Methodenartikel

Een abdominaal aorta-aneurysmamodel van muizen door periadventitiële infiltratie van calciumchloride en elastase

DOI:

10.3791/66674

⸱

2 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of General Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 2Key Laboratory of Birth Defects and Related Diseases of Women and Children of MOE, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Second University Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript presenteert een protocol voor het opstellen van een abdominaal aorta-aneurysmamodel van muizen met behulp van calciumchloride en elastase, waarbij de voordelen van eerdere modelleringsmethoden worden gecombineerd. Dit model kan worden gebruikt om de pathofysiologische mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan abdominale aorta-aneurysma's.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abdominaal aorta-aneurysma (AAA) is een levensbedreigende ziekte die gepaard gaat met hoge sterftecijfers. Het wordt gekenmerkt door de permanente verwijding van de abdominale aorta met een toename van ten minste 50% in arteriële diameter. Er zijn verschillende diermodellen van AAA geïntroduceerd om de pathofysiologische veranderingen na te bootsen en de onderliggende mechanismen van AAA te bestuderen. Van deze modellen worden de calciumchloride (CaCl2)- en elastase-geïnduceerde AAA-modellen vaak gebruikt bij muizen. Deze methoden hebben echter bepaalde beperkingen. Traditionele intraluminale perfusie van varkenspancreaselastase (PPE) gaat gepaard met hoge technische problemen en een hoog breukpercentage, terwijl periadventitiële toediening van PPE inconsistente resultaten oplevert. Bovendien mist het CaCl 2-geïnduceerde AAA-model menselijke AAA-kenmerken, zoals atherotrombose en aneurysmaruptuur. Daarom is de gecombineerde toepassing van CaCl2 en PPE voorgesteld als een aanpak om de slagingspercentages te verbeteren en een grotere diametertoename in AAA-diermodellen te induceren. Dit manuscript presenteert een uitgebreid protocol voor het opzetten van een AAA-model voor muizen door middel van periaorta-infiltratie van PPE en CaCl2 in het infrarenale segment van de abdominale aorta. Door dit protocol te volgen, kunnen we een AAA-vormingspercentage van ongeveer 90% bereiken met technische eenvoud en reproduceerbaarheid. Verdere echografie en histologische experimenten bevestigen dat dit model de morfologische en pathologische veranderingen die zijn waargenomen bij menselijke AAA effectief repliceert.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abdominaal aorta-aneurysma (AAA) wordt gedefinieerd als een diametertoename van meer dan 50% of een maximale aortadiameter van meer dan 3 cm in de abdominale aorta. Deze aandoening vormt een aanzienlijke bedreiging voor het leven, met een sterftecijfer van ongeveer 90% bij aneurysmaruptuur 1,2,3. Momenteel zijn open chirurgisch herstel en endovasculaire aortareparatie (EVAR) de enige beschikbare interventies voor AAA-patiënten 4,5,6. Er is echter onvoldoende bewijs om de effectiviteit van medische behandelingen te ondersteunen bij het remmen van de vorming van aneurysma's of het vertragen van de groeisnelheid van de abdominale aorta bij patiënten die geen chirurgische indicaties hebben7. Desalniettemin worden niet-specifieke behandelingen, waaronder aanhoudende bewaking van de maximale aneurysmadiameter, bloeddrukcontrole, plaatjesaggregatieremmers en statines, gebruikt om het risico op plotselinge aneurysmaruptuur en mogelijke cardiovasculaire en neurologische gebeurtenissen zoveel mogelijk te verminderen. Desondanks blijft de rol van plaatjesaggregatieremmers en statines bij het voorkomen van aneurysmaruptuur controversieel en vereist verdere studies 5,7,8,9,10.

Een stabiel AAA-diermodel is van vitaal belang voor het onderzoeken van de pathogenese van AAA, en er zijn tal van methoden geïntroduceerd om een dergelijk model op te zetten 11,12,13. Momenteel worden calciumchloride (CaCl2), elastase, angiotensine II (Ang II), xenotransplantaten en transgene modellen gebruikt bij het opstellen van AAA-modellen voor knaagdieren 11,12,13. Hiervan wordt Ang II het meest gebruikt bij muizen, terwijl CaCl2 en elastase ook veel worden gebruikt bij muizen en ratten 11,12,13,14. Het Ang II-geïnduceerde AAA-model is het enige diermodel dat atherosclerose kan induceren dat sterk lijkt op de menselijke AAA-pathologie, die eenvoudig en reproduceerbaar is en de noodzaak van laparotomie overbodig maakt 11,12,13. In tegenstelling tot de modellen geïnduceerd door CaCl2 of elastase, is de plaats van aneurysma's geïnduceerd door Ang II echter onzeker en wordt deze vaak waargenomen in de dalende aorta of suprarenale abdominale aorta, met een verhoogd risico op ruptuur 11,12,13,14. De incidentie van aneurysma's van het Ang II-geïnduceerde AAA-model bij muizen met een tekort kan oplopen tot 100%, terwijl slechts 39% van de C57BL/6-muizen aneurysma's ontwikkelde, en de tijd en economische kosten van het verkrijgen van gen-deficiënte muizen zijn hoog13,15.

Oorspronkelijk geïntroduceerd door Gertz et al., werd CaCl2 gebruikt om aneurysmavorming in de halsslagader te induceren en later gewijzigd door Chiou et al. om een AAA-model bij muizen op te zetten16,17. Ondanks het vermogen om elastische vezelafbraak, vaatontsteking en afbraak van extracellulaire matrix te induceren, mist CaCl2 echter verschillende menselijke AAA-kenmerken, waaronder atherotrombose, intraluminale trombus (ILT) en aneurysmaruptuur12,18. Bovendien blijven de vormingssnelheid en het percentage diametertoename van periaorta CaCl2 onstabiel13,19. Het eerste intraluminale porcine pancreas elastase (PPE) perfusiemodel voor het induceren van AAA werd ontwikkeld door Anidjar et al. in 1990, gevolgd door het rapport van Bhamidipati et al. over periadventitiële PPE-infiltratie in een muizenmodel20,21. Tegenwoordig maken de meeste door elastase geïnduceerde AAA-diermodellen gebruik van het protocol van Bhamidipati vanwege de haalbaarheid en het minimaal invasieve karakter. Het is echter belangrijk op te merken dat de incidentie en de maximale diameter van AAA kunnen variëren en over het algemeen lager zijn dan intra-aorta PBM-perfusie. Bovendien vertonen aneurysma's geïnduceerd door periaorta-toepassing van elastase de neiging om spontaan te genezen 11,12,20,21,22,23.

Om deze beperkingen aan te pakken, stelden Tanaka et al. een combinatiebenadering voor met intraluminale PPE-perfusie en CaCl2-infiltratie om een AAA-model bij ratten op te zetten, wat bevredigende resultaten opleverde24. Daarnaast toonden Zhu et al. aan dat het PPE + CaCl2-model voordelen biedt zoals hogere overlevingspercentages en verhoogde aneurysmavormingspercentages in vergelijking met zowel de enkele PPE-groep als de PPE + BAPN-groep25. Deze gecombineerde aanpak vertoont ook een goede stabiliteit en reproduceerbaarheid. Bovendien hebben Bi et al. met succes een AAA-model voor konijnen opgezet via de combinatie van periaorta-CaCl2 en elastase-incubatie. De gemiddelde dilatatieratio was 65,3% ± 8,9% op dag 5, die verder steeg tot 86,5% ± 28,7% op dag 15 en aanzienlijk escaleerde tot 203,6% ± 39,1% op dag 3026. Er is momenteel echter geen bestaande literatuur die de inductie van AAA bij knaagdieren rapporteert door periaorta-CaCl2 en elastasetoepassing te combineren.

Dit manuscript presenteert een standaardprotocol voor het opstellen van een muizen AAA-model door het gecombineerde gebruik van periadventitiële CaCl2 - en elastase-infiltratie. De volgende secties bieden gedetailleerde chirurgische ingrepen en presenteren representatieve resultaten van het muizen AAA-model.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol voor dierproeven voldeed aan de National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Pub No. 86/23, 1985) en werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het West China Hospital, Sichuan University (goedkeuringsnummer 202311300012). Voor dit onderzoek werden acht tot tien weken oude C57/B6J mannelijke muizen gebruikt. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Preoperatieve voorbereiding

  1. Verkrijg de dieren en voer ze een normaal chow-dieet met schoon water onder standaardomstandigheden (temperatuur 24 °C, vochtigheid 40%-50%, 12-uurs licht-donkercyclus).
  2. Snijd een wattenschijfje in reepjes van 40 mm x 4 mm en steriliseer het samen met een schaar, tang en ander chirurgisch materiaal.
  3. Plaats het dier in de inductiekamer van het anesthesieapparaat en gebruik 3%-3,5% isofluraan om snel anesthesie op te wekken (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Daarnaast moet butorfanol (1 mg/kg, intramusculaire injectie) worden voorgeschreven als preventieve analgesiemedicatie.
    1. Haal de muis uit de kamer wanneer deze niet meer reageert op pijnstimulatie, plaats vervolgens een masker op de muis en handhaaf de diepte van de anesthesie met 1%-1,5% isofluraan. Controleer de ademhalingsfrequentie en -diepte elke 5-10 minuten.
  4. Plaats de muis in rugligging op het verwarmingskussen, gebruik plakband om de ledematen te immobiliseren en breng oogzalf aan om uitdroging te voorkomen.
  5. Gebruik een elektrisch scheerapparaat of ontharingslotion om het haar in de buikstreek volledig te verwijderen en desinfecteer dit gebied vervolgens minstens drie keer in een cirkelvormige beweging met povidonjodium en met ethanol doordrenkte wattenstaafjes.

2. Chirurgische ingreep

  1. Plaats de muis onder een stereomicroscoop. Maak met een schaar een incisie in de lengterichting van ongeveer 2-2,5 cm langs de middellijn van de buik.
  2. Ga de peritoneale holte binnen via de linea alba (transabdominale benadering), plaats een retractor om de peritoneale holte bloot te leggen en verpak de darmen en dikke darm in de rechterhelft van de buik met behulp van normaal met zoutoplossing doordrenkt gaas.
  3. Voer een stompe scheiding uit van bind- en vetweefsel grenzend aan de infrarenale abdominale aorta en de inferieure vena cava (IVC) met behulp van een tang en wattenstaafjes. Ontleed de abdominale aorta voorzichtig en leg de opening tussen de abdominale aorta en de bovenliggende psoas major bloot, zoals eerder vermeld25.
    1. Steek de gesteriliseerde wattenschijfstrips in die opening en zorg ervoor dat u de lumbale slagader of ader niet beschadigt. Het is niet nodig om de abdominale aorta te isoleren van de IVC.
  4. Doordrenk het watje met 0,9 M CaCl2 en plaats het gedurende 15 minuten op de adventitia van de abdominale aorta. Gebruik gesteriliseerd gaas om de buikholte te bedekken tijdens het infiltratieproces.
  5. Verwijder voorzichtig het in CaCl2 gedrenkte watje en was het geïnfiltreerde segment met 0,9% zoutoplossing.
  6. Verdun de elastase tot 2 mg/ml (8 E/ml) met ddH2O. Gebruik een insulinespuit om 50 μl verdunde elastase aan te brengen op het infrarenale segment van de abdominale aorta en wikkel de wattenschijfstrips om de abdominale aorta en IVC te bedekken. Gebruik gesteriliseerd gaas om de buikholte te bedekken tijdens het infiltratieproces. Gebruik in de Sham-groep 0,9% normale zoutoplossing ter vervanging van CaCl2 en PBM.
  7. Verwijder 15 minuten later voorzichtig het gaas en de stroken wattenschijfjes. Verplaats de darmen en de dikke darm terug naar hun oorspronkelijke posities, bedek de behandelde aorta met het mesenterium en bevochtig de darmen om verkleving te voorkomen.
  8. Sluit de spierlaag en de huid afzonderlijk met behulp van 6-0 niet-resorbeerbare polypropyleen hechtdraad. Desinfecteer het operatiegebied met povidonjodium en ethanol.
  9. Plaats de muis op een verwarmingskussen en controleer de ademhalingsstatus totdat hij weer bij bewustzijn is. Noteer de operatietijd en het aantal proefdieren. Carprofen (5 mg/kg, subcutaan) voorschrijven als postoperatieve analgesie gedurende ten minste 3 dagen na de operatie, volgens de aanbeveling van de dierenarts.

3. Ultragrafisch onderzoek

  1. Voer 21 dagen na de operatie een echografisch onderzoek uit om de incidentie van AAA te evalueren.
  2. Verdoof de muis (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) en verwijder het buikhaar zoals eerder beschreven.
  3. Plaats de muis op het verwarmingskussen van het echoapparaat voor knaagdieren. Breng ultrasoon koppelmiddel aan op de buik en meet de maximale diameter van het aneurysma en de diameter van het normale segment van de abdominale aorta.
    1. Bereken het verhoogde percentage van de infrarenale abdominale aorta. Het criterium voor succesvolle AAA-vorming is dat de maximale diameter van de AAA met 50% of meer is toegenomen ten opzichte van de diameter van het normale segment van de infrarenale abdominale aorta.
  4. Gebruik een servet om de resterende ultrasone darmstof na het onderzoek af te vegen en plaats de muis op het verwarmingskussen totdat deze volledig is hersteld.

4. Abdominale aortaoogst en pathologische experimenten

  1. Offer de muis door een overdosis isofluraan op de dag na het echografisch onderzoek (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  2. Open de borst- en buikholte en voer perfusie uit met 1x PBS door de linker ventrikel totdat de longen en lever wit worden, volgens de procedure die in eerdere literatuur is beschreven27.
  3. Gebruik een digitale schuifmaat om de uitwendige diameter van de infrarenale aorta te meten. Oogst de infrarenale abdominale aorta onder een stereomicroscoop en bewaar het vat 24-48 uur in 4% paraformaldehyde.
  4. Verwijder het bind- en vetweefsel rond de abdominale aorta. Sluit de aorta in paraffine om secties voor te bereiden en snijd de secties in plakjes van 3-5 μm zoals eerder beschreven18,28.
  5. Voer hematoxyline en eosine (H&E), Masson's trichroom en Elastic-Van Gieson (EVG) kleuring uit op de gedeparaffiniseerde plakjes met behulp van de respectievelijke kleuringskits volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Analyseer de vaatstructuur en ontsteking met H&E-kleuring, observeer de afbraak van extracellulaire matrix (ECM) en collageenvezels met de trichrome kleuring van Masson en onderzoek elastische vezels met EVG-kleuring.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie werden in totaal 24 muizen geïncludeerd en willekeurig toegewezen: respectievelijk 12 in de Sham-groep en 12 in de PPE + CaCl2-groep . Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± standaarddeviaties, tenzij anders vermeld. De gemiddelde bedrijfstijd bedroeg 55,67 min ± 4,08 min. Er waren geen intra-operatieve sterfgevallen of aneurysmarupturen en het overlevingspercentage binnen 21 dagen na de operatie was 100%. Er werden geen ernstige darmverklevingen of complicaties in verband met abdominale aortadissectie waargenomen.

In de PPE + CaCl2-groep ontwikkelden 11 van de 12 muizen (91,67%) AAA op 21 dagen na de operatie, terwijl er geen aneurysmavorming werd waargenomen in de Sham-groep. De gemiddelde maximale inwendige diameter van de infrarenale abdominale aorta was 1,29 mm ± 0,18 mm in de PPE + CaCl2-groep , vergeleken met 0,50 mm ± 0,04 mm in de Sham-groep. De gemiddelde procentuele toename van de inwendige diameter van de infrarenale abdominale aorta in de PPE + CaCl2-groep was 99,50% ± 25,42%. De gemiddelde maximale externe infrarenale aortadiameter was 1,49 mm ± 0,19 mm in de PPE + CaCl2-groep , vergeleken met 0,61 mm ± 0,04 mm in de Sham-groep.

Representatieve beelden van de abdominale aorta in de Sham- en PPE + CaCl2-groepen onder een stereomicroscoop en echografie werden getoond in figuur 1A,B. Statistische analyseresultaten van de gemiddelde maximale interne en externe diameter van de infrarenale abdominale aorta in de PPE + CaCl2- en Sham-groepen werden gepresenteerd in figuur 1C,D. Verder histologisch onderzoek met H&E-kleuring toonde verdikking van de aortawand en infiltratie van ontstekingscellen in de PPE + CaCl2-groep, terwijl de trichrome kleuring van Masson extracellulaire matrixdegradatie en afzetting van collageenvezels in de aortawand vertoonde. EVG-kleuring vertoonde elastische vezelafbraak (Figuur 1E).

figure-results-1
Figuur 1: Resultaten van het AAA-model van muizen vastgesteld door periadventitiële CaCl2 en elastase-infiltratie. (A) Representatieve beelden van de normale abdominale aorta en AAA onder stereomicroscoop. (B) Transversale en longitudinale echografiebeelden van de abdominale aorta in de Sham- en PPE + CaCl2-groep . (C) Statistische analyse van de maximale inwendige diameter van de infrarenale abdominale aorta in de Sham- en PPE + CaCl2-groep , ****p < 0,0001. (D) Vergelijking van de externe infrarenale aortadiameter van Sham en PPE + CaCl2-groep , ****p < 0,0001. (E) H&E, Masson en EVG kleuringsbeelden van de abdominale aorta. Schaal balken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek naar de moleculaire mechanismen van AAA vraagt om een stabiel diermodel. Dientengevolge zijn er sinds de eerste ontwikkeling door Economou et al. in de jaren 1960 talrijke AAA-diermodellen opgesteld29. Van deze modellen wordt CaCl2 vaak gebruikt bij knaagdieren vanwege de kosteneffectiviteit, technische eenvoud en betrouwbare reproduceerbaarheid. Het is echter aangetoond dat perivasculaire CaCl2-infiltratie onstabiel is bij het tot stand brengen van AAA. Bi et al. en Freestone et al. rapporteerden dat slechts ongeveer 60% van de ratten AAA ontwikkelde, zelfs wanneer het criterium voor AAA-vorming werd gedefinieerd als een toename van 20% in vergelijking met het normale segment van de abdominale aorta. Beide studies merkten op dat er geen aneurysmavorming werd waargenomen na een enkele periaortainbatie van 0,5 mol/L CaCl2 gedurende 20 minuten 13,19,26,30.

Bovendien is er momenteel geen consensus in de bestaande literatuur over de optimale concentratie van CaCl2-infiltratie, de blootstellingstijd en de follow-upduur11. Als zodanig is het door elastase geïnduceerde AAA-model het op één na meest gebruikte knaagdiermodel voor het bestuderen van AAA. Intra-aorta PPE-infusie wordt echter in verband gebracht met hoge peri-operatieve en postoperatieve sterftecijfers, tot 40%. Bovendien zijn er opmerkelijke genderverschillen waargenomen in het PPE-geïnduceerde AAA-model, waarbij vrouwelijke muizen een veel lagere procentuele toename van de aortadiameter vertoonden in vergelijking met hun mannelijke tegenhangers 11,20,25,31,32,33.

Om deze beperkingen aan te pakken, werd een aangepaste versie van het elastase-geïnduceerde AAA-model met perivasculaire elastase-infiltratie geïntroduceerd als een haalbaar en minder invasief alternatief. Er moet echter worden opgemerkt dat de vormingssnelheid en diameter van het aneurysma bij deze benadering minder stabiel waren dan bij intraluminale PPE-perfusie 11,12,21,22. Daarom stelden onderzoekers een combinatie van periadventitiële CaCl2 en elastase-incubatie voor om AAA bij konijnen tot stand te brengen, waarvan is aangetoond dat het eenvoudig, effectief en reproduceerbaar is26.

Ondertussen heeft een andere studie een AAA-model bij ratten vastgesteld door PPE-perfusie en CaCl 2-incubatie te combineren, wat aantoont dat het PPE + CaCl2-model hoge overlevingspercentages, hoge aneurysmavormingspercentages en een goede reproduceerbaarheid heeft25. Er is momenteel echter geen literatuur over het gebruik van peri-aorta PPE + CaCl2-infiltratie om AAA bij muizen vast te stellen en de resultaten ervan.

Dit artikel geeft aan dat de AAA-incidentie en de toename van het percentage aortadiameter met behulp van dit protocol stabiel bleven zonder peri-operatieve sterfgevallen, zoals bevestigd door echografie en histologie-onderzoeken. Bovendien induceert dit protocol effectief morfologische en pathologische veranderingen die vergelijkbaar zijn met die welke worden gezien bij menselijke AAA. Bovendien was de gemiddelde werkingstijd voor dit protocol beperkt tot minder dan 1 uur, inclusief 15 minuten CaCl 2-infiltratie en 15 minuten PPE-incubatie. Dit chirurgische protocol is robuust en gemakkelijk te implementeren, met behulp van direct beschikbare materialen. Deze voordelen suggereren de mogelijke toepassing ervan in toekomstige inspanningen op het gebied van fundamenteel onderzoek.

Er bestaan discrepanties in de snelheid van de ontwikkeling van aneurysma's in PPE- of CaCl 2-geïnduceerde AAA-diermodellen, en de huidige chemisch geïnduceerde modellen kunnen geen 100% slagingspercentage garanderen bij het vaststellen van AAA 11,12,13. Hoewel pathologische veranderingen geassocieerd met AAA, zoals chronische ontsteking, intima/mediadikte, elastische afbraak, verkalking en intraluminale trombus, kunnen worden waargenomen na PPE- of CaCl2-infiltratie, kan de verwijding van de aorta of de vorming van een aneurysma de neiging hebben spontaan te genezen omdat de chemische toepassingsperiode beperkt is en geen voortdurende activiteit biedt zodra de stimulus stopt12, 23. okt. Bovendien kan de chirurgische procedure voor het vaststellen van AAA niet volledig worden gestandaardiseerd, wat leidt tot mogelijke variaties in de mate van blootstelling van de abdominale aorta, wat de vorming van aneurysma's kan beïnvloeden. Maar zelfs bij muizen waar modellering niet succesvol was, vertoonde de diameter van de abdominale aorta nog steeds een significante expansie van 44%, wat aangeeft dat deze methode een aanzienlijke vergroting van de abdominale aorta kan veroorzaken, hoewel deze niet altijd voldoet aan de diagnostische criteria voor abdominaal aorta-aneurysma.

Van bijzonder belang is dat dit protocol een aantal cruciale stappen omvat. Eerst en vooral is het absoluut noodzakelijk dat de infrarenale abdominale aorta adequaat wordt blootgelegd tijdens de oprichting van het AAA-model van de muis. Het maximaliseren van de scheiding van bind- en vetweefsel rond de abdominale aorta vergemakkelijkt een betere infiltratie van CaCl2 en elastase in de middelste laag van de infrarenale abdominale aorta, waardoor de snelheid van aneurysmavorming toeneemt22. Bovendien kan het gemakkelijker zijn om bind- en vetweefsel te scheiden na CaCl2-infiltratie. Daarom, als de initiële dissectie van het omliggende weefsel niet bevredigend is, is het raadzaam om door te gaan met het scheiden van het bindweefsel naast de abdominale aorta na CaCl2-infiltratie. Het blootleggen van de abdominale aorta brengt echter inherente risico's met zich mee van beschadiging van de lumbale slagader en ader, wat mogelijk kan leiden tot ernstige bloedingen en fatale gevolgen tijdens of na de operatie. Daarom moet de grootste voorzichtigheid worden betracht bij het verwijderen van bind- en vetweefsel rond de abdominale aorta. Een andere belangrijke stap in dit protocol is de scheiding van de abdominale aorta van de inferieure vena cava (IVC). Eerdere studies en experimentele bevindingen geven consequent aan dat het al dan niet ontleden van de IVC uit de abdominale aorta geen invloed heeft op de vorming van aneurysma's, waardoor het niet nodig is voor deze procedure18,22.

Deze studie heeft verschillende beperkingen. Ten eerste ontbreken er basisgegevens over de incidentie van aneurysma's en pathologische veranderingen in de abdominale aorta op verschillende tijdstippen. Bovendien evalueerde het niet de niveaus van belangrijke biomarkers die betrokken zijn bij de ontwikkeling van AAA, zoals MMP2, MMP9, TIMP1 en SMA. Ten tweede is deze methode niet eerder gebruikt bij muizen en mist het cross-sectionele vergelijkingen met andere veelgebruikte modellen, vooral die met alleen PPE of CaCl2 , om de vorming van aneurysma's en pathologische kenmerken te beoordelen. Ten derde mist AAA die door deze methode wordt geïnduceerd verschillende kenmerken van menselijke AAA, waaronder atherosclerose en intramurale trombose. Bovendien verschillen de concentraties van CaCl2 en elastase die in deze methode worden gebruikt, evenals de infiltratietijd, enigszins van die welke in eerdere studies zijn gebruikt. De auteurs willen deze vragen beantwoorden door middel van experimenteel onderzoek in toekomstige studies.

Een andere beperking van dit protocol is de toepasbaarheid op grotere diermodellen, zoals varkens of honden. Momenteel hebben individuele chemische middelen zoals elastase, collagenase of CaCl2 niet aangetoond dat ze in staat zijn om een verwijding van 50% van de abdominale aorta te induceren bij niet-knaagdieren, behalve bij konijnen. Alleen combinaties van chemicaliën en angioplastiek of andere chirurgische ingrepen hebben potentieel aangetoond voor het induceren van aneurysmavorming bij honden en varkens11,34. Eerder onderzoek heeft ook aangetoond dat aneurysma's tekenen van regeneratie vertoonden tijdens een follow-up van 5 maanden in een AAA-model van konijnen geïnduceerd door elastase35. Hoewel Bi et al. de inductie van AAA bij konijnen hebben aangetoond met behulp van dit protocol, zijn verdere studies nodig om de geldigheid en langetermijnresultaten bij varkens of honden te bepalen.

De laatste beperking betreft de opname van alleen mannelijke muizen, aangezien het induceren van AAA bij vrouwelijke muizen die elastase gebruiken, in verband is gebracht met lagere percentages aneurysmavorming en aortaverwijdingspercentage 11,13,33,36. Studies van Xue et al. hebben echter aangetoond dat perivasculaire toepassing van elastase alleen resulteerde in een incidentie van 90% van AAA bij vrouwelijke muizen. Dit suggereert dat dit protocol ook effectief kan zijn bij vrouwelijke muizen22, hoewel verdere studies gerechtvaardigd zijn om de werkzaamheid ervan te bevestigen. Het is ook belangrijk op te merken dat schade aan de vaatstructuur en elastische vezels alleen optreedt aan de kant die is geïnfiltreerd door CaCl2 en elastase, en dat er geen pathologische veranderingen optreden aan de kant naast de inferieure vena cava (IVC) vanwege hun nabijheid. Zoals eerder vermeld, hebben deze factoren echter geen invloed op de incidentie van AAA of de procentuele toename van de abdominale aortagrootte tijdens de ontwikkeling van AAA.

Concluderend presenteert dit manuscript een nieuw, veilig, stabiel en reproduceerbaar AAA-model voor muizen dat een hoge incidentie van AAA, significante verwijding van de abdominale aorta en pathofysiologische veranderingen aantoont die lijken op die waargenomen bij menselijke AAA. Ondanks zijn beperkingen heeft dit AAA-muismodel een groot potentieel voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan AAA en voor het ontwikkelen van effectieve therapeutische benaderingen voor patiënten met deze aandoening.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundations of China (nr. 82300542, 81770471), Sichuan Science and Technology Program (nr. 2022YFS0359, 2019JDRC0104) en Post-Doctor Research Project, West China Hospital, Sichuan University (nr. 2023HXBH108). De subsidieverstrekkers speelden geen rol bij het ontwerp van het onderzoek, het verzamelen, analyseren en interpreteren van de gegevens en het schrijven van het manuscript.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anesthesia MachineRWDR550
ButorphanolJiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd220608BP1ml: 1mg
C57BL/6JGpt Male MiceGemPharmatechN000013
Calcium ChlorideSigma AldrichC4901100 g
CarprofenMCEHY-B1227100 mg
Chow DietDossy Experimental Animals Co.Ltd
Digital CaliperGreenerIP54
EthanolJinhe Pharmaceutical Co.Ltd53968275%/500 mL
EVG Staining KitSolarbioG1597
GraphPad PrismGraphpadVer 9.0.0
H&E Staining KitServicebioG1076
Insulin SyringeBD2143420
IsofluraneRWDR510-22-4100 mL
Masson Staining KitServicebioG1006
Normal SalineServicebioG4702500 mL
ParaformaldehydeBiosharpBL539A4%/500 mL
PBS, 1xServicebioG4202500 mL
Porcine Pancreatic ElastaseSigma AldrichE1250100 mg
Povidine IodineYongan Pharmaceutical Co.Ltd5%/100 mg
Prolene Polypropylene SutureEthicon LLC8709H
Rodent Ultrasound SystemFujifilmVevo 3100LT
Stereo MicroscopeOlympusSZ61
Ultrasonic CouplantKepplerKL-250250 g

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chaikof, E. L., et al. The Society for Vascular Surgery practices guidelines on the care of patients with an abdominal aortic aneurysm. J Vasc Surg. 67 (1), 2-77 (2018).
  2. Johnston, K. W., et al. Suggested standards for reporting on arterial aneurysms. Subcommittee on reporting standards for arterial aneurysms, ad hoc committee on reporting standards, society for vascular surgery and north American chapter, international society for cardiovascular surgery. J Vasc Surg. 13 (3), 452-458 (1991).
  3. Bown, M. J., Sutton, A. J., Bell, P. R. F., Sayers, R. D. A meta-analysis of 50 years of ruptured abdominal aortic aneurysm repair. Br J Surg. 89 (6), 714-730 (2002).
  4. Erbel, R., et al. Esc guidelines on the diagnosis and treatment of aortic diseases: Document covering acute and chronic aortic diseases of the thoracic and abdominal aorta of the adult. The task force for the diagnosis and treatment of aortic diseases of the European Society of Cardiology (ESC). Eur Heart J. 35 (41), 2873-2926 (2014).
  5. Wanhainen, A., et al. Editor's choice - European Society for Vascular Surgery (ESVS) 2019 clinical practice guidelines on the management of abdominal aorto-iliac artery aneurysms. Eur J Vasc Endovasc Surg. 57 (1), 8-93 (2019).
  6. Veith, F. J., Ohki, T., Lipsitz, E. C., Suggs, W. D., Cynamon, J. Treatment of ruptured abdominal aneurysms with stent grafts: A new gold standard. Semin Vasc Surg. 16 (2), 171-175 (2003).
  7. Golledge, J., Thanigaimani, S., Powell, J. T., Tsao, P. S. Pathogenesis and management of abdominal aortic aneurysm. Eur Heart J. 44 (29), 2682-2697 (2023).
  8. Wanhainen, A., et al. Editor's choice -- European Society for Vascular Surgery (ESVS) 2024 clinical practice guidelines on the management of abdominal aorto-iliac artery aneurysms. Eur J Vasc Endovasc Surg. 67 (2), 192-331 (2024).
  9. Golledge, J., et al. Lack of an effective drug therapy for abdominal aortic aneurysm. J Intern Med. 288 (1), 6-22 (2020).
  10. Li, R., Liu, Y., Jiang, J. Research advances in drug therapy for abdominal aortic aneurysms over the past five years: An updated narrative review. Int J Cardiol. 372, 93-100 (2023).
  11. Lysgaard Poulsen, J., Stubbe, J., Lindholt, J. S. Animal models used to explore abdominal aortic aneurysms: A systematic review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 52 (4), 487-499 (2016).
  12. Sénémaud, J., et al. Translational relevance and recent advances of animal models of abdominal aortic aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (3), 401-410 (2017).
  13. Patelis, N., et al. Animal models in the research of abdominal aortic aneurysm development. Physiol Res. 66 (6), 899-915 (2017).
  14. Golledge, J., Krishna, S. M., Wang, Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. Br J Pharmacol. 179 (5), 792-810 (2022).
  15. Deng, G. G., et al. Urokinase-type plasminogen activator plays a critical role in angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm. Circ Res. 92 (5), 510-517 (2003).
  16. Gertz, S. D., Kurgan, A., Eisenberg, D. Aneurysm of the rabbit common carotid artery induced by periarterial application of calcium chloride in vivo. J Clin Invest. 81 (3), 649-656 (1988).
  17. Chiou, A. C., Chiu, B., Pearce, W. H. Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride. J Surg Res. 99 (2), 371-376 (2001).
  18. Zhang, S., Cai, Z., Zhang, X., Ma, T., Kong, W. A calcium phosphate-induced mouse abdominal aortic aneurysm model. J Vis Exp. (189), e64173(2022).
  19. Isenburg, J. C., Simionescu, D. T., Starcher, B. C., Vyavahare, N. R. Elastin stabilization for treatment of abdominal aortic aneurysms. Circulation. 115 (13), 1729-1737 (2007).
  20. Anidjar, S., et al. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).
  21. Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
  22. Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. Mouse abdominal aortic aneurysm model induced by perivascular application of elastase. J Vis Exp. (180), e63608(2022).
  23. Origuchi, N., et al. Aneurysm induced by periarterial application of elastase heals spontaneously. Int Angiol. 17 (2), 113-119 (1998).
  24. Tanaka, A., Hasegawa, T., Zhi, C., Okita, Y., Okada, K. A novel rat model of abdominal aortic aneurysm using a combination of intraluminal elastase infusion and extraluminal calcium chloride exposure. J Vasc Surg. 50 (6), 1423-1432 (2009).
  25. Zhu, J. X., et al. Establishment of a new abdominal aortic aneurysm model in rats by a retroperitoneal approach. Front Cardiovasc Med. 9, 808732(2022).
  26. Bi, Y., et al. Development of a novel rabbit model of abdominal aortic aneurysm via a combination of periaortic calcium chloride and elastase incubation. PLoS One. 8 (7), e68476(2013).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  28. Ishida, Y., et al. Prevention of CaCl2-induced aortic inflammation and subsequent aneurysm formation by the CCL3-CCR5 axis. Nat Commun. 11 (1), 5994(2020).
  29. Economou, S. G., Taylor, C. B., Beattie, E. J., Davis, C. B. Persistent experimental aortic aneurysms in dogs. Surgery. 47, 21-28 (1960).
  30. Freestone, T., Turner, R. J., Higman, D. J., Lever, M. J., Powell, J. T. Influence of hypercholesterolemia and adventitial inflammation on the development of aortic aneurysm in rabbits. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17 (1), 10-17 (1997).
  31. Carsten, C. G., et al. Elastase is not sufficient to induce experimental abdominal aortic aneurysms. J Vasc Surg. 33 (6), 1255-1262 (2001).
  32. Yue, J., Yin, L., Shen, J., Liu, Z. A modified murine abdominal aortic aneurysm rupture model using elastase perfusion and angiotensin II infusion. Ann Vasc Surg. 67, 474-481 (2020).
  33. Ailawadi, G., et al. Gender differences in experimental aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (11), 2116-2122 (2004).
  34. Furubayashi, K., et al. The significance of chymase in the progression of abdominal aortic aneurysms in dogs. Hypertens Res. 30 (4), 349-357 (2007).
  35. Bi, Y., et al. Performance of a modified rabbit model of abdominal aortic aneurysm induced by topical application of porcine elastase: 5-month follow-up study. Eur J Vasc Endovasc Surg. 45 (2), 145-152 (2013).
  36. Wu, X. F., Zhang, J., Paskauskas, S., Xin, S. J., Duan, Z. Q. The role of estrogen in the formation of experimental abdominal aortic aneurysm. Am J Surg. 197 (1), 49-54 (2009).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

AAA muismodelinfiltratie van calciumchlorideperiadventiti le applicatieinfrarenale abdominale aortaverdikking van de aortawanddegradatie van de extracellulaire matrixechografische metinghistologisch onderzoek

Gerelateerde artikelen