Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bacteriële cytoskeleteiwitten zoals FtsZ en MreB vervullen essentiële functies zoals celdeling en behoud van de celvorm. Verder zijn FtsZ en MreB naar voren gekomen als belangrijke doelen voor nieuwe antimicrobiële ontdekkingen. Er zijn verschillende tests ontwikkeld om verbindingen te identificeren die zich richten op nucleotidebinding en polymerisatie van deze cytoskeleteiwitten, voornamelijk gericht op FtsZ. Bovendien zijn veel van de tests arbeidsintensief of kostenintensief, en om vast te stellen of deze eiwitten het cellulaire doelwit van het medicijn zijn, zijn vaak meerdere methoden nodig. Ten slotte vormt de toxiciteit van de medicijnen voor eukaryote cellen ook een probleem. Hier beschrijven we een eenstaps celgebaseerde test om nieuwe moleculen te ontdekken die gericht zijn op het bacteriële cytoskelet en treffers te minimaliseren die mogelijk giftig kunnen zijn voor eukaryote cellen. Splijtingsgist is vatbaar voor schermen met een hoge doorvoer op basis van microscopie, en een visuele screening kan gemakkelijk elk molecuul identificeren dat de polymerisatie van FtsZ of MreB verandert. Onze test maakt gebruik van de standaard plaat met 96 putjes en vertrouwt op het vermogen van de bacteriële cytoskeleteiwitten om te polymeriseren in een eukaryote cel zoals de splijtingsgist. Hoewel de hier beschreven protocollen voor splijtingsgist zijn en gebruik maken van FtsZ van Staphylococcus aureus en MreB van Escherichia coli, zijn ze gemakkelijk aan te passen aan andere bacteriële cytoskeleteiwitten die gemakkelijk samenvoegen tot polymeren in alle eukaryote expressiegastheren. De hier beschreven methode zou de verdere ontdekking van nieuwe antimicrobiële stoffen gericht op bacteriële cytoskeletale eiwitten moeten vergemakkelijken.
Inleiding
De wijdverbreide resistentie tegen bijna alle antibiotica die momenteel worden gebruikt om bacteriële infecties te bestrijden, heeft een onmiddellijke behoefte gecreëerd aan nieuwe categorieën antibiotica. Een rapport uit 2019 gaf aan dat antibioticaresistente infecties resulteerden in het verlies van 1.27 miljoen levens, wat bijdroeg aan een totaal van 4.95 miljoen sterfgevallen wanneer rekening wordt gehouden met complicaties van resistente bacteriële infecties1. Hoewel het nog steeds effectief is in de klinische praktijk, richt het huidige arsenaal aan antibiotica zich voornamelijk op een smal spectrum van cellulaire processen, voornamelijk ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Expressie van GFP-gelabelde bacteriële cytoskeleteiwitten in S. pombe
OPMERKING: Zie Tabel 1 voor informatie over alle plasmiden en stammen die hier worden gebruikt. Zie Tabel 2 voor alle mediasamenstellingen.
- Voer klonen uit van E. coli MreB met een N-terminale GFP-fusie (GFP-MreB) en S. aureus FtsZ met een C-terminale GFP (SaFtsZ-GFP) in de S. pombe-expressievector, pREP42 met een thiamine-repressibele promotor van gemiddelde sterkte, nmt4118,19 zoals eerder beschreven
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Opzetten van de 96-putjes plaat voor het screenen van medicijnen
Het gebruik van S. pombe om een C-terminaal GFP-gelabeld S. aureus FtsZ uit een vector (pREP42) die de middelsterke thiamine-repressibele promotor nmt41bevat, is eerder vastgesteld17 en op dezelfde manier werd de E. coli MreB gelabeld met N-terminaal GFP ook tot expressie gebracht in S. pombe14. We hebben ook aangetoond dat PC190723, een specifie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Antimicrobiële resistentie (AMR) is een ernstige wereldwijde bedreiging voor de gezondheid en er is dringend behoefte aan nieuwe antibiotica met nieuwe doelen. Het bacteriële cytoskelet is naar voren gekomen als een aantrekkelijk doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica, met kleine molecuulremmers van het celdelingseiwit FtsZ, zoals TXA709, die zich al in fase I klinische onderzoeken bevinden30. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om remmers van FtsZ-polymerisatie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenconflicten.
Dankbetuigingen
SMP, SR en AKS erkennen de beurzen die zijn ontvangen van het National Institute of Science Education and Research, Department of Atomic Energy. RS erkent intramurale financieringssteun van het Department of Atomic Energy, en dit werk wordt ondersteund door een onderzoekssubsidie aan RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) van het Department of Biotechnology (DBT). De auteurs erkennen ook V Badireenath Konkimalla voor zijn opmerkingen, suggesties en discussies tijdens de ontwikkeling van het protocol.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Opgelost in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L van media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar of EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | Zie hieronder voor samenstelling |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L van media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | Duits bedrijf | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L van media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Opgelost in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter gesteriliseerd |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L van media, Los oplossing bij 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | Zie hieronder voor samenstelling |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | Zie hieronder voor samenstelling |
| Gist (S. pombe) media | |||
| Gist extract + supplements (YES) | |||
| Samenstelling | g/L | ||
| Gist extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Samenstelling | g/L | concentratie | |
| kalium waterstof ftalaat | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) of 20 g/L | 111 mM | |
| Zouten (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitaminen (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Mineralen (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Zouten x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitaminen x 1000 | 1 g/l pantotheenzuur | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinezuur | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Mineralen x 10,000 | boorzuur | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdeenzuur | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citroenzuur | 10 | 47.6 mM | |
| Stam/ Plasmids | |||
| Stam | Beschrijving | Referentie | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42- |
Referenties
- Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
- Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
