Dit protocol beschrijft een techniek voor intracamerale injectie bij ratten met behulp van een centrale incisie in het hoornvlies en een lange tunnel in de voorste oogkamer. Deze injectiemethode minimaliseert het risico op het veroorzaken van onbedoelde weefselbeschadiging en verbetert daardoor de precisie en reproduceerbaarheid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intracamerale injectie bij ratten met een laag risico op bijwerkingen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Intracamerale injectie is een standaard toedieningsroutine in de oogheelkunde. De toepassing van intracamerale injectie bij knaagdieren voor onderzoek is een uitdaging vanwege de beperkende afmetingen en anatomie van het oog, inclusief het kleine kamerwatervolume, de lenskromming en de lensdikte. Mogelijke schade tijdens intracamerale injecties introduceert nadelige effecten en experimentele variabiliteit. Dit protocol beschrijft een procedure voor intracamerale injectie bij ratten, waardoor precisie en reproduceerbaarheid mogelijk zijn.
Sprague-Dawley-ratten werden gebruikt als experimentele modellen. Omdat de lenspositie bij ratten in de voorste oogkamer uitsteekt, is injecteren vanuit de periferie, zoals bij mensen, ongunstig. Daarom wordt een incisie gemaakt in het centrale hoornvliesgebied met behulp van een 31 gauge 0,8 mm stilettoblad om een zelfdichtende tunnel in de voorste kamer te vormen. Een incisie onder een hoek dicht bij de flat maakt het mogelijk om een lange tunnel te creëren, die het verlies van kamerwater en ondiepgang van de voorste kamer minimaliseert. Een 34 gauge nanonaald wordt in de tunnel ingebracht voor injectie. Dit maakt penetratie mogelijk met minimale wrijvingsweerstand en vermijdt het aanraken van de lens. Injectie van trypan-blauw maakt visualisatie door spleetmicroscopie van de aanwezigheid van de kleurstof in de voorste kamer mogelijk en sluit lekkage uit. De biologische beschikbaarheid van de endotheellaag van het hoornvlies wordt aangetoond door injectie van Hoechst-kleurstof, die de kernen van de endotheelcellen van het hoornvlies na injectie kleurt.
Concluderend implementeert dit protocol een procedure voor nauwkeurige intracamerale injectie bij ratten. Deze procedure kan worden gebruikt voor intracamerale toediening van verschillende geneesmiddelen en verbindingen in experimentele rattenmodellen, waardoor de efficiëntie en reproduceerbaarheid van oogheelkundig onderzoek wordt verhoogd.
Inleiding
De biologische beschikbaarheid van verbindingen die door topische toediening aan het oogoppervlak worden toegediend, is sterk beperkt, doorgaans <5%1. Verbindingen die door oogdruppels worden toegediend, worden voornamelijk geëlimineerd door drainage, geïnduceerde tranenvloed, traanvochtomzetting en conjunctivale absorptie. Bovendien wordt de permeatie van verbindingen door het oogoppervlak sterk beperkt door de hoornvlies-bindvliesbarrière 1,2,3. Het hoornvlies bestaat uit drie hoofdlagen: het buitenste epitheel, het tussenliggende stroma en het binnenste endotheel. Het oppervlakkige hoornvliesepitheel is met elkaar verbonden door sterke tight junctions en creëert een hoge paracellulaire weerstand, wat de belangrijkste barrière is voor de doorlaatbaarheid van de stof. Meerdere epitheellagen beperken verder de permeatie van hydrofiele en grote moleculen door de intercellulaire ruimtes van het hoornvliesepitheel. Als opvolger van het epitheel is het stroma samengesteld uit collageenvezels en bevat het waterige poriën. In tegenstelling tot het hoornvliesepitheel maakt het stroma de beweging van hydrofiele geneesmiddelen mogelijk; Het is echter zeer ondoordringbaar voor lipofiele verbindingen 1,2,3. Samen vormen het hoornvliesepitheel en de stromale lagen grote weefselbarrières die de opname van geneesmiddelen beperken. Het endotheel van het hoornvlies wordt niet beschouwd als een beperking van het transport van geneesmiddelen.
Alternatief voor de toedieningsroute van het hoornvlies is de conjunctivale route. Het bindvlies is een multi-epitheellaag die de binnenkant van de oogleden en het voorste deel van de sclera bedekt. Het bindvlies wordt gekenmerkt door minder tight junctions dan het hoornvliesepitheel, waardoor een betere permeabiliteit van hydrofiele geneesmiddelen mogelijk is. Vascularisatie van het bindvlies resulteert echter in systemische absorptie van een groot deel van de toegediende moleculen, waardoor de biologische beschikbaarheid van afgeleverde verbindingen in de voorste oogkamer opnieuw sterk wordt beperkt 1,2. Een efficiënte manier om de buitenste oculaire permeabiliteitsbarrières te omzeilen, is door het medicijn rechtstreeks in het interessegebied af te leveren. Intravitreale injectie is bijvoorbeeld gebruikelijk voor toediening in het glasvocht4. Evenzo wordt intracamerale injectie gebruikt voor toediening in de voorste oogkamer5. Het tot stand brengen van een efficiënte concentratie in de voorste oogkamer is van cruciaal belang voor verschillende klinische situaties, zoals de behandeling van infectie door intracamerale injectie van antibiotica en postoperatieve ontstekingsremmende behandelingen bij staaroperaties. Ondanks het voordeel van een verbeterde biologische beschikbaarheid van stoffen door injectie met een eigen camera, zijn er grote veiligheidsproblemen waarmee rekening moet worden gehouden. Intracamerale injectie van geneesmiddelen kan bijvoorbeeld leiden tot verhoogde intraoculaire druk, toxisch voorste segmentsyndroom en toxisch endotheelcelvernietigingssyndroom 5,6. Het is daarom essentieel om in preklinische onderzoeken de werkzaamheid en veiligheid van geneesmiddelen die via intracamerale injecties worden toegediend, zorgvuldig te beoordelen om de efficiëntie van de behandeling te maximaliseren en mogelijke bijwerkingen bij patiënten te minimaliseren.
Experimentele diermodellen zijn onmisbaar in preklinische studies om nieuwe behandelingen te onderzoeken. Kleine knaagdieren, zoals muizen en ratten, zijn de meest gebruikte proefdieren voor dergelijke doeleinden. Deze dieren vertonen tal van overeenkomsten met de menselijke anatomie en fysiologie en leveren waardevolle inzichten op. Bovendien is het gebruik ervan economisch voordelig vanwege hun kleine formaat, onderhoudsgemak, snelle dracht en het vermogen om grote aantallen nakomelingen te produceren7.
Ondanks het wijdverbreide gebruik van kleine knaagdieren in oogziektemodellen, vormen hun unieke oogafmetingen en anatomie aanzienlijke uitdagingen tijdens experimentele manipulaties. Procedures zoals intracamerale injecties, die bij mensen relatief eenvoudig zijn, worden bijvoorbeeld technisch veeleisend bij muizen en ratten. De uitdagingen komen voort uit factoren zoals het kleine volume kamerwater, de relatief grote en inflexibele lens en de obstructieve positionering en kromming van de lens in de ogen van de knaagdieren (Figuur 1)8. Deze uitdagingen verhogen het risico op schade tijdens intracamerale injecties bij knaagdieren, wat leidt tot mogelijke nadelige effecten en het introduceren van experimentele variabiliteit die de geldigheid van onderzoeksconclusies kan beïnvloeden. In ons onderzoek hebben we met succes een procedure ontwikkeld voor veilige intracamerale injectie bij ratten. De techniek omvat het creëren van een lange, vlakke, zelfdichtende tunnel in het hoornvlies naar de voorste oogkamer. Deze methode zorgt niet alleen voor precisie, maar verbetert ook de experimentele reproduceerbaarheid, waardoor de problemen worden aangepakt die gepaard gaan met injectietechnieken bij kleine knaagdieren.
Figuur 1: Schematische weergave van de kenmerken van het anatomische voorste segment van ratten- en mensenogen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimenten in het protocol zijn goedgekeurd door de Nationale Vergunningscommissie - voor dierwetenschappen en voldoen aan de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en oogheelkundig onderzoek. Vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten, in de leeftijd van 8-10 weken, werden gebruikt voor de huidige studie en werden blootgesteld aan licht-donkercycli van 12/12 uur. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel).
1. Voorbereiding van dieren
- Bereid een verdovingsmiddel voor van ketamine (80 mg/kg lichaamsgewicht in 0,8 ml) en xylazine (4 mg/kg lichaamsgewicht in 0,2 ml) en injecteer het intraperitoneaal in een enkele injectie om de ratten te verdoven.
- Injecteer pijnstillend buprenorfine (0,03 mg/kg) intraperitoneaal in een enkele injectie.
- Breng topische oogheelkundige verdoving 0,4% oxybuprocaïne aan op beide ogen.
2. Het creëren van een zelfsluitende hoornvliestunnel
- Stabiliseer het oog door de superieure sclera op de verticale middellijn naast de corneosclerale overgang vast te houden met een chirurgische oogtechnische pincet.
- Plaats onder een chirurgische microscoop een steriel stilettoblad van 0,8 mm 31 G in het paracentrale hoornvliesgebied in de verticale middellijn (boven het midden van de pupil) in een vlakke positie in een hoek die zo dicht mogelijk bij horizontaal ligt (Figuur 2).
- Prik in deze positie in het hoornvlies om een incisie te maken en maak een lange tunnel (2-3 mm) totdat deze doordringt in het centrale gebied van de voorste kamer. Raak de lens niet aan (Figuur 2).
OPMERKING: Een succesvolle tunnel zal geen lekkage van het kamerwater en ondiepgang van de voorste oogkamer veroorzaken. - Breng topisch 0,3% ofloxacine en 0,1% dexamethason aan op het geïnjecteerde oog.
- Onderzoek onder spleetmicroscopie als volgt.
- Observeer de diepte van de voorste oogkamer van het geïnjecteerde oog in vergelijking met het niet-geïnjecteerde oog.
OPMERKING: De diepte moet vergelijkbaar zijn. - Observeer de lens van het geïnjecteerde oog in vergelijking met het niet-geïnjecteerde oog.
NOTITIE: De lens moet helder zijn. Vertroebeling kan lensbeschadiging tijdens de chirurgische ingreep weerspiegelen.
- Observeer de diepte van de voorste oogkamer van het geïnjecteerde oog in vergelijking met het niet-geïnjecteerde oog.
Figuur 2: Schematische weergave van de hoek en positie van het mes en de incisie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
3. Optie 1: Intracamerale injectie van trypanblauw voor het beoordelen van de succesvolle injectie in de voorste oogkamer
- Plaats 5 μL trypanblauw in een steriele glazen Hamilton-spuit van 10 μl met een stompe naald van 34 G.
OPMERKING: Injectie van trypanblauw wordt beschreven als een middel om het succes van injectie tijdens de modelkalibratie- of installatiefasen te evalueren. In de experimentele setting kan de spuit worden geladen met een oplossing van de verbinding naar keuze. - Steek de geladen spuitnaald door de tunnel die in sectie 2 is gemaakt in de voorste kamer.
- Injecteer en houd de naald na de injectie 2-3 seconden op zijn plaats totdat alle vloeistof is verdwenen.
- Verwijder de naald door deze voorzichtig en langzaam naar buiten te trekken om lekkage uit de hoornvliestunnel te voorkomen.
- Onderzoek onder spleetmicroscopie. Evalueer de diepte van de voorste oogkamer om ondiepgang uit te sluiten en verifieer de aanwezigheid van trypanblauw in de voorste oogkamer.
- Herhaal het spleetonderzoek na 24 uur, 48 uur en 72 uur.
4. Optie 2: Intracamerale injectie van Hoechst voor het beoordelen van de biologische beschikbaarheid van geïnjecteerd materiaal in de endotheelcellaag
- Plaats 5 μL Hoechst in een steriele glazen Hamilton-spuit van 10 μl met een stompe naald van 34 G.
OPMERKING: Injectie van Hoechst wordt beschreven als een middel om de biologische beschikbaarheid van geïnjecteerd materiaal te evalueren door opname in de endotheelcellaag en is nuttig tijdens de kalibratie- of instellingsfasen van het model. In de experimentele setting kan de spuit worden geladen met een oplossing van de verbinding naar keuze. - Steek de geladen spuitnaald door de tunnel die in sectie 2 is gemaakt in de voorste kamer.
- Injecteer en houd de naald na de injectie 2-3 seconden op zijn plaats totdat alle vloeistof is verdwenen.
- Verwijder de naald door deze voorzichtig en langzaam uit te trekken om lekkage uit de incisie in de hoornvliestunnel te voorkomen.
- Ongeveer 15-20 minuten na injectie euthanaseren van de ratten door intraperitoneale injectie van 500 mg/kg natriumpentobarbiton.
- Ontnucleer beide ogen en isoleer hoornvliezen. Verzamel het niet-geïnjecteerde hoornvlies als controle.
- Kleuring beide hoornvliezen met 0,5% Alizarin Red S volgens de instructies van de fabrikant om endotheelcellen te identificeren.
- Onderzoek onder een lichtmicroscoop om de alizarinerode kleuring van endotheelcellen in beeld te brengen en onder een fluorescerende microscoop om de Hoechst-kleuring te observeren, vergeleken met het niet-geïnjecteerde hoornvlies als controle.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Sprague Dawley-ratten werden intracameraal geïnjecteerd met 5 μL trypanblauw volgens het hierboven beschreven protocol. Onderzoek van de spleetlamp onmiddellijk na injectie toonde aan dat de kamer was gekleurd met trypanblauw, wat aangeeft dat het geïnjecteerde materiaal de voorste kamer bereikte (figuur 3). Bovendien was de diepte van de voorste kamer intact, wat suggereert dat de injectie geen lekkage van kamerwater en ondieping van de kamer veroorzaakte.<...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Preklinische onderzoeksmodellen moeten een gecontroleerde en reproduceerbare omgeving bieden om de betrouwbaarheid en toepasbaarheid van de bevindingen te waarborgen. In oogheelkundig onderzoek worden ooginjectiemodellen vaak gebruikt in diverse onderzoeksaspecten, variërend van het opstellen van ziektemodellen, het testen van nieuwe behandelingen en het beoordelen van weefselreacties en mogelijke bijwerkingen.
Intracamerale injecties dienen als een veelgebrui...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Marcovich A.L. heeft patenten in Steba Biotech, Yeda Weizmann, EyeYon Medical en Mor Isum en is consultant voor EyeYon Medical en Johnson & Johnson. Alle andere auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door de subsidies 2670/23 en 1304/20 van de Israel Science Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Alizarin Red | Alpha Aesar | 042040.5 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 102047 | |
| Dexamethasone 0.1% | Fisher Pharmaceutical | 393102-0413 | |
| Hamilton glass syringe 10 μL | Hamilton Co. | 721711 | |
| Hoeschst | Merck | B2261 | |
| Ketamine | Bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
| Ofloxacin 0.3% eye drops | Allergan | E92170 | |
| Oxybuprocaine Hydrochloride 0.4% | Fisher Pharmaceutical | N/A | |
| Pentobarbital sodium 200 mg/mL | CTS | N/A | |
| Slit microscope | Haag-streit bern | b-90019115 | |
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | N/A | |
| Stiletto blade 31 G 0.8 mm | Tecfen medical (skymed) | QKN2808 | |
| Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
| Trypan Blue | Sartorius | 03-102-1B | |
| Xylazine | Eurovet Animal Health | 615648 |
Referenties
- Ramsay, E., et al. Corneal and conjunctival drug permeability: Systematic comparison and pharmacokinetic impact in the eye. Eur J Pharm Sci. 119, 83-89 (2018).
- Cholkar, K., Dasari, S. R., Pal, D., Mitra, A. K. Eye: Anatomy, Physiology and Barriers to Drug Delivery. Ocular Transporters and Receptors. , Elsevier, Woodhead Publishing. (2013).
- Prausnitz, M. R. Permeability of cornea, sclera, and conjunctiva: A literature analysis for drug delivery to the eye. J Pharm Sci. 87 (12), 1479-1488 (1998).
- Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the Eye: Biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).
- Gautam, M., et al. Intracameral drug delivery: A Review of agents, indications, and outcomes. J Ocul Pharmacol Ther. 39 (2), 102-116 (2023).
- Shah, T. J., Conway, M. D., Peyman, G. A. Intracameral dexamethasone injection in the treatment of cataract surgery induced inflammation: design, development, and place in therapy. Clin Ophthalmol. 12, 2223-2235 (2018).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Chawla, S., Jena, S. The Anatomy and Physiology of Laboratory Rat.Essentials of Laboratory Animal Science: Principles and Practices. , Springer. Singapore. (2021).
- Lundström, M., Wejde, G., Stenevi, U., Thorburn, W., Montan, P. Endophthalmitis after cataract surgery: a nationwide prospective study evaluating incidence in relation to incision type and location. Ophthalmology. 114 (5), 866-870 (2007).
- Fine, I. H. Clear corneal incisions. Int Ophthalmol Clin. 34 (2), 59-72 (1994).
- Herretes, S., Stark, W. J., Pirouzmanesh, A., Reyes, J. M. G., McDonnell, P. J., Behrens, A. Inflow of ocular surface fluid into the anterior chamber after phacoemulsification through sutureless corneal cataract wounds. Am J Ophthalmol. 140 (4), 737-740 (2005).
- Masket, S., Belani, S. Proper wound construction to prevent short-term ocular hypotony after clear corneal incision cataract surgery. J Cataract Refract Surg. 33 (3), 383-386 (2007).
- Taban, M., Rao, B., Reznik, J., Zhang, J., Chen, Z., McDonnell, P. J. Dynamic morphology of sutureless cataract wounds - Effect of incision angle and location. Surv Ophthalmol. 49, Suppl 2 S62-S72 (2004).
- Belforte, N., Sande, P. H., de Zavalía, N., Dorfman, D., Rosenstein, R. E. Therapeutic benefit of radial optic neurotomy in a rat model of glaucoma. PLoS One. 7 (3), e34574(2012).
- Moreno, M. C., et al. A new experimental model of glaucoma in rats through intracameral injections of hyaluronic acid. Exp Eye Res. 81 (1), 71-80 (2005).
- Belforte, N., Sande, P., de Zavalía, N., Knepper, P., Rosenstein, R. Effect of chondroitin sulfate on intraocular pressure in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (11), 5768-5775 (2010).
- Matsumoto, Y., Kanamori, A., Nakamura, M., Negi, A. Rat chronic glaucoma model induced by intracameral injection of microbeads suspended in sodium sulfate-sodium hyaluronate. Jpn J Ophthalmol. 58 (3), 290-297 (2014).
- Liu, Y., et al. A novel rat model of ocular hypertension by a single intracameral injection of cross-linked hyaluronic acid hydrogel (Healaflow® ). Basic Clin Pharmacol Toxicol. 127 (5), 361-370 (2020).
- Bowen, R. C., et al. Comparative analysis of the safety and efficacy of intracameral cefuroxime, moxifloxacin and vancomycin at the end of cataract surgery: a meta-analysis. Br J Ophthalmol. 102 (9), 1268-1276 (2018).
- Kato, A., et al. Prophylactic antibiotics for postcataract surgery endophthalmitis: a systematic review and network meta-analysis of 6.8 million eyes. Sci Rep. 12 (1), 17416(2022).
- Wang, M., Liu, Y., Dong, H. Effect of cefuroxime intracameral injection antibiotic prophylactic on postoperative endophthalmitis wound post-cataract: A meta-analysis. Int Wound J. 20 (5), 1376-1383 (2023).
- Katz, G., et al. Intracameral cefuroxime and the incidence of post-cataract endophthalmitis: an Israeli experience. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253 (10), 1729-1733 (2015).
- Lipnitzki, I., Ben Eliahu, S., Marcovitz, A. L., Ezov, N., Kleinmann, G. Intraocular concentration of moxifloxacin after intracameral injection combined with presoaked intraocular lenses. J Cataract Refract Surg. 40 (4), 639-643 (2014).
- Colleaux, K. M., Hamilton, W. K., Morgan, R. A. Effect of prophylactic antibiotics and incision type on the incidence of endophthalmitis after cataract surgery. Can J Ophthalmol. 35 (7), 373-378 (2000).
- Libre, P. E., Della-Latta, P., Chin, N. X. Intracameral antibiotic agents for endophthalmitis prophylaxis: A pharmacokinetic model. J Cataract Refract Surg. 29 (9), 1791-1794 (2003).
- Carino, N. S., Slomovic, A. R., Chung, F., Marcovich, A. L. Topical tetracaine versus topical tetracaine plus intracameral lidocaine for cataract surgery. J Cataract Refract Surg. 24 (12), 1602-1608 (1998).
- Minakaran, N., Ezra, D. G., Allan, B. D. Topical anaesthesia plus intracameral lidocaine versus topical anaesthesia alone for phacoemulsification cataract surgery in adults. Cochrane Database Syst Rev. 7 (7), CD005276 (2020).
- Dan-Ni, W., Li-Dian, H., Zhi-Guo, P., Qiang, W., Lei, S. Intracameral anti-VEGF injection for advanced neovascular glaucoma after vitrectomy with silicone oil tamponade. Int J Ophthalmol. 14 (3), 129-135 (2021).
- Bhagat, P. R., Agrawal, K. U., Tandel, D. Study of the effect of injection bevacizumab through various routes in neovascular glaucoma. J Curr Glaucoma Pract. 10 (2), 39-48 (2016).
- Al-Qaysi, Z. K., Beadham, I. G., Schwikkard, S. L., Bear, J. C., Al-Kinani, A. A., Alany, R. G. Sustained release ocular drug delivery systems for glaucoma therapy. Expert Opin Drug Deliv. 20 (7), 905-919 (2023).
- Eghrari, A. O., Gottsch, J. D. Fuchs' corneal dystrophy. Expert Rev Ophthalmol. 5 (2), 147-159 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
