Methodenartikel

Live beeldvorming om cellulaire stralingsgevoeligheid te kwantificeren in van de patiënt afgeleide tumororganoïden

DOI:

10.3791/66680

⸱

5 april 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Weill Cornell Medical College, 2Sandra and Edward Meyer Cancer Center, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 4Caryl and Israel Englander Institute for Precision Medicine, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een eenvoudige live beeldvormingsbenadering voor het kwantificeren van de gevoeligheid van van patiënt-afgeleide tumororganoïden voor ioniserende straling.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bestralingstherapie (RT) is een van de pijlers van de moderne klinische behandeling van kanker. Niet alle soorten kanker zijn echter even gevoelig voor bestraling, vaak (maar niet altijd) vanwege verschillen in het vermogen van kwaadaardige cellen om oxidatieve DNA-schade te herstellen zoals opgewekt door ioniserende stralen. Klonogene assays worden al tientallen jaren gebruikt om de gevoeligheid van gekweekte kankercellen voor ioniserende bestraling te beoordelen, grotendeels omdat bestraalde kankercellen vaak op een vertraagde manier sterven die moeilijk te kwantificeren is met kortetermijnflowcytometrie of microscopie-ondersteunde technieken. Helaas kunnen clonogene testen niet als zodanig worden gebruikt voor complexere tumormodellen, zoals patiënt-afgeleide tumororganoïden (PDTO's). Inderdaad, het bestralen van gevestigde PDTO's hoeft niet noodzakelijkerwijs hun groei als meercellige eenheden op te heffen, tenzij hun stengelachtige compartiment volledig is uitgeroeid. Bovendien is het mogelijk dat het bestralen van PDTO-afgeleide eencellige suspensies de gevoeligheid van kwaadaardige cellen voor RT in de context van gevestigde PDTO's niet goed recapituleert. Hier beschrijven we een aanpassing van conventionele klonogene assays waarbij gevestigde PDTO's worden blootgesteld aan ioniserende straling, gevolgd door dissociatie van één cel, remissie in geschikte kweekomstandigheden en live beeldvorming. Niet-bestraalde (controle) PDTO-afgeleide stamachtige cellen hervormen groeiende PDTO's met een PDTO-specifieke efficiëntie, die op een dosisafhankelijke manier negatief wordt beïnvloed door doorstraling. Onder deze omstandigheden kunnen de efficiëntie en groeisnelheid van PDTO's worden gekwantificeerd als een maat voor radiogevoeligheid op time-lapse-beelden die zijn verzameld totdat controle-PDTO's een vooraf bepaalde ruimtebezetting bereiken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uitwendige bestralingstherapie (RT) is een van de steunpilaren van de moderne oncologie en weerspiegelt niet alleen een uitgesproken antikankeractiviteit die gepaard gaat met een goed gedefinieerd spectrum van over het algemeen beheersbarebijwerkingen1, maar ook een uitzonderlijk wijdverbreide klinische beschikbaarheid (de meeste kankercentra in ontwikkelde landen zijn uitgerust met moderne lineaire versnellers voor uitwendige bundel RT)2. In overeenstemming met dit idee wordt RT wereldwijd met succes gebruikt voor zowel curatieve doeleinden, meestal in de context van ziekte in een vroeg stadium 3,4, als palliatieve toepassingen, om symptomen (bijv. pijn) van uitgezaaide tumoren in te dammen5. Dat gezegd hebbende, zijn niet alle maligniteiten even gevoelig voor RT, wat een weerspiegeling is van een aantal intrinsieke en micro-omgevingskenmerken van kankercellen 6,7,8,9. Als een op zichzelf staand voorbeeld zijn verschillende kanker-geassocieerde genetische en epigenetische veranderingen die van invloed zijn op DNA-herstel en redoxhomeostase in verband gebracht met verhoogde of verminderde intrinsieke radiosensitiviteit, grotendeels als gevolg van het vermogen van RT om kankercellen te doden door directe en reactieve zuurstofspecies (ROS)-afhankelijke schade aan DNA en andere macromoleculen te veroorzaken 10,11,12,13.

In de afgelopen decennia zijn clonogene tests routinematig gebruikt om de stralingsgevoeligheid van gekweekte menselijke en muizenkankercellen te beoordelen 14,15,16. Inderdaad, terwijl chemotherapeutica en andere stressfactoren vaak kwaadaardige cellen op een vrij snelle manier doden, veroorzaakt RT die in klinisch relevante doses wordt gebruikt meestal een vertraagde vorm van celdood die niet eenvoudig kan worden gekwantificeerd met kortetermijnflowcytometrie of microscopie-ondersteunde technieken, zoals het meten van de cellulaire opname van vitale kleurstoffen (die selectief dode cellen kleuren) 24-72 uur na blootstelling aan een cytotoxische stimulus17. Clonogene assays zijn niet alleen eenvoudig en afhankelijk van vrij goedkope reagentia, maar zijn ook bijzonder handig omdat ze de implementatie van het zogenaamde "lineaire kwadratische" model mogelijk maken, een vrij eenvoudig wiskundig hulpmiddel voor de kwantitatieve analyse van RT-dosisrespons18,19. Op dezelfde manier hebben gekweekte kankercellen (met inbegrip van gevestigde cellijnen en primaire, van de patiënt afgeleide cellen) een handig platform geboden voor het testen van verschillende aspecten van de kankerbiologie, met inbegrip van (maar niet beperkt tot) gevoeligheid voor behandeling op een vrij eenvoudige maar vereenvoudigde manier, met als belangrijkste beperking de afwezigheid van een gestructureerde tumormicro-omgeving (TME)20, 21. okt. Tweedimensionale kankercelculturen zijn inderdaad intrinsiek niet in staat om cel-celcommunicatie en interacties met de extracellulaire matrix en zoals ze zich voordoen bij kankerte recapituleren 22,23. Patiënt-afgeleide tumororganoïden (PDTO's) zijn naar voren gekomen als tumormodellen die een dergelijke beperking ten minste gedeeltelijk omzeilen 24,25,26.

Helaas kunnen conventionele klonogene testen niet worden gebruikt om de stralingsgevoeligheid van PDTO's te beoordelen. Aan de ene kant hoeft het bestralen van gevestigde PDTO's hun groei als meercellige eenheid niet noodzakelijkerwijs in gevaar te brengen, tenzij hun stengelachtige compartiment - dat verantwoordelijk is voor de vorming en rijping van PDTO's maar een verhoogde resistentie tegen DNA-schade vertoont in vergelijking met meer gedifferentieerde PDTO-samenstellende cellen27 - volledig wordt uitgeroeid. Aan de andere kant is het mogelijk dat het bestralen van PDTO-afgeleide eencellige suspensies de radiogevoeligheid van PDTO-samenstellende (inclusief stamachtige) cellen zoals vertoond in de context van gevormde PDTO's, niet goed recapituleert. Hier beschrijven we een techniek die gebruikmaakt van live beeldvorming van PDTO's bij borstkanker om de PDTO-vormende werkzaamheid en groeisnelheid te controleren van PDTO-afgeleide cellen die eerder zijn blootgesteld aan ioniserende bestraling in vergelijking met hun niet-bestraalde tegenhangers. Met de vereiste variaties die grotendeels de differentiële biologie van individuele PDTO's weerspiegelen (bijv. vereisten voor kweekmedia, groeisnelheid), verwachten we dat dit protocol geschikt zal zijn voor de studie van radiosensitiviteit in een breed panel van PTDO's van zowel borst- als niet-borstoorsprong.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De reagentia en apparatuur die in het onderzoek worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Organoïde cultuur

OPMERKING: TNBC#1 PDTO's werden in ons laboratorium vastgesteld op basis van tumorweefsel dat operatief werd verwijderd van een patiënt met triple-negatieve borstkanker (TNBC) die geïnformeerde toestemming gaf om deel te nemen aan een biobankprotocol (IRB21-06023682). Na validatie door histologie en RNA-sequencing (RNAseq) worden TNBC#1 PDTO's gekweekt in 66% matrigeldruppels (zogenaamde 'domes') in verrijkt DMEM/F12-kweekmedium (Tabel 1) en elke 2-3 weken gepasseerd in een verhouding van 1:2-1:1028.

  1. Zaad PDTO's in een verhouding van 1:2-1:10 ongeveer 2 weken voor doorstraling in afzonderlijke, niet-hechtende platen met 6 putjes, één per elke geteste stralingsdosis (plus negatieve controles, die zullen worden verstrekt door PDTO's die niet zijn blootgesteld aan ioniserende straling).
  2. Voeg elke 3-4 dagen 3 ml vers verrijkt DMEM/F12-kweekmedium toe aan de PDTO's.
    OPMERKING: De zaai- en kweekomstandigheden kunnen enige aanpassing vereisen om te voorkomen dat PDTO's een zeer herkenbaar, ringachtig uiterlijk krijgen dat indicatief is voor kernnecrose onder de microscoop en om een optimale levensvatbaarheid bij doorstraling te garanderen.

2. Straling

  1. PDTO's zijn klaar voor bestraling zodra ze de gemiddelde grootte hebben bereikt (ongeveer 100 μm, zoals vooraf bepaald met behulp van helderveldmicroscopie met een schaalreferentie) en de bezetting van de koepel (ongeveer 80%). Passage de PDTO's in dit stadium om overbevolking te voorkomen.
  2. Bestraal de PDTO-bevattende koepels met behulp van de bestraling van het Small Animal Research Radition Platform (SARRP) (of een alternatieve bestraling voor in-vitro - of in-vivotoepassingen ) in open veldmodus (geen collimator), waarbij enkele doses van 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy en 10 Gy worden toegediend. Niet-bestraalde PDTO's zorgen voor passende negatieve controleomstandigheden.
    OPMERKING: Voorafgaand aan elk experiment moet de kalibratie van de dosimetrische tests worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat met matrigel omsloten PDTO's de geplande stralingsdosis ontvangen. Deze doses zijn gekozen op basis van voorlopige beoordelingen van de stralingsgevoeligheid van TNBC#1 PDTO's en kunnen daarom aanpassingen voor andere PDTO's vereisen.

3. Dissociatie

  1. Onmiddellijk na de doorstraling wast u elke PDTO-bevattende matrigelkoepel met 2 ml verrijkt DMEM/F12-kweekmedium en resuspendeert u ze in 1-3 ml TrypL-E met behulp van een p1000-micropipet. Herhaal dit ongeveer 30 keer voor elk putje.
  2. Verzamel de celsuspensie in een centrifugebuisje van 50 ml en incubeer gedurende ~5 minuten in een waterbad bij 37 °C.
  3. Pelleteer de cellen door ze 5 minuten bij kamertemperatuur te centrifugeren op 800 x g .
  4. Verwijder overtollig TrypL-E om ~1 ml in de tube achter te laten en voeg 3x het oorspronkelijke enzymvolume (zie stap 3.1) verrijkt DMEM/F12-medium toe om de cellen te wassen.
  5. Filtreer de celsuspensie met behulp van een maaswijdtefilter van 40 μm. Deze stap zorgt ervoor dat er geen celclusters achterblijven bij het plateren en dat elke nieuwe PDTO afkomstig is van een enkele cel.
  6. Tel de cellen in een geautomatiseerde cellenteller bij kleuring met 10% trypanblauw in PBS, en resuspendeer ze om 800 cellen te hebben in 50 μL verrijkt DMEM/F12-medium plus 66% matrigel bij 4 °C (voorwaarden voor 1 koepel).
  7. Plaat elke koepel in een afzonderlijk putje van een live-beeldvormingscompatibele kweekplaat met 48 putjes en vermijd de vorming van bellen. Technische drievouden voor elke stralingsdosis worden aanbevolen.
  8. Plaats de platen gedurende 30 minuten in een celcultuurincubator (37 °C, 5% CO2) om de matrigel te laten stollen.
  9. Voeg 0,5-1 ml verrijkt DMEM/F12-medium toe, verwijder mogelijke luchtbellen en plaats platen in het live beeldvormingssysteem in een celcultuurincubator. Laat de plaat ongeveer 30 minuten in evenwicht komen tot de ingestelde temperatuur voordat u de beeldvorming uitvoert.
    OPMERKING: Matrigel stolt bij temperaturen >4 °C, wat betekent dat deze temperatuur moet worden bewaard totdat stolling vereist is.

4. Live beeldvorming

  1. Selecteer in de Incucyte-software Schema om te verwerven.
  2. Klik op het plusteken in de linkerbovenhoek van Launch Add Vessel.
  3. Als u herhaaldelijk of één keer wilt scannen, selecteert u Scannen op schema en klikt u vervolgens op Volgende.
  4. Om een vaartuig te maken of te herstellen, selecteert u Vaartuig nieuw maken en klikt u vervolgens op Volgende.
  5. Om het scantype te selecteren, selecteert u Organoïde en klikt u vervolgens op Volgende.
  6. Scaninstellingen: Kies QC < ' Fase + Brightfield Image Channels. '4x Objectief' wordt automatisch geselecteerd. Klik vervolgens op Volgende.
  7. Selectie van schepen: Kies de juiste software-gevalideerde plaat op basis van het catalogusnummer.
  8. Locatie van het schip: Selecteer de locatie van de plaat op het instrument volgens de lay-out en klik vervolgens op Volgende.
  9. Scan patroon: Selecteer putjes volgens de lay-out van de plaat en klik vervolgens op Volgende.
  10. Vaartuig Notitieboekje: Naamplaatje (Optioneel: naam Celtype en Passage). Maak een plaatkaart door op het plusteken in de rechterbovenhoek van de plaatlay-out te klikken, 'Plaatkaart maken'.
  11. Geef in de Plate Map Editor het celtype aan door op het pictogram Nieuwe cel maken in de sectie Cellen te klikken, pas toe op de juiste putten door op het pluspictogram te klikken en selecteer de juiste putten. Optioneel: Het aantal gezaaide cellen en doorgangen kan worden aangegeven. Herhaal dit voor elke cellijn.
  12. Geef de behandeling aan door op het pictogram Nieuwe cel maken in het gedeelte Groeivoorwaarden te klikken, pas toe op de juiste putjes door op het pluspictogram te klikken en selecteer de juiste putjes. Herhaal dit voor elke experimentele voorwaarde. Klik vervolgens op Oké > Volgende.
  13. Analyse instellen: 'Analyse uitstellen tot later' wordt automatisch geselecteerd; klik op Volgende.
  14. Scan schema: Kies ervoor om twee keer per dag te scannen, voor onbepaalde tijd. Klik op Volgende. Houd de duisternis van controle-PDTO's in de gaten voor het ideale eindpunt, aangezien ze de neiging hebben in te storten wanneer ze overwoekerd zijn.
  15. Samenvatting: Controleer het overzicht en klik op Toevoegen aan planning.
    OPMERKING: Scaneigenschappen kunnen worden gevisualiseerd en het schema kan indien nodig worden bewerkt door met de rechtermuisknop op de scantijdlijn te klikken.

5. Beoordeling

  1. Selecteer in de compatibele software de optie Weergave. Dit kan ook worden bediend vanaf een computer die via intranet op het systeem is aangesloten.
  2. Selecteer het gewenste experiment door erop te dubbelklikken.
  3. Selecteer het pictogram Analyse starten .
  4. Selecteer de Nieuwe analysedefinitie maken en klik vervolgens op Volgende.
  5. Type analyse: Selecteer Organoïde en klik op Volgende.
  6. Afbeelding kanalen: 'Fase + Brightfield' is standaard geselecteerd, klik op 'Volgende'.
  7. Selecteer een set representatieve afbeeldingen voor analyse. Klik op Volgende. Het wordt aanbevolen om vroege en late tijdstippen en verschillende behandelingsomstandigheden te kiezen, bijv. controle en verschillende stralingsdoses.
  8. Voer een analysedefinitie uit voor TNBC#1 door de onderstaande stappen te volgen:
    1. Op afbeelding: Selecteer Voorbeeld van huidig of 'Voorbeeld van alles' om het standaardmasker van huidige of geselecteerde afbeeldingen te visualiseren. Herhaal dit terwijl de analyseparameters worden gewijzigd om het masker bij te werken.
    2. Segmentatie: Stel de straal in op 300, de gevoeligheidsachtergrond op 80, de randsplitsing op AAN en de randgevoeligheid op 70.
    3. Opruimen: Stel de vulling van het gat in op 5E+05 μm2 en pas de grootte aan op 0 pixels.
    4. Filters: Stel geen minimale of maximale oppervlakte in, minimale excentriciteit ingesteld op 0,19 en geen maximale excentriciteit. Klik op Volgende.
  9. Scantijden en putjes: Selecteer alle gewenste scantijdstippen en putjes. Klik op Volgende. Optioneel: selecteer Toekomstige scans analyseren.
  10. Analysedefinitie opslaan en toepassen: Voer de definitienaam in en klik op Volgende.
  11. Visualiseer de samenvatting en klik op Voltooien.
  12. Er verschijnt een pop-upvenster om de gebruiker te informeren dat de analyse in de analysewachtrij is terechtgekomen. Klik op OK. Zodra het venster Analysewachtrij wordt geopend, kunnen de resterende taken worden gevisualiseerd.
  13. Indien nodig haalt u de voltooide analyse op in Weergave door de blauwe pijl in de kolom Analyses te selecteren, naast de naam van het vaartuig, en met de rechtermuisknop op de naam van de analysedefinitie te klikken. Visualiseer vervolgens de onbewerkte gegevens in de software door te klikken op Metrische gegevens voor grafiekanalyse, of exporteer voor verdere analyse door Definitie van analyse exporteren te selecteren.
    OPMERKING: De export van onbewerkte gegevens kan worden aangepast in het venster Metrische gegevens voor grafiekanalyse . Het aantal organoïden, de totale oppervlakte, de gemiddelde excentriciteit en de duisternis kunnen afzonderlijk worden geëxporteerd en de gegevens kunnen worden geordend in het rolldown-menu Groepering selecteren door te klikken op Geen, Kolommen, Rijen of Replica's van plaatkaarten. Voor TNBC#1, voor export van onbewerkte gegevens, Graph Analysis Metrics en voor de roll-down-optie Select Grouping is de optie Geen gekozen. Deze importparameters zijn gekozen op basis van voorlopige beoordelingen met TNBC#1 PDTO's. Ze kunnen dus aanpassingen nodig hebben voor andere PDTO's, wat mogelijk is op de software op basis van de "Preview"-functies. We raden aan om importparameters aan te passen voor (1) vroege beelden die voornamelijk enkele cellen of kleine PDTO's bevatten, en (2) beelden die op late tijdstippen zijn verzameld om ervoor te zorgen dat grote PDTO's ook worden verkregen in zowel controle- als behandelde omstandigheden.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TNBC#1 PDTO's werden blootgesteld aan een enkele stralingsdosis van 0 (niet-bestraalde controles), 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy of 10 Gy op dag 0. Onmiddellijk daarna werden PDTO's gedissocieerd om een eencellige suspensie te verkrijgen voor elke experimentele aandoening. PDTO-afgeleide cellen werden vervolgens gezaaid in platen met 48 putjes binnen 66% matrigelkoepels (elk 50 μL) die in het midden van de putjes werden afgezet, in 3 technische replicaten per aandoening. De platen werden in een live beeldvormingssysteem geplaatst en elke 6 uur afgebeeld met behulp van het 4X-objectief van de organoïdemodule gedurende in totaal 30 dagen. Bestraling van TNBC#1 PDTO's met RT in een enkele dosis van 2 Gy vertraagde de hergroei van PDTO aanzienlijk, terwijl voltooide stralingsdoses ≥4 Gy (tot 10 Gy) de regeneratie van groeiende PDTO's verhinderden (Figuur 1).

figure-results-1
Figuur 1: Live beeldvorming van patiënt-afgeleide tumororganoïden (PDTO's). Borstkanker TNBC#1 patiënt-afgeleide tumororganoïden (PDTO's) werden onbehandeld gelaten of blootgesteld aan de aangegeven stralingsdosis, kort gevolgd door dissociatie, replating en beeldvorming met een live celbeeldvormingssysteem. Representatieve beelden na contrastaanpassing (A) en kwantitatieve beoordelingen (B, gemiddelde ± SEM) worden gerapporteerd. Beeldschaal: 1,19 x 1,16 mm (1,38 mm2). Schaal balk: 400 μm; inzetstukken: 200 μm. ****p < 0,001 (tweezijdig ANOVA, vergeleken met 0 Gy); ####p < 0,001 (tweezijdig ANOVA, vergeleken met 2 Gy). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BestanddeelConcentratie
DMEM F/121X
GlutaMax1X
Hepes10 mM
PenStreptokokken100 E/ml
B271X
Nac1,25 mM
Nicotinamide10 mM
TGFbeta-receptorremmer A83-010,5 μM
p38 MAP-remmer p38i SB2021901 μM
Kanton Noggin10%
Rspondin Media10%
Bekijk materiaal FGF1020 ng/ml
FGF75 ng/ml
NR (Heregulin)5 miljoen
Primocin100 μg/ml
Y-27632 (RhoKi)5 μM
Epidermale groeifactor hEGF5 ng/ml

Tabel 1: Samenstelling PDTO-kweekmedium.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een aanpassing van conventionele clonogene assays die gebruik maakt van PDTO's voor borstkanker en live beeldvorming om PDTO-radiogevoeligheid te kwantificeren op basis van (1) de persistentie van PTDO-vormende stamachtige cellen bij PDTO-bestraling in vitro, en (2) de groeisnelheid van de PDTO's die deze cellen (kunnen) genereren. Cruciale stappen van dit protocol zijn onder meer (1) het opzetten van PDTO's voor een koepelbezetting die een goede levensvatbaarheid mogelijk maakt, (2) PDTO-blootstelling aan ioniserende bestraling bij verschillende doses, inclusief nepbestraalde controleomstandigheden; (3) PDTO-dissociatie in enkele cellen; (4) vervanging van PDTO-afgeleide individuele cellen; en (5) live beeldvorming tot een vooraf gedefinieerde koepelbezetting in controleomstandigheden.

Met minimale aanpassingen, meestal gekoppeld aan de PDTO-vormende efficiëntie en de PDTO-groeisnelheid in controleomstandigheden (die waarschijnlijk aanzienlijk zullen variëren tussen verschillende PDTO's), verwachten we dat dit protocol kan worden aangepast aan meerdere in de handel verkrijgbare live beeldvormingsplatforms, evenals aan talrijke PDTO's, van zowel borst- als niet-borstoorsprong. Aan de ene kant wordt verwacht dat de basisefficiëntie van PDTO-vorming bij dispersie van één cel van invloed zal zijn op het aantal afzonderlijke cellen dat opnieuw moet worden ingezaaid om nieuwe PDTO's te verkrijgen met een dichtheid die niet alleen op beelden gebaseerde PDTO-kwantificering mogelijk maakt, maar ook de normale groei van onbehandelde PDTO's. Aan de andere kant wordt verwacht dat de groeisnelheid van PDTO van invloed zal zijn op de duur van de test, aangezien het samenvoegen van aangrenzende PDTO's moet worden vermeden om optimale analytische capaciteiten te behouden. Het bepalen van de PDTO-vormingsefficiëntie en PDTO-groeisnelheid in controleomstandigheden voor elke individuele PDTO is dus van cruciaal belang voor de juiste implementatie van dit protocol.

Hoewel deze methode vrij eenvoudig blijkt te zijn, heeft deze enkele beperkingen. Ten eerste kan een te laag aantal PDTO-vormende cellen de regeneratie van normaal groeiende PDTO's bij dissociatie van één cel belemmeren. Inderdaad, terwijl routinematige PDTO-passaging kan worden bereikt door onvolledige dissociatie, zijn kwantitatieve beoordelingen, zoals aangeboden door dit protocol, gebaseerd op het genereren van een eencellige suspensie (die visueel kan worden bevestigd tijdens het tellen). Ten tweede kan een te trage groeisnelheid de duur van de test aanzienlijk verlengen en mogelijk leiden tot een onnauwkeurige schatting van de radiosensitiviteit. Het is inderdaad denkbaar dat een langere kweektijd die nodig is voor langzaam groeiende PDTO's om een eindpunt-compatibele grootte te bereiken, extra kansen kan bieden voor subletaal bestraalde PDTO-vormende cellen om te herstellen van stress en detecteerbare (hoewel langzaam groeiende) PDTO's te herstellen. Ten slotte wordt verwacht dat het dissociëren van PDTO's kort na bestraling extra stress zal veroorzaken op PDTO-vormende cellen, waardoor de stralingsgevoeligheid mogelijk toeneemt als gevolg van veranderde cel-celcommunicatie in de vroege fasen van herstel. Het uitstellen van dissociatie van 24-72 uur kan inzicht geven in de relatieve bijdrage van geconserveerde cel-celcommunicatie aan het vermogen van PDTO-vormende cellen om te herstellen van macromoleculaire schade, zoals opgelegd door RT.

Hoewel live beeldvormingsplatforms een handige methode bieden om de vorming en groei van PDTO's in de lengterichting te volgen, kunnen beelden van één eindpunt ook voor hetzelfde doel worden gebruikt. In dit geval moet erop worden gelet dat aangrenzende PDTO's niet samensmelten voorafgaand aan de beeldvorming, en kan de groeisnelheid worden beoordeeld als een functie van de PDTO-grootte genormaliseerd naar de duur van de test.

In het tijdperk van gepersonaliseerde kankergeneeskunde is het beoordelen van de gevoeligheid van individuele tumoren voor behandeling van het grootste belang, omdat het enkele aanwijzingen geeft voor het ontwerp van geïndividualiseerde therapeutische strategieën met verbeterde werkzaamheid29. Het hierin beschreven protocol past in dit streven door een handige benadering te bieden voor het schatten van de cellulaire gevoeligheid van individuele PDTO's voor ioniserende straling (alleen of in combinatie met andere therapeutische modaliteiten). Dat gezegd hebbende, moet nog worden aangetoond of het meten van de radiogevoeligheid van kankercellen van PDTO's de respons van individuele patiënten met kanker op focale RT nauwkeurig voorspelt. Het correleren van de stralingsgevoeligheid van verschillende PDTO's voor bestraling met de klinische respons op RT van hun respectievelijke donoren zal belangrijke inzichten opleveren in deze mogelijkheid.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niet gerelateerd aan dit werk, SCF heeft/heeft onderzoekscontracten met Merck, Varian, Bristol Myers Squibb, Celldex, Regeneron, Eisai en Eli-Lilly, en heeft consulting/adviserende honoraria ontvangen van Bayer, Bristol Myers Squibb, Varian, Elekta, Regeneron, Eisai, AstraZeneca, MedImmune, Merck US, EMD Serono, Accuray, Boehringer Ingelheim, Roche, Genentech, AstraZeneca, View Ray en Nanobiotix. Niet gerelateerd aan dit werk, heeft SD consulting/advisory honoraria ontvangen van Lytix Biopharma, EMD Serono, Ono Pharmaceutical, Genentech en Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc., en heeft/heeft onderzoekscontracten met Lytix Biopharma, Nanobiotix en Boehringer-Ingelheim. LG heeft/had onderzoekscontracten met Lytix Biopharma, Promontory en Onxeo, heeft consulting/advisory honoraria ontvangen van Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, OmniSEQ, Onxeo, The Longevity Labs, Inzen, Imvax, Sotio, Promontory, Noxopharm, EduCom en de Luke Heller TECPR2 Foundation, en heeft Promontory aandelenopties.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Raymond Briones en Wen H. Shen (Weill Cornell Medical College, New York, NY, USA) voor hun hulp bij de ontwikkeling van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door een Transformative Breast Cancer Consortium Grant van het Amerikaanse DoD BCRP (#W81XWH2120034, PI: Formenti).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
40 µm mesh filterThomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell CounterNexcelom
DMEM F/12Corning 12634-010
Epidermal Growth Factor hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 35050061
HepesInvitrogen 15630-080
IncuCyte software 2021ASartoriusversie: 2021A
Incucyte SX1Sartoriusmodel SX1
Incucyte gevalideerde 48-wells plaatCorning 3548
MatrigelDiscovery Labware354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginAangeschaft bij het Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Niet-behandelde 6-wells plaatCellstar657 185
NR (Heregulin)Peprotech100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBSCorning 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin MediaAangeschaft bij het Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP) Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01Tocris2939
Trypan blauw kleurmiddel (0,4%)Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 (RhoKi)SelleckS1049

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Ruysscher, D., et al. Radiotherapy toxicity. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 13(2019).
  2. Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for prostate cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 111, 3, Supplement e351-e352 (2021).
  3. Harmenberg, U., Hamdy, F. C., Widmark, A., Lennernäs, B., Nilsson, S. Curative radiation therapy in prostate cancer. Acta Oncol. 50, Suppl 1 98-103 (2011).
  4. Nakano, T., Ohno, T., Ishikawa, H., Suzuki, Y., Takahashi, T. Current advancement in radiation therapy for uterine cervical cancer. J Radiat Res. 51 (1), 1-8 (2010).
  5. Spencer, K., Parrish, R., Barton, R., Henry, A. Palliative radiotherapy. BMJ. 360, k821(2018).
  6. Price, J. M., Prabhakaran, A., West, C. M. L. Predicting tumour radiosensitivity to deliver precision radiotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 20 (2), 83-98 (2023).
  7. McLaughlin, M., et al. Inflammatory microenvironment remodelling by tumour cells after radiotherapy. Nat Rev Cancer. 20 (4), 203-217 (2020).
  8. Rodriguez-Ruiz, M. E., Vitale, I., Harrington, K. J., Melero, I., Galluzzi, L. Immunological impact of cell death signaling driven by radiation on the tumor microenvironment. Nat Immunol. 21 (2), 120-134 (2020).
  9. Cytlak, U. M., et al. Immunomodulation by radiotherapy in tumour control and normal tissue toxicity. Nat Rev Immunol. 22 (2), 124-138 (2022).
  10. Hanahan, D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).
  11. Groelly, F. J., Fawkes, M., Dagg, R. A., Blackford, A. N., Tarsounas, M. Targeting DNA damage response pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 23 (2), 78-94 (2023).
  12. Renaudin, X. Reactive oxygen species and DNA damage response in cancer. Int Rev Cell Mol Biol. 364, 139-161 (2021).
  13. Klapp, V., et al. The DNA damage response and inflammation in cancer. Cancer Discov. 13 (7), 1521-1545 (2023).
  14. Constanzo, J., Garcia-Prada, C. D., Pouget, J. P. Clonogenic assay to measure bystander cytotoxicity of targeted alpha-particle therapy. Methods Cell Biol. 174, 137-149 (2023).
  15. Serrano-Mendioroz, I., Garate-Soraluze, E., Rodriguez-Ruiz, M. E. A simple method to assess clonogenic survival of irradiated cancer cells. Methods Cell Biol. 174, 127-136 (2023).
  16. Petroni, G., et al. Radiotherapy delivered before CDK4/6 inhibitors mediates superior therapeutic effects in ER(+) breast cancer. Clin Cancer Res. 27 (7), 1855-1863 (2021).
  17. Alvarez-Abril, B., et al. Cytofluorometric assessment of acute cell death responses driven by radiation therapy. Methods Cell Biol. 172, 17-36 (2022).
  18. Bodey, R. K., Evans, P. M., Flux, G. D. Application of the linear-quadratic model to combined modality radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 59 (1), 228-241 (2004).
  19. Unkel, S., Belka, C., Lauber, K. On the analysis of clonogenic survival data: Statistical alternatives to the linear-quadratic model. Radiat Oncol. 11, 11(2016).
  20. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  21. Buqué, A., Galluzzi, L. Modeling Tumor immunology and immunotherapy in mice. Trends Cancer. 4 (9), 599-601 (2018).
  22. Lee, S. Y., Bissell, M. J. A Functionally robust phenotypic screen that identifies drug resistance-associated genes using 3D cell culture. Bio Protoc. 8 (22), e3083(2018).
  23. Mina, J. Bissell: Context Matters. Trends Cancer. 1 (1), 6-8 (2015).
  24. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  25. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  26. van Renterghem, A. W. J., van de Haar, J., Voest, E. E. Functional precision oncology using patient-derived assays: Bridging genotype and phenotype. Nat Rev Clin Oncol. 20 (5), 305-317 (2023).
  27. Vitale, I., Manic, G., De Maria, R., Kroemer, G., Galluzzi, L. DNA damage in stem cells. Mol Cell. 66 (3), 306-319 (2017).
  28. Sachs, N., et al. A Living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  29. Zhou, Z., et al. Harnessing 3D in vitro systems to model immune responses to solid tumours: A step towards improving and creating personalized immunotherapies. Nat Rev Immunol. 24, 18-32 (2024).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Clonogenic AssayRadiation TherapyPatient Derived OrganoidsIonizing IrradiationOrganoid Growth RateStem Like CellsPersonalized Medicine

Gerelateerde artikelen