Het protocol demonstreert een methode om achtereenvolgens bloed te verzamelen uit poortaders en inferieure vena cava van muizen om de productie en absorptie van microbiële metabolieten in de darm te evalueren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Sequentiële bloedafname uit inferieure vena cava gevolgd door poortader om microbiële metabolieten in de darm bij muizen te evalueren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Van microbiële darmproducten is bekend dat ze zowel lokaal in de darm werken als in de bloedsomloop worden opgenomen, waar hun effecten zich kunnen uitstrekken tot tal van verre orgaansystemen. Vetzuren met een korte keten (SCFA) zijn een klasse van metabolieten die door darmmicroben worden geproduceerd tijdens de fermentatie van onverteerbare voedingsvezels. Ze worden nu erkend als belangrijke bijdragers aan de manier waarop het darmmicrobioom extra-intestinale orgaansystemen beïnvloedt via de darm-long, darm-hersenen en andere darmorgaanassen in de gastheer. SCFA's worden geabsorbeerd vanuit de dikke darm, via darmweefsel, in de poortader (PV). Ze passeren vervolgens de lever en worden geconsumeerd in verschillende organen, zoals de hersenen, spieren, vetweefsel en longen. SCFA's worden het gemakkelijkst gemeten in het uitgestoten fecale materiaal, maar er zijn nauwkeurigere metingen verkregen uit de fecale inhoud binnen de dikke darm. Hier stellen we voor dat het bemonsteren van PV en systemisch circulerend plasma van een enkele proefpersoon de voorkeur kan hebben voor het bestuderen van de absorptie, het transport en de systemische niveaus van SCFA's bij muizen. We presenteren een nieuwe techniek voor efficiënte bloedafname van de PV en inferieure vena cava (IVC) die het mogelijk maakt om relatief grote hoeveelheden bloed uit de portale en systemische circulaties te verzamelen. Dit wordt bereikt door de PV af te binden, waardoor de PV kan worden verwijd of vergroot terwijl deze wordt opgevuld vanuit de mesenteriale aders die erin uitmonden. Met behulp van deze methode waren we in staat om de snelheid van succesvolle afname te verbeteren, evenals de totale hoeveelheid bloed die werd afgenomen (tot 0,3 ml van IVC en 0,5 ml van PV).
Inleiding
Vetzuren met een korte keten (SCFA) zijn een belangrijke klasse van metabolieten die door de darmmicrobiota worden geproduceerd. Hun cruciale rol in de interactie tussen het darmmicrobioom en andere verre organen1 is ondersteund door onderzoek dat beschrijft hoe ze ontstekingen moduleren, signalen geven via speciale receptoren en dienen als substraten in het cellulaire metabolisme 2,3,4,5. Recent werk van onze groep heeft voorgesteld dat SCFA's in vivo inflammatoire regulatoren zijn van de immuuntonus van de longen in vivo via de darm-longas 6,7. Aanvullende rapporten hebben hun functionele invloed op het metabolisme beschreven via de darm-hersenas 8,9. Over het algemeen wordt de invloed van SCFA's op de fysiologie en pathologie van de gastheer actief en intensief onderzocht door talrijke onderzoeksgroepen die een breed scala aan ziekteprocessen bestrijken.
Acetaat (C2), propionaat (C3) en butyraat (C4) zijn de primaire SCFA's en worden gegenereerd door de darmmicrobiota door de fermentatie van opneembare voedingsvezels in de blindedarm en dikke darm. Alle drie de SCFA's kunnen ook rechtstreeks uit de voeding worden verkregen en alleen acetaat kan ook door zoogdiercellen worden aangemaakt. SCFA's worden geabsorbeerd in de dikke darm en worden gedeeltelijk gebruikt door darmepitheelcellen (als energiebron, voor lokale weefselimmuunmodulatie en ter ondersteuning van het onderhoud van de darmbarrière). Ze worden ook via het mesenteriale veneuze systeem naar de poortader getransporteerd10. Butyraat wordt voornamelijk geconsumeerd door intestinale epitheel, propionaat door de lever11,12, en van acetaat is gemeld dat het inwerkt op spier- en vetweefsel nadat het in de perifere bloedsomloop is terechtgekomen13,14.
Een uitgebreide beoordeling van de productie, absorptie en functionele activiteit van SCFA vereist kennis van SCFA-niveaus in het lumen van de dikke darm, in de portale circulatie en perifeer bloed. Dit kan worden bereikt door bloedafname uit de poortader (PV) en systemische circulatie tegelijkertijd of achtereenvolgens bij hetzelfde dier. Aangezien SCFA's vluchtig15 zijn, is het meten van hun niveaus in uitgestoten fecale pellets mogelijk niet nauwkeurig een weergave van de niveaus in de dikke darm. Bovendien kan, in vergelijking met metingen van de inhoud van de dikke darm, het niveau van SCFA's dat aanwezig is in de PV een nauwkeuriger beeld geven van de netto som van de steady-state niveaus die door de gastheer worden geabsorbeerd versus de ongelijke niveaus geproduceerd door het darmmicrobioom gedurende de lengte van de dikke darm11. Deze PV SCFA-niveaus kunnen dus relevanter en geschikter zijn voor het bestuderen van de effecten van SCFA's op de fysiologie en pathologie van de gastheer dan de lokale effecten in de darm.
Om de gecoördineerde en bijna gelijktijdige verzameling van PV en systemisch circulerend bloed uit te voeren, moet het middenrif intact blijven om een normale bloedcirculatie te behouden en spontane ademhaling te ondersteunen. Daarom is de inferieure vena cava (IVC) een ideale plaats om systemisch circulatiebloed te verkrijgen tijdens het verzamelen van PV-bloed. Dit IVC-bloed kan ook voor andere doeleinden worden gebruikt, zoals het meten van circulerende cytokines om systemische ontstekingen te evalueren.
Momenteel zijn er slechts enkele methoden voor het verzamelen van bloed uit zowel de systemische circulatie als PV gemeld bij grotere knaagdieren16,17. Conventionele methoden, die canulatie van bloedvaten bij ratten vereisen, zijn technisch moeilijk uit te voeren bij muizen. Bovendien is de maximale hoeveelheid bloed die met deze methoden wordt verzameld meestal niet meer dan 0,3 ml18.
In dit artikel presenteren we een nieuwe methode die het proces van dubbele bloedafname van IVC van muizen gevolgd door PV in hetzelfde dier vereenvoudigt. Het unieke van de methode is de ligatie van de PV in de buurt van het leverhilum vlak voor de PV-bloedafname. Deze aanpak kan de afmetingen van de PV vergroten, waardoor het slagingspercentage aanzienlijk wordt verbeterd en het maximale verzamelbare bloedvolume wordt verhoogd tot 0,5 ml.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle stappen in deze niet-overlevingsprocedure werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Californië in San Francisco. Het geslacht en de stam van de muis die werden gebruikt, waren mannelijke C57BL/6J-muizen (met een gewicht van 25-35 g en een leeftijd van 12-15 weken). Vrouwelijke en/of andere standaard muizenstammen kunnen ook worden gebruikt.
1. Anesthesie
- Veeg de onderste helft van de buik van de muis af met wattenstaafjes van 70% ethanol. Dien anesthesie toe door een intraperitoneale injectie van tribroomethanol (250-400 mg/kg) te geven. Ketamine/xylazine of isofluraan anesthesie kan ook worden gebruikt. Breng oogzalf aan op de ogen om beschadiging van het hoornvlies te voorkomen.
- Injecteer buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg) intraperitoneaal voor analgesie.
OPMERKING: Buprenorfine is nodig vanwege de pijn die gepaard gaat met de laparotomieprocedure.
2. Laparotomie
- Plaats de verdoofde muis op het operatieoppervlak (met een verwarmingskussen eronder) in rugligging. Bevestig alle muisledematen op de operatiekamer met tape. Bevestig dat de juiste diepte van de anesthesie is bereikt door teenknijpen zonder pedaalterugtrekkingsreflex.
- Til de huid op en maak een longitudinale incisie met een ontleedschaar langs de middellijn van de navel naar de processus xiphoid en caudaal naar de basis van de buik (uitwendig geslachtsorgaan).
- Maak een soortgelijke incisie in het buikvlies met een ontleedschaar zonder de darmen, het middenrif of de lever te perforeren of te beschadigen.
- Breid het operatieveld uit door een transversale incisie over de volledige lengte te maken (waarbij de breedte van de buik wordt verlengd) met een schaar aan beide zijden van de navel.
- Verplaats de dikke en dunne darm naar de rechterkant van de chirurg met behulp van een schoon gaasje gedrenkt in warme PBS om de IVC eronder bloot te leggen.
3. Ligatuurvoorbereiding voor PV
- Manipuleer de darmsegmenten in het operatieveld voorzichtig met een wattenstaafje om de PV aan de wortel van het mesenterium te lokaliseren.
- Gebruik een ontleedmicroscoop om de bloedvaten en andere abdominale structuren te visualiseren en passeer voorzichtig een 7-0 prolene hechting achter de PV in de buurt van het leverhilum (tussen de ader van de twaalfvingerige darm en de miltader)19 zodat deze klaar is voor ligatie in stap 5 (Figuur 1).
OPMERKING: Het gebruik van een microscoop vanaf deze stap is niet verplicht, maar verbetert het slagingspercentage van de algehele procedure aanzienlijk.
4. Bloedafname bij het IVC
- Steek de 28G 1/2-inch naald van een gehepariniseerde insulinespuit van 1 cc in de IVC. Verzamel 0,2-0,3 ml bloedmonster.
OPMERKING: Als er in deze stap te veel bloed wordt verwijderd, zal dit resulteren in lagere hoeveelheden PV-bloed die in stap 5 worden verzameld. - Laat de naald in de IVC om de bloeding te voorkomen die zou optreden bij verwijdering.
5. Afname van bloedmonsters van de PV
- Bind de 7-0 prolene ligatuur voorzichtig rond de PV; de PV moet uitzetten en verwijden als deze zich opvult. Steek de 28G 1/2-inch naald van een andere gehepariniseerde 1cc-insulinespuit in de PV.
- Zuig langzaam op om tot 0,3-0,5 ml bloed uit de PV te verzamelen. De PV kan instorten, maar het zou geleidelijk opnieuw moeten uitzetten met bloedaanvulling vanuit het mesenteriale veneuze systeem.
6. Opslag van monsters
- Verwijder de naalden uit de IVC en PV na bloedafname.
- Breng de bloedmonsters van spuiten over naar 1,5 ml gehepariniseerde eppendorf-buisjes en plaats ze op ijs voor latere verwerking tot plasma voor opslag en analyse indien nodig.
- Euthanaseer de muis met behulp van een overdosis verdoving gevolgd door cervicale dislocatie (volgens de door UCSF IACUC goedgekeurde richtlijnen).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van de hierboven beschreven methode kunnen we achtereenvolgens bloedmonsters van het IVC en PV in dezelfde muis verzamelen met een slagingspercentage van meer dan 95%. De gemiddelde volumes van de verzamelde bloedmonsters zijn 0,25 ml voor de IVC en 0,35 ml voor de PV.
Met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) hebben we de concentratie van SCFA's in ontlasting, PV-bloed en IVC-bloed gemeten en waren we zo in staat om de absorptie e...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel beschrijft een innovatieve in vivo methode voor het bijna gelijktijdig verzamelen van bloedmonsters achtereenvolgens van de IVC en PV in dezelfde experimentele muis. Deze methode is nuttig voor het meten van de niveaus van door darmmicrobiota gegenereerde producten, zoals SCFA's, die door de portaalcirculatie gaan. Het gemiddelde maximale bloedvolume dat kan worden verzameld tijdens een terminale procedure bij muizen (met een gewicht van 25-30 g) is ongeveer 1 ml/mui...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
AP wordt gefinancierd door een R01-prijs van de NIH/NHLBI (1R01HL146753). DM wordt gefinancierd door een T32-fellowship van de NIH en door een Trainee / Staff Pilot Awards van het UCSF Benioff Center for Microbiome Medicine.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2,2,2 Tribromoethanol, 97% (Avertin) | Sigma Aldrich | T48402-25G | Anesthetisch middel |
| Buprenorphine Hydrochloride Injectie 0,3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Pijnstiller |
| Dressing Forceps | Miltex | 6-100 | Dissectie |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5136 | Dissectie |
| Heparine natrium 1000 USP eenheden/mL | Hikma | NDC 0641-0391-12 | Heparinisatie van bloedmonsters/buizen |
| Prolene 7-0 | Ethicon | 8696G | Ligatuur van de poortader |
| Schaar | F.S.T | 14058-11 | Dissectie |
| Student Halsted-Mosquito Hemostaten | F.S.T | 91308-12 | Dissectie |
| Chirurgisch tape | 3M Transpore | 1527-1 | Fixatie van muizenledematen |
| U-100 Insuline-sering 28G1/2 | EXEL | 26027 | Verzameling van bloedmonsters |
Referenties
- vander Hee, B., Wells, J. M. Microbial regulation of host physiology by short-chain fatty acids. Trends Microbiol. 29 (8), 700-712 (2021).
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Vinolo, M. A. R., Rodrigues, H. G., Nachbar, R. T., Curi, R. Regulation of inflammation by short chain fatty acids. Nutrients. 3 (10), 858-876 (2011).
- Layden, B. T., Angueira, A. R., Brodsky, M., Durai, V., Lowe, W. L. Short chain fatty acids and their receptors: new metabolic targets. Transl Res. 161 (3), 131-140 (2013).
- den Besten, G., et al. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. J Lipid Res. 54 (9), 2325-2340 (2013).
- Tian, X., et al. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Front Microbiol. 10, 159(2019).
- Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids’ immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L65-L78 (2021).
- De Vadder, F., et al. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell. 156 (1-2), 84-96 (2014).
- Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota–gut–brain communication. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 461-478 (2019).
- Sun, M., Wu, W., Liu, Z., Cong, Y. Microbiota metabolite short chain fatty acids, GPCR, and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol. 52 (1), 1-8 (2017).
- Cummings, J. H., Pomare, E. W., Branch, H. W. J., Naylor, C. P. E., MacFarlane, G. T. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut. 28 (10), 1221-1227 (1987).
- Macfarlane, G. T., Gibson, G. R., Cummings, J. H. Comparison of fermentation reactions in different regions of the human colon. J Appl Bacteriol. 72 (1), 57-64 (1992).
- Neis, E. P., et al. Distal versus proximal intestinal short-chain fatty acid release in man. Gut. 68 (4), 764-765 (2019).
- Yamashita, H., et al. Effects of acetate on lipid metabolism in muscles and adipose tissues of type 2 diabetic Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) Rats. Biosci Biotechnol Biochem. 73 (3), 570-576 (2009).
- Ríos-Covián, D., et al. Intestinal short chain fatty acids and their ink with diet and human health. Front Microbiol. 7, 185(2016).
- Jaworska, K., et al. An in vivo method for evaluating the gut-blood barrier and liver metabolism of microbiota products. J Vis Exp. (140), e58456(2018).
- Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985(2023).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Cheever, A. W., Warren, K. S. Portal vein ligation in mice: Portal hypertension, collateral circulation, and blood flow. J Appl Physiol. 18, 405-407 (1963).
- Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clin Nutr. 28 (6), 657-661 (2009).
- Hoyles, L., et al. Microbiome–host systems interactions: Protective effects of propionate upon the blood–brain barrier. Microbiome. 6 (1), 55(2018).
- Shimizu, J., et al. Propionate-producing bacteria in the intestine may associate with skewed responses of IL10-producing regulatory T cells in patients with relapsing polychondritis. PLoS One. 13 (9), e0203657(2018).
- Wang, J., et al. Propionate protects against lipopolysaccharide-induced mastitis in mice by restoring blood–milk barrier disruption and suppressing inflammatory response. Front Immunol. 8, 1108(2017).
- Lucas, S., et al. Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss. Nat Commun. 9 (1), 55(2018).
- Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J Vis Exp. (92), e51955(2014).
- Sänger, C., et al. Intrahepatic vascular anatomy in rats and mice - Variations and surgical implications. PLoS One. 10 (11), e0141798(2015).
- Phillips, B. J., Mirzaie, M., Turco, L. Portal Vein Injuries: A Review. J Emerg Trauma. 2 (2), 4(2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
