Methodenartikel

Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila

4.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66679

⸱

7 juni 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 4Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo's, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.

Samenvatting

Transgenese bij Drosophila is een essentiële benadering voor het bestuderen van de genfunctie op organismeniveau. Embryo-micro-injectie is een cruciale stap voor de bouw van transgene vliegen. Micro-injectie vereist bepaalde soorten apparatuur, waaronder een micro-injector, een micromanipulator, een omgekeerde microscoop en een stereomicroscoop. Plasmiden geïsoleerd met een plasmide miniprep-kit komen in aanmerking voor micro-injectie. Embryo's in het pre-blastoderm of syncytieel blastoderm stadium, waar kernen een gemeenschappelijk cytoplasma delen, worden onderworpen aan micro-injectie. Een celzeef vergemakkelijkt het proces van het dechorioneren van embryo's. Het optimale tijdstip voor dechorionatie en uitdroging van embryo's moet experimenteel worden bepaald. Om de efficiëntie van embryo-micro-injectie te verhogen, moeten naalden die door een trekker zijn voorbereid, worden afgeschuind door een naaldslijper. Bij het slijpen van naalden gebruiken we een voetluchtpomp met een manometer om het capillaire effect van de naaldpunt te voorkomen. We injecteren routinematig 120-140 embryo's voor elk plasmide en verkrijgen ten minste één transgene lijn voor ongeveer 85% van de plasmiden. Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een gedetailleerd protocol voor embryo-micro-injectie voor transgenese in Drosophila.

Inleiding

De fruitvlieg Drosophila melanogaster is uitermate vatbaar voor genetische manipulatie en genetische analyse. Transgene fruitvliegjes worden veel gebruikt in biologisch onderzoek. Sinds de ontwikkeling in het begin van de jaren 1980 is P-element transposon-gemedieerde transgenese onmisbaar geweest voorhet onderzoek naar Drosophila. In sommige scenario's zijn ook andere transposons, zoals piggyBac en Minos, gebruikt voor transgenese in Drosophila 2. Transgenen via transposon worden willekeurig ingevoegd in het Drosophila-genoom en de expressieniveaus van transgenen op verschillende genomische loci kunnen variëren als gevolg van positie-effecten en kunnen daardoor niet worden vergeleken2. Deze nadelen werden ondervangen door de phiC31-gemedieerde plaatsspecifieke transgenese3. Het bacteriofaag phiC31-gen codeert voor een integrase dat sequentiespecifieke recombinatie tussen de attB- en attP-sites in Drosophila3 bemiddelt. Veel attP-dockingplaatsen zijn gekarakteriseerd en zijn beschikbaar in het Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.

Het phiC31-transgenesesysteem voor Drosophila wordt veel gebruikt door de vliegengemeenschap. Van de attP-dockingplaatsen zijn attP18 op het X-chromosoom, attP40 op het tweede chromosoom en attP2 op het derde chromosoom meestal de voorkeursplaatsen voor transgenintegratie op elk chromosoom, omdat transgenen op de drie plaatsen hoge niveaus van induceerbare expressie vertonen terwijl ze lage niveaus van basale expressie hebben5. Onlangs ontdekten Van der Graaf en collega's echter dat de attP40-site, dicht bij de Msp300-genlocus, en transgenen die zijn geïntegreerd op attP40 larvale spiernucleaire clustering veroorzaken in Drosophila10. In een andere recente studie ontdekten Duan en collega's dat het homozygote attP40-chromosoom de normale glomerulaire organisatie van de Or47b-olfactorische receptorneuronklasse in Drosophila11 verstoort. Deze bevindingen suggereren dat strenge controles moeten worden opgenomen bij het ontwerpen van experimenten en het interpreteren van gegevens.

Drosophila is een ideaal modelorganisme voor in vivo ondervraging van de genfunctie vanwege de korte levenscyclus, lage kosten en eenvoudig onderhoud. Genoombrede genetische screening is gebaseerd op de constructie van genoombrede transgene bibliotheken in Drosophila 12,13,14,15. We hebben eerder 5551 UAS-cDNA/ORF-constructen gegenereerd op basis van het binaire GAL4/upstream activerende sequentie (GAL4/UAS) systeem, dat 83% van de Drosophila-genen omvat die bij mensen worden bewaard in de Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. De UAS-cDNA/ORF-plasmiden kunnen worden gebruikt voor het creëren van een transgene UAS-cDNA/ORF-bibliotheek in Drosophila. Efficiënte micro-injectietechnologie voor embryo's kan de creatie van transgene vliegenbibliotheken versnellen.

Voor micro-injectie van embryo's wordt de punt van de naald normaal gesproken gebroken tegen een dekglaasje17. Daarbij raken naalden vaak verstopt of veroorzaken ze lekkage van grote hoeveelheden cytoplasma, en wanneer deze problemen zich voordoen, moeten nieuwe naalden worden gebruikt. Hoewel afschuinnaalden de efficiëntie van micro-injectie kunnen verbeteren, komt de slijpoplossing tijdens het slijpproces in de afgeschuinde punt. De maaloplossing in de afgeschuinde punt verdampt niet snel op natuurlijke wijze; Daarom kunnen naalden niet direct na het afschuinen worden gebruikt voor micro-injectie. Deze factoren verminderen de efficiëntie van micro-injectieprocedures voor embryo's. Hier presenteren we, met behulp van de phiC31-gemedieerde plaatsspecifieke transgenese in Drosophila als voorbeeld, een protocol voor embryo-micro-injectie voor transgenese in Drosophila. Om te voorkomen dat de slijpoplossing de naald binnendringt, gebruiken we een luchtpomp om luchtdruk uit te oefenen in de naald, waardoor wordt voorkomen dat de slijpoplossing de afgeschuinde punt binnendringt. Afgeschuinde naalden zijn direct na het afschuinen klaar voor het laden van monsters en micro-injectie.

Protocol

1. Bereiding van plasmiden

  1. Isoleer plasmiden uit 4 ml nachtelijke bacterieculturen met behulp van een plasmide miniprep-kit. Elute met 40 μL elutiebuffer.
    OPMERKING: Isolatie van plasmiden met behulp van een plasmide midi-prep kit is niet nodig. Een plasmide miniprep-kit kan volledig voldoen aan de experimentele vereisten voor micro-injectie van embryo's. In dit protocol bevatten de geprepareerde UAS-cDNA/ORF-plasmiden tien kopieën van UAS, een minimale Hsp70-promotor, een attB-plaats, een mini-wit gen en een interessant gen.
  2. Bepaal de plasmide-DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer en bewaar deze bij -80 °C vriezer.
    OPMERKING: De plasmideconcentratie is niet cruciaal voor succesvolle micro-injectie van embryo's, aangezien plasmideconcentraties variërend van 20 ng/μL tot 1683 ng/μL goed werken voor transgenese bij Drosophila (aanvullende tabel 1).
  3. Vlak voor de micro-injectie de plasmiden ontdooien en gedurende 5 minuten centrifugeren bij 13000 x g .
  4. Breng 10 μL van elk plasmide over van de bovenste laag van de vloeistof in een nieuwe buis van 1,5 ml.

2. Naalden trekken

  1. Schakel een naaldtrekker in met geselecteerde instellingen (Warmte: 500, Trekken: 50, Vel: 60, Vertraging: 90, Druk: 200, Ramptest: 510).
  2. Steek een capillair van borosilicaatglas (buitendiameter 1,0 mm, binnendiameter 0,75 mm, lengte 10 cm) in de naaldtrekker en sluit het deksel.
  3. Druk op de trekknop . Elk glazen capillair maakt twee naalden.

3. Slijpnaalden (Figuur 1)

  1. Gebruik een naaldslijper die is gemonteerd met een geschikte schuurplaat (voor 0.7-2.0 μm tipmaten) van een naaldslijper.
  2. Bevochtig de doek (referentiedraad) met een maaloplossing (100 ml gedestilleerd water met 0,9 g NaCl, 1 ml bevochtigingsmiddel) en fixeer de doek.
  3. Zet de naaldslijper aan en laat de slijpplaat draaien.
  4. Sluit een naald aan op een voetluchtpomp met een manometer via een siliconen capillaire slang en monteer de naald vervolgens op een naaldhouder van de naaldslijper. Stel de hoek van de naald ten opzichte van de slijpplaat in op 35° (Figuur 1A, B).
  5. Pas de positie van de naaldpunt net boven het oppervlak van de slijpplaat aan met behulp van een grove bedieningsknop onder de microscoop (Figuur 1C).
    NOTITIE: De getrokken naalden die in sectie 2 zijn verkregen, hebben een conus van 6-8 mm en een punt van minder dan 1 μm (Figuur 1D), zoals beschreven in de gebruikershandleiding van de trekker.
  6. Houd de inwendige druk van de naald op 40 psi met behulp van de voetluchtpomp. Pas de positie van de naaldpunt aan met behulp van een fijne bedieningsknop onder de microscoop en zorg ervoor dat de punt van de naald de slijpplaat raakt.
  7. Maal gedurende 3-5 s. Wanneer er kleine luchtbelletjes uit de punt van de naald komen, laadt u de naald uit (Figuur 1E).
    NOTITIE: Tijdens het slijpen voorkomt het gebruik van een luchtpomp dat de maaloplossing wordt overgeheveld.
  8. Doe de geslepen naalden in een opbergkoffer.
    OPMERKING: Gebruik zoveel mogelijk versgemalen naalden, hoewel de geslepen naalden ten minste een paar weken in een opbergdoos kunnen worden bewaard voordat u de micro-injectie uitvoert.

4. Pipetten voorbereiden voor het laden van plasmiden

  1. Verwarm een pipet van 200 μL met de buitenste vlam van een alcoholbrander.
  2. Zodra het begint te smelten, rekt u de pipet uit.
  3. Knip het verzegelde uiteinde van de uitgerekte pipet af met een schaar en de uitgerekte pipet is klaar om DNA in een geslepen naald te laden.
    OPMERKING: Als alternatief zijn extreem lange en fijne punten voor het vullen van gemalen naalden in de handel verkrijgbaar.
  4. Plaats deze pipetten in een geautoclaveerde plastic doos.

5. Verzamelen van embryo's

  1. Verzamel vliegen (vas-phiC31; + ; attP2) die phiC31-integrase tot expressie brengen en de attP2-aanmeerplaats dragen 3 dagen nadat ze zijn uitgekomen uit 50 injectieflacons en breng ze over naar een kooi (φ 90 mm x 150 mm). Voeg een beetje verse gistpasta toe aan het midden van elke druivenagarplaat18.
  2. Bereid 2-4 kooien met vliegen voor. Houd de kooien en platen op 25 °C en vervang de platen elke dag gedurende 2-4 dagen.
    OPMERKING: Deze studie combineerde het vas-phiC31-transgen (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) op het eerste chromosoom en het attP2-transgen (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) op het derde chromosoom. De resulterende voorraad (vas-phiC31; + ; attP2) wordt in dit protocol gebruikt. Gistpasta moet dagelijks worden bereid en verse gistpasta moet aan de vliegen worden gevoerd. De vervangen kooien moeten worden opgeruimd en gedroogd om de resterende embryo's in de kooien kwijt te raken.
  3. Vervang op de dag van de micro-injectie de kooien en platen 's ochtends. Vervang vervolgens de platen elke 30 minuten en verzamel embryo's van deze platen. Vervang alle kooien en platen bij kamertemperatuur (RT) en houd de kooien en platen daarna op 25 °C.
    OPMERKING: Sommige protocollen geven er de voorkeur aan om de kooien en platen bij 18 °C uit te broeden voor het leggen van eieren. Het hangt af van het aantal embryo's dat men nodig heeft voor micro-injectie.

6. Embryo's dechorioneren

  1. Bereid 30% bleekmiddel voor door 60 ml bleekmiddel (met een actief chloorgehalte van 34-46 g/l) en 140 ml dubbel gedestilleerd water te mengen.
  2. Verwijder de resterende vliegen op de agarplaten van druivensap met een borstel of tang en spoel de embryo's in een celzeef met dubbel gedestilleerd water.
  3. Droog de celzeef met de embryo's af met tissuepapier.
  4. Plaats het in een petrischaal met 30% bleekmiddel en draai de celzeef met de hand of een horizontale shaker gedurende 1,5 minuut op 60 tpm.
    OPMERKING: Spoelen is een cruciale stap. Als de spoeltijd niet lang genoeg is, zal de schaal van een embryo niet volledig loskomen. Als de spoeltijd te lang is, zal het embryo zacht worden en gemakkelijk breken. De celzeef moet volledig worden ondergedompeld in het bleekmiddel van 30%. Draag een paar rubberen handschoenen en een laboratoriumjas om verwondingen door bleekmiddel te voorkomen.
  5. Spoel embryo's gedurende 2 minuten af met dubbel gedestilleerd water dat is bewaard in een plastic wasfles in het laboratorium om het resterende bleekmiddel te verwijderen. Kies de drijvende embryo's voor de line-up.

7. Embryo's op een rij zetten

  1. Snijd de vaste druivensapagar met een mes in lange reepjes.
    OPMERKING: Gebruik paars druivensap om het gemakkelijker te maken om witte embryo's op een rij te zetten.
  2. Leg de embryo's met een penseel op een lange strook.
  3. Zet ongeveer 60 embryo's op een rij met een ontleednaald langs de rand van een lange strook met hun achterste naar de buitenkant van de strook gericht. Zet ongeveer 60 embryo's op een rij binnen 5 minuten.
    OPMERKING: De micropyle is een kegelvormig uitsteeksel aan de voorpool van het embryo, waardoor het sperma binnenkomt om de eicel te bevruchten (Figuur 2A). Daarom is het op basis van het kegelvormige uitsteeksel aan de voorpool van het embryo gemakkelijk om de achterkant van het gedechorioneerde embryo te bepalen.
  4. Plak een dubbelzijdige tape van 18 mm in de lengte langs de rand van een dekglaasje (18 mm x 18 mm) en verwijder de papieren achterkant. Druk het dekglaasje voorzichtig op de uitgelijnde embryo's. Zorg ervoor dat de embryo's in het midden van de tape zijn gelijmd.

8. Uitdrogen van embryo's

  1. Plaats het dekglaasje met de in de rij gezette embryo's in een doos met droogmiddel. De droogtijd varieert afhankelijk van temperatuur en vochtigheid.
    OPMERKING: De droogtijd is van cruciaal belang voor micro-injectie en moet experimenteel worden bepaald. De droogtijd is meestal 9-10 minuten in de zomer en 17-18 minuten in de winter.
  2. Bedek de embryo's met halokoolstofolie.
    OPMERKING: Laat niet te veel olie op de embryo's vallen, omdat de extra olie de lijm kan overlopen. De volumeverhouding van halokoolstofolie 700 en halokoolstofolie 27 is 1:3.

9. Micro-injectie van embryo's

  1. Laad 2 μL DNA in de naald met behulp van de uitgerekte pipet. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de naald zitten. Plaats de naald in de naaldhouder van de micromanipulator.
  2. Plaats de uitgelijnde embryo's bedekt met halogeenkoolstofolie onder een omgekeerde microscoop. Zorg ervoor dat de achterste uiteinden van de embryo's naar de naald wijzen.
  3. Gebruik de micromanipulator om de naald dicht bij de embryo's te brengen. Maak de naald schoon. Zorg ervoor dat er een druppel vloeistof uit de naald komt. Uitgaande van een injectiedruk van 300 hPa en een evenwichtsdruk van 20 hPa, past u de injectiedruk en de evenwichtsdruk aan om de optimale grootte van de vloeistofdruppel te garanderen.
  4. Gebruik de micromanipulator om de naald in de achterste uiteinden van de embryo's te steken en gebruik het voetpedaal dat op de microinjector is aangesloten om het DNA te injecteren (Figuur 2). Als er een kleine halo zichtbaar is, wordt DNA met succes in het embryo geïnjecteerd.
    OPMERKING: Selecteer de meerkernige embryo's voor injectie en dood de oudere embryo's met behulp van de knop "schoonmaken". Als er na injectie een grote hoeveelheid cytoplasma lekt, zijn de embryo's te weinig gedroogd. Als er na injectie slechts een kleine hoeveelheid of geen hoeveelheid cytoplasma lekt, worden injecties als succesvol beschouwd. Als meer dan een derde van de embryo's na injectie cytoplasma lekt, verleng dan de droogtijd met 1-2 minuten. Als meer dan een derde van de embryo's te droog is, verkort dan de droogtijd met 1-2 minuten.
  5. Verwijder de naald uit het embryo. Verplaats de naald naar het achterste uiteinde van het volgende embryo. Herhaal de bovenstaande stappen.
  6. Leg de geïnjecteerde embryo's in een agarplaat. Zet de plaat in een ruimte bij 18-20 °C. Breng de plaat de volgende dag over naar een incubator bij een temperatuur van 25 °Cen een vochtigheid van 50%-60% en incubeer gedurende 1 dag.
    OPMERKING: Houd embryo's na injectie op een temperatuur van 18-20 °C om hun ontwikkeling te vertragen, de integratie van plasmide-DNA in het Drosophila-genoom te vergemakkelijken en de overlevingskans van de geïnjecteerde embryo's te vergroten.

10. Larven verzamelen

  1. Gebruik een ontleednaald om het voedsel in een injectieflacon te schrapen en los te maken. Voorzie het voer van een paar druppels gedestilleerd water.
    OPMERKING: Laat het gedestilleerde water in het voer opnemen om te voorkomen dat larven verdrinken.
  2. Haal de borden uit de couveuse.
  3. Verzamel de uitgekomen larven met een penseel onder een stereomicroscoop en breng ze over naar de flacon.
  4. Plaats de injectieflacon in een incubator bij een temperatuur van 25 °Cen een luchtvochtigheid van50%-60%.

11. Transgene vliegen verkrijgen

  1. Verzamel de uitgekomen vliegen nadat de injectieflacon gedurende 10 dagen bij 25 °Cis geïncubeerd.
  2. Kruis een enkele mannelijke vlieg met drie maagdelijke vrouwelijke vliegen van de TM2/TM6C Sb1 Tb1 balancers, en kruis een enkele vrouwelijke vlieg met drie mannelijke vliegen van de TM2/TM6C Sb1 Tb1 balancers.
  3. Plaats de kruizen in een incubator bij een temperatuur van 25 °C en een luchtvochtigheid van 50%-60%.
  4. Screen het nageslacht op vliegen met oranje ogen. Dit zijn de transgene vliegen (Figuur 3A-C).
    OPMERKING: Vliegen met een kopie van transgen op de attP2-dockingplaats hebben oranje ogen.
  5. Kruis een enkele oranjeogige mannetjesvlieg met drie maagdelijke vrouwtjesvliegen van de TM2/TM6C Sb1 Tb1 balancers om een bestand te vormen.
    OPMERKING: Er moet meer dan één generatie kruisingen worden opgezet om het phiC31-transgen op het eerste chromosoom door te strepen.

Resultaten

De punt van een injectienaald wordt afgeschuind door een naaldslijper (Figuur 1). Men kan 50-60 naalden in één uur afschuinen. DNA wordt micro-geïnjecteerd in het achterste van een embryo in het pre-blastoderm of syncytieel blastoderm-stadium, waar kernen een gemeenschappelijk cytoplasma delen (Figuur 2A). De achterkant van een embryo kan gemakkelijk worden gelokaliseerd op basis van de micropyle aan de voorkant van het embryo (Figuur 2A). Embryo's in de stadia van cellulair blastoderm en gastrulatie kunnen niet worden gebruikt voor injectie, omdat elke kern in deze stadia wordt omringd door een celmembraan, en daardoor is de kans op het verkrijgen van transgene vliegen bijna nul (Figuur 2B). Overgedroogde embryo's worden vervormd wanneer ze worden doorboord en kunnen niet worden gebruikt voor micro-injectie (Figuur 2C). Ondergedroogde embryo's kunnen een grote hoeveelheid cytoplasma extruderen wanneer ze met de naald worden geprikt (Figuur 2D), wat resulteert in een lager overlevingspercentage van embryo's. Embryo's die op de juiste manier zijn gedroogd, kunnen al dan niet een kleine hoeveelheid cytoplasma lekken wanneer ze worden geïnjecteerd (Figuur 2E).

De Drosophila-lijn die phiC31-integrase tot expressie brengt en de attP2-dockingplaats draagt die in dit protocol wordt gebruikt voor micro-injectie van embryo's, heeft witte ogen (Figuur 3A), en de oude vliegen van dit genotype hebben roze ogen die het gevolg zijn van opgehoopt rood fluorescerend eiwit dat specifiek in het oog tot expressie wordt gebracht (Figuur 3B). We gebruiken het mini-witte gen als een selectieve marker voor transgenese in Drosophila, en transgene vliegen worden geïdentificeerd aan de hand van de oogkleur, variërend van lichtgeel tot rood. Transgene vliegen met een transgen op de aanlegplaats van attP2 hebben oranje ogen (figuur 3C), die men gemakkelijk kan onderscheiden van vliegen die geen transgenen dragen.

figure-results-1
Afbeelding 1: Slijpen van de naalden. (A) Een voetluchtpomp met een manometer wordt gebruikt om luchtdruk op de naald uit te oefenen. (B) Een naald wordt op een naaldslijper gemonteerd onder een hoek van 35° ten opzichte van het oppervlak van een slijpplaat. (C) Gebruik een grove instelknop om de naaldpunt net boven het oppervlak van de slijpplaat te plaatsen en gebruik vervolgens een fijnafstelknop om de punt af te schuinen. (D) De punt van een getrokken naald ligt onder een microscoop. Schaalbalken = 10 μm. (E) Een afgeschuinde naald ligt onder een microscoop. De afgeschuinde punt van de naald wordt aangegeven met een pijl. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Drosophila-embryo's die geschikt zijn voor micro-injectie. (A) Een Drosophila-embryo in het pre-blastoderm- of syncytieel blastodermstadium kan worden geïnjecteerd in de achterste pool van het embryo, aangeduid met een rode ellips. De micropyle aan de voorpool van het embryo wordt aangegeven met een pijl. (B) Een Drosophila-embryo in het stadium van cellulair blastoderm kan niet worden gebruikt voor micro-injectie. (C) Een embryo dat overgedroogd is, ziet er misvormd uit. (D) Onvoldoende uitdroging van een embryo leidt tot een grote hoeveelheid cytoplasmatische lekkage na injectie. (E) Voor een succesvolle injectie kan een kleine hoeveelheid cytoplasma lekken. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Oogkleur van transgene Drosophila met een transgen op de attP2-dockingplaats. (A) De attP2-injectielijn die phiC31-integrase (vas-phiC31; + ; attP2) tot expressie brengt, heeft een wit oog. RFP die specifiek in het oog tot expressie komt, wordt gebruikt als selectieve marker voor phiC31-transgen. (B) De verouderde attP2-injectielijn die phiC31-integrase tot expressie brengt, heeft een roze oog als gevolg van het opgehoopte RFP-eiwit in het oog. (C) Vliegen met een transgen dat is geïntegreerd in de attP2-dockingplaats hebben een oranje oog. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Tabel 1: Transgenese bij Drosophila als gevolg van embryonale micro-injectie van 100 verschillende plasmiden. In totaal werden 100 verschillende plasmiden van verschillende concentraties, variërend van 20 ng/μL tot 1683 ng/μL, in embryo's geïnjecteerd en transgene vliegen werden verkregen voor 85 van de 100 plasmiden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Efficiëntie van embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila. In totaal werden 120 verschillende plasmiden in embryo's geïnjecteerd en voor 101 van de 120 plasmiden werden transgene vliegen verkregen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hier presenteren we een protocol voor embryo-micro-injectie voor transgenese in Drosophila. Voor phiC31-gemedieerde plaatsspecifieke transgenese injecteerden we 120-140 embryo's voor elk plasmide en verkregen we ten minste één transgene lijn voor ongeveer 85% van de plasmiden (aanvullende tabel 2). Onze ervaring is dat plasmide-DNA geïsoleerd door een plasmide-miniprep-kit volstaat voor transgenese in Drosophila. Plasmide-DNA-concentraties variërend van 20 ng/μL tot 1683 ng/μL hebben mogelijk geen duidelijk effect op het slagingspercentage van transgenese, omdat de meeste van hen transgene vliegen kunnen produceren (aanvullende tabel 1).

De voorbereiding van injectienaalden is van cruciaal belang voor efficiënte micro-injectie van embryo's. Een injectienaald wordt gesloten nadat deze is getrokken door een naaldtrekker. Voor routinematige phiC31-gemedieerde transgenese bij Drosophila wordt de punt van een naald meestal gebroken door een dekglaasje17. De willekeurig afgebroken naalden zijn echter vaak niet geschikt voor micro-injectie van embryo's, omdat ze geblokkeerd kunnen raken of lekkage van een grote hoeveelheid cytoplasma kunnen veroorzaken en daardoor tijdens de injectie moeten worden vervangen door een nieuwe. Injectienaalden waarvan de uiteinden door een slijper zijn afgeschuind, raken meestal niet geblokkeerd of veroorzaken grote cytoplasmatische lekkage, waardoor de frequentie van het vervangen van de naald wordt verminderd. We hebben gemerkt dat de slijpoplossing de afgeschuinde punt van een naald kan binnendringen zodra de punt open is tijdens het slijpen. Als het eenmaal in de naald komt, zal de maaloplossing niet snel op natuurlijke wijze opdrogen. Om te voorkomen dat de maaloplossing overhevelt, sluiten we een injectienaald aan op een voetluchtpomp met een manometer. Tijdens het slijpen van de punt van de naald gebruiken we de luchtpomp om luchtdruk op de naald uit te oefenen, en daardoor wordt voorkomen dat de slijpoplossing de afgeschuinde punt binnendringt, waardoor de afgeschuinde naald onmiddellijk kan worden gebruikt. Samen zou de voetluchtpomp met de manometer moeten helpen om de transgenese bij Drosophila te versnellen, met name voor een groot aantal plasmiden.

Het identificeren van embryo's in het pre-blastoderm of syncytieel blastoderm stadium is van cruciaal belang voor micro-injectie19,20, omdat het injecteren van embryo's in latere stadia nauwelijks transgene vliegen produceert. Vliegen van minder dan 10 dagen oud worden gebruikt voor het leggen van eieren, omdat ze de neiging hebben om meer eieren te leggen dan oudere. Bij het dechorioneren van embryo's wordt een celzeef gebruikt om de bleekbehandeling en het dubbel spoelen met gedestilleerd water van embryo's te vereenvoudigen. Na het spoelen van het embryo geven de drijvende embryo's aan dat de eierschalen goed zijn behandeld en kunnen worden gebruikt voor daaropvolgende micro-injectie. Zowel de dechorionatie als de droogtijd van embryo's zijn van cruciaal belang voor micro-injectie en moeten experimenteel worden geoptimaliseerd, aangezien langdurige dechorionatie of droogtijd embryo's kan doden. De dechorionatie- en droogtijd worden beïnvloed door de temperatuur en vochtigheid die van plaats tot plaats en van tijd tot tijd variëren en moeten dienovereenkomstig worden aangepast op basis van de embryonale uitkomstsnelheid.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Het werk werd ondersteund door het Scientific Research Fund for High-Level Talents, University of South China.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 μm Cell StrainerNEST258367
3M dubbelzijdig plakband3M415
BorosilicaatglasSUTTERB100-75-10
DiamantschuurplaatSUTTER104E
FLAMING/BROWN Micropipet PullerSUTTERP-1000
Voetpomp met manometerShenfengSF8705D
Halocarbon olie 27SigmaH8773
Halocarbon olie 700SigmaH8898
Omgekeerd microscoopNikonECLIPSE Ts2R
MicroinjectiepompeppendorfFemtoJet 4i
MicromanipulatoreppendorfTransferMan 4r
Micropipet BevelerSUTTERBV-10
Microscoop dekglazen (18 mm x 18 mm)CITOLAS10211818C
Microscoopglaasjes (25 mm x 75 mm)CITOLAS188105W
Petrischaal (90 mm x 15 mm)LAIBOER4190152
Photo-Flo 200Kodak1026269
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Stereo MicroscoopNikonSMZ745

Referenties

  1. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  2. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
  3. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  4. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  5. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
  6. Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
  7. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  8. Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3. 2 (9), Bethesda. 1095-1102 (2012).
  9. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
  10. Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598(2022).
  11. Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3. 13 (4), Bethesda. 022(2023).
  12. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  13. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  14. Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  15. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).
  16. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  17. Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
  18. Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
  19. Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
  20. Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Drosophila transgenesePhiC31 integrasetransgene vliegenmicro injectienaaldennaaldslijpendechorioneringsprotocolhalogeenkoolstofolieomgekeerde microscoopmicromanipulator
Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.