Snelle detectie van bacteriële pathogenen die infecties van de onderste luchtwegen veroorzaken via op microfluïdische-chips gebaseerde lus-gemedieerde isotherme amplificatie

Samenvatting

Verschillende bacteriële ziekteverwekkers kunnen luchtweginfecties veroorzaken en tot ernstige gezondheidsproblemen leiden als ze niet nauwkeurig worden gedetecteerd en onmiddellijk worden behandeld. Snelle en nauwkeurige detectie van deze ziekteverwekkers via lusgemedieerde isotherme amplificatie zorgt voor een effectief beheer en controle van luchtweginfecties in klinische omgevingen.

Samenvatting

Luchtweginfecties (RTI's) behoren tot de meest voorkomende problemen in klinische omgevingen. Snelle en nauwkeurige identificatie van bacteriële pathogenen zal praktische richtlijnen opleveren voor het beheer en de behandeling van RTI's. Deze studie beschrijft een methode voor het snel detecteren van bacteriële pathogenen die luchtweginfecties veroorzaken via meerkanaals lusgemedieerde isotherme amplificatie (LAMP). LAMP is een gevoelig en specifiek diagnostisch hulpmiddel dat snel bacteriële nucleïnezuren detecteert met hoge nauwkeurigheid en betrouwbaarheid. De voorgestelde methode biedt een aanzienlijk voordeel ten opzichte van traditionele bacteriële kweekmethoden, die tijdrovend zijn en vaak een grotere gevoeligheid vereisen voor het detecteren van lage niveaus van bacteriële nucleïnezuren. Dit artikel presenteert representatieve resultaten van K. pneumoniae-infectie en zijn meerdere co-infecties met behulp van LAMP om monsters (sputum, bronchiale lavagevloeistof en alveolaire lavagevloeistof) uit de onderste luchtwegen te detecteren. Samenvattend biedt de meerkanaals LAMP-methode een snelle en efficiënte manier om enkelvoudige en meervoudige bacteriële pathogenen in klinische monsters te identificeren, wat kan helpen de verspreiding van bacteriële pathogenen te voorkomen en kan helpen bij de juiste behandeling van RTI's.

Inleiding

Luchtweginfecties (RTI's) veroorzaakt door bacteriële pathogenen dragen voornamelijk bij aan morbiditeit en mortaliteit^wereldwijd1. Het wordt gedefinieerd als alle symptomen van de bovenste of onderste luchtwegen die gepaard gaan met koorts die 2-3 dagen aanhoudt. Hoewel infectie van de bovenste luchtwegen vaker voorkomt dan infectie van de onderste luchtwegen, zijn chronische en terugkerende luchtweginfecties ook veel voorkomende klinische aandoeningen, die grote risico's met zich meebrengen voor individuen en een aanzienlijke belasting vormen voor de gezondheidszorgstelsels². Veel voorkomende bacteriële pathogenen van RTI's zijn onder andere Streptococcus pneumoniae³, Haemophilus influenzae⁴, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia. Deze pathogene bacteriën koloniseren meestal de slijmvliesoppervlakken van de neus-keelholte en de bovenste luchtwegen van de gastheer en veroorzaken typische symptomen van RTI's zoals keelpijn en bronchitis. Ze veroorzaken longontsteking wanneer ze zich verspreiden van de bovenste luchtwegen naar steriele delen van de onderste luchtwegen en kunnen zich van persoon tot persoon verspreiden via de luchtwegen⁵. In ernstige gevallen kunnen ze ook leiden tot invasieve bacteriële ziekten, met name bacteriëmische longontsteking, meningitis en sepsis, die de belangrijkste oorzaken zijn van morbiditeit en mortaliteit bij mensen van alle leeftijdsgroepen wereldwijd.

Traditionele tests voor RTI's omvatten microbiologische kweek met behulp van keeluitstrijkjes en sputumademhalingsmonsters⁶. Bovendien detecteren serologische tests zoals enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) antilichamen of antigenen in serum, terwijl agglutinatietests de agglutinatiereactie van antilichamen en antigenen observeren om infectie te detecteren⁷. Microbiële cultuur wordt beschouwd als de gouden standaard voor het diagnosticeren van RTI's, maar het lage cultuurpositiviteitspercentage, de slechte betrouwbaarheid en de lange detectiecyclus beperken de diagnostische efficiëntie⁸. In werkelijkheid is een snelle en nauwkeurige diagnose van RTI's cruciaal voor een nauwkeurige uitroeiing van de bacteriële ziekteverwekker. Snelle en effectieve detectiemethoden kunnen helpen de overdrachtssnelheid van ziekteverwekkers te verminderen, de duur van de infectie te verkorten en onnodig antibioticagebruik te verminderen ^9,10. Op moleculairbiologie gebaseerde methoden versnellen de detectie aanzienlijk, zoals polymerasekettingreactie (PCR), die de DNA-sequentie van een doelgen versterkt om ziekteverwekkers te detecteren. Traditionele PCR vereist echter complexe apparatuur voor temperatuurwisselingen, wat omslachtig en tijdrovend is. Bovendien wordt elke DNA-amplificatie met behulp van PCR (behalve real-time PCR) afgesloten met elektroforetische scheiding van het product, wat ook tijd kost. Visualisatie van het product vereist kleurstoffen, waarvan er vele mutageen of kankerverwekkend zijn. Daarom is het absoluut noodzakelijk om voortdurend nieuwe methoden en technologieën te ontwikkelen voor het diagnosticeren van RTI-bacteriële pathogenen.

Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) is een nieuwe en opkomende moleculaire technologie die oorspronkelijk werd ontwikkeld door Notomi et al. in 2000¹¹. LAMP kan DNA amplificeren onder stabiele isotherme omstandigheden zonder complexe apparatuur voor temperatuurwisselingen, waardoor het geschikt is voor snelle detectie en de complexiteit en kosten van apparatuur vermindert¹². LAMP kan lage concentraties doel-DNA detecteren met een hoge gevoeligheid¹³. Het maakt gebruik van meerdere specifieke primers om de selectiviteit voor doelsequenties te verbeteren en de kans op valse positieven te verminderen¹⁴. LAMP wordt geleidelijk op grote schaal gebruikt in klinische laboratoria vanwege het gemak, de snelheid en de intuïtieve bediening, zelfs voor het detecteren van RTI's. In deze studie onderzochten we de effectiviteit van LAMP bij het detecteren van lagere RTI's in klinische monsters (sputum, bronchiale lavagevloeistof en alveolaire lavagevloeistof), zoals weergegeven in figuur 1. Het is duidelijk dat LAMP voordelen biedt zoals snelheid, gevoeligheid en gebruiksgemak ten opzichte van traditionele tests bij detectie van lagere RTI's, waardoor het een veelbelovende toepassing is.

Figuur 1: Schematische weergave van de LAMP-detectiemethode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle monsters voor deze studie werden geëvalueerd en goedgekeurd door de ethische beoordelingscommissie van het provinciale volksziekenhuis van Guangdong (goedkeuringsnummer: KY2023-1114-01). Alle deelnemers ondertekenden schriftelijke geïnformeerde toestemming vóór de experimenten. De reagentia en apparatuur die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel. De afkortingen die in het protocol worden gebruikt, zijn opgenomen in aanvullende tabel 1.

1. Afname van klinische monsters van de onderste luchtwegen

1. Sputum collectie
   1. Reinig de mondholte en tanden met schoon water en zorg ervoor dat de prothese indien van toepassing wordt verwijderd. Hoest krachtig om diep respiratoir sputum in een sputumcontainer (minimaal 0,6 ml) te verdrijven.
   2. Vermijd besmetting met speeksel of loopneus. Als hoesten moeilijk is, dien dan inhalatie van een 100 g/L NaCl-oplossing bij 45 °C toe om het slijmen te vergemakkelijken. Breng het monster over in een steriele, afsluitbare container.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de sputummonsters 's ochtends en vóór het gebruik van antibacteriële geneesmiddelen worden verzameld.
2. Bronchiale spoelvloeistof (BLF)
   1. Steek de collectorkop in de luchtpijp vanuit het neusgat of de tracheacanuleplaats (ongeveer 30 cm diep). Injecteer 5 ml zoutoplossing, stel onderdruk in, draai de collectorkop en trek langzaam terug.
   2. Verzamel het geëxtraheerde slijm en spoel de collector eenmaal met een bemonsteringsoplossing (fysiologische zoutoplossing of steriel water voor injectie). U kunt ook een pediatrische urinekatheter aansluiten op een spuit van 50 ml als vervanging voor verzameling.
3. Alveolaire lavagevloeistof (ALF)
   1. Identificeer de locatie van de laesie door middel van beeldvormend onderzoek van de borstkas. Selecteer het belangrijkste of snelst voortschrijdende gebied voor lavage.
   2. Injecteer 1-2 ml 2% lidocaïne in het bronchiale segment via het biopsiekanaal tijdens het spoelen, waarbij lokale anesthesie wordt geboden voor het gespoelde longsegment¹⁵. Voor patiënten onder intraveneuze algemene anesthesie die nog steeds sterke luchtwegreacties vertonen, injecteert u 1-2 ml 2% lidocaïne.
   3. Breng na lokale anesthesie een fiberoptische bronchoscoop in door de mond of neus, door de keelholte in de bronchus van de rechter middenkwab of het linguale segment van de linkerlong. Plaats de punt bij de opening van de bronchiale tak en introduceer langzaam steriele fysiologische zoutoplossing.
   4. Dien 30-50 ml zoutoplossing per sessie toe, met een volume van 100-250 ml (max. 300 ml). Verzamel het geëxtraheerde slijm in een afgesloten steriele container.

2. DNA-extractie

1. Voeg op basis van de viscositeit van monsters van de onderste luchtwegen een geschikte hoeveelheid 10% NaOH toe. Voeg voor monsters met een lage viscositeit 2-3 keer het volume van het monster van de vloeibaarmakingsoplossing toe. Voor monsters met een matige viscositeit voegt u 5-6 keer het volume van het monster van de vloeibaarmakingsoplossing toe. Voeg voor monsters met een hoge viscositeit 8-10 keer het volume van het monster vloeibaarmakende oplossing toe.
   1. Pas het volume van 10% NaOH aan op basis van de viscositeit van het monster. Verspreid de monsters zo gelijkmatig mogelijk met behulp van een vortexmixer gedurende 15 s en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten voor het vloeibaar maken.
      OPMERKING: Voor dikkere monsters, verhoog het volume van NaOH of verleng de vloeibaarmakingstijd. De vloeibaarmakingskwaliteit van monsters heeft een directe invloed op de latere extractie-efficiëntie. Idealiter zouden vloeibare monsters een consistente, niet-plakkerige consistentie moeten vertonen.
2. Pipette 1 ml van het vloeibare monster in een centrifugebuisje van 1,5 ml. Centrifugeer met een snelheid van 15.777 × g gedurende 5 minuten bij 2-6 °C, gebruik vervolgens een pipet om het supernatant te verwijderen en gooi het weg.
   NOTITIE: Vermijd bij het opzuigen van het monster onzuiverheden uit de bodem van de buis; Als er veel onzuiverheden zijn, kan het monster vóór aspiratie gedurende 1 minuut worden gecentrifugeerd bij 1.753-2.739 × G .
3. Voeg 1 ml wasoplossing toe aan de centrifugebuis en draaikolk om het neerslag van de bodem van de buis te tillen. Het is niet nodig om het volledig te verspreiden.
   1. Centrifugeer de oplossing bij 15.777 × g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en probeer het neerslag niet aan te raken.
      NOTITIE: Zorg voor een grondige verwijdering van de wasoplossing om te voorkomen dat de latere versterking wordt beïnvloed.
4. Voeg 100 μL nucleïnezuurextractieoplossing toe aan de centrifugebuis. Gebruik een pipet om het neerslag op te zuigen en grondig te mengen. Breng de vloeistof over en sla samen neer in een nucleïnezuurextractiebuis. De samenstelling van de nucleïnezuurextractieoplossing is weergegeven in tabel 1.
5. Plaats de nucleïnezuurextractiebuisjes in een vortexmixer en draai minimaal 5 minuten op gemiddelde snelheid. Breng de nucleïnezuurextractiebuizen na het vortexen over naar een metaalbad met een constante temperatuur en verwarm gedurende 5 minuten bij 100 °C.
6. Centrifugeer bij 15.777 × g bij 2-6 °C gedurende 5 minuten en zet apart.
   OPMERKING: Als de PCR-amplificatiereactie binnen 24 uur wordt uitgevoerd, kan het nucleïnezuur bij 4 °C worden opgeslagen. Bewaar het nucleïnezuur na de amplificatie bij -20 °C. Voor langdurige opslag (langer dan 24 uur) moet het nucleïnezuur worden opgeslagen bij -20 °C. Wanneer u klaar bent om het monster opnieuw te gebruiken, ontdooit u het op natuurlijke wijze, draait u het om te mengen, verwarmt u het gedurende 5 minuten in een waterbad van 95 °C, centrifugeert u het gedurende 1 minuut bij 10.956 × g en gebruikt u het supernatans voor PCR-amplificatie.

Oplossing	Onderdelen	Getal	Specificatie
Wasoplossing	10 mM EDTA	1 fles	24 ml/fles
Reagens voor nucleïnezuurextractie	10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, Nucleïnezuur conserveermiddelen	2 buizen	1,2 ml/fles
Nucleïnezuur extractie buis	Glaskralen	1 zakje	24 flessen/zak

Tabel 1: Samenstelling van het reagens voor nucleïnezuurextractie.

3. Lus-gemedieerde isotherme amplificatie en microfluïdumchip

1. Reagens en microfluïdische chip
   1. Voer isotherme versterkingsreacties uit op een microfluïdische schijfvormige chip (zie Materiaaltabel). Voer de versterking bij constante temperatuur uit bij 65 °C.
   2. Voer real-time fluorescentieanalyse uit met behulp van een fluorescerende kleurstofincorporatiemethode¹⁴ op de microfluïdische chip-nucleïnezuuranalysator met constante temperatuuramplificatie. Observeer een S-vormige versterkingscurve voor positieve monsters met behulp van een polymerase met strengverplaatsingsfunctionaliteit.
2. Lus-gemedieerde isotherme versterking
   1. Richt u op zes sequentiegebieden met vier specifieke primers, waaronder twee binnenprimers en twee buitenprimers (meegeleverd met de LAMP-kit).
      OPMERKING: DNA wordt continu gerepliceerd en geamplificeerd bij een constante temperatuur met behulp van een DNA-polymerase met strengverplaatsingsfunctionaliteit. Het reactieproces omvat de haltervormige sjabloonsynthesefase, de cyclische amplificatiefase, de verlengings- en recyclingfase, die uiteindelijk een mengsel vormt van DNA-fragmenten met stengellus- en bloemkoolachtige structuren. Raadpleeg de instructies van de kit voor gedetailleerde informatie (aanvullend bestand 1).
   2. Voeg primers met twee lussen toe aan het reactiesysteem om de reactie-efficiëntie te verbeteren, die zich bindt aan de stam-lusstructuren, waardoor de synthese van de strengverplaatsing en cyclische replicatie wordt geïnitieerd. De samenstelling van de nucleïnezuurdetectiekit voor pathogenen van de luchtwegen is weergegeven in tabel 2.
      OPMERKING: De reagenskit maakt gebruik van de LAMP-methode. Het principe is gebaseerd op het dynamische evenwicht van DNA bij ongeveer 65 °C, waarbij elke primer die zich uitstrekt door basenparen op de complementaire plaats van dubbelstrengs DNA ervoor zorgt dat de andere streng dissocieert en een enkele streng vormt.
3. Microfluïdische chip
   OPMERKING: Elke microfluïdische chip (zie materiaaltabel) is uitgerust met 24 reactieputjes die tegen de klok in zijn genummerd, waarbij de inlaat en uitlaat voor put 1 overeenkomen met de reactieput 1 (Figuur 2). Een specifieke set primers voor amplificatie en detectie van een bepaalde nucleïnezuurdoelsequentie is ingebed en gefixeerd in elke reactieput.
   1. Meng het DNA van het monster met het amplificatiereagens. Injecteer het mengsel in de chip en verdeel het over elke reactieput, centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Onafhankelijke isotherme versterkingsreacties en real-time fluorescentiedetectie komen samen voor in elke reactieput op de chip. Als in een bepaald reactieputje een S-vormige versterkingscurve wordt gedetecteerd, is de overeenkomstige detectie-index voor dat putje positief.

Onderdelen	Compositie	Getal
Bikken	Inleidingen	12 plaatsen
Afdichtingsfolie	/	1 vel
Isotherm versterkingsreagens	Fluorescerende kleurstof, Enzym	270 μL/buis
Positieve controle	Escherichia coli Genoom DNA	160 μL/buis

Tabel 2: Samenstelling van de nucleïnezuurdetectiekit voor pathogenen van de luchtwegen.

Figuur 2: Diagram van de structuur van de schijfchip. De reactieputten zijn achtereenvolgens tegen de klok in genummerd, waarbij de inlaat-/uitlaatpoort 1 overeenkomt met het nummer 1 van de reactieput. Reactieputjes 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 en 24 zijn negatieve controles. Reactieput 6 is een positieve controle (E. coli). De reactieput 12 is een interne positieve controle en reactieput 23 is een externe positieve controle. Reactieput 2 detecteert spn. Reactieput 3 detecteert sau. De reactieput 5 detecteert MRSA. De reactieput 8 detecteert kpn. De reactieput 9 detecteert pae. De reactieput 11 detecteert aba. De reactieput 14 detecteert sma. De reactieput 15 detecteert hin. Zie tabel 5 voor meer informatie over het voorbeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Monstervoorbereiding en bacteriële detectie

1. Bereid het isotherme versterkingsreactiesysteem voor
   1. Neem het isotherme versterkingsreagens uit de set en laat het volledig ontdooien bij kamertemperatuur. Schud voorzichtig om grondig te mengen en centrifugeer kort om op de bodem van de buis te verzamelen.
   2. In de opslagruimte en bereidingsruimte van het reagens pipetteer u 20 μl van het isotherme amplificatiereagens in een voorbereide centrifugebuis van 200 μl. Dek de buis af en verplaats deze naar het voorbereidingsgebied van het monster met één centrifugebuis per monster.
   3. Voeg in het voorbereidingsgebied van het monster 34,5 μl van het doelnucleïnezuurmonster toe. Schud voorzichtig om grondig te mengen en centrifugeer kort om op de bodem van de buis te verzamelen. Het totale volume van elk nucleïnezuuramplificatiereactiesysteem is 54,5 μL (tabel 3).
2. Procedure voor het laden van spaanen
   1. Vermeld op de verpakking van de chip het monsternummer. Open de microfluïdische chip met het verpakkingsetiket naar boven.
   2. Plaats de chip met de inlaat- en uitlaatpoorten naar boven gericht. Zuig met een pipet 50 μl van het voorbereide amplificatiereactiesysteem af en voeg dit toe aan het hoofdkanaal van de chip via de inlaatpoort. Stop met toevoegen wanneer het hoofdkanaal is gevuld en veeg overtollige vloeistof rond de inlaat- en uitlaatpoorten snel weg met een pluisvrije tissue.
   3. Gebruik een pincet om een afdichtingsfilm op te pakken en bedek deze over de inlaat- en uitlaatpoorten. Druk een schone pipetpunt in één richting op de afdichtingsfolie. Zorg voor een goede afdichting.
3. qPCR-reactie
   1. Nadat de lichtbron van de nucleïnezuuranalysator is voorverwarmd, klikt u op de knop Lade openen . Plaats de chip met de voorkant naar boven op de lade en zorg ervoor dat de kleine cilinder uit de middelste opening van de chip komt om deze vast te zetten. Lijn het middelste positioneringsapparaat in de lade uit met het grote centrale gat in de chip.
   2. Klik op de knop Lade sluiten om de chip in de nucleïnezuuranalysator te plaatsen.
   3. Voer in het gebied Monsterinformatie op de detectie-interface de informatie in voor het testen van het monster. Monsternummer, chipnummer en monstertype zijn verplicht; andere zijn optioneel.
   4. Klik op de knop Detectie starten in het bedieningsgebied om de monsterdetectie te starten. Het instrument voert steekproeftesten uit volgens het vooraf ingestelde programma.
      NOTITIE: Na voltooiing van de detectie voert de bijbehorende software van het apparaat automatisch gegevensanalyse uit. Tegelijkertijd start de nucleïnezuuranalysator een automatisch koelproces. Zodra de temperatuur daalt tot 37 °C, opent het instrument automatisch de lade en werpt de chip uit om deze op te halen. De resultaten worden automatisch geïnterpreteerd door het systeem (tabel 4).
4. Normen voor kwaliteitscontrole
   1. In elke chip in deze reagenskit zijn één positieve kwaliteitscontrole en negen negatieve kwaliteitscontroles ingesloten. Zorg ervoor dat de detectieresultaten voor de positieve kwaliteitscontrole positief zijn en tegelijkertijd de resultaten voor alle negen negatieve kwaliteitscontroles negatief zijn.
      OPMERKING: De resultaten worden aan de rechterkant van de afbeelding weergegeven met de vermelding "Kwaliteitscontroleresultaten: Experiment Normaal (Positief Normaal, Negatief Normaal)", wat aangeeft dat de testresultaten geldig zijn. Een nieuwe test is vereist als een resultaat onjuist is en het testresultaat van het monster als ongeldig wordt beschouwd. In de chip zit één positieve interne controle met behulp van mensspecifieke primers, waarvan het resultaat positief is voor het testen van klinische monsters, terwijl het negatief is als het monster een laag humaan genoom-DNA-gehalte heeft, wat wijst op een lager celgetal. In dergelijke gevallen monsters verzamelen en opnieuw testen.
5. Analyse van de resultaten
   1. Gebruik na voltooiing van de detectie de methode van het tweede afgeleide maximum in combinatie met commercieel beschermde algoritmen in de software om het eerste buigpunt van de S-vormige versterkingscurve te berekenen tijdens de snelle versterkingsfase. Details worden beschreven in het gedeelte "Principes van de test" van de instructies van de Respiratory Pathogens Nucleic Acid Detection Kit (aanvullend bestand 1).
      OPMERKING: De TP-waarde is het tijdsverschil tussen het buigpunt en de oorsprong. Het resultaat wordt geïnterpreteerd op basis van de TP en positieve beoordelingswaarden. Als de TP-waarde voor een detectie-index kleiner is dan of gelijk is aan de positieve beoordelingswaarde voor die index, wordt deze als positief geïnterpreteerd. Als de TP-waarde hoger is dan de positieve beoordelingswaarde, wordt deze geïnterpreteerd als negatief, volgens de criteria voor "positieve beslissingswaarde" in de instructies. Het "Fluorescentiecurvegebied" geeft de genormaliseerde curve weer en het gebied "Detectieresultaat" toont de kwaliteitscontrole en detectieresultaten voor elke parameter (tabel 5).

Reactant	Inhoud (μl)
Isotherm versterkingsreagens	20
Sjabloon DNA	34.5

Tabel 3: Isotherm versterkingsreactiesysteem.

Stap	Een	Twee
Temperatuur (°C)	37	65
Tijd (min)	3	47

Tabel 4: Reactieprogramma voor nucleïnezuuramplificatie.

Naam indicator	Positieve controlewaarde
Streptococcus pneumoniae (sp)	30
Staphylococcus aureus (MSU)	34
Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (mrsa)	22
Klebsiella pneumoniae (kpn)	29
Pseudomonas aeruginosa (pae)	36
Acinetobacter baumannii (aba)	36
Stenotrophomonas maltophilia (sma)	27
Haemophilus influenzae (hin)	36

Tabel 5: Positieve controlewaarde voor de infectie-indicator.

Resultaten

Dit experiment maakt gebruik van isotherme versterkingstechnologie, waarbij reacties worden uitgevoerd op een microfluïdische schijfchip. De reactie vindt plaats op een nucleïnezuuranalysator van een microfluïdische chip, waarbij gebruik wordt gemaakt van een fluorescentiekleurstofinvoegingsmethode. De isotherme reactie wordt uitgevoerd bij een constante temperatuur van 65 °C en tegelijkertijd wordt real-time fluorescentieanalyse uitgevoerd. Positieve monsters ondergaan amplificatie onder invloed van polymerase met ketenverplaatsingsfunctionaliteit, wat resulteert in een S-vormige amplificatiecurve. Dit eenstapsproces voltooit de amplificatie en detectie van het doelgen. Deze studie selecteerde 7 monsters met verschillende experimentele resultaten om de betrouwbaarheid van het experimentele ontwerp aan te tonen. De hoofdletter S staat voor een steekproef. S1 is een monster dat is geïnfecteerd met een enkele stam van K. pneumoniae. S2 tot S7 zijn monsters met polymicrobiële infecties, allemaal geïnfecteerd met K. pneumoniae. Voor effectieve detectieresultaten kan interpretatie worden gemaakt door middel van de genormaliseerde fluorescentiecurven die in de afbeeldingen worden weergegeven. Een positieve indicator wordt weergegeven door een versterkingscurve met een S-vorm, terwijl een horizontale lijn een negatieve indicator vertegenwoordigt (figuur 3).

Figuur 3: Representatieve resultaten van nucleïnezuuramplificatie via LAMP. De hoofdletter S staat voor sample. S1 is een monster dat is geïnfecteerd met een enkele stam van kpn. S2 tot en met S7 zijn monsters met polymicrobiële infecties, allemaal geïnfecteerd met kpn. S2 staat voor een steekproef die besmet is met kpn en sma. S3 geeft een monster aan dat gelijktijdig is geïnfecteerd met kpn, su en MRSA. S4 betekent een monster dat gelijktijdig is geïnfecteerd met kpn, sau, MRSA en aba. S5 geeft een monster aan dat gelijktijdig is geïnfecteerd met kpn, sma, sau, MRSA en aba. S6 geeft een monster aan dat gelijktijdig is geïnfecteerd met kpn, sma, pae, sau, MRSA en aba. S7 vertegenwoordigt een monster dat gelijktijdig is geïnfecteerd met kpn, sma, pae, sau, MRSA, aba en E. coli. Zie tabel 5 voor meer informatie over het voorbeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze reagenskit maakt gebruik van de ROC-methode om positieve drempelwaarden te berekenen voor acht testindicatoren. Wanneer de TP-waarde van een detectie-indicator kleiner is dan of gelijk is aan de overeenkomstige positieve drempelwaarde, wordt deze als positief geïnterpreteerd. Omgekeerd, wanneer de TP-waarde van een detectie-indicator groter is dan de positieve drempelwaarde, wordt deze als negatief geïnterpreteerd. De positieve drempelwaarden voor elke indicator zijn weergegeven in tabel 5. De echte positieve TP-waarden die we hebben gedetecteerd voor de 7 monsters met verschillende experimentele uitkomsten worden weergegeven in Tabel 6.

MONSTER	KPN	Sma	pae	Sau	mrsa	Hin	aba	eco
	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)
S1	19.68 (+)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)
S2	17.73 (+)	18.30 (+)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)
S3	16.73 (+)	U (-)	U (-)	18.05 (+)	12.18 (+)	U (-)	U (-)	U (-)
S4	21.66 (+)	U (-)	U (-)	27.07 (+)	19.61 (+)	U (-)	18.29 (+)	U (-)
S5	16.16 (+)	20.85 (+)	U (-)	23.80 (+)	17.13 (+)	U (-)	15.22 (+)	U (-)
S6	11.20 (+)	16.79(+)	17.18(+)	23.09 (+)	16.14 (+)	U (-)	14.28 (+)	U (-)
S7	14.69 (+)	24.84(+)	19.70(+)	24.07(+)	14.16 (+)	- (+)	15.23 (+)	20.12 (+)
Elke steekproef+/-, kwalitatief resultaat; +, positief resultaat; -, negatief resultaat.

Tabel 6: Tabel met TP-waarden voor detectie na infectie.

Aanvullende tabel 1: Lijst van afkortingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Instructies voor de nucleïnezuurdetectiekit voor respiratoire pathogenen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Luchtweginfecties zijn veel voorkomende ziekenhuisinfecties, die ernstige gevolgen hebben voor patiënten en escalerende sterftecijfers¹⁶. Het tijdig en nauwkeurig identificeren van potentiële ziekteverwekkers, gevolgd door effectieve antibiotica, is de sleutel tot een succesvolle behandeling en het verbeteren van de prognose, vooral gezien de beperkingen die inherent zijn aan traditionele kweekmethoden¹⁷. In deze studie gebruikten we een op LAMP gebaseerde methode om enkelvoudige of meervoudige infecties te bepalen voor snelle en nauwkeurige detectie van RTI's. Dit snelle detectiesysteem komt tot stand door LAMP-technologie te combineren met microfluïdische technologie. Het nucleïnezuur uit klinische monsters, zoals sputum, BLF en ALF, kan snel worden geëxtraheerd. Dit geëxtraheerde materiaal vergemakkelijkt de snelle en nauwkeurige detectie van bacteriële pathogenen en vormt een leidraad voor klinische praktijken voor een betere controle en behandeling van RTI's.

Eerdere studies hebben aangetoond dat in vergelijking met op cultuur gebaseerde methoden en polymerasekettingreactie, LAMP-resultaten 100% gevoeligheid, specificiteit en geen kruisreactie met andere bacteriën bereikten in zuivere culturen en bloedmonsters¹⁸. LAMP-assays kunnen ook ziekteverwekkers rechtstreeks detecteren uit biologische vloeistoffen, zoals bloed, pleura- en peritoneale vloeistof en hersenvocht¹⁹. Het is eerder aangetoond dat exogeen DNA en remmers de gevoeligheid van PCR aanzienlijk kunnen verminderen, en voor LAMP-assays is zuivering van DNA uit klinische monsters niet vereist²⁰. Deze techniek maakt gebruik van gistgenen en primers tijdens het amplificatieproces om de normaliteit van de amplificatie te beoordelen, waardoor de kwalificatie van externe controlekwaliteitscontrole wordt bepaald. Interne controles, waarbij gebruik wordt gemaakt van primers van menselijke genen, bepalen de normaliteit van bemonstering, nucleïnezuurextractie en amplificatieprocessen. Gelijktijdig gebruik van interne en externe controles zorgt voor de betrouwbaarheid van de resultaten. Tegelijkertijd worden er ook meerdere positieve en negatieve controleputten opgezet, wat de nauwkeurigheid van de test sterk garandeert. De LAMP-microfluïdische chip heeft mogelijkheden die vergelijkbaar zijn met qPCR bij het detecteren van klinische monsters. Het heeft de kenmerken van een hoge gevoeligheid en een sterk detectievermogen en biedt een betrouwbare basis voor snelle klinische detectie en nauwkeurige behandeling²¹. Microbiële cultuur duurt 3-5 dagen of zelfs langer, en sommige ziekteverwekkers, zoals Chlamydia pneumoniae en Legionella pneumophila, kunnen niet worden gekweekt. Daarentegen detecteert LAMP meerdere bacteriële pathogenen, zelfs de niet-kweekbare, in minder dan 3 uur, waardoor de detectiesnelheid aanzienlijk wordt verhoogd.

Het kan ook meerdere detecties uitvoeren. De LAMP-microfluïdische chip is verdeeld in verschillende reactie-eenheden die meerdere ziekteverwekkers parallel detecteren, waardoor de onafhankelijkheid van elke reactie en de nauwkeurigheid van de resultaten worden gegarandeerd^22,23. Uit de gegevens van het China Network Antibacterial Surveillance Center bleek dat de prevalentie van K. pneumoniae in 2022 op de eerste plaats stond van de bacteriële isolaten uit respiratoire monsters¹⁵. Onder de ademhalingsmonsters die in 2022 door het Provinciaal Volksziekenhuis van Guangdong werden verzameld, was het positieve percentage van K. pneumoniae getest door LAMP 18.6%, wat ook een van de bacteriën is met de hoogste prevalentie. In alle K. pneumoniae-positieve monsters waren 30,6% infecties die uitsluitend werden veroorzaakt door K. pneumoniae, en 29,7% waren infecties waarbij K. pneumoniae naast andere bacteriesoorten bestond. Daarnaast waren er drievoudige infecties (23,9%) en viervoudige infecties (10,5%) met K. pneumoniae-infectie, die de meerderheid vormden in KP-positieve monsters, ongeveer 95%. Er waren zeer weinig gevallen van vijfvoudige en zesvoudige infecties, en tot nu toe zijn er geen infecties buiten het zestal gedetecteerd. De resultaten tonen zes representatieve scenario's aan, die elk de detectieresultaten vertegenwoordigen van infecties veroorzaakt door K. pneumoniae alleen of naast 1-5 andere bacteriesoorten.

Bovendien kan de LAMP-chiptechnologie die in dit onderzoek wordt gebruikt, ook bacteriële resistentie detecteren. Het detecteert methicilline-resistente MRSA via het mecA-gen . Wanneer de putjes die Staphylococcus aureus vertegenwoordigen en de putjes voor het mecA-gen positief zijn, vertegenwoordigen ze een methicilline-MRSA-infectie. Onderzoekers onderzoeken voortdurend methoden om tegelijkertijd snel ziekteverwekkers en antibioticaresistentiekenmerken te detecteren. Een snelle diagnostische methode voor Helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie is bijvoorbeeld gebaseerd op kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)²⁴. Een andere benadering omvat het snel voorspellen van multiresistente K. pneumoniae door middel van deep learning-analyse van oppervlakteversterkte Raman-verstrooiing (SERS) spectra²⁵ en een methode voor het detecteren van K. pneumoniae- en carbapenemase-genen met behulp van SER-spectra²⁶. Daarnaast is er een classificatie- en voorspellingsmethode voor verschillende multi-locus sequentietypering (MLST) profielen van K. pneumoniae-stammen op basis van SERS-spectra-analyse²⁷. Vervolgens zullen we ook gevoelige en nauwkeurige detectie van K. pneumoniae - en carbapenemase-genen ontwikkelen, met prestaties die vergelijkbaar zijn met die van klinische methoden volgens de gouden standaard die tijdrovend zijn of gebaseerd zijn op dure gespecialiseerde instrumenten. Bovendien is de ideale diagnostische aanpak snel, nauwkeurig, kosteneffectief en gebruiksvriendelijk¹⁸. Een studie waarin de kosten van reagentia voor de huidige diagnostische technologieën werden geschat, toonde aan dat het testen van monsters op basis van PCR-technologie tot 6,4-7,7 dollar kost, vergeleken met slechts 0,71-2 dollar voor LAMP-technologie²⁸.

De meerkanaals lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP)-methode biedt weliswaar aanzienlijke voordelen voor de snelle detectie van bacteriële pathogenen bij luchtweginfecties, maar heeft zijn beperkingen. De hoge gevoeligheid van LAMP brengt een risico op kruisbesmetting met zich mee, waarbij minimale DNA-contaminatie kan leiden tot vals-positieve resultaten²⁹; Strikte monsterbehandeling en procedurele protocollen zijn dus noodzakelijk om dit risico te beperken. Ondanks de eenvoud van de methode vereist de interpretatie van de resultaten specifieke expertise en ervaring om verkeerde interpretaties of diagnostische fouten te voorkomen, wat de noodzaak van goed opgeleid personeel benadrukt. Het onderkennen van deze beperkingen is essentieel voor de effectieve toepassing en verdere ontwikkeling van de LAMP-methode op het gebied van klinische diagnostiek. Alles bij elkaar kan de LAMP-methode in combinatie met een microfluïdische chip snel verschillende bacteriële ziekteverwekkers parallel detecteren. Het heeft de voordelen van hoge gevoeligheid en sterke specificiteit en de kenmerken van lage kosten, snelheid en gemak. Het is van groot praktisch belang voor het voorkomen en beheersen van RTI's veroorzaakt door pathogene infecties in klinische omgevingen. Het belangrijke kenmerk van de LAMP-test die in deze studie wordt voorgesteld, is dat het laboratoriumpersoneel deze gemakkelijk onder de knie kan krijgen, wat een grote hulp is voor primaire ziekenhuizen, ziektepreventie, controlecentra en inspectie- en quarantaineafdelingen. Samenvattend is het LAMP-microfluïdische chipsysteem een krachtig detectiehulpmiddel in klinische laboratoria, dat de hoge kosten en lage doorlooptijden bij de diagnose van klinische infecties kan oplossen en aanzienlijke toepassingswaarden heeft in klinische omgevingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bath Incubator(MK2000-2)	ALLSHENG		Bied een omgeving met constante temperatuur
Bronchial lavage vloeistophouder	TIANPINGHUACHANG	SEDA 20172081375	Verzameling bronchoalveolaire lavage vloeistof
Fibro-optische bronchoscoop	OLYMPUS	SEDA 20153062703	Een flexibele bronchoscoop uitgerust met een fibro-optische lichtbron en camera, om de luchtwegen en structuren in de longen visueel te onderzoeken. Hulp bij het verzamelen van bronchoalveolaire lavage
HR1500-B2	Haier	SEDA 20183541642	Bioveiligheidskast
NAOH	MACKLIN	S817977	Vloeibaar maken van viskeuze onderste luchtwegmonster
Nucleïnezuur detectiekit voor luchtwegpathogenen	Capitalbio Technology	SEDA 20173401346	Testen op bacteriëninfectie
Nucleïnezuur extractiereagens	Capitalbio Technology	SEDA 20160034	Voor DNA extractie
RTisochip-W	Capitalbio Technology	SEDA 20193220539	Loop-mediated Isothermal Amplification
THERMO ST16R	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20180585	Centrifugeer de resterende vloeistof van de wand van de buis.
Vortexmixer VM-5005	JOANLAB		Voor het mengen van reagens