Methodenartikel

Isolatie van endotheelcellen van de pancreas van muizen

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66690

⸱

21 juni 2024

 ,  ,  ,  , 
1Irell and Manella Graduate School, City of Hope, 2Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de isolatie van endotheelcellen van muizen uit de hele alvleesklier.

Samenvatting

De alvleesklier is een vitaal orgaan voor het handhaven van het metabolische evenwicht in het lichaam, deels vanwege de productie van metabole hormonen zoals insuline en glucagon, evenals spijsverteringsenzymen. De alvleesklier is ook een sterk gevasculariseerd orgaan, een kenmerk dat wordt vergemakkelijkt door het ingewikkelde netwerk van pancreashaarvaten. Dit uitgebreide capillaire netwerk bestaat uit sterk gefenestreerde endotheelcellen (EC's) die belangrijk zijn voor de ontwikkeling en functie van de alvleesklier. Dienovereenkomstig kan de disfunctie van EC's bijdragen aan die van de alvleesklier bij ziekten zoals diabetes en kanker. Onderzoek naar de functie van pancreas-EC's (pEC's) is dus niet alleen belangrijk voor het begrijpen van de biologie van de alvleesklier, maar ook voor het ontwikkelen van de pathologieën ervan. Muismodellen zijn waardevolle hulpmiddelen om stofwisselings- en hart- en vaatziekten te bestuderen. Er is echter geen opgesteld protocol met voldoende details beschreven voor de isolatie van pEC's bij muizen vanwege de relatief kleine populatie EC's en de overvloedige spijsverteringsenzymen die mogelijk vrijkomen uit het acinaire weefsel en die kunnen leiden tot celbeschadiging en dus lage opbrengst. Om deze uitdagingen aan te gaan, hebben we een protocol opgesteld om de pEC's van muizen te verrijken en te herstellen, waarbij zachte fysische en chemische dissociatie en antilichaam-gemedieerde selectie worden gecombineerd. Het hier gepresenteerde protocol biedt een robuuste methode om intacte en levensvatbare EC's uit de hele alvleesklier van de muis te extraheren. Dit protocol is geschikt voor meerdere downstream-assays en kan worden toegepast op verschillende muismodellen.

Inleiding

De alvleesklier, de sleutel tot metabole controle en homeostase, is een sterk gevasculariseerd orgaan. De alvleesklier heeft zowel endocriene als exocriene functies en regelt respectievelijk de regulatie van de bloedglucose en spijsverteringsenzymen. Deze twee compartimenten zijn met elkaar verbonden door het uitgebreide netwerk van pancreasbloedvaten, waardoor de uitwisseling en het transport van zuurstof, hormonen en enzymen wordt vergemakkelijkt. Van cruciaal belang is dat dit dichte capillaire netwerk het eilandje Langerhans binnendringt, een cluster van hormoonregulerende cellen in de alvleesklier die verantwoordelijk zijn voor de endocriene functie, bestaande uit de glucagon-afscheidende alfa (α) cellen, de insuline-afscheidende bèta (β) cellen en de somatostatine-afscheidende delta (δ) cellen 1,2. Hoewel de eilandjes slechts 1-2% van de pancreasmassa uitmaken, ontvangen ze 20% van de totale bloedstroom3, wat het belang van eilandjesvasculatuur benadrukt. De capillairen van de alvleesklier bestaan voornamelijk uit sterk gefenestreerde endotheelcellen (EC's), die zijn omgeven door murale pericyten. Deze capillaire EC's spelen een vitale rol bij de ontwikkeling, rijping en (dys)functie van eilandjes en vormen intieme overspraak met verschillende endo- en exocriene cellen4 (Figuur 1).

Endotheliale disfunctie is waargenomen bij zowel diabetes type 1 als type 2, de meest voorkomende aandoeningen veroorzaakt door disfunctie van de pancreaseilandjes 5,6. Zowel de microvasculaire dichtheid als de morfologie van de eilandjes kunnen worden gewijzigd bij diabetes7. Bovendien wordt alvleesklierkanker, een zeer agressieve tumor die zich ook als diabetes kan manifesteren, gekenmerkt door een hoge microvasculaire dichtheid met slechte perfusie8. Gezien de cruciale structurele en functionele rol van EC's in zowel normaal als ziek pancreasweefsel, is er een pertinente behoefte om de pEC's in ontwikkeling, fysiologie en pathologie te bestuderen om de mechanismen te onthullen die gezondheid of ziekten stimuleren.

Er zijn talloze protocollen ontwikkeld voor de isolatie van EC's uit verschillende muizen (bijv. hersenen 9,10, long11, hart12, lever13, skeletspieren14 en vetweefsel15) en mensen (bijv. hersenen16, visceraal vetweefsel17,18, perifere zenuwen19, long 20,21,22 en mesenteriale slagader 23) weefsels. Deze protocollen omvatten doorgaans het gebruik van enzymatische digesties (bijv. door collagenase, trypsine24, dispase 24,25 en liberase26), gevolgd door een op antilichamen gebaseerde verrijkingsstap. Bovendien zijn deze protocollen meestal gebaseerd op een langere duur van de spijsvertering in hoge concentraties enzymen met krachtige agitatie bij 37 °C (tabel 1). Vanwege de unieke kenmerken van de alvleesklier, waaronder het feit dat deze een overvloed aan endogene spijsverteringsenzymen herbergt, kunnen deze bestaande protocollen niet rechtstreeks worden toegepast om pEC's te isoleren. Ten eerste verschilt de samenstelling van de extracellulaire matrix (ECM) van de alvleesklier van andere weefsels. Hoewel collagenase vaak wordt gebruikt voor EC-isolatie, zijn er meerdere subtypes met verschillende weefselspecifieke dissociatiemogelijkheden, waardoor optimalisatie vereist is. Ten tweede, en cruciaal voor pEC-isolatie, kan de afgifte en activering van endogene enzymen van de pancreas het isolatieproces aanzienlijk belemmeren. Daartoe moet voorzichtigheid worden betracht om de breuk van de exocriene acinaire cellen (de primaire bron van zymogens, proteasen en RNase27) tot een minimum te beperken, wat verdere celbeschadiging kan veroorzaken en kan resulteren in een lage levensvatbaarheid van de cellen en het algehele herstel kan beïnvloeden 27,28,29.

Om deze uitdagingen aan te gaan, hebben we methoden aangepast uit bestaande EC-isolatieprotocollen en een nieuw protocol opgesteld dat geschikt is voor EC-isolatie van muizenpancreas. Concreet beschrijven we hier een workflow (Figuur 2) met collagenase Type I (typisch geïmplementeerd voor EC-isolatie van de long), lagere spijsverteringstemperaturen en geen agitatie (om activering van pancreaszymogenen te voorkomen) en DNase 30,31,32-suppletie (om DNA-geïnduceerde apoptose te voorkomen en de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren, en een antilichaam voor CD3133 (PECAM1, een pan-EC-marker). Het beschreven protocol produceert EC-populaties geïsoleerd uit de alvleesklier van muizen die kunnen worden gebruikt voor genexpressieprofilering en eiwittesten.

Protocol

Weefselisolatie werd uitgevoerd onder het goedgekeurde onderzoeksprotocol #17010 door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Beckman Research Institute, City of Hope (Duarte, Californië, VS). Hier gebruiken we Tie-2CreERT2; Rosa26-TdTomato muislijn in C57BL/6 achtergrond op een leeftijd van 8 - 12 weken. In deze lijn worden EC's gelabeld met TdTomato wanneer ze worden geïnduceerd met tamoxifen zoals eerder beschreven34. Dit protocol kan echter worden aangepast voor volwassen muizen van alle leeftijden met verschillende genotypen en genetische achtergronden.

1. Weefselafname (geschatte tijd: 1-2 uur)

OPMERKING: De geschatte tijd is 15 min/dier, aanbevolen maximum 3 dieren gepoold per dissociatiemonster.

  1. Euthanaseer dieren door een overdosis kooldioxide (CO2), gevolgd door secundaire bevestiging van overlijden. Spuit vóór de dissectie het hele lichaam in met 70% ethanol (EtOH) en desinfecteer het operatiegebied volledig.
  2. Rek de ledematen uit en zet ze vast met pinnen. Maak met een chirurgische schaar een kleine incisie in de middellijn door de huid en het buikvlies, beginnend bij de onderbuik en zich uitstrekkend naar het thoracale gebied.
  3. Leg de ribbenkast bloot door het middenrif door te snijden en til de ribbenkast op om het hart bloot te leggen.
  4. Steek een naald (25G-30G) aangesloten op een spuit met ijskoude steriele PBS, in de linker hartkamer.
  5. Start de perfusie door de PBS door het hart te injecteren met een snelheid van 5 - 10 ml/min. Stop na het injecteren van 10 ml, of totdat de lever en de nieren verkleuren.
  6. Zoek na perfusie de alvleesklier (onder de maag en bevestigd aan de twaalfvingerige darm)35 (Figuur 3A) en verwijder deze voorzichtig met een ontleedschaar en een tang.
  7. Eenmaal geïsoleerd, breng de alvleesklier over naar een buis van 50 ml met 10 ml ijskoude PBS + 0,2 mg/ml trypsineremmer, bewaar op ijs (Figuur 3B).
    OPMERKING: Alvleesklier van maximaal 3 muizen kan bij deze stap worden samengevoegd en in 1 buis worden overgebracht. Monsters kunnen maximaal 2 uur op ijs worden bewaard.

2. Collagenasepreparaat (geschatte tijd: 15-30 min)

  1. Bereid oplossingen en buffers voor zoals hieronder beschreven.
    1. Dissociatieoplossing: Voeg collagenase Type I toe aan een tube van 50 ml tot een eindconcentratie van 1 mg/ml in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS 1x (Ca2+, Mg2+; zie materiaaltabel) en 0,001 E/ml DNase I + 0,2 mg/ml trypsineremmer.
    2. Dissociatiestopoplossing: Voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing toe (PBS 1x, zonder Ca2+, Mg2+; hetzelfde voor alle overige PBS in dit protocol; zie materiaaltabel), 5% runderserumalbumine (BSA), 0,001 E/ml DNase I of DMEM + 10% FBS + 0,001 MU/ml DNase I.
    3. Wasbuffer: PBS 1x, 0,5% runderserumalbumine (BSA), 0,001 E/ml DNase I + 0,05 mg/ml trypsineremmer toevoegen.
  2. Los de buffers volledig op en filtreer door een filter van 0,22 μm. Zet opzij en houd op ijs.

3. Spijsvertering (geschatte tijd: 40 min-1 uur)

  1. Verwijder de alvleesklier van ijskoude PBS en leg deze op een petrischaaltje op ijs. Verwijder voorzichtig overtollig weefsel (bijv. milt, vet, vuil) met een chirurgische schaar en een pincet (Figuur 3C).
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om vet te verwijderen, omdat een teveel aan lipiden de weefselvertering kan verstoren.
  2. Breng de bijgesneden muizenalvleesklier over in een buisje van 5 ml met 1 ml dissociatieoplossing.
  3. Houd de buis op ijs en hak het vlies van de alvleesklier met een ontleedschaar fijn tot fijne pipetbare stukjes, bijv. 0,5 mm of 1 mm. Breng het lysaat over in een buis van 50 ml en bewaar op ijs.
  4. Voeg extra pancreas toe aan de tube van 5 ml die wordt gebruikt om het pancreasweefsel in eerste instantie te hakken en voeg nog eens 1 ml collagenase toe. Herhaal indien nodig voor meerdere pancreaspreparaten.
  5. Voeg 2 ml collagenaseoplossing toe aan de tube van 5 ml om eventueel achtergebleven pancreasweefsel te verwijderen en breng over naar de tube van 50 ml. Het totale collagenasevolume moet 5 ml zijn voor 3 alvleesklieren of 3 ml voor een enkele alvleesklier.
  6. Nadat alle monsters mechanisch zijn gedissocieerd, worden de buisjes van 50 ml met de gehomogeniseerde weefsellysaten overgebracht naar een waterbad van 37 °C en gedurende 10 minuten geïncubeerd.
    OPMERKING: Schud of draai het weefselmengsel tijdens dit proces niet krachtig, omdat dit kan leiden tot scheuren van acinaire weefsels en het vrijkomen van overvloedige endogene enzymen en DNA.
  7. Haal de buizen uit het waterbad en draai ze voorzichtig rond om goed te mengen, en laat ze nog 10 minuten in het waterbad staan (Totale tijd: 20 min).
    OPMERKING: Niet langer dan 30 minuten in een waterbad van 37 °C gebruiken om oververtering te voorkomen.
  8. Plaats de buizen op ijs en laat het homogenaat door de zwaartekracht bezinken. Zodra het is bezonken, brengt u het bovenstaande over door een filter van 70 μm en voegt u 5 ml dissociatiestopoplossing toe.
  9. Voeg een extra 1 ml dissociatieoplossing toe aan de resterende pellet en triturateer met een naald van 18 G.
  10. Haal het resterende homogenaat door het filter en was met nog eens 5 ml dissociatiestopoplossing.
  11. Centrifugeercelsuspensie bij 300 x g gedurende 10 min, bij 4 °C. Verwijder het bovenstaande volledig door aspiratie en bewaar de celpellet op ijs.
  12. Resuspendeer de celpellet met 1 ml wasbuffer en breng over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  13. Neem een klein aliquoot uit de geresuspendeerde celpellet (10 μL) en meng met trypanblauw in een verhouding van 1:1 om cellen te tellen met behulp van een cellenteller en de levensvatbaarheid te meten.

4. Verrijking van endotheelcellen (EC) (geschatte tijd: 2-3 uur)

  1. Voeg 1 μl anti-CD31-biotine-antilichaam toe voor elke 1 x 107 cellen geteld en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C op een rotator (ongeveer 5 μl per 3 alvleesklier).
  2. Voeg 20 μL anti-biotine microbeads toe en incubeer gedurende 40 minuten bij 4 °C op een buisrotator.
  3. Zet een magnetische standaard op met de kolomscheidingshouder en breng de kolom aan. Evenwichtskolom met 3 ml wasbuffer.
  4. Voeg een monster toe aan de kolom en was met in totaal 9 ml wasbuffer.
    OPMERKING: Als de celconcentratie hoog is, verdun de cellen dan met een extra 2 ml wasbuffer in een aparte buis. Voeg 1 ml monster per keer toe aan de kolom om te voorkomen dat de kolom verstopt raakt.
  5. Verwijder de kolom uit de kolomhouder en plaats deze in een buis van 15 ml. Voeg 5 ml wasbuffer toe aan de kolom. Gebruik de zuiger om cellen in de kolom naar beneden te duwen en elutie op te vangen (die verrijkte EC bevat).
  6. Draai de doorstroming en de elutie/EC-fractie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C af. Tel cellen en meet de levensvatbaarheid zoals in stap 3.13.
  7. Valideer EC-verrijking via qPCR van doorstroom en EC-fracties. Gebruik NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) als algemene marker voor endocriene cellen en bloedplaatjes en endotheelceladhesiemolecuul (Pecam1) als marker voor EC33. Gebruik 36B4 (Rplp0, zuur ribosomaal fosfoproteïne p0) als interne controle voor normalisatie van genexpressie.
    OPMERKING: Verzamelde monsters kunnen in deze stap worden gebruikt voor eiwit- of RNA-analyses.

5. Kweken van pEC's

  1. Bereid de M199 medium voor. Vul M199 medium aan tot een eindconcentratie van 20% foetaal runderserum (FBS) en 0,1% penicilline-streptomycine.
  2. Smeer een celkweekplaat van 60 mm in met collageen Type I (1 mg/ml in 0,1 M azijnzuur) en laat 30 minuten bij kamertemperatuur staan.
  3. Verwijder collageen Type I en spoel de plaat twee keer af met 1X PBS. Voeg 2 ml bereide M199 Media toe en plaats de celkweekplaat gedurende 5 minuten in de standaard celcultuurincubator (5% CO2, 37 °C).
  4. Zodra de cellen zijn geïsoleerd, voegt u geïsoleerde cellen toe aan de voorverwarmde M199-celkweekplaat. Bewaar cellen ongeveer 14 dagen in kweekomstandigheden en vervang de media elke 2-3 dagen.

Resultaten

Volgens dit protocol kunnen ongeveer 2 x 106 levende cellen worden verkregen bij het samenvoegen van 3 muizenalvleesklieren en 750.000 cellen van een enkele muizenalvleesklier. Om de verrijking van EC te valideren, hebben we de volgende analyses uitgevoerd: 1) kwantitatieve PCR: vergeleken met de doorstroommonsters (FT) (d.w.z. de niet-CD31-antilichaamgebonden fracties), hadden de EC-fracties significant hogere niveaus van Pecam1 (coderend voor CD31) en Kdr (coderend voor VEGFR2), twee EC-markergenen33 en lagere niveaus van NK6 homeobox 1 (Nkx6.1), een transcriptiefactor in de endocriene cellen van de pancreas (Figuur 4A); 2) western blotting: EC-verrijkte monsters van drie preparaten (pEC-1-3) vertoonden sterke signalen van CD31 bij de verwachte grootte (~130 kDa). Ter vergelijking: de input- en FT-samples vertoonden een minimaal CD31-signaal. Als positieve controle vertoonden lysaten van MS1-cellen, een pEC-cellijn, ook een sterk CD31-signaal (Figuur 4B); 3) trypanblauwe kleuring: we ontdekten dat de levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen ongeveer 50% was (Figuur 4C); 4) flowcytometrie volgens een gepubliceerd protocol15 : door gating op de levende celpopulatie (Figuur 4D), ontdekten we dat de CD31+-cellen op 88% zaten en de TdTomato+-cellen op 76%. Merk op dat de meerderheid van de geïsoleerde cellen CD31 en TdTomato samen tot expressie brengt (Figuur 4E). Als negatieve controles vertoonden de ongekleurde MS1-cellen en MS1 geïncubeerd met IgG geen levende cellen zoals gemarkeerd door CD31. Als positieve controle, d.w.z. MS1-cellen gekleurd voor CD31, vertoonden bijna 100% levende CD31+-cellen (Figuur 4F). We hebben ook de geïsoleerde cellen gekweekt, immunofluorescentiekleuring van PECAM1 uitgevoerd volgens een gepubliceerd protocol36 en TdTomato in beeld gebracht, dat robuuste signalen van beide markers in de geïsoleerde cellen liet zien, wat de aanwezigheid van EC's suggereert (Figuur 4G).

figure-results-1
Figuur 1: Illustratie van vascularisatie van pancreas en pancreaseilandjes. Een picturale weergave van de endotheelcellen van de alvleesklier (EC's) en EC's binnen de eilandjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Overzicht van de workflow. 1) Pancreasdissectie, 2) mechanische digestie, 3) enzymincubatie, 4) centrifugatie, 5a) verwijdering van supernatans en 5b) secundaire collagenasedigestie van de celpellets met trituratie voor filtering in 6), 7) en 8) reconstitutie van pellets en antilichaambinding, 9) incubatie van microbeads, 10) verrijking van de MACS-kolom, 11) celtelling voor levensvatbaarheid, en 12) stroomafwaartse analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Stappen voor weefselverwerking. Afbeeldingen van (A) de buikholte, (B) de geïsoleerde muizenalvleesklier en (C) de bijgesneden muizenalvleesklier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Validatie van geïsoleerde EC-fracties uit de alvleesklier van muizen. (A) qPCR van FT-monsters en verrijkte EC-fractie met CD31 voor verrijking. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) en Nkx6.1 (pancreas-β-celspecifieke transcriptiefactor)33. * geeft p <0,05 aan in vergelijking met FT op basis van t-tests . n = 3-4 gepoolde monsters, bestaande uit elk 3 muizen. (B) Westerse blotting van CD31. pEC-1-3 geeft verrijkte EC's aan uit 3 afzonderlijke gepoolde muismonsters. Cellysaten van 30 mg werden op elke baan geladen, gevolgd door Ponceau S-kleuring. (C) Celtelling en trypanblauwe kleuring van verrijkte pEC's voor levensvatbaarheidstest. (D) Flowcytometrie-poortstrategie voor pEC's van muizen gekleurd door 4', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) en CD31-antilichaam. (E) Flowcytometriehistogrammen van ongekleurd MS1 (linksboven), MS1 gekleurd met AlexaFluor-488 secundair antilichaam (IgG-controle; rechtsboven), MS1 gekleurd met CD31 (linksonder) en de geïsoleerde muizen-pEC's gekleurd met CD31 (rechtsonder). (F) Percentage levende cellen gekwantificeerd met behulp van flowcytometrie. (G) Immunofluorescentie van CD31-expressie (groen) met DAPI (blauw) tegenkleuring en endogene TdTomato fluorescerende reporter (rood). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: CD31- en CD144-specificiteit in de alvleesklier van muizen. (A) Immunofluorescentie van de alvleesklier van muizen met CD31 (Magenta) en CD144 (cyaan), met DAPI-tegenkleuring. Afbeelding vastgelegd met een 10x lens onder een breedveld fluorescerende omgekeerde microscoop. Schaal balk = 100 μm. Stippellijnen bakenen het eilandje af. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) die Cdh5- en Pecam1-expressie toont in de eilandjes-EC's van C57BL6-muizen gedetecteerd door scRNA-seq (GSE128565)37. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

EnzymGebruikenTemperatuur en tijdReferentie
Collagenase IEencellige dissociatie, EC-verrijking van de hele alvleesklier37 °C, 20 minDit protocol
Collagenase IVIsolatie van eilandjes en niet-enzymatische dissociatie37 °C, 20 min46
Collagenase + TrypsineOnderzoek naar ductale cellen in de alvleesklier van muizen37 °C, 30 min47
Collagenase BEencellige suspensie van de alvleesklier37 °C, 30 min48
Collagenase NBIEilandje isolatie37 °C, 30 min49
Collagenase PAcinar levensvatbare suspensie37 °C, 15 min45
Collagenase XIEilandje isolatie37 °C, 15 min35
DispaseOphanging met één cel37 °C, 45 min24
LiberaseOphanging met één cel37 °C, 10 min25, 48
TrypsineDissociatie van enkele cellen, hele alvleesklier4 °C, O/N28

Tabel 1: Samenvatting van de verschillende protocollen die worden gebruikt om monsters van de alvleesklier van muizen te verwerken.

Discussie

In dit artikel presenteren we een protocol voor verrijking en isolatie van de pEC's. Net als bij eerdere EC-isolatieprotocollen van andere weefsels of organen, bestaat dit protocol uit drie belangrijke processen, namelijk fysieke dissociatie, enzymatische vertering en op antilichamen gebaseerde EC-verrijking. Om de unieke uitdagingen bij de verwerking van de alvleesklier aan te pakken, hebben we verschillende belangrijke aanpassingen en cruciale stappen binnen ons protocol geïntroduceerd: 1) een zachte eenstaps collagenasevertering met een korte incubatietijd, 2) suppletie van een hogere concentratie DNase en een trypsineremmer om DNA-besmetting en endogene enzymvertering te minimaliseren, die de binding van antilichamen kunnen verstoren en zo de EC-verrijking en levensvatbaarheid kunnen verminderen en 3) celtelling na de verteringsstap om aan te passen hoe er wordt veel antilichaam aan het monster toegevoegd om de EC-verrijking te optimaliseren. Tijdens het optimaliseren van dit protocol hebben we andere enzymen getest die in eerdere studies zijn gebruikt, bijv. trypsine28, collagenase Type IV31 en andere spijsverteringstemperaturen, bijv. 4°C, evenals verschillende incubatietijden (Tabel 1). We vonden collagenase Type I, 20 min, bij 37 °C de optimale conditie voor de pEC-isolatie van muizen en gebruikten dit hier. Hoewel de toevoeging van een antistollingsmiddel tijdens de perfusie de algehele levensvatbaarheid van de cellen kan verbeteren, kan een typisch antistollingsmiddel, bijv. EDTA of heparine, de activiteit van bepaalde enzymen verstoren, bijv. collagenase voor celdissociatie en reverse transcriptase dat wordt gebruikt in qPCR. Om het onverwachte/ongewenste effect van deze anticoagulantia te voorkomen, wordt PBS (zonder Ca2+ en Mg2+) voor perfusie gebruikt.

We concentreerden ons op het ontwikkelen van een protocol voor het verrijken van de EC-populatie uit hele pancreasen van muizen, dat zowel EC's binnen eilandjes als EC's in de exocriene weefsels zou omvatten, wat zou resulteren in een hogere opbrengst. In het huidige protocol hebben we 3 dieren samengevoegd tijdens de dissociatiestap en bereikten we gemiddeld een eencellige suspensie met ongeveer 2,0 x 106 levensvatbare cellen. We hebben ook monsters getest van de alvleesklier van één muis en er kunnen ongeveer 750.000 cellen worden verkregen. Het is vermeldenswaard dat bij het aanpassen aan de verwerking van een enkel dier, minder dissociatieoplossing (3 ml dissociatie per alvleesklier) moet worden gebruikt. Een cruciale stap in het protocol is het volledig wegsnijden en verwijderen van eventueel achtergebleven vet dat aan de alvleesklier is bevestigd (Figuur 3B). Besmetting van vetweefsel in de collagenasevertering zal de dissociatiestap van één cel van de alvleesklier verstoren, waardoor de levensvatbaarheid van de cellen afneemt in de volgende verrijkingsstappen38. Om de pEC's te verrijken gebruikten we bovendien een pan-EC oppervlaktemerker, PECAM1/CD31. Met behulp van PECAM1/CD31-antilichaam konden we de EC-fracties aanzienlijk verrijken, wat blijkt uit de genexpressieanalyse. Bij de ontwikkeling van dit protocol hebben we ook het nut van CD144-antilichaam getest, dat ook vaak wordt gebruikt om EC's13 te isoleren. We waren echter niet in staat om de pEC's te verrijken (gegevens niet getoond). Intrigerend genoeg onthulde immunofluorescerende kleuring dat terwijl CD31 tot expressie komt in alle EC's in het pancreasweefsel, CD144-antilichaam alleen intra-eilandje EC's lijkt te kleuren (Figuur 5A). Daarnaast analyseerden we openbaar beschikbare eencellige RNA-seq-gegevens van eilandjes geïsoleerd uit C57BL/6-muizen (GSE128565)37 en ontdekten dat ongeveer 50% van de eilandjes-EC's expressie van zowel Cdh5 (VE-Cad) als Pecam1 vertoont, maar de rest van de eilandjes-EC's brengen alleen Cdh5 of Pecam1 tot expressie (Figuur 5B). We speculeren dus dat CD31-antilichamen geschikter zijn voor pEC-isolatie en dat het nut van CD144-antilichamen voor dit doel toekomstig onderzoek rechtvaardigt. Bovendien zijn er in de handel verkrijgbare anti-CD31 geconjugeerd met magnetische kralen die de tweestaps antilichaambindingsstap kunnen vereenvoudigen tot een enkelvoudige stap.

Zoals aangetoond, hebben we qPCR, immunoblotting, flowcytometrie en immunofluorescerende kleuring uitgevoerd om de geïsoleerde EC-fractie te valideren. Het is denkbaar dat deze fracties kunnen worden onderworpen aan andere testen, zoals (sc)RNA-seq en massaspectrometrie. Een beperking van dit protocol is dat we niet in staat zijn geweest om een robuuste subcultuur te bereiken en functionele assays uit te voeren. Gezien het feit dat is aangetoond dat de subcultuur van geïsoleerde muizen-EC's een uitdaging is, is dit een gebied dat toekomstige inspanningen rechtvaardigt. Een manier om dit aan te pakken kan de introductie zijn van groot T-antigeen, dat is gebruikt om primaire cellen te vereeuwigen39.

De recente ontwikkelingen en toepassing van scRNA-sequencing hebben profilering met hoge resolutie van pancreascellen40 en vooral eilandjescellen41 mogelijk gemaakt. De meeste van de bestaande onderzoeken hebben zich echter gericht op endocriene celpopulaties en gebruikten weefseldissociatieprotocollen die EC's niet efficiënt behouden. Als gevolg hiervan worden EC-fracties vaak schaars en vormen ze slechts 3%-5% in de gehele gevangen celpopulaties 42,43,44. Een recent protocol maakt gebruik van enzymatische vertering en deactivering in twee stappen en een fluorescerend geactiveerde celsorteerstap en haalt EC's op bij 12% van de gehele pancreascelpopulatie45. Als aanvulling op dit protocol biedt ons protocol een vereenvoudigde workflow, die kosteneffectiever en technisch minder veeleisend kan zijn als EC's de focus van het onderzoek zijn. Hoewel dit protocol alleen is getest in de alvleesklier van muizen, kan het worden opgeschaald en aangepast om EC's te isoleren van andere organismen, waaronder de menselijke alvleesklier.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Dr. Brian Armstrong van City of Hope en Mindy Rodriguez van de University of California, Riverside voor technische assistentie. Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door subsidies van de NIH (R01 HL145170 aan ZBC), Ella Fitzgerald Foundation (aan ZBC), City of Hope (Arthur Riggs Diabetes Metabolism and Research Institute Innovation Award) en California Institute of Regenerative Medicine grant EDU4-12772 (aan AT). Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, omvatte werk dat werd uitgevoerd in de lichtmicroscopie en digitale beeldvorming die werden ondersteund door het National Cancer Institute van de NIH onder toekenningsnummer P30CA033572. Figuur 1 en Figuur 2 zijn gemaakt met BioRender.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL eppendorfUSA Scientific1615-5500
10 cm dishGenesee Scientific25-202
25G needlesBD305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 mL eppendorfThermo Fisher 14282300
6-well plateGreiner Bio-One07-000-208
70 µm strainerFisher22-363-548
Anti-CD31-biotinMiltenyi BiotechREA784
Bovine serum albumin heat shock treatedFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugeEppendorf
Collagen Type 1, from calf skinSigma Aldrich C9791Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1 Worthington BioLS004197
Countess Automatic Cell CounterThermo Fisher 
DAPIThermo Fisher D1306immunofluorescence
Disposable Safety ScalpelsMyco Instrumentation6008TR-10
DNAse I Roche260913 
D-PBS (Ca2+,Mg2+)Thermo Fisher 14080055
EthanolFisherBP2818-4
Fetal bovine serumFisher10437028
IncubatorKept at 37 °C 5% CO2
LS ColumnsMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech130-042-303
Medium 199Sigma Aldrich M2520-10X
Microbeads anti-biotinMiltenyi Biotech130-090-485
MicroscopeLeicaTo assess cell morphology
Molecular Grade WaterCorning46-000-CM
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker Eppendorf
PECAM1 (CD31) AntibodyAbcamab56299immunofluorescence
PECAM1 (CD31) AntibodyR&D SystemsAF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)Genesee Scientific25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouseIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse IDTTCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse IDTTCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouseIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouseIDTCTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouseIDTACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouseIDTTCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAPThermo Fisher AM9780
RNase-free waterTakaraRR036B
Sterile 12" long forcepsF.S.T91100-16
Sterile fine forcepsF.S.T11050-10
Sterile fine scissorsF.S.T14061-11
Tissue Culture Dishes 2cmGenesee Scientific25-260
TRIzol reagentFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
Trypsin Inhibitor Roche10109886001
Tween-20
VE-Cadherin AntibodyAbcamab33168immunofluorescence
Waterbath

Referenties

  1. Ballian, N., Brunicardi, F. C. Islet vasculature as a regulator of endocrine pancreas function. World J Surg. 31 (4), 705-714 (2007).
  2. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metab. 27 (3), 630-644 (2018).
  3. Lifson, N., Lassa, C. V., Dixit, P. K. Relation between blood flow and morphology in islet organ of rat pancreas. Am J Physiol. 249, 1 Pt 1 E43-E48 (1985).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 667170(2021).
  5. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  6. Granlund, L., Hedin, A., Korsgren, O., Skog, O., Lundberg, M. Altered microvasculature in pancreatic islets from subjects with type 1 diabetes. PLoS One. 17 (10), e0276942(2022).
  7. Dai, C., et al. Pancreatic islet vasculature adapts to insulin resistance through dilation and not angiogenesis. Diabetes. 62 (12), 4144-4153 (2013).
  8. Nishikawa, Y., Tsuji, Y., Isoda, H., Kodama, Y., Chiba, T. Perfusion in the tissue surrounding pancreatic cancer and the patient's prognosis. Biomed Res Int. 2014, 648021(2014).
  9. Conchinha, N. V., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Brain, chord, lung, and muscle. STAR Protoc. 2 (3), 100508(2021).
  10. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  11. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Sci Rep. 9 (1), 1458(2019).
  12. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. 2 (2), 100489(2021).
  13. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  14. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).
  15. Tang, X., et al. Suppression of endothelial ago1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  16. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  17. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  18. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: Differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  19. Domer, P., et al. Rapid and efficient immunomagnetic isolation of endothelial cells from human peripheral nerves. Sci Rep. 11 (1), 1951(2021).
  20. Comhair, S. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. Am J Respir Cell Mol Biol. 46 (6), 723-730 (2012).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: Isolation, culture, and characterization. Microvasc Res. 46 (1), 89-102 (1993).
  22. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulm Circ. 7 (1), 108-116 (2017).
  23. Malhi, N. K., et al. Isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level. J Vis Exp. (181), e63307(2022).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of liberase hi and collagenase nb1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19 (1), 3-8 (2010).
  26. Waise, S., et al. An optimised tissue disaggregation and data processing pipeline for characterising fibroblast phenotypes using single-cell rna sequencing. Sci Rep. 9 (1), 9580(2019).
  27. Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J Cell Biol. 63 (3), 1037-1056 (1974).
  28. Li, D., et al. Complete disassociation of adult pancreas into viable single cells through cold trypsin-edta digestion. J Zhejiang Univ Sci B. 14 (7), 596-603 (2013).
  29. Ji, B., Gaiser, S., Chen, X., Ernst, S. A., Logsdon, C. D. Intracellular trypsin induces pancreatic acinar cell death but not nf-kappab activation. J Biol Chem. 284 (26), 17488-17498 (2009).
  30. Mao, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the mouse pancreas: Characteristic features of pancreatic ductal cells in chronic pancreatitis. Genes (Basel). 13 (6), 1015(2022).
  31. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell rna sequencing. STAR Protoc. 1 (3), 100144(2020).
  32. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nat Commun. 11 (1), 4516(2020).
  33. Park, S., Dimaio, T. A., Scheef, E. A., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Pecam-1 regulates proangiogenic properties of endothelial cells through modulation of cell-cell and cell-matrix interactions. Am J Physiol Cell Physiol. 299 (6), C1468-C1484 (2010).
  34. Kim, Y. W., et al. Integration of single-cell transcriptomes and biological function reveals distinct behavioral patterns in bone marrow endothelium. Nat Commun. 13 (1), 7235(2022).
  35. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  36. Malhi, N. K., et al. Serine-arginine-rich protein kinase-1 inhibition for the treatment of diabetic retinopathy. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 322 (6), H1014-H1027 (2022).
  37. Sachs, S., et al. Targeted pharmacological therapy restores beta-cell function for diabetes remission. Nat Metab. 2 (2), 192-209 (2020).
  38. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plast Reconstr Surg. 136 (2), 189-199 (2015).
  39. Arbiser, J. L., et al. Oncogenic h-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (3), 861-866 (1997).
  40. Muraro, M. J., et al. A single-cell transcriptome atlas of the human pancreas. Cell Syst. 3 (4), 385-394 (2016).
  41. Segerstolpe, A., et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metab. 24 (4), 593-607 (2016).
  42. Kang, R. B., et al. Single-nucleus rna sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes beta-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Med. 15 (1), 30(2023).
  43. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Res. 27 (2), 208-222 (2017).
  44. Fasolino, M., et al. Single-cell multi-omics analysis of human pancreatic islets reveals novel cellular states in type 1 diabetes. Nat Metab. 4 (2), 284-299 (2022).
  45. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), e64871(2023).
  46. Castillo, J. J., et al. Islet amyloid polypeptide aggregation exerts cytotoxic and proinflammatory effects on the islet vasculature in mice. Diabetologia. 65 (10), 1687-1700 (2022).
  47. Tremblay, J. R., et al. Rare, tightly-bound, multi-cellular clusters in the pancreatic ducts of adult mice function like progenitor cells and survive and proliferate after acinar cell injury. Stem Cells. 42 (4), 385-401 (2024).
  48. Zook, H. N., et al. Activation of ductal progenitor-like cells from adult human pancreas requires extracellular matrix protein signaling. iScience. 27 (3), 109237(2024).
  49. Sordi, V., et al. Establishment, characterization and long-term culture of human endocrine pancreas-derived microvascular endothelial cells. Cytotherapy. 19 (1), 141-152 (2017).

Herprints en machtigingen

Tags

Muisalvleesklierisolatie van endotheelcellenmagnetische cel sorteringmilde dissociatieceloppervlaktemarkerssingle-cell sequencingpancreasvasculatuurCD31-antilichaamWestern blotting
Isolatie van endotheelcellen van de pancreas van muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.