Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bacteriële cytoskeleteiwitten zoals FtsZ en MreB vervullen essentiële functies zoals celdeling en behoud van de celvorm. Verder zijn FtsZ en MreB naar voren gekomen als belangrijke doelen voor nieuwe antimicrobiële ontdekkingen. Er zijn verschillende tests ontwikkeld om verbindingen te identificeren die zich richten op nucleotidebinding en polymerisatie van deze cytoskeleteiwitten, voornamelijk gericht op FtsZ. Bovendien zijn veel van de tests arbeidsintensief of kostenintensief, en om vast te stellen of deze eiwitten het cellulaire doelwit van het medicijn zijn, zijn vaak meerdere methoden nodig. Ten slotte vormt de toxiciteit van de medicijnen voor eukaryote cellen ook een probleem. Hier beschrijven we een eenstaps celgebaseerde test om nieuwe moleculen te ontdekken die gericht zijn op het bacteriële cytoskelet en treffers te minimaliseren die mogelijk giftig kunnen zijn voor eukaryote cellen. Splijtingsgist is vatbaar voor schermen met een hoge doorvoer op basis van microscopie, en een visuele screening kan gemakkelijk elk molecuul identificeren dat de polymerisatie van FtsZ of MreB verandert. Onze test maakt gebruik van de standaard plaat met 96 putjes en vertrouwt op het vermogen van de bacteriële cytoskeleteiwitten om te polymeriseren in een eukaryote cel zoals de splijtingsgist. Hoewel de hier beschreven protocollen voor splijtingsgist zijn en gebruik maken van FtsZ van Staphylococcus aureus en MreB van Escherichia coli, zijn ze gemakkelijk aan te passen aan andere bacteriële cytoskeleteiwitten die gemakkelijk samenvoegen tot polymeren in alle eukaryote expressiegastheren. De hier beschreven methode zou de verdere ontdekking van nieuwe antimicrobiële stoffen gericht op bacteriële cytoskeletale eiwitten moeten vergemakkelijken.
Inleiding
De wijdverbreide resistentie tegen bijna alle antibiotica die momenteel worden gebruikt om bacteriële infecties te bestrijden, heeft een onmiddellijke behoefte gecreëerd aan nieuwe categorieën antibiotica. Een rapport uit 2019 gaf aan dat antibioticaresistente infecties resulteerden in het verlies van 1.27 miljoen levens, wat bijdroeg aan een totaal van 4.95 miljoen sterfgevallen wanneer rekening wordt gehouden met complicaties van resistente bacteriële infecties1. Hoewel het nog steeds effectief is in de klinische praktijk, richt het huidige arsenaal aan antibiotica zich voornamelijk op een smal spectrum van cellulaire processen, voornamelijk gericht op celwand-, DNA- en eiwitsynthese. In de afgelopen halve eeuw zijn minder dan 30 eiwitten commercieel geëxploiteerd als doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe antibacteriële middelen 2,3. Dit beperkte aantal levensvatbare doelen creëert aanzienlijke beperkingen voor het ontdekken van nieuwe antibiotica of hun derivaten voor de bestrijding van antibioticaresistente bacteriën. Om het opkomende probleem van antibioticaresistentie op te lossen, is er dus behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe antibiotica met nieuwe doelen en werkingsmechanismen.
Een antibacterieel doelwit zou idealiter een essentieel onderdeel moeten zijn van de groei van bacteriële cellen, geconserveerd moeten blijven in de fylogenetisch diverse soorten, de minste eukaryote homologie moeten vertonen en toegankelijk moeten zijn voor antibiotica. Sinds de ontdekking van bacteriële cytoskeletale eiwitten die betrokken zijn bij celdeling en het behoud van de celvorm, zijn ze naar voren gekomen als een veelbelovend brandpunt voor het ontwikkelen van antibacteriële verbindingen. Deze eiwitten zijn essentieel voor de levensvatbaarheid van bacteriën en spelen een cruciale rol bij het behoud van de celvorm (MreB, CreS), deling (FtsZ, FtsA) en DNA-segregatie (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), vergelijkbaar met het cytoskelet in eukaryote cellen. Met name FtsZ vertoont een opmerkelijk hoog niveau van conservering van een breed scala aan prokaryote organismen, terwijl MreB wordt aangetroffen in bijna alle staafvormige bacteriën. Een dergelijke brede verspreiding en relevantie in de levensvatbaarheid van cellen maken deze eiwitten tot een fascinerend doelwit in antibioticaonderzoek 5,6,7.
Het is van cruciaal belang om een meervoudige aanpak te hanteren die in vivo observaties, in vitro interacties en enzymatische experimenten combineert om bacteriële cytoskeleteiwitten grondig te valideren als het primaire doelwit van een potentiële remmer7. Omslachtige procedures of aanzienlijke kostenimplicaties belasten veel beschikbare tests voor dit doel. Dit zijn opmerkelijke obstakels voor hun wijdverbreide gebruik bij het screenen van loodverbindingen die het bacteriële cytoskelet zouden kunnen beïnvloeden. Hiervan onderscheidt microscopie zich als een uitzonderlijk efficiënte en snelle methode voor het beoordelen van de effectiviteit van verbindingen door veranderingen in de celmorfologie rechtstreeks te onderzoeken. Maar de hetero-associatie van doeleiwit met andere cytoskeletcomplexen, indirecte effecten als gevolg van off-target binding en veranderingen in membraanpotentiaal, moeilijkheid om de cel efficiënt binnen te dringen en de aanwezigheid van effluxpompen, vooral in Gram-negatieve bacteriën, maken het collectief complex om de precieze oorzaak van bacteriële celvervorming vast te stellen 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, of splijtingsgist zoals het algemeen bekend is, is een staafvormig eencellig eukaryotisch organisme. Splijtingsgist wordt veel gebruikt als modelorganisme in de cellulaire en moleculaire biologie vanwege de buitengewone conservering in cellulaire processen zoals de celcyclus en -deling, cellulaire organisatie en chromosoomreplicatie met hogere eukaryoten, waaronder mensen11,12. Bovendien brachten Errington en collega's een pool-gelokaliseerd bacterieel cytoskeletaal eiwit DivIVA tot expressie in splijtingsgist om aan te tonen dat DivIVA zich ophoopte op negatief gebogen oppervlakken13. Nogmaals, Balasubramanian en zijn groep hadden voor het eerst splijtingsgist vastgesteld als een cellulair modelsysteem om nieuwe inzichten te krijgen in het mechanisme, de assemblage en de dynamiek van het E. coli-actine-cytoskeleteiwit zoals MreB14 en tubuline-homoloog FtsZ15. Ze tonen ook het vermogen van A22 aan om de polymerisatie van MreB efficiënt te belemmeren door middel van epifluorescentiemicroscopie wanneer het tot expressie wordt gebracht in gist14. Hierna hebben andere groepen ook met succes splijtingsgist gebruikt om de assemblage-eigenschappen van chloroplast FtsZ1- en FtsZ2-eiwitten te bestuderen16. Meer recentelijk hebben we een proof-of-concept opgesteld van de levensvatbaarheid van het gebruik van splijtingsgist als een cellulair platform om specifiek te screenen op bacteriële cytoskeletremmers door een uitgebreide beoordeling uit te voeren van de impact van drie bekende FtsZ-remmers - sanguinarine, berberine en PC190723--op FtsZ-eiwitten afgeleid van twee pathogene bacteriën, namelijk Staphylococcus aureus en Helicobacter pylori17. Bovendien blijkt deze op cellen gebaseerde test in één stap van groot belang te zijn bij het minimaliseren van het risico op het identificeren van verbindingen die mogelijk giftig kunnen zijn voor eukaryote cellen.
In dit rapport stellen we, met behulp van het splijtingsgistsysteem, een systematische workflow voor met behulp van de standaard plaat met 96 putjes voor semi-geautomatiseerde screening en kwantificering van het effect van kleine molecuulremmers gericht op FtsZ van Staphylococcus aureus en MreB van Escherichia coli. Hier zetten we de semi-geautomatiseerde workflow op en optimaliseren we deze met behulp van de gevestigde remmers PC190723 en A22 die zich specifiek richten op respectievelijk FtsZ en MreB. Deze workflow maakt gebruik van een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een gemotoriseerde, zeer nauwkeurige tafel en geautomatiseerde beeldacquisitie in een standaard plaat met 96 putjes om de huidige standaardisatie te verbeteren. Daarom kan het worden toegepast op schermen met zowel gemiddelde als hoge doorvoer van synthetische chemische bibliotheken en omzeilt het enkele van de hierboven genoemde uitdagingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Expressie van GFP-gelabelde bacteriële cytoskeleteiwitten in S. pombe
OPMERKING: Zie Tabel 1 voor informatie over alle plasmiden en stammen die hier worden gebruikt. Zie Tabel 2 voor alle mediasamenstellingen.
- Voer klonen uit van E. coli MreB met een N-terminale GFP-fusie (GFP-MreB) en S. aureus FtsZ met een C-terminale GFP (SaFtsZ-GFP) in de S. pombe-expressievector, pREP42 met een thiamine-repressibele promotor van gemiddelde sterkte, nmt4118,19 zoals eerder beschreven14,15. Onderhoud, amplificeer en isoleer de plasmiden van E. coli-stammen (DH10β) zoals beschreven in20,21.
OPMERKING: Andere E. coli-stammen zoals DH5α, XL1Blue, TOP10, enz. of andere in de handel verkrijgbare competente cellen die routinematig worden gebruikt voor moleculair klonen, kunnen ook worden gebruikt. - Transformatie van plasmiden pREP42-GFP-EcMreB en pREP42-SaFtsZ-GFP in S. pombe
- Transformeer de plasmiden pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) en pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) in S. pombe-stam (h-leu1-32 ura4-D18) met behulp van de lithiumacetaatmethode22, zoals vermeld in de onderstaande stappen.
- Dag 1 - Primaire cultuur: Inoculeer een lusvol vers uitgestreepte S. pombe-cultuur in 3 ml geautoclaveerd gistextract en supplementen (YES) bouillon. Incubeer het in een orbitale shaker bij 30 °C 's nachts (O/N).
- Dag 2:
- Secundaire cultuur: Voeg ongeveer 500 μL primaire cultuur toe aan 30 ml geautoclaveerde YES-bouillon. Incubeer bij 30 °C gedurende 3 - 4 uur met schudden tot de OD600 0,4 - 0,6 bereikt.
OPMERKING: Voor elke transformatie wordt 30 ml gebruikt. - Pellet de cultuur van 30 ml op 2.500 x g gedurende 6-8 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatans weg en was de cellen met 50 ml steriel gedestilleerd water (D/W). Pellet weer naar beneden en gooi supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 1 ml steriele D/W en breng deze over in een centrifugebuis van 2 ml. Centrifugeer zoals hierboven en gooi supernatant weg.
- Voeg 1 ml 0,1 M lithiumacetaat, Tris-EDTA (LiAc-TE) oplossing toe en centrifugeer zoals hierboven. Gooi het supernatans weg en resuspendeer in 1 ml 0,1 M LiAc-TE. Centrifugeer en gooi supernatant weg, laat 100 μL oplossing achter.
- Voeg 10 - 20 μg drager-DNA toe (zalmsperma-DNA; gedenatureerd en snel afgekoeld op ijs) en 2 - 3 μg van het plasmide-DNA, dat moet worden getransformeerd. Meng voorzichtig. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Voeg 260 μL 40 % PEG/LiAc-TE toe; Meng voorzichtig. Incubeer gedurende 60 minuten in de shaker of een thermomixer op 30 °C met voorzichtig mengen. Voeg 43 μL DMSO toe; Meng voorzichtig.
- Hitteschok bij 42 °C gedurende 10 minuten in de thermomixer. Pellet bij 2.500 x g gedurende 6-8 minuten en gooi supernatant weg. Was de korrel 1x met 1 ml steriele D/W.
- Pellet, gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 200 μL steriele D/W. Plaat 100 μL op Edinburgh minimal medium (EMM) platen met 5 μg/ml thiamine (om de nmt41-promotor te onderdrukken) en aminozuursupplementen adenine (0,225 mg/ml), histidine (0,225 mg/ml) en leucine (0,225 mg/ml) maar zonder uracil (selectiemarker voor pREP42-plasmide).
OPMERKING: Afwisselend plaat 70 μL en 130 μL in twee verschillende platen. Twee verschillende volumes (70 μL en 130 μL) worden geplateerd om geïsoleerde kolonies op ten minste één van de platen te verkrijgen, afhankelijk van de transformatie-efficiëntie, die van experiment tot experiment kan variëren. - Incubeer de platen 2-3 dagen bij 30 °C tot er kolonies verschijnen. Meng een enkele kolonie met 100 μL steriele D/W en verdeel het over een verse EMM-plaat die thiamine bevat maar geen uracil bevat, zoals hierboven beschreven.
- Incubeer bij 30 °C gedurende 2-3 dagen tot er een compleet gazon verschijnt. Schraap het gegroeide gazon van cellen met behulp van een inoculatielus en resuspendeer het tot 1 ml YES-media met 30% glycerol in een cryoflacon.
- Vries de cryoflacon snel in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C om de bevroren gistvoorraden te behouden.
- Secundaire cultuur: Voeg ongeveer 500 μL primaire cultuur toe aan 30 ml geautoclaveerde YES-bouillon. Incubeer bij 30 °C gedurende 3 - 4 uur met schudden tot de OD600 0,4 - 0,6 bereikt.
- Expressie van bacteriële cytoskeleteiwitten in splijtingsgist
- Strijk aseptisch een pleister uit de glycerolvoorraad op een verse gistspecifieke plaat om voldoende cultuur te verkrijgen voor verdere experimenten.
OPMERKING: In het geval van pREP42 gebruikten we een EMM-agarplaat (minimale media) die adenine, histidine en leucine bevatte (zoals bij gebruik van de S. pombe-stam (h-leu1-32 ura4-D18)) zonder uracil (uracil aanwezig in pREP42 als selectiemarker). We voegen 15 - 20 μM thiamine toe aan de agarplaten (aangezien pREP42 een thiamine-repressieve nmt41-promotor heeft) om de expressie van het gen van belang bij het groeien op de plaat te onderdrukken. - Inoculeer een kleine lus van het inoculum uit de gestreepte pleister in 5 ml gistspecifieke EMM-media zonder thiamine en incubeer het gedurende 10 - 12 uur bij 30 °C.
OPMERKING: De expressie van FtsZ en MreB van verschillende soorten onder de nmt41-promotor in de S. pombe kan variëren, meestal van 16 tot 30 uur. De optimale tijd voor eiwitexpressie van GFP-EcMreB en SaFtsZ-GFP in S. pombe is respectievelijk 20 - 24 uur en 16 - 20 uur bij 30 °C zonder thiamine.
- Strijk aseptisch een pleister uit de glycerolvoorraad op een verse gistspecifieke plaat om voldoende cultuur te verkrijgen voor verdere experimenten.
2. Behandeling van S. pombe-culturen die GFP-gelabelde bacteriële cytoskeletale eiwitten tot expressie brengen
OPMERKING: Een aantal verschillende geneesmiddelmoleculen worden getest op de 's nachts gekweekte gistcultuur in een plaat met 96 putjes.
- Inoculeer een verse cultuur door 50 μl van de nachtelijke cultuur over te brengen in elk putje van een plaat met 96 putjes met 150 μl verse gist EMM-media met behulp van het semi-geautomatiseerde, 96-wells meerkanaals pipetteerinstrument.
- Tijdens het pipetteren voor een goede menging met behulp van een semi-geautomatiseerde, 96-wells meerkanaalspipet, introduceer je langzaam verschillende toenemende concentraties geneesmiddelen in de teeltcultuur, elk in drievoud, zoals weergegeven in het schema in figuur 1.
- Gebruik als positieve controle de reeds bekende geneesmiddelen PC190723 voor (S. aureus FtsZ) en A22 (voor E. coli MreB) in tweevoud.
OPMERKING: Zoals eerder gemeld, werden PC190723 en A22 gebruikt in een concentratie van respectievelijk 56,2 μM17 en 72,6 μM 14,17. Ondertussen dienden A22-behandeling van SaFtsZ en PC190723 behandeling van EcMreB respectievelijk als negatieve controles. - Gebruik DMSO als oplosmiddelcontrole bij drie verschillende concentraties, afhankelijk van de laagste en hoogste concentraties geneesmiddelen.
OPMERKING: Het oplosmiddel waarin geneesmiddelen zijn opgelost, wordt gebruikt als oplosmiddelcontrole. - Incubeer de controle- en behandelde culturen bij 30 °C gedurende 6-10 uur (totdat de cellen de expressie van bacteriële fluorescerende eiwitten vertonen) en neem vervolgens een beeld af met behulp van epifluorescentiemicroscopie.
3. Visualisatie van de polymeren
- Breng een laag van 20 μl 1 mg/ml concanavalin A aan op elk putje van de optisch transparante onderste plaat met 96 putjes (zwartwandig voor fluorescentiebeeldvorming) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de vloeistof op en laat deze 10 minuten aan de lucht drogen.
- Breng 20 μL cellen van de kweekplaat over naar elk respectievelijke putje en laat 10 minuten zitten. Was de cel 3x-4x met de steriele EMM-media.
- Terwijl de objectieflens op zijn plaats moet worden gebruikt (zie stap 3.6), gebruikt u de navigatormodus in het acquisitiepaneel van de beeldacquisitiesoftware voor de uitlijning van de plaat met 96 putjes en de dekking van de put. Lijn de randen van de put uit op de navigator.
- Selecteer vervolgens de parameters voor de putdekking, waaronder een selectie in meerdere posities van het interessegebied in de put, en gebruik adaptieve autofocusregeling met on-demand-modus om het monster scherp te houden tijdens de beeldvorming.
- Verkrijg beelden met behulp van differentieel interferentiecontrast (DIC) en fluorescentie. Stel excitatie- en emissiefilters in van respectievelijk 475/28 nm en 525/48 nm om de GFP-gelabelde bacteriële eiwitten die in gist tot expressie komen, af te beelden. Verkrijg Z-stacks met een stapgrootte van 0,2 μm door de dikte van de gistcellen (5 μm).
- Leg beelden vast met behulp van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een 100x, 1,4-NA olie-immersieobjectief en een 2.000 x 2,000 sCMOS-camera (6,5 μm x 6,5 μm pixelgrootte). Gebruik een LED-verlichtingssysteem voor excitatie van de fluorofoor.
OPMERKING: Elk epifluorescentiemicroscoopsysteem met een gemotoriseerde tafel voor een plaat met 96 putjes met nauwkeurige positionering op meerdere punten moet geschikt zijn. Verkrijg alle celbeelden van controle- en medicamenteuze behandelde beelden met een vergelijkbare belichtingstijd (meestal in het bereik van 0,3 - 0,5 s) bij een binning van 1 x 1 en verlichting bij 15% - 20% om de experimentvariabelen te minimaliseren en consistentie te behouden.
4. Kwantificering van de afbeeldingen met behulp van ImageJ
- Verwerk celbeelden en meet het aantal vlekken per cel en de dichtheid voor FtsZ17. Meet in het geval van MreB de dichtheid en anisotropie23 en vergelijk tussen controlecellen en behandelde cellen met behulp van Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.
- Gebruik de afbeeldingen van het DIC-kanaal om eerst de afzonderlijke gistcellen te schetsen met behulp van de tekentool uit de vrije hand en sla deze op als een interessegebied (ROI) in de ROI-manager. Deze stap is nog niet geautomatiseerd, maar recent ontwikkelde tools met behulp van machine learning25,26 kunnen in de nabije toekomst worden uitgeprobeerd en geïntegreerd.
- Maskeer het buitengebied van de cel en vul zwart zoals beschreven in27.
- Gebruik de analysemacro OPS-drempel IJ1, een ingebouwde functie in Fiji, om het aantal spots24 te tellen.
- Gebruik de otsu-methode voor automatische drempels en maskeer de gesegmenteerde deeltjes. Voer de plug-in uit om deeltjes te analyseren met behulp van een macro.
- Voor het meten van de polymeerdichtheid (hoeveelheid cytoskelet per oppervlakte-eenheid in een cel), verwerk afbeeldingen zoals beschreven, inclusief maskeer- en skeletvormingsstappen27,28. Gebruik Lpx 2Dfilter in de lpx-plug-in om de afbeeldingen te skeletteren.
- Zie voor meer informatie deze recente publicatie17. Voer EcMreB-polymeerkwantificering uit zoals eerder vermeld in23, gebruik anisotropie om de ruimtelijke organisatie te kwantificeren met behulp van FibrilTool29 zoals eerder beschreven23.
OPMERKING: Deze analysemethoden kunnen worden gebruikt om andere bacteriële cytoskeleteiwitten te kwantificeren die al dan niet door de geneesmiddelen worden behandeld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Opzetten van de 96-putjes plaat voor het screenen van medicijnen
Het gebruik van S. pombe om een C-terminaal GFP-gelabeld S. aureus FtsZ uit een vector (pREP42) die de middelsterke thiamine-repressibele promotor nmt41bevat, is eerder vastgesteld17 en op dezelfde manier werd de E. coli MreB gelabeld met N-terminaal GFP ook tot expressie gebracht in S. pombe14. We hebben ook aangetoond dat PC190723, een specifie...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Antimicrobiële resistentie (AMR) is een ernstige wereldwijde bedreiging voor de gezondheid en er is dringend behoefte aan nieuwe antibiotica met nieuwe doelen. Het bacteriële cytoskelet is naar voren gekomen als een aantrekkelijk doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica, met kleine molecuulremmers van het celdelingseiwit FtsZ, zoals TXA709, die zich al in fase I klinische onderzoeken bevinden30. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om remmers van FtsZ-polymerisatie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenconflicten.
Dankbetuigingen
SMP, SR en AKS erkennen de beurzen die zijn ontvangen van het National Institute of Science Education and Research, Department of Atomic Energy. RS erkent intramurale financieringssteun van het Department of Atomic Energy, en dit werk wordt ondersteund door een onderzoekssubsidie aan RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) van het Department of Biotechnology (DBT). De auteurs erkennen ook V Badireenath Konkimalla voor zijn opmerkingen, suggesties en discussies tijdens de ontwikkeling van het protocol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Opgelost in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L van media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar of EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | Zie hieronder voor samenstelling |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L van media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | Duits bedrijf | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L van media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Opgelost in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter gesteriliseerd |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L van media, Los oplossing bij 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | Zie hieronder voor samenstelling |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | Zie hieronder voor samenstelling |
| Gist (S. pombe) media | |||
| Gist extract + supplements (YES) | |||
| Samenstelling | g/L | ||
| Gist extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Samenstelling | g/L | concentratie | |
| kalium waterstof ftalaat | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) of 20 g/L | 111 mM | |
| Zouten (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitaminen (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Mineralen (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Zouten x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitaminen x 1000 | 1 g/l pantotheenzuur | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinezuur | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Mineralen x 10,000 | boorzuur | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdeenzuur | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citroenzuur | 10 | 47.6 mM | |
| Stam/ Plasmids | |||
| Stam | Beschrijving | Referentie | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42- |
Referenties
- Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
- Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
- Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
- Sanchez, S., Demain, A. L. Antibiotics: current innovations and future trends. , Caister Academic Press. (2015).
- Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
- Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
- Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
- Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
- Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69(2020).
- Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
- Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
- Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151(2021).
- Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
- TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
- Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16(2023).
- Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
- Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
- Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
- Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092(2022).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26(2022).
- Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
- Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
- Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
- Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
- Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
- Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825(2022).
- Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754(2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364(2010).
- Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
- Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
- Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804(2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
