Methodenartikel

Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66657

⸱

26 april 2024

 ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, National Institute of Science Education and Research, 2Homi Bhabha National Institutes

In dit artikel

Samenvatting

Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Samenvatting

Bacteriële cytoskeleteiwitten zoals FtsZ en MreB vervullen essentiële functies zoals celdeling en behoud van de celvorm. Verder zijn FtsZ en MreB naar voren gekomen als belangrijke doelen voor nieuwe antimicrobiële ontdekkingen. Er zijn verschillende tests ontwikkeld om verbindingen te identificeren die zich richten op nucleotidebinding en polymerisatie van deze cytoskeleteiwitten, voornamelijk gericht op FtsZ. Bovendien zijn veel van de tests arbeidsintensief of kostenintensief, en om vast te stellen of deze eiwitten het cellulaire doelwit van het medicijn zijn, zijn vaak meerdere methoden nodig. Ten slotte vormt de toxiciteit van de medicijnen voor eukaryote cellen ook een probleem. Hier beschrijven we een eenstaps celgebaseerde test om nieuwe moleculen te ontdekken die gericht zijn op het bacteriële cytoskelet en treffers te minimaliseren die mogelijk giftig kunnen zijn voor eukaryote cellen. Splijtingsgist is vatbaar voor schermen met een hoge doorvoer op basis van microscopie, en een visuele screening kan gemakkelijk elk molecuul identificeren dat de polymerisatie van FtsZ of MreB verandert. Onze test maakt gebruik van de standaard plaat met 96 putjes en vertrouwt op het vermogen van de bacteriële cytoskeleteiwitten om te polymeriseren in een eukaryote cel zoals de splijtingsgist. Hoewel de hier beschreven protocollen voor splijtingsgist zijn en gebruik maken van FtsZ van Staphylococcus aureus en MreB van Escherichia coli, zijn ze gemakkelijk aan te passen aan andere bacteriële cytoskeleteiwitten die gemakkelijk samenvoegen tot polymeren in alle eukaryote expressiegastheren. De hier beschreven methode zou de verdere ontdekking van nieuwe antimicrobiële stoffen gericht op bacteriële cytoskeletale eiwitten moeten vergemakkelijken.

Inleiding

De wijdverbreide resistentie tegen bijna alle antibiotica die momenteel worden gebruikt om bacteriële infecties te bestrijden, heeft een onmiddellijke behoefte gecreëerd aan nieuwe categorieën antibiotica. Een rapport uit 2019 gaf aan dat antibioticaresistente infecties resulteerden in het verlies van 1.27 miljoen levens, wat bijdroeg aan een totaal van 4.95 miljoen sterfgevallen wanneer rekening wordt gehouden met complicaties van resistente bacteriële infecties1. Hoewel het nog steeds effectief is in de klinische praktijk, richt het huidige arsenaal aan antibiotica zich voornamelijk op een smal spectrum van cellulaire processen, voornamelijk gericht op celwand-, DNA- en eiwitsynthese. In de afgelopen halve eeuw zijn minder dan 30 eiwitten commercieel geëxploiteerd als doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe antibacteriële middelen 2,3. Dit beperkte aantal levensvatbare doelen creëert aanzienlijke beperkingen voor het ontdekken van nieuwe antibiotica of hun derivaten voor de bestrijding van antibioticaresistente bacteriën. Om het opkomende probleem van antibioticaresistentie op te lossen, is er dus behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe antibiotica met nieuwe doelen en werkingsmechanismen.

Een antibacterieel doelwit zou idealiter een essentieel onderdeel moeten zijn van de groei van bacteriële cellen, geconserveerd moeten blijven in de fylogenetisch diverse soorten, de minste eukaryote homologie moeten vertonen en toegankelijk moeten zijn voor antibiotica. Sinds de ontdekking van bacteriële cytoskeletale eiwitten die betrokken zijn bij celdeling en het behoud van de celvorm, zijn ze naar voren gekomen als een veelbelovend brandpunt voor het ontwikkelen van antibacteriële verbindingen. Deze eiwitten zijn essentieel voor de levensvatbaarheid van bacteriën en spelen een cruciale rol bij het behoud van de celvorm (MreB, CreS), deling (FtsZ, FtsA) en DNA-segregatie (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), vergelijkbaar met het cytoskelet in eukaryote cellen. Met name FtsZ vertoont een opmerkelijk hoog niveau van conservering van een breed scala aan prokaryote organismen, terwijl MreB wordt aangetroffen in bijna alle staafvormige bacteriën. Een dergelijke brede verspreiding en relevantie in de levensvatbaarheid van cellen maken deze eiwitten tot een fascinerend doelwit in antibioticaonderzoek 5,6,7.

Het is van cruciaal belang om een meervoudige aanpak te hanteren die in vivo observaties, in vitro interacties en enzymatische experimenten combineert om bacteriële cytoskeleteiwitten grondig te valideren als het primaire doelwit van een potentiële remmer7. Omslachtige procedures of aanzienlijke kostenimplicaties belasten veel beschikbare tests voor dit doel. Dit zijn opmerkelijke obstakels voor hun wijdverbreide gebruik bij het screenen van loodverbindingen die het bacteriële cytoskelet zouden kunnen beïnvloeden. Hiervan onderscheidt microscopie zich als een uitzonderlijk efficiënte en snelle methode voor het beoordelen van de effectiviteit van verbindingen door veranderingen in de celmorfologie rechtstreeks te onderzoeken. Maar de hetero-associatie van doeleiwit met andere cytoskeletcomplexen, indirecte effecten als gevolg van off-target binding en veranderingen in membraanpotentiaal, moeilijkheid om de cel efficiënt binnen te dringen en de aanwezigheid van effluxpompen, vooral in Gram-negatieve bacteriën, maken het collectief complex om de precieze oorzaak van bacteriële celvervorming vast te stellen 8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, of splijtingsgist zoals het algemeen bekend is, is een staafvormig eencellig eukaryotisch organisme. Splijtingsgist wordt veel gebruikt als modelorganisme in de cellulaire en moleculaire biologie vanwege de buitengewone conservering in cellulaire processen zoals de celcyclus en -deling, cellulaire organisatie en chromosoomreplicatie met hogere eukaryoten, waaronder mensen11,12. Bovendien brachten Errington en collega's een pool-gelokaliseerd bacterieel cytoskeletaal eiwit DivIVA tot expressie in splijtingsgist om aan te tonen dat DivIVA zich ophoopte op negatief gebogen oppervlakken13. Nogmaals, Balasubramanian en zijn groep hadden voor het eerst splijtingsgist vastgesteld als een cellulair modelsysteem om nieuwe inzichten te krijgen in het mechanisme, de assemblage en de dynamiek van het E. coli-actine-cytoskeleteiwit zoals MreB14 en tubuline-homoloog FtsZ15. Ze tonen ook het vermogen van A22 aan om de polymerisatie van MreB efficiënt te belemmeren door middel van epifluorescentiemicroscopie wanneer het tot expressie wordt gebracht in gist14. Hierna hebben andere groepen ook met succes splijtingsgist gebruikt om de assemblage-eigenschappen van chloroplast FtsZ1- en FtsZ2-eiwitten te bestuderen16. Meer recentelijk hebben we een proof-of-concept opgesteld van de levensvatbaarheid van het gebruik van splijtingsgist als een cellulair platform om specifiek te screenen op bacteriële cytoskeletremmers door een uitgebreide beoordeling uit te voeren van de impact van drie bekende FtsZ-remmers - sanguinarine, berberine en PC190723--op FtsZ-eiwitten afgeleid van twee pathogene bacteriën, namelijk Staphylococcus aureus en Helicobacter pylori17. Bovendien blijkt deze op cellen gebaseerde test in één stap van groot belang te zijn bij het minimaliseren van het risico op het identificeren van verbindingen die mogelijk giftig kunnen zijn voor eukaryote cellen.

In dit rapport stellen we, met behulp van het splijtingsgistsysteem, een systematische workflow voor met behulp van de standaard plaat met 96 putjes voor semi-geautomatiseerde screening en kwantificering van het effect van kleine molecuulremmers gericht op FtsZ van Staphylococcus aureus en MreB van Escherichia coli. Hier zetten we de semi-geautomatiseerde workflow op en optimaliseren we deze met behulp van de gevestigde remmers PC190723 en A22 die zich specifiek richten op respectievelijk FtsZ en MreB. Deze workflow maakt gebruik van een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een gemotoriseerde, zeer nauwkeurige tafel en geautomatiseerde beeldacquisitie in een standaard plaat met 96 putjes om de huidige standaardisatie te verbeteren. Daarom kan het worden toegepast op schermen met zowel gemiddelde als hoge doorvoer van synthetische chemische bibliotheken en omzeilt het enkele van de hierboven genoemde uitdagingen.

Protocol

1. Expressie van GFP-gelabelde bacteriële cytoskeleteiwitten in S. pombe

OPMERKING: Zie Tabel 1 voor informatie over alle plasmiden en stammen die hier worden gebruikt. Zie Tabel 2 voor alle mediasamenstellingen.

  1. Voer klonen uit van E. coli MreB met een N-terminale GFP-fusie (GFP-MreB) en S. aureus FtsZ met een C-terminale GFP (SaFtsZ-GFP) in de S. pombe-expressievector, pREP42 met een thiamine-repressibele promotor van gemiddelde sterkte, nmt4118,19 zoals eerder beschreven14,15. Onderhoud, amplificeer en isoleer de plasmiden van E. coli-stammen (DH10β) zoals beschreven in20,21.
    OPMERKING: Andere E. coli-stammen zoals DH5α, XL1Blue, TOP10, enz. of andere in de handel verkrijgbare competente cellen die routinematig worden gebruikt voor moleculair klonen, kunnen ook worden gebruikt.
  2. Transformatie van plasmiden pREP42-GFP-EcMreB en pREP42-SaFtsZ-GFP in S. pombe
    1. Transformeer de plasmiden pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) en pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) in S. pombe-stam (h-leu1-32 ura4-D18) met behulp van de lithiumacetaatmethode22, zoals vermeld in de onderstaande stappen.
    2. Dag 1 - Primaire cultuur: Inoculeer een lusvol vers uitgestreepte S. pombe-cultuur in 3 ml geautoclaveerd gistextract en supplementen (YES) bouillon. Incubeer het in een orbitale shaker bij 30 °C 's nachts (O/N).
    3. Dag 2:
      1. Secundaire cultuur: Voeg ongeveer 500 μL primaire cultuur toe aan 30 ml geautoclaveerde YES-bouillon. Incubeer bij 30 °C gedurende 3 - 4 uur met schudden tot de OD600 0,4 - 0,6 bereikt.
        OPMERKING: Voor elke transformatie wordt 30 ml gebruikt.
      2. Pellet de cultuur van 30 ml op 2.500 x g gedurende 6-8 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatans weg en was de cellen met 50 ml steriel gedestilleerd water (D/W). Pellet weer naar beneden en gooi supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 1 ml steriele D/W en breng deze over in een centrifugebuis van 2 ml. Centrifugeer zoals hierboven en gooi supernatant weg.
      3. Voeg 1 ml 0,1 M lithiumacetaat, Tris-EDTA (LiAc-TE) oplossing toe en centrifugeer zoals hierboven. Gooi het supernatans weg en resuspendeer in 1 ml 0,1 M LiAc-TE. Centrifugeer en gooi supernatant weg, laat 100 μL oplossing achter.
      4. Voeg 10 - 20 μg drager-DNA toe (zalmsperma-DNA; gedenatureerd en snel afgekoeld op ijs) en 2 - 3 μg van het plasmide-DNA, dat moet worden getransformeerd. Meng voorzichtig. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
      5. Voeg 260 μL 40 % PEG/LiAc-TE toe; Meng voorzichtig. Incubeer gedurende 60 minuten in de shaker of een thermomixer op 30 °C met voorzichtig mengen. Voeg 43 μL DMSO toe; Meng voorzichtig.
      6. Hitteschok bij 42 °C gedurende 10 minuten in de thermomixer. Pellet bij 2.500 x g gedurende 6-8 minuten en gooi supernatant weg. Was de korrel 1x met 1 ml steriele D/W.
      7. Pellet, gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 200 μL steriele D/W. Plaat 100 μL op Edinburgh minimal medium (EMM) platen met 5 μg/ml thiamine (om de nmt41-promotor te onderdrukken) en aminozuursupplementen adenine (0,225 mg/ml), histidine (0,225 mg/ml) en leucine (0,225 mg/ml) maar zonder uracil (selectiemarker voor pREP42-plasmide).
        OPMERKING: Afwisselend plaat 70 μL en 130 μL in twee verschillende platen. Twee verschillende volumes (70 μL en 130 μL) worden geplateerd om geïsoleerde kolonies op ten minste één van de platen te verkrijgen, afhankelijk van de transformatie-efficiëntie, die van experiment tot experiment kan variëren.
      8. Incubeer de platen 2-3 dagen bij 30 °C tot er kolonies verschijnen. Meng een enkele kolonie met 100 μL steriele D/W en verdeel het over een verse EMM-plaat die thiamine bevat maar geen uracil bevat, zoals hierboven beschreven.
      9. Incubeer bij 30 °C gedurende 2-3 dagen tot er een compleet gazon verschijnt. Schraap het gegroeide gazon van cellen met behulp van een inoculatielus en resuspendeer het tot 1 ml YES-media met 30% glycerol in een cryoflacon.
      10. Vries de cryoflacon snel in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C om de bevroren gistvoorraden te behouden.
  3. Expressie van bacteriële cytoskeleteiwitten in splijtingsgist
    1. Strijk aseptisch een pleister uit de glycerolvoorraad op een verse gistspecifieke plaat om voldoende cultuur te verkrijgen voor verdere experimenten.
      OPMERKING: In het geval van pREP42 gebruikten we een EMM-agarplaat (minimale media) die adenine, histidine en leucine bevatte (zoals bij gebruik van de S. pombe-stam (h-leu1-32 ura4-D18)) zonder uracil (uracil aanwezig in pREP42 als selectiemarker). We voegen 15 - 20 μM thiamine toe aan de agarplaten (aangezien pREP42 een thiamine-repressieve nmt41-promotor heeft) om de expressie van het gen van belang bij het groeien op de plaat te onderdrukken.
    2. Inoculeer een kleine lus van het inoculum uit de gestreepte pleister in 5 ml gistspecifieke EMM-media zonder thiamine en incubeer het gedurende 10 - 12 uur bij 30 °C.
      OPMERKING: De expressie van FtsZ en MreB van verschillende soorten onder de nmt41-promotor in de S. pombe kan variëren, meestal van 16 tot 30 uur. De optimale tijd voor eiwitexpressie van GFP-EcMreB en SaFtsZ-GFP in S. pombe is respectievelijk 20 - 24 uur en 16 - 20 uur bij 30 °C zonder thiamine.

2. Behandeling van S. pombe-culturen die GFP-gelabelde bacteriële cytoskeletale eiwitten tot expressie brengen

OPMERKING: Een aantal verschillende geneesmiddelmoleculen worden getest op de 's nachts gekweekte gistcultuur in een plaat met 96 putjes.

  1. Inoculeer een verse cultuur door 50 μl van de nachtelijke cultuur over te brengen in elk putje van een plaat met 96 putjes met 150 μl verse gist EMM-media met behulp van het semi-geautomatiseerde, 96-wells meerkanaals pipetteerinstrument.
  2. Tijdens het pipetteren voor een goede menging met behulp van een semi-geautomatiseerde, 96-wells meerkanaalspipet, introduceer je langzaam verschillende toenemende concentraties geneesmiddelen in de teeltcultuur, elk in drievoud, zoals weergegeven in het schema in figuur 1.
  3. Gebruik als positieve controle de reeds bekende geneesmiddelen PC190723 voor (S. aureus FtsZ) en A22 (voor E. coli MreB) in tweevoud.
    OPMERKING: Zoals eerder gemeld, werden PC190723 en A22 gebruikt in een concentratie van respectievelijk 56,2 μM17 en 72,6 μM 14,17. Ondertussen dienden A22-behandeling van SaFtsZ en PC190723 behandeling van EcMreB respectievelijk als negatieve controles.
  4. Gebruik DMSO als oplosmiddelcontrole bij drie verschillende concentraties, afhankelijk van de laagste en hoogste concentraties geneesmiddelen.
    OPMERKING: Het oplosmiddel waarin geneesmiddelen zijn opgelost, wordt gebruikt als oplosmiddelcontrole.
  5. Incubeer de controle- en behandelde culturen bij 30 °C gedurende 6-10 uur (totdat de cellen de expressie van bacteriële fluorescerende eiwitten vertonen) en neem vervolgens een beeld af met behulp van epifluorescentiemicroscopie.

3. Visualisatie van de polymeren

  1. Breng een laag van 20 μl 1 mg/ml concanavalin A aan op elk putje van de optisch transparante onderste plaat met 96 putjes (zwartwandig voor fluorescentiebeeldvorming) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de vloeistof op en laat deze 10 minuten aan de lucht drogen.
  2. Breng 20 μL cellen van de kweekplaat over naar elk respectievelijke putje en laat 10 minuten zitten. Was de cel 3x-4x met de steriele EMM-media.
  3. Terwijl de objectieflens op zijn plaats moet worden gebruikt (zie stap 3.6), gebruikt u de navigatormodus in het acquisitiepaneel van de beeldacquisitiesoftware voor de uitlijning van de plaat met 96 putjes en de dekking van de put. Lijn de randen van de put uit op de navigator.
  4. Selecteer vervolgens de parameters voor de putdekking, waaronder een selectie in meerdere posities van het interessegebied in de put, en gebruik adaptieve autofocusregeling met on-demand-modus om het monster scherp te houden tijdens de beeldvorming.
  5. Verkrijg beelden met behulp van differentieel interferentiecontrast (DIC) en fluorescentie. Stel excitatie- en emissiefilters in van respectievelijk 475/28 nm en 525/48 nm om de GFP-gelabelde bacteriële eiwitten die in gist tot expressie komen, af te beelden. Verkrijg Z-stacks met een stapgrootte van 0,2 μm door de dikte van de gistcellen (5 μm).
  6. Leg beelden vast met behulp van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een 100x, 1,4-NA olie-immersieobjectief en een 2.000 x 2,000 sCMOS-camera (6,5 μm x 6,5 μm pixelgrootte). Gebruik een LED-verlichtingssysteem voor excitatie van de fluorofoor.
    OPMERKING: Elk epifluorescentiemicroscoopsysteem met een gemotoriseerde tafel voor een plaat met 96 putjes met nauwkeurige positionering op meerdere punten moet geschikt zijn. Verkrijg alle celbeelden van controle- en medicamenteuze behandelde beelden met een vergelijkbare belichtingstijd (meestal in het bereik van 0,3 - 0,5 s) bij een binning van 1 x 1 en verlichting bij 15% - 20% om de experimentvariabelen te minimaliseren en consistentie te behouden.

4. Kwantificering van de afbeeldingen met behulp van ImageJ

  1. Verwerk celbeelden en meet het aantal vlekken per cel en de dichtheid voor FtsZ17. Meet in het geval van MreB de dichtheid en anisotropie23 en vergelijk tussen controlecellen en behandelde cellen met behulp van Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.
  2. Gebruik de afbeeldingen van het DIC-kanaal om eerst de afzonderlijke gistcellen te schetsen met behulp van de tekentool uit de vrije hand en sla deze op als een interessegebied (ROI) in de ROI-manager. Deze stap is nog niet geautomatiseerd, maar recent ontwikkelde tools met behulp van machine learning25,26 kunnen in de nabije toekomst worden uitgeprobeerd en geïntegreerd.
  3. Maskeer het buitengebied van de cel en vul zwart zoals beschreven in27.
  4. Gebruik de analysemacro OPS-drempel IJ1, een ingebouwde functie in Fiji, om het aantal spots24 te tellen.
  5. Gebruik de otsu-methode voor automatische drempels en maskeer de gesegmenteerde deeltjes. Voer de plug-in uit om deeltjes te analyseren met behulp van een macro.
  6. Voor het meten van de polymeerdichtheid (hoeveelheid cytoskelet per oppervlakte-eenheid in een cel), verwerk afbeeldingen zoals beschreven, inclusief maskeer- en skeletvormingsstappen27,28. Gebruik Lpx 2Dfilter in de lpx-plug-in om de afbeeldingen te skeletteren.
  7. Zie voor meer informatie deze recente publicatie17. Voer EcMreB-polymeerkwantificering uit zoals eerder vermeld in23, gebruik anisotropie om de ruimtelijke organisatie te kwantificeren met behulp van FibrilTool29 zoals eerder beschreven23.
    OPMERKING: Deze analysemethoden kunnen worden gebruikt om andere bacteriële cytoskeleteiwitten te kwantificeren die al dan niet door de geneesmiddelen worden behandeld.

Resultaten

Opzetten van de 96-putjes plaat voor het screenen van medicijnen
Het gebruik van S. pombe om een C-terminaal GFP-gelabeld S. aureus FtsZ uit een vector (pREP42) die de middelsterke thiamine-repressibele promotor nmt41bevat, is eerder vastgesteld17 en op dezelfde manier werd de E. coli MreB gelabeld met N-terminaal GFP ook tot expressie gebracht in S. pombe14. We hebben ook aangetoond dat PC190723, een specifieke remmer van SaFtsZ en A22, een MreB-remmer, hun effecten op de respectievelijke bacteriële cytoskeleteiwitten op een specifieke manier kunnen uitoefenen wanneer ze tot expressie worden gebracht in gist14,17.

Hier stellen we voor om het gistexpressiesysteem te gebruiken om een gemiddelde of high-throughput screening van antibacteriële geneesmiddelen te ontwikkelen die gericht zijn op de bacteriële cytoskeleteiwitten. Een epifluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde tafel kan worden geautomatiseerd om een plaat met 96 putjes af te beelden, en commerciële medicijnbibliotheken zijn ook direct beschikbaar in plaatformaten met 96 putjes. Wij geven daarom de voorkeur aan een plaat met 96 putjes voor de voorgestelde screening van geneesmiddelen. De platen zijn ingesteld zoals weergegeven in afbeelding 1. De eerste rij (figuur 1A) bestaat uit de gistcultuur die SaFtsZ-GFP tot expressie brengt. De tweede rij (figuur 1B) bestaat uit gistculturen die GFP-EcMreB tot expressie brengen. De eerste twee kolommen van de eerste twee rijen (A1:B2) zijn ingesteld als media leeg. De volgende zes kolommen van de eerste twee rijen (A3:B12) zijn ingesteld als DMSO-controle met drie verschillende concentraties, afhankelijk van de geneesmiddelverdunningen in tweevoud. Vervolgens worden PC190723 (56,2 μM) en A22 (72,6 μM) toegevoegd aan gistcellen die SaFtsZ-GFP of GFP-EcMreB tot expressie brengen. PC190723 en A22 dienen als positieve controles voor respectievelijk FtsZ en MreB. Alle andere putjes (C1:F12) worden gebruikt voor het toevoegen van verschillende geneesmiddelen (in drie verschillende concentraties en in tweevoud) die in het scherm worden gebruikt om effectoren van de bacteriële cytoskeleteiwitten, SaFtsZ of EcMreB, te identificeren. Culturen van gist die de GFP-gelabelde SaFtsZ of MreB tot expressie brengen, worden in deze 96-wells platen gedoseerd en gekweekt totdat de effecten van de medicijnen op de assemblage van polymeren worden gevisualiseerd.

Beoordeling van groei-effecten op gistcellen
Na het incuberen van de 96-wells bevattende subgekweekte cellen bij 30 °C gedurende 6 tot 10 uur, wordt de optische dichtheid (OD) van de gistcultuur gemeten met behulp van een microplaatlezer. De meting van OD helpt bij het beoordelen van eventuele groeiremmende effecten van de geneesmiddelen tegen de eukaryote gistcellen en mogelijk schadelijke effecten op menselijke cellen. Deze test kan dus worden gebruikt om meerdere geneesmiddelen te screenen op basis van hun toxiciteit in het gistsysteem. Noch PC190723 noch A22 vertonen echter groei-effecten of toxiciteit voor gistcellen, en OD600 van de culturen die SaFtsZ-GFP tot expressie brengen behandeld met DMSO, PC190723 of A22 waren respectievelijk 0,38 ± 0,03, 0,44 ± 0,02 en 0,43 ± 0,06 (N ≥ 4). Evenzo waren de OD600 van de culturen die GFP-EcMreB tot expressie brengen en behandeld met DMSO, PC190723 of A22 respectievelijk 0,38 ± 0,04, 0,44 ± 0,07 en 0,41 ± 0,08 (N ≥ 4).

Visualisatie van het effect van de geneesmiddelen op de polymere structuren geassembleerd door SaFtsZ en EcMreB, uitgedrukt in S. pombe
Om het effect van de geneesmiddelen op de polymerisatie van SaFtsZ of EcMreB te beoordelen, wordt een aliquot van de gistcellen van de bovengenoemde 96-putjes plaat met geneesmiddelen overgebracht naar een andere 96-putjes plaat met optisch heldere glazen bodem 96-well geschikt voor fluorescentiebeeldvorming. Deze plaat met 96 putjes is ook gecoat met concanavalin A om hechting van de gistcellen mogelijk te maken die de GFP-gelabelde SaFtsZ of EcMreB tot expressie brengen. De plaat met 96 putjes wordt afgebeeld met behulp van een epifluorescentiemicroscoop die alle 96 putjes van de plaat bestrijkt op de vooraf bepaalde posities zoals gecontroleerd door de beeldacquisitiesoftware (Figuur 2). In de controleputjes (DMSO behandeld) vertoonden gistcellen die SaFtsZ-GFP tot expressie brachten polymere structuren in de vorm van vlekken of vlekken verspreid over de cellen, na 16 - 18 uur groei in afwezigheid van thiamine. Echter, 10 - 12 uur na de groei bij gebrek aan thiamine, vertoonden cellen slechts diffuse fluorescentie of enkele patches, wat suggereert dat de FtsZ-GFP-expressie niet de kritische concentratie had bereikt die nodig is voor polymerisatie (Figuur 3A). Integendeel, het FtsZ-stabiliserende geneesmiddel, PC190723, vertoonde een aanzienlijke toename van de polymere structuren (vlekken of pleisters) van SaFtsZ-GFP in vergelijking met DMSO-controle na 12 uur groei (Figuur 3B), die als positieve controle diende. Daarentegen vertoonden cellen die met A22 werden behandeld geen verschil in de geassembleerde SaFtsZ-GFP-structuren (Figuur 3C). Echter, in tegenstelling tot culturen die met PC190723 zijn behandeld, wordt SaFtsZ-GFP in onbehandelde culturen alleen tot pleisters geassembleerd wanneer het gedurende langere perioden wordt geïnduceerd, wat aantoont dat PC190723 de kritische polymerisatieconcentratie van SaFtsZ heeft verlaagd (Figuur 3D). Evenzo vormde GFP-EcMreB, uitgedrukt in S. pombe , lineaire reeksen van lange filamenten langs de lengteas van splijtingsgist (figuur 4A). Hoewel PC190723 geen effect bleek te hebben op EcMreB-polymerisatie (Figuur 4B), resulteerde behandeling van cellen met A22 in diffuse fluorescentie door het cytoplasma van de gistcellen (Figuur 4C). De beelden van de rest van de platen met 96 putjes worden visueel geïnspecteerd op eventuele stabilisatie- of remmende effecten van de geneesmiddelen op de SaFtsZ of EcMreB, al naar gelang het geval.

De impact van de geneesmiddelen op de assemblage van bacteriële cytoskeletale eiwitten kan vervolgens worden gekwantificeerd met behulp van beeldanalysetools en plug-ins in ImageJ of Fiji, zoals eerder gerapporteerd voor SaFtsZ17 en EcMreB21. De geautomatiseerde beeldacquisitie in plaatformaat met 96 putjes en de implementatie van aangepaste macro's en scripts voor beeldverwerking kunnen de beeldvormingstijd en kwantificering van de effecten van de medicijnen versnellen. Dus, met behulp van de eencellige eukaryote gist, S. pombe, als gastheersysteem, stellen we voor dat een gemiddelde of hoge doorvoerscreening voor kleine moleculen gericht op de bacteriële cytoskeleteiwitten met succes kan worden uitgevoerd, wat uiteindelijk leidt tot de ontdekking van nieuwe antibiotica.

figure-results-1
Figuur 1: Schema met het gebruik van splijtingsgistcellen om te screenen op geneesmiddelen die gericht zijn op de assemblage van bacteriële cytoskeleteiwitten SaFtsZ of EcMreB. FtsZ van S. aureus en MreB van E. coli werden gekloond in de gistexpressievector, pREP42 met GFP-tag op respectievelijk C- en N-terminus en getransformeerd in S. pombe voor de fenotypische en geneesmiddelstudie. De culturen werden 8 - 12 uur gekweekt. Vervolgens werden de culturen gesubcultureerd in platen met 96 putjes met de juiste controles en werden de verschillende medicijnen gescreend. Verder werd de plaat gedurende 6 - 8 uur bij 30 °C geïncubeerd totdat de OD600 0,5-0,6 bereikte, en de optische dichtheid wordt gemeten met behulp van een microplaatlezer om de toxiciteit van de geneesmiddelen voor gistcellen te beoordelen. Een andere optisch heldere glazen bodem met 96 putjes was voorgecoat met concanavalin A, voor het aanhangen van gistcellen. Deze plaat met 96 putjes werd gebruikt voor visualisatie en beeldacquisitie met een epifluorescentiemicroscoop. De verkregen beelden werden vervolgens geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schema van de beeldacquisitiesoftware voor geautomatiseerde beeldvorming van een plaat met 96 putjes. Met behulp van de navigator in beeldacquisitiesoftware werd een plaat met 96 putjes uitgelijnd door de randen te markeren. Parameters voor putdekking, zoals het aantal foto's dat van elke put moet worden gemaakt en de locatie (willekeurig of vanuit het midden van de put) werden naar wens geselecteerd. Tot slot zijn er beeldparameters zoals de te gebruiken filterset (DIC en FITC-filter; Ex 475/28 nm en Em 525/48 nm), procentuele intensiteit van het verlichtingslicht, autofocus en belichtingstijd voor het vastleggen van het beeld werden ingesteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Visualisatie van het effect van PC190723- en A22-geneesmiddelen op SaFtsZ-GFP, uitgedrukt in S. pombe. S. pombe-cultuur die SaFtsZ-GFP tot expressie brengt, werd gekweekt in afwezigheid van thiamine gedurende 8 - 9 uur bij 30 °C vóór DMSO en medicamenteuze behandeling. De cultuur werd verder gekweekt in een plaat met 96 putjes gedurende 7 - 9 uur bij 30 °C in aanwezigheid of afwezigheid van de medicijnen. (A) Bij DMSO-controle, waar een equivalente hoeveelheid DMSO werd toegevoegd, vertoonden cellen enkele polymere structuren. (B) In aanwezigheid van PC190723 (56,2 μM) brengt SaFtsZ gistcellen tot expressie die een aanzienlijke toename van de polymere structuren vertonen dan die van de DMSO-controle. (C) De MreB-remmer, A22 (72,6 μM), had geen invloed op de SaFtsZ-GFP-structuren. (D) Langere uren eiwitexpressie waren nodig voor SaFtsZ-GFP-assemblage in afwezigheid van PC190723, en daarom vertonen controleculturen die gedurende 12 - 15 uur bij 30 °C werden gekweekt na subteelt in een plaat met 96 putjes die DMSO bevatte, ook FtsZ-polymeren. De schaalbalk is 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Visualisatie van het effect van PC190723- en A22-geneesmiddelen op GFP-EcMreB uitgedrukt in S. pombe. S. pombe-cultuur die GFP-EcMreB tot expressie brengt, werd gekweekt in afwezigheid van thiamine gedurende 9 - 11 uur bij 30 °C voorafgaand aan toevoeging van DMSO of de geneesmiddelen (A22 of PC190723). De cultuur werd verder gekweekt in een plaat met 96 putjes gedurende 8 - 10 uur bij 30 °C met en zonder medicijnen als controle. (A) In culturen waar een equivalente hoeveelheid DMSO als controle werd toegevoegd, vertoonden cellen lineaire filamenten van EcMreB die langs de lengteas van de gistcellen waren georiënteerd. (B) De assemblage van GFP-EcMreB werd niet beïnvloed in culturen behandeld met PC190723 (56,2 μM). (C) Het kleine molecuul A22 (72,6 μM), een bekende remmer van MreB-polymerisatie, verhinderde de assemblage van GFP-EcMreB in splijtingsgistcellen. De schaalbalk is 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Stammen en plasmiden die in deze studie zijn gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Samenstelling van media en buffers die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Antimicrobiële resistentie (AMR) is een ernstige wereldwijde bedreiging voor de gezondheid en er is dringend behoefte aan nieuwe antibiotica met nieuwe doelen. Het bacteriële cytoskelet is naar voren gekomen als een aantrekkelijk doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica, met kleine molecuulremmers van het celdelingseiwit FtsZ, zoals TXA709, die zich al in fase I klinische onderzoeken bevinden30. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om remmers van FtsZ-polymerisatiete identificeren 7,31. We hebben onlangs de eukaryote splijtingsgist gebruikt in een celgebaseerde test om aan te tonen dat het FtsZ-stabiliserende medicijn, PC190723, zich kan richten op HpFtsZ17. Bovendien toonden we ook aan dat hoewel geneesmiddelen zoals berberine en sanguinarine de polymerisatie van FtsZ beïnvloedden, ze ook de morfologie van gistcellenbeïnvloedden17. Naar aanleiding van deze studies en observaties zijn we begonnen met het ontwikkelen van een eenstaps celgebaseerde test om te screenen op kleine molecuulmodulatoren van het bacteriële cytoskelet met behulp van het splijtingsgistexpressieplatform. Aangezien de screening berust op remming van de assemblage van GFP-gelabelde cytoskeleteiwitten, kunnen kleine moleculen met vergelijkbare fluorofooreigenschappen aanleiding geven tot valse positieven. Het vermijden van long-pass filters en het kiezen van smalband-pass filters kan helpen om deze valse positieven als gevolg van fluorescerende kleine moleculen te verminderen. Hier laten we de stappen zien die betrokken zijn bij het opzetten van een scherm met gemiddelde doorvoer met behulp van een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een plaattafelhouder met 96 putjes die kan worden gebruikt om te screenen op geneesmiddelen die gericht zijn op SaFtsZ of EcMreB. De workflow omvat semi-geautomatiseerde beeldacquisitie en -analyse, die in de toekomst gemakkelijk kan worden opgeschaald naar schermen met een hoge doorvoer met behulp van gerobotiseerde vloeistofverwerkingssystemen en beeldverwerkingspijplijnen.

Verder zou de screening nuttig moeten zijn voor andere bacteriële cytoskeletale eiwitten, zoals het actineplooi-bevattende plasmide-onderhoudseiwit ParM32 en tegen elk eiwit dat zich samenvoegt tot polymere structuren in splijtingsgist. Optimale expressieniveaus voor elk eiwit van belang moeten echter worden gestandaardiseerd voordat ze in medicijnschermen worden gebruikt. Terwijl we voor FtsZ's hebben vastgesteld dat nmt41 een optimale promotor is, voor andere eiwitten die van belang zijn, een sterkere of zwakkere versie van de nmt1-promotor (Promotorsterkte (en lekheid): nmt1 > nmt41 > nmt81) of andere constitutieve promotors zoals de gist adh1 of act118,33 kan worden geprobeerd om optimale niveaus van expressie en assemblage van polymere structuren te verkrijgen. Bovendien vormen bij het gebruik van episomale plasmiden variaties in het aantal kopieën van cel tot cel ook problemen voor uniforme genexpressie. Om deze problemen te omzeilen, zijn onlangs verschillende vectoren ontwikkeld die in het splijtingsgistgenoom kunnen worden geïntegreerd (SIV's voor stabiele integratievectoren) die promotors van verschillende sterktes dragen34. Het gebruik van deze vectoren kan meer uniforme en kwantitatieve resultaten opleveren in vergelijking met de episomale vectoren die hier in deze studie worden gebruikt. Het gebruik van SIV's zou de grote heterogeniteit in expressieniveaus kunnen vermijden, die wordt gezien als een variatie in de fluorescentie-intensiteiten tussen de cellen, en zou beter geschikt moeten zijn voor schermen met een hoge doorvoer.

Bovendien werken geneesmiddelen zoals PC190723 om de FtsZ-polymeren te stabiliseren, wat resulteert in de vroege assemblage van FtsZ-filamenten in vergelijking met onbehandelde cellen. Hoewel de screening geschikt is voor het screenen van geneesmiddelen die de polymerisatie van bacteriële cytoskeleteiwitten remmen, vereist het screenen van geneesmiddelen die FtsZ-polymeren stabiliseren vanwege de visuele beoordeling van diffuse fluorescentie op het eindpunt verdere optimalisatie van de eiwitexpressieniveaus en de tijd die nodig is om een maximaal aantal cellen met polymeren te bereiken. Het is dus van cruciaal belang om een redelijke schatting te hebben van de tijd die nodig is voor eiwitexpressie om de kritische concentratie te bereiken die nodig is voor assemblage en om het eindpunt voor de test dienovereenkomstig te bepalen. In het geval van geneesmiddelen die de kritische concentratie kunnen verlagen die nodig is voor polymerisatie van het eiwit, zou de keuze van het eindpunt meestal een tijd zijn waarin een aanzienlijke populatie onbehandelde cellen diffuse fluorescentie vertoont, maar culturen die met geneesmiddelen zijn behandeld, polymeerassemblages zouden vertonen.

Een van de beperkingen, die ook een tijdrovende stap van de workflow is, is de vereiste om individuele cellen te identificeren en te segmenteren voor kwantitatieve beeldanalyse. Momenteel is dit in het voorgestelde schema een handmatige stap om individuele gistcellen te identificeren en het interessegebied (ROI's) toe te wijzen voor de kwantificering van het effect van de medicijnen. We zijn echter van plan dat de recent ontwikkelde algoritmen voor machinaal leren met behulp van trainingssets zoals die kunnen worden geïmplementeerd in ilastik35 , de noodzaak van handmatige interventie tot een minimum moeten beperken.

Hoewel onze aanpak hier met behulp van het gistplatform nuttig is voor het identificeren van treffers en potentiële kleine moleculen die gericht zijn op het bacteriële cytoskelet, zal men uiteindelijk hun antibacteriële activiteit moeten testen met behulp van de standaard minimale remmende concentratietests en werkzaamheid in diermodellen. Desalniettemin ligt de grootste uitdaging voor de wereldwijde toename van antimicrobiële resistentie (AMR) nog steeds in de permeabiliteit van het buitenmembraan van de Gram-negatieve bacteriën en de talrijke effluxpompen in veel pathogene bacteriesoorten. Bovendien kunnen effluxpompen in splijtingsgist ook soortgelijke problemen opleveren en kunnen hogere geneesmiddelconcentraties nodig zijn voor het screeningproces. Als alternatief kunnen splijtingsgiststammen die overgevoelig zijn voor geneesmiddelen (S. pombe MDR-supML), als gevolg van de deletie van de zeven multiresistente genen voor geneesmiddelen, waaronder vier transportergenen en een transcriptiefactor, worden gebruikt als gastheer voor screening32,33. Toekomstige ontwikkelingen in technologieën die de gerichte ontdekking van antibacteriën combineren met het aanpakken van resistentie als gevolg van algemene verschijnselen zoals membraanpermeabiliteit, zullen nodig zijn om de groeiende antimicrobiële resistentie aan te pakken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenconflicten.

Dankbetuigingen

SMP, SR en AKS erkennen de beurzen die zijn ontvangen van het National Institute of Science Education and Research, Department of Atomic Energy. RS erkent intramurale financieringssteun van het Department of Atomic Energy, en dit werk wordt ondersteund door een onderzoekssubsidie aan RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) van het Department of Biotechnology (DBT). De auteurs erkennen ook V Badireenath Konkimalla voor zijn opmerkingen, suggesties en discussies tijdens de ontwikkeling van het protocol.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. BlackThermo Scientific™160376
96-well plateCorning  CLS3370
A22 HydrochlorideSigma SML0471Opgelost in DMSO
AdenineFormediumTMDOC0229225 mg/L van media 
Concanavalin A Sigma C5275-5MG
DMSOSigma 317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar of EMM Broth)FormediumTMPMD0210Zie hieronder voor samenstelling
EDTA Sigma EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position sliderEppendorf5069000101
HistidineFormediumTMDOC0144225 mg/L van media 
Leica DMi8 inverted fluorescence microscopeLeica MicrosystemsDuits bedrijf
LeucineFormediumTMDOC0157225 mg/L van media 
Lithium acetate Sigma 517992-100G
PC190723Merck 344580Opgelost in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)Sigma 202398
ThiamineSigmaT4625Filter gesteriliseerd
Tris-HydrochlorideMP194855
UracilFormediumTMDOC0214225 mg/L van media, Los oplossing bij 36°C
YES (Yeast extract + supplements) AgarFormediumTMPCM0410Zie hieronder voor samenstelling
YES (Yeast extract + supplements) BrothFormediumTMPCM0310Zie hieronder voor samenstelling
Gist (S. pombe) media 
Gist extract + supplements (YES)
Samenstellingg/L
Gist extract5
Dextrose30
Agar17
Adenine0.05
L-Histidine0.05
L-Leucine0.05
L-Lysine HCl0.05
Uracil0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
Samenstellingg/Lconcentratie
kalium waterstof ftalaat 314.7mM
Na2HPO4 2.215.5 mM
NH4Cl 593.5 mM
glucose2% (w/v) of 20 g/L 111 mM
Zouten (stock x 50)20 mL/L (v/v)
Vitaminen (stock x 1000)1 mL/L (v/v)
Mineralen (Stock x 10,000)0.1 mL/L (v/v)
Zouten x 50 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) 52.50.26 M
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) 0.0007354.99 mM
50 g/l KCl (0.67 M) 500.67 M
2 g/l Na2SO4 (14.l mM)214.1 mM
Vitaminen x 1000 1 g/l pantotheenzuur 14.20 mM
10 g/l nicotinezuur 1081.2 mM
10 g/l inositol 1055.5 mM
10 mg/l biotin 0.0140.8 µM
Mineralen x 10,000 boorzuur580.9 mM
MnSO4  423.7 mM
ZnSO4.7H2O413.9 mM
FeCl2.6H2O  27.40 mM
molybdeenzuur 0.42.47 mM
KI 16.02 mM
CuSO4.5H2O 0.41.60 mM
citroenzuur 1047.6 mM
Stam/ Plasmids
StamBeschrijvingReferentie
CCD190Escherichia coli DH10β Invitrogen
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
pCCD713pREP42-

Referenties

  1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  2. Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
  3. Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
  4. Sanchez, S., Demain, A. L. Antibiotics: current innovations and future trends. , Caister Academic Press. (2015).
  5. Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
  6. Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
  7. Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
  8. Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
  9. Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69(2020).
  10. Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
  11. Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
  12. Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151(2021).
  13. Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
  14. Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
  15. Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
  16. TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
  17. Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16(2023).
  18. Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
  19. Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  21. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  22. Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  23. Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092(2022).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26(2022).
  26. Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
  27. Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
  28. Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
  29. Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
  30. Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
  31. Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825(2022).
  32. Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754(2020).
  33. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  34. Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364(2010).
  35. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  36. Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
  37. Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804(2022).

Herprints en machtigingen

Tags

Screens met scheuringsgistontdekking van antibacteriële geneesmiddelenFtsZ-polymerisatieMreB-polymerisatiecelgebaseerde assayhigh-throughput screeningfluorescentiemicroscopie96-wells plaateukaryote expressiesysteem
Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.