteotomiechirurgie met behulp van interne plaatfixatie bij volwassen axolotls wordt gepresenteerd. De procedure kan worden gebruikt om vergelijkende studies uit te voeren naar de regeneratie van ledematen en de genezing van fracturen bij aquatische amfibieën.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Stabiliseren van een dijbeenosteotomie met een plaatfixatie bij Ambystoma mexicanum
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De axolotl (Ambystoma mexicanum) is een veelbelovend modelorganisme voor regeneratieve geneeskunde vanwege zijn opmerkelijke vermogen om verloren of beschadigde organen te regenereren, waaronder ledematen, hersenen, hart, staart en andere. Studies met axolotl werpen licht op cellulaire en moleculaire routes die de activering van voorlopercellen en weefselherstel na letsel beheersen. Deze kennis kan worden toegepast om de genezing van regeneratie-incompetente verwondingen, zoals botbreuk, te vergemakkelijken. In het huidige protocol wordt de stabilisatie van de dijbeenosteotomie met behulp van een intern plaatfixatiesysteem beschreven. De procedure is aangepast voor gebruik bij waterdieren (axolotl, Ambystoma mexicanum). ≥20 cm snuit-tot-staartpunt axolotls met volledig verbeend, muisgrootte vergelijkbare dijbenen werden gebruikt, en er werd speciale aandacht besteed aan de positionering en fixatie van de plaat, evenals aan de postoperatieve zorg. Deze chirurgische techniek maakt gestandaardiseerde en gestabiliseerde botfixatie mogelijk en kan nuttig zijn voor directe vergelijking met axolotl-ledemaatregeneratie en analoge studies van botgenezing bij amfibieën en zoogdieren.
Inleiding
De axolotl (Ambystoma mexicanum) is een belangrijk model voor orgaanregeneratie, waaronder de staart, het ruggenmerg, de hersenen, het hart, de kieuwen en de ledematen 1,2,3,4,5. Gedetailleerde studies van de regeneratie van axolotl-ledematen ontdekten mechanismen van celdedifferentiatie en de vorming van een stamcelpool, blastema, op de amputatieplaats. Vanwege het vermogen van de blastemacellen om alle ontbrekende ledemaatdelen te reconstrueren, inclusief een skelet met een patroon 6,7, lijkt de axolotl een aantrekkelijk modelorganisme te zijn voor botgenezingsstudies. Onlangs hebben verschillende onderzoeken zich meer gericht op botbiologie in axolotls, waarbij skeletmorfologie, cellulaire samenstelling en ossificatiedynamiek worden beschreven.
Bij zoogdieren werd vastgesteld dat het botgenezingsproces in lange botten plaatsvindt via endochondrale verbening en bestaat uit verschillende fasen: hematoom, granulatieweefsel en vorming van zachte callus, verbening van callus in harde callus en geweven bot, en botremodellering8. Een recente studie heeft aangetoond dat vergelijkbare stadia kunnen worden waargenomen bij axolotl-botgenezing9.
Tot nu toe werden axolotlfracturen bestudeerd in een niet-gestabiliseerd systeem, waarbij bot eenvoudig wordt gesneden met een iridectomieschaar. De grote breuken zijn ontstaan in de zeugopod, waar osteotomie wordt uitgevoerd op een van de botten, terwijl de andere dient als ondersteuning 10,11. Fracturen daarentegen worden routinematig bestudeerd bij zoogdieren, waaronder ratten en muizen, met behulp van betrouwbare fixatiesystemen, zoals intramedullaire pin en botuitlijnende platen, om de fractuurgrootte te controleren en de botuitlijning te garanderen.
De methode is dus gericht op een gestabiliseerde en uniforme fixatie van het axolotldijbeen voorafgaand aan de osteotomie. Om axolotl-studies meer vergelijkbaar te maken met zoogdieren, waaronder muizen en mensen, werden intramedullaire pin12, externe plaatfixator13,14 en interne botuitlijnende plaat 15,16,17-fixatie overwogen. Van dit laatste werd aangetoond dat het zorgt voor een goede botfixatie en het mogelijk maakt om een opening van een bepaalde grootte te creëren door een of twee sneden te gebruiken met een Gigly-zaag met een specifieke diameter. Aangezien axolotls de aquatische larven van Ambystoma mexicanum vertegenwoordigen, kan de externe fixator postoperatieve complicaties hebben veroorzaakt als gevolg van de open wond en het contact met water. Omdat axolotls pas heel laat in hun ontwikkeling secundaire ossificatiecentra ontwikkelen (20 jaar oud18), en dus de standaard intramedullaire nagel die bij muizen wordt gebruikt niet kan worden verhinderd de epifysen te doorboren, werd besloten om een interne plaatfixatiemethode toe te passen op grote axolotls. Bij grote axolotls lijken de dijbeengrootte en de mate van verbening op die van een volwassen muis, waardoor mid-diafysaire osteotomie met fixatie van de titaniumplaat mogelijkis1.
De grootte van de fractuurspleet bepaalt in grote mate de genezingsdynamiek en het resultaat. Bij een muis genezen gestabiliseerde fracturen van 0,25 mm bijvoorbeeld meestal door intramembraneuze ossificatie vanwege hun kleine formaat en stijve stabilisatie; een fractuur van 0,7 mm geneest door endochondrale verbenvorming, met de vorming van een kraakbeenachtige callus rond de fractuur; Grote defecten, zoals defecten van 3,5 mm van kritische grootte, genezen niet volledig en worden daarom gebruikt om botbreuken non-union te modelleren16. In deze studie werd het plaatfixatieprotocol van het axolotl-dijbeen voorafgaand aan de osteotomie vastgesteld aan de hand van het voorbeeld van een fractuurspleet van 0,7 mm met als uiteindelijk doel de genezing van axolotl-bot te vergelijken met die van de muis9.
Na osteotomie ondergingen de fracturen het proces van endochondrale verbenvorming, zij het langzamer dan bij muizen, mogelijk als gevolg van de aquatische levensstijl van axolotls en langzamere celdelingssnelheden. In de hier gepresenteerde methode wordt de osteotomie met een opening van 0,7 mm met stijve plaatfixatie getoond; Andere spleetgroottes en semi-flexibele fixatoren, evenals platen van verschillende materialen, zijn echter potentieel mogelijk. Over het algemeen kan de hier gepresenteerde methode worden gebruikt voor gestandaardiseerde botfixatie en zal deze nuttig zijn voor onderzoeken waarin axolotl-ledemaatregeneratie wordt vergeleken met botgenezing of voor het bestuderen van botgenezing in axolotls onder verschillende omstandigheden om gestandaardiseerde fractuurfixatie te garanderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De volgende procedure werd uitgevoerd met goedkeuring van de magistraat van Wenen (GZ: MA 58-65248-2021-26). 5-8 jaar oud, ≥ 20 cm snuit-tot-staartpunt (snuit tot het puntje van de staart) lange axolotls (Ambystoma mexicanum) werden gebruikt voor fractuuroperaties en amputaties. Zowel mannen als vrouwen werden gebruikt voor de operaties. Axolotls werden gekweekt in de faciliteit van het Research Institute of Molecular Pathology. Pijn en het risico op infecties werden behandeld met de juiste pijnstillers en antibiotica om een succesvol resultaat te garanderen. De reagentia en apparatuur die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Voorbereiding van dieren
- Baad het dier ongeveer 15-20 minuten in 0,03% benzocaïne-oplossing totdat volledige sedatie is bereikt en er geen reflexieve beweging is bij het aanraken van ledematen met een pincet.
- Leg het dier met de buikzijde naar beneden op nat keukenpapier gedrenkt in 0,03% benzocaïne-oplossing en bedek het met met benzocaïne gedrenkte papieren handdoeken. De huid van waterdieren, zoals axolotls, is gevoelig voor uitdroging en daarom is het essentieel om het lichaamsoppervlak te bedekken om uitdroging te voorkomen en de huidademhaling te garanderen.
- Strek de te bedienen achterpoot uit met een ringtang. Gebruik geen desinfectiereagentia, zoals ethanol, aangezien de axolotlhuid gevoelig is voor chemicaliën en gemakkelijk geïrriteerd raakt. Gebruik in plaats daarvan 0,7x PBS (A-PBS) met 50 E/ml penicilline en 20 μg/ml streptomycine voor het reinigen van de ledemaat en later voor botirrigatie bij het zagen.
OPMERKING: De infectie is over het algemeen geen probleem voor de operaties die worden uitgevoerd op axolotls. Vanwege de aquatische aard van deze dieren en de hechtingen die op het huidoppervlak worden geplaatst, raden we echter het gebruik van antibiotica aan om besmetting van de operatieplaats te voorkomen.
2. Chirurgie
OPMERKING: Steriliseer alle chirurgische instrumenten. Gangbare sterilisatiemethoden zoals warmtesterilisatie, autoclaveren en wassen in 70% ethanol, gevolgd door grondige verwijdering van de alcoholresten, zijn geschikt voor dit doel. Als u bij meerdere dieren werkt, steriliseer dan het gereedschap tussendoor met een sterilisator met hete kralen of 70% ethanol.
- Maak een zijdelingse incisie in de lengterichting (1,5-2 cm) met een scalpel boven het dijbeen en overspan de hele dij in de bovenste achterpoot. Om dit te doen, palpert u het bot voordat u in de huid snijdt.
- Verplaats de spieren en zenuwen voorzichtig van de operatieplaats zonder te snijden. Gebruik een gebogen pincet om het efficiënt te doen.
- Plaats voorzichtig een gebogen tang onder het dijbeen om het bloot te leggen voor de operatie.
- Plaats een stijve 7,75 mm 4-gaats fixatorplaat samen met de dijbeendiafyse, vermijd het aanraken van de gewrichten, en zet deze vast in de uitgelijnde positie met een pincet.
- Gebruik vier titanium schroeven van 2 mm om het bot aan de plaat te bevestigen.
OPMERKING: De schroeven die in dit protocol worden gebruikt, hebben een complex ontwerp en bestaan uit 4 delen: het hoofddeel (wordt in het bot geschroefd), de schroefkop (maakt het mogelijk om de schroeven en de plaat te verwijderen met behulp van de vierkante ringsleutel), een smallere hals (gebruikt als breekpunt zodra de schroef in het bot is vastgedraaid) en een schroefhandvat (gebruikt voor bevestiging aan de schroevendraaier en het zaaggeleidingsapparaat). - De volgorde van de schroefbevestiging is belangrijk. Begin eerst met de binnenste schroeven en vervolgens met de twee buitenste schroeven om ervoor te zorgen dat de plaat is uitgelijnd met de botas. Gebruik een handmatige boor om het eerste gat in het bot te maken voor het gemakkelijk inbrengen van de schroef, gevolgd door het plaatsen van de 1eschroef. Boor in het midden van de botomtrek om te voorkomen dat het bot aan één kant dunner wordt, wat kan leiden tot spontane botbreuken. Gebruik irrigatie met 0,7x PBS + 1% pen/streptokokken tijdens het boren. Breek het handvat van de 1st (optioneel: 1st en 2nd) schroef(en) niet af.
- Breng de zaaggeleider aan op de 1st (optioneel: 1st en 2e ) schroef(en) en lijn deze uit met het bot en de plaat.
OPMERKING: In dit protocol worden een plaat, schroeven, een zaaggeleider en een zaag geleverd door dezelfde fabrikant en geoptimaliseerd om op elkaar te passen. De zaaggeleider kan in verschillende maten worden geleverd om compatibel te zijn met verschillende platen en zaagmaten. - Gebruik de zaaggeleider om te boren en de rest van de schroeven in te voeren. Zorg voor uitlijning van de plaat met het bot. Breek de handvatten van de schroeven af.
- Plaats een stuk plastic folie (6-7 mm bij 4-5 cm), gesteriliseerd door af te vegen met 70% ethanol en vervolgens geautoclaveerd of met warmte gesteriliseerd (140 °C gedurende 4 uur), onder het dijbeen om beschadiging van zacht weefsel tijdens het osteotomieproces te voorkomen.
NOTITIE: Voor dit doel kan een stuk plastic folie worden gebruikt, een zak afgesneden voor sterilisatie met warmte. - Plaats de Gigly draadzaag tussen het bot en de beschermfolie.
- Snijd bot met de 0,66 mm Gigly draadzaag, waardoor een enkele snede van 0,7 mm in het dijbeen ontstaat. Gebruik tijdens het zagen constante irrigatie met 0,7x PBS + 1% pen/streptokokken om weefselbeschadiging en wrijving te minimaliseren.
- Verwijder de zaag en de zaaggeleider en gebruik een schroevendraaier om de schroefhandvatten van de schroeven af te breken.
- Verwijder de beschermfilm en irrigeer de operatieplaats met 0,7x PBS + 1% pen/streptokokken.
- Bedek de bovenkant van de plaat en schroeven met steriele bijenwas om de huid en spieren te beschermen tegen irritatie door de randen van de schroeven.
- Leg spieren en huid op de botbijenwas.
- Sluit de incisieplaats af met een 7.0 synthetische (polypropyleen/polyethyleen) hechting met behulp van eenvoudige onderbroken hechtingen. Synthetische hechting wordt gebruikt om besmetting met in water geboren bacteriën en schimmels te minimaliseren.
3. Postoperatieve behandeling
- Om het dier weer wakker te maken, plaatst u het in een tank met vers kunstmatig vijverwater, aangevuld met 50 E/ml penicilline, 20 μg/ml streptomycine en analgetisch butorfanol (0,5 mg/L water).
- Observeer het dier om kieuwen te bewegen, stappen te zetten en te zwemmen - meestal binnen 1 uur na de operatie.
- Houd het dier 3 dagen in kunstmatig vijverwater met 50 E/ml penicilline en 20 μg/ml streptomycine voordat u het terugplaatst in de vuilwatertank. Om analgesie te garanderen, voegt u Butorfanol (0,5 mg/L water) toe.
- Zorg ervoor dat de hechtingen op hun plaats blijven en dat er een goede wondgenezing plaatsvindt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hier beschreven chirurgische ingreep (Figuur 1) duurt tussen de 20 minuten en 30 minuten en vereist een chirurg en een assistent. Gebruik eventueel een binoculaire dissectiemicroscoop of een vergrootglassysteem.
Figuur 1: Schema's van de chirurgische ingreep en de ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De momenteel beschreven methode van dijbeenplaatfixatie en osteotomie maakt het mogelijk om het toe te passen bij waterdieren, zoals Ambystoma mexicanum (axolotl). Deze chirurgische methode werd onlangs gebruikt om fractuurgenezing en regeneratie van ledematen bij axolotls te vergelijken met fractuurgenezing bij muizen9. Net als bij muizen kan een 4-gaats fixatorplaat met zelfbrekende schroeven aan het bot worden bevestigd en kan een Gigly-zaag worden geb...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Sabine Stumpp bedanken voor de uitstekende technische ondersteuning en Lidia Grösser voor haar hulp bij de operaties. Dit onderzoek werd gefinancierd door het Austrian Science Fund [Hertha Firnberg Fellowship nummer T-1219], ERC [Advanced Grant, 742046 RegGeneMems], DFG [CRC 1444].
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.66 mm Gigly wire saw | RISystem | RIS.590.120 | |
| 7.0 Optilene suture | Braun | C3090538 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | verdunst tot 0,03% voor gebruik |
| Butorphanol (Butomidor 10 mg/mL) | Richter Pharma AG | - | verdun tot 0,5 mg/L voor gebruik |
| Drill bit 0.30 mm | RISystem | RIS.590.200 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Hand drill | RISystem | RIS.390.130 | beter om minstens 3 stuks te hebben |
| Micro CT data analyzer | Bruker, Billerica, MA, USA | SkyScan NRecon software | |
| Micro CT specimen scanner | Bruker, Billerica, MA, USA | SkyScan 1172 | |
| Moria MC31b Iris forceps - smooth, curved, 10 cm | Fine Science Tools | 11373-12FST | 2 stuks |
| MouseFix Drill-&Saw guide 1.75 mm, rigid | RISystem | RIS.301.102 | |
| MouseFix plate 4 hole, rigid | RISystem | RIS.401.110 | |
| MouseFix screw, L =2.00 mm | RISystem | RIS.401.100 | 4 per bot nodig |
| Narrow Pattern Forceps | VWR | FSCI11002-12 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| scalpel #15 | B Braun, Thermo Fischer Scientific | 5518032 | |
| Square box wrench 0.50 mm | RISystem | RIS.590.111 | |
| Sterile bone wax, 2.5 g | Ethicon, Johnson & Johnson | W810 | |
| Student Fine Scissors - Straight/11.5cm | Fine Science Tools | 91460-11 |
Referenties
- Amamoto, R., et al. Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury. Elife. 5, 13998(2016).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. J Exp Zool. 160 (1), 47-65 (1965).
- Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
- Vargas-Gonzalez, A., Prado-Zayago, E., Leon-Olea, M., Guarner-Lans, V., Cano-Martinez, A. Myocardial regeneration in Ambystoma mexicanum after surgical injury. Arch Cardiol Mex. 75 (3), S321-S329 (2005).
- Vieira, W. A., Wells, K. M., McCusker, C. D. Advancements to the axolotl model for regeneration and aging. Gerontology. 66 (3), 212-222 (2020).
- Song, F., Li, B., Stocum, D. L. Amphibians as research models for regenerative medicine. Organogenesis. 6 (3), 141-150 (2010).
- McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. The axolotl limb blastema: Cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods. Regeneration (Oxf). 2 (2), 54-71 (2015).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions). Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Polikarpova, A., et al. The specialist in regeneration-the Axolotl-a suitable model to study bone healing. NPJ Regen Med. 7 (1), 35(2022).
- Chen, X., et al. The axolotl fibula as a model for the induction of regeneration across large segment defects in long bones of the extremities. PLoS One. 10 (6), e0130819(2015).
- Cosden-Decker, R. S., Bickett, M. M., Lattermann, C., MacLeod, J. N. Structural and functional analysis of intra-articular interzone tissue in axolotl salamanders. Osteoarthritis Cartilage. 20 (11), 1347-1356 (2012).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. J Vis Exp. (138), e58122(2018).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Jiang, S., Knapstein, P., Donat, A., Tsitsilonis, S., Keller, J. An optimized protocol for a standardized, femoral osteotomy model to study fracture healing in mice. STAR Protoc. 2 (3), 100798(2021).
- Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40, Suppl 4 S103-S109 (2009).
- Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940(2016).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Riquelme-Guzman, C., et al. Postembryonic development and aging of the appendicular skeleton in Ambystoma mexicanum. Dev Dyn. 251 (6), 1015-1034 (2022).
- Gentz, E. J., et al. Medicine and surgery of amphibians. ILAR J. 48 (3), 255-259 (2007).
- Lang, A., et al. Collagen I-based scaffolds negatively impact fracture healing in a mouse-osteotomy-model although used routinely in research and clinical application. Acta Biomater. 86, 171-184 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
