Methodenartikel

Bloedafname en hormoonmeting voor het bepalen van het stadium in de eierstokcyclus bij zijdeaapjes

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66691

⸱

5 juli 2024

 , 
1National Center for Child Health and Development

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft bloed- en urinebemonstering voor het meten van progesteron/estradiol- en choriongonadotrofinespiegels om het stadium van de ovariumcyclus te bepalen. De hormoonspiegels worden gebruikt om de timing van de eisprong te voorspellen en te bepalen en hormonen worden geïnjecteerd om de eierstokcyclus en de eicelgroei te reguleren.

Samenvatting

Gewone zijdeaapjes zijn kleine apen uit de Nieuwe Wereld. Omdat veel van hun biologische mechanismen vergelijkbaar zijn met die van mensen, zijn zijdeaapjes potentieel nuttig voor medisch en menselijk biologisch onderzoek op verschillende gebieden, zoals neurowetenschappen, regeneratieve geneeskunde en ontwikkeling. Er is echter een gebrek aan literatuur die methoden beschrijft voor veel basisexperimenten en procedures. Hier worden gedetailleerde methoden beschreven voor het bepalen van de niveaus van geslachtshormonen (progesteron, estradiol en choriongonadotrofine) in zijdeaapjes. De meting van deze hormonen maakt het mogelijk om het stadium in de eierstokcyclus te voorspellen, dat typisch 26-30 dagen is bij zijdeaapjes; Nauwkeurige bepaling is essentieel voor het oogsten van eicellen/zygoten op het juiste tijdstip en voor de voorbereiding van gastheervrouwtjes op de generatie van genetisch gemodificeerde zijdeaapjes.

Bovendien is de meting van geslachtshormoonspiegels nuttig voor endocrinologie, ethologie, vroege ontwikkeling en reproductieve biologiestudies. Dit protocol biedt een gedetailleerde beschrijving van de methoden voor bloedafname uit de dijbeenader, scheiding van plasma voor hormoonmeting, het meten van choriongonadotrofinespiegels met behulp van urine en plasma, het resetten van de ovariumcyclus met behulp van injecties van een prostaglandine F2α-analoog om de cyclus te verkorten en te synchroniseren, en het bevorderen van folliculaire groei en ovulatie door follikelstimulerend hormoon en choriongonadotrofine te injecteren. Met behulp van deze protocollen kunnen de stadia in de ovariële cyclus worden bepaald voor het tijdig verzamelen van eicellen/zygoten.

Inleiding

De gewone zijdeaap (Callithrix jacchus) is een kleine aap uit de Nieuwe Wereld met veel kenmerken die lijken op die van mensen, en de duur van zijn eierstokcyclus is 26-30 dagen 1,2. Studies naar de vroege ontwikkeling en het ontstaan van genetisch gemodificeerde zijdeaapjes vereisen het oogsten van eicellen en zygoten in specifieke stadia van de eierstokcyclus. Een nauwkeurige bepaling van het stadium is dus cruciaal en kan worden geschat door de bloedspiegels van de hormonen progesteron (P4) en estradiol (E2) te meten2,3. Deze hormonen bevorderen de groei van het baarmoederslijmvlies, wat nodig is voor de implantatie. P4 wordt geproduceerd uit het corpus luteum, dat zich onmiddellijk na de eisprong in de eierstokken vormt. E2 wordt uitgescheiden door de ovariële follikels als reactie op follikelstimulerend hormoon (FSH) van het hypothalamus-hypofysecomplex in de hersenen. E2-niveaus nemen toe naarmate de follikel rijpt, met een piek vóór de eisprong3. Hoge E2-spiegels veroorzaken de gepulseerde afgifte van luteïniserend hormoon (LH) via het hypothalamus-hypofysecomplex bij mensen; deze LH-piek induceert de eisprong. Bij zijdeaapjes onderging het LH-gen echter degeneratie tijdens de evolutie en wordt de eisprong in plaats daarvan geïnduceerd door de afgifte van choriongonadotrofine (CG), dat een vergelijkbare structuur heeft als LH's, uit de hypofyse 4,5.

De eierstokcyclus kan onder controle worden gehouden door hormooninjecties. FSH-injecties werken bij mensen in op ovarium-FSH-receptoren en worden gebruikt om de oestrogeensynthese en follikelgroei te bevorderen6. De injectie van humaan CG (hCG) als vervanging voor LH aan het einde van de folliculaire fase wordt gebruikt om de eisprong bij mensen te stimuleren7. CG-injecties worden ook gebruikt om menselijke onvruchtbaarheid te behandelen, omdat CG het corpus luteum in de vroege zwangerschap stimuleert, wat resulteert in een verhoogde P4-productie. Prostaglandine F2α (PGF2α) injecties resetten de ovariële cyclus8. Bij gedomesticeerd vee wordt PGF2α-injectie gebruikt om de luteale fase te verkorten en de oestruscyclus te synchroniseren voor reproductief beheer.

Hoewel zijdeaapjes en mensen vergelijkbare biologische mechanismen hebben, waardoor ze ideale modeldieren zijn, is er een gebrek aan literatuur die basismethoden beschrijft voor veel veelgebruikte technieken. Bloedafname is een van de meest gebruikte technieken 9,10,11,12. Beginners hebben echter soms moeite met het vinden van de ader. Daarom voerde deze studie anatomische analyses uit van het dijbeenadergebied. Op basis van anatomische observaties introduceert dit protocol het proximale gebied van de femurdriehoek als een gemakkelijke plaats voor venapunctie.

Protocol

Alle methoden met zijdeaapjes maakten gebruik van hoge ethische en welzijnsnormen en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het National Center for Child Health and Development. De dieren die hier werden gebruikt, waren enkelvoudig of gepaard, gehuisvest (een vrouwtje en een mannetje) met 12 uur licht per dag.

1. Bloedafname van de dijbeenader

  1. Bereid een spuit van 1 ml voor (het korte type is gemakkelijk te gebruiken) met een naald van 25 G die met het mes naar boven is bevestigd. Om bloedverstopping te voorkomen, hepariniseert u de spuit door 200 μl onverdunde heparine-natriumoplossing in de spuit op te nemen. Smeer de binnenkant van de spuit gelijkmatig in door deze meerdere keren op en neer te trekken; Verdrijf vervolgens de heparineoplossing uit de spuit.
    OPMERKING: Aangezien het vaak nodig is om over te stappen op een nieuwe spuit, moet u een paar extra gehepariniseerde spuiten voorbereiden.
  2. Maak absorberende watten- en alcoholdoekjes klaar. Schakel een verstelbare lamp in om het gebied te verlichten waar het zijdeaapje wordt geplaatst voor bloedafname.
  3. Bereid het beveiligingssysteem voor (420 x 85 x 85 mm, afbeelding 1A), dat in de handel verkrijgbaar is (zie Materiaaltabel voor details). Om een zijdeaapje in het apparaat te plaatsen, opent u het retentiegedeelte met de sponsriem, waarmee zijdeaapjes worden vastgezet. Plaats het zijdeaapje met de voorkant naar boven in het fixatieapparaat.
    OPMERKING: Marmosets zijn meestal kalm in fixatie-apparaten, wat de noodzaak van fixatie-acclimatisatie of training teniet kan doen.
  4. Leg de zijdeaap vast; steek het zijdeaapje in het cilindrische deel; en zet deze vast door de sponsriem naar beneden te drukken. Plaats het been waarvan bloed moet worden afgenomen op het andere (Figuur 1A). Houd de benen vast met de niet-dominante hand; Plaats de middel- en ringvinger in elk been om ze vast te maken en de andere vingers buiten elk been om ze vast te zetten.
    OPMERKING: Bijthandschoenen worden aanbevolen bij het vangen van zijdeaapjes. Als er geen fixatiemiddel aanwezig is, voer dan bloedafname uit onder narcose of met een andere persoon die het zijdeaapje in bedwang houdt.
  5. Controleer of de dijbeenader zichtbaar is in de buurt van de basis van de dij. Als dit niet het geval is, palpeert u om de pulserende slagader te vinden en gebruikt u deze als een oriëntatiepunt om te controleren of de ader erin loopt (Figuur 1B-D).
    OPMERKING: Bureauverlichting en haarscheren worden aanbevolen om de zichtbaarheid te verbeteren. Het zicht kan ook worden verbeterd door te wrijven met alcoholdoekjes. Lymfeklieren in de driehoek bevinden zich vaak dicht bij de ader en vertonen een donkerblauwe kleur als ader. Hoe u ze kunt onderscheiden, wordt beschreven in de sectie Representatieve resultaten.
  6. Desinfecteer de prikplaats met een alcoholdoekje. Steek de naald met het mes naar boven in een hoek van 15°-20°. Om te voorkomen dat de naald tijdens de bloedafname uit het bloedvat glijdt, stabiliseert u de hand die de spuit vasthoudt, bijvoorbeeld door deze op de andere hand te laten rusten.
  7. Trek de zuiger voorzichtig terug om negatieve druk uit te oefenen (Figuur 1E). Duw de punt van de naald naar voren. Zodra er bloed in de spuit komt, houdt u de positie van de naaldpunt vast totdat het vereiste volume (500-700 μL) is verzameld.
    1. Als er geen bloed in de spuit komt, verander dan de plaats van punctie. Als het bloed naar buiten komt bij het uittrekken van de naald, stop dan het bloeden door gedurende 3 minuten druk uit te oefenen op de prikplaats. Nadat u het bloeden hebt gestopt, start u de venapunctie opnieuw.
    2. Als het bloed dat in de spuit wordt gezogen tijdens het trekproces stopt met stromen, duwt u de punt van de naald langzaam naar voren en trekt u deze vervolgens terug om het bloedvat te vinden. Dit kan de bloedstroom in de spuit herstellen. Als dit niet het geval is, trekt u de naald eruit en voert u een venapunctie uit met een nieuwe spuit.
      OPMERKING: Gebruik de dij op het andere been als het moeilijk is om bloed van dezelfde kant op te vangen.
  8. Trek de naald voorzichtig uit terwijl u met de pink lichtjes op de prikplaats drukt. Oefen vervolgens met een absorberend wattenstaafje onmiddellijk gedurende 3 minuten druk uit op de prikplaats om het bloeden te stoppen. Keer de spuit om om bloed en heparine te mengen.
    OPMERKING: Oefen gedurende een langere tijd (5 min) druk uit tijdens het afkoelen wanneer arterieel bloed wordt afgenomen en bevestig zorgvuldig het stoppen van de bloeding om de vorming van hematoom te voorkomen, wat soms kan leiden tot een fatale afloop.
  9. Nadat u heeft bevestigd dat het bloeden is gestopt, verwijdert u de sponsriem, houdt u de taille van het dier met één hand vast en draait u het dier zodat men de onderarm van het dier met een andere hand vanaf de achterkant kan vasthouden.
  10. Doe de zijdeaap terug in zijn kooi. Om stress te verminderen en herhaalde bloedafname te vergemakkelijken, geeft u het zijdeaapje zijn favoriete voedsel (bijv. koekjes, marshmallows of biscuitgebak). Controleer af en toe het optreden van hematoom.
    OPMERKING: Wanneer hematoom in een vroeg stadium wordt gevonden, breng dan een drukverband aan om de progressie van hematoom te voorkomen. Wanneer het na lange tijd wordt gevonden, kan chirurgische verwijdering van het hematoom met ligatie van de dijbeenslagader en bloedtransfusie nodig zijn 9,13.
  11. Maak de naald los van de spuit om hemolyse te voorkomen. Verdrijf vervolgens langzaam het verzamelde bloed langs de binnenwand van een microbuisje van 1,5 ml.
    OPMERKING: Het afgenomen bloed kan tot 24 uur bij 4 °C worden bewaard voordat het plasma wordt gescheiden voor het meten van P4/E2-waarden.

2. Scheiding van plasma en bepaling van hormonale niveaus

  1. Centrifugeer het bloed in een buisje van 1,5 ml bij 1.100 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  2. Breng het afgescheiden plasma (supernatant) over van de buis van 1,5 ml naar een nieuwe buis/beker, waarbij u zorgvuldig de opname van bloedcellen (bezinksel) vermijdt.
  3. Meet de P4- en E2-niveaus met behulp van een ELISA-kit of een automatische analysator. Als de hoeveelheid plasma niet voldoende is voor de automatische analysator, gebruik dan een monsterverdunningsoplossing.
    OPMERKING: Voor de meting met behulp van een automatische analysator is >175 μL plasma nodig voor het bepalen van alleen een P4-niveau en >250 μL plasma is nodig voor het bepalen van zowel P4 als E2.

3. Urine CG-meting om ovulatie en zwangerschap te detecteren

OPMERKING: CG-niveaus in zijdeaapjes kunnen worden gemeten met behulp van een immunochromatografische kittest voor zowel ovulatie als zwangerschap. In het geval van ovulatie kan 0-2 dagen voor de eisprong een positief resultaat worden verkregen. In het geval van zwangerschap wordt een positief resultaat gedetecteerd van dag 15-20 tot ongeveer dag 100 van de zwangerschap. De test vereist een kleine hoeveelheid (90 μL) urine (één druppel urine is ~30 μL).

  1. Tray-methode: Als er meer dan twee dieren in dezelfde kooi zitten, verplaats dan de doelzijdeaapje (of de andere dieren) de dag ervoor naar een andere kooi. Plaats de avond voor of voor het aansteken een schone bak op de bodem van de kooi. Urine wordt 's nachts niet uit de blaas afgevoerd. Daarom komt er meestal kort na het aansteken urine uit de blaas.
    OPMERKING: Als u 's ochtends voor het aansteken de kamer betreedt, kan dit de slaapcyclus van het cohort verstoren. Urine kan meestal binnen ongeveer 30 minuten na het aansteken worden opgevangen.
  2. Knijpmethode: Bereid de gewassen bakken voor op het opvangen van urine. Nadat u de blaas van het zijdeaapje hebt gelokaliseerd, knijpt u deze voorzichtig vanaf de voorkant en beide zijden met behulp van de gehele lengte van de vingers (Figuur 1F). Verzamel urine net voordat u 's ochtends de kamer verlicht.
    OPMERKING: Als het verzamelen van urine niet lukt vanwege de afwezigheid van urine in de blaas, wacht dan even en probeer het opnieuw. Pas op dat u niet te veel kracht gebruikt, want dit zal het dier verwonden.
  3. Plaats het urinemonster onmiddellijk na afname in het putje van de immunochromatografische testkit. Lees het resultaat na 10 minuten af volgens de instructies van de fabrikant.

4. Controle en bepaling van het stadium van de ovariële cyclus voor het verzamelen van eicellen, zygoten en embryo's

  1. Verzameling van eicellen uit de eierstokken met kiemblaasjes (GV)
    1. Dien een intramusculaire injectie toe van 3 μL van 0,263 mg/ml cloprostenol (een synthetisch PGF2α-analoog) verdund in 150 μL zoutoplossing14 (Figuur 2) om de ovariële cyclus aan het einde van de luteale fase (d.w.z. ≥10 dagen na de start van de luteale fase) te resetten.
      OPMERKING: Het kan handig zijn om de verdunde oplossing in een groter volume te maken, aangezien de verdunde cloprostenol stabiel blijft gedurende ten minste enkele weken bij +4 °C.
    2. Bevestig de volgende dag (dag 1) de start van de folliculaire fase door te controleren of het P4-niveau is gedaald.
      OPMERKING: Van cloprostenol-injectie is gemeld dat het de P4-spiegels (meestal <10 ng/ml) binnen 24 uur dramatischverlaagt3.
    3. Injecteer vanaf dag 1 FSH (25 IE, intramusculair) eenmaal per 2 dagen voor een totaal van 5x (dag 1, 3, 5, 7 en 9). Injecteer op dag 10 's middags hCG (75 IE, intramusculair).
    4. Verzamel GV's uit de eierstokken op dag 11 door folliculaire aspiratie onder narcose volgens de literatuur15,16.
      OPMERKING: Soms vindt de eisprong eerder plaats dan verwacht. Daarom wordt aanbevolen om de CG-niveaus vanaf dag 8 te controleren. Als de CG-test positief is, voer dan op deze dag GV-afname uit.
  2. Verzameling van metafase II (MII) eicellen, zygoten en vroege embryo's
    1. Reset de ovariële cyclus met cloprostenol zoals beschreven in stap 4.1.1.
    2. Bevestig de volgende dag (dag 1) de start van de folliculaire fase door te controleren of het P4-niveau is gedaald.
    3. Voor het verzamelen van zygoten en embryo's, huisvest vrouwelijke zijdeaapjes samen met mannelijke zijdeaapjes voor paring vanaf dag 6.
    4. Controleer vanaf dag 7 de P4/E2-waarden in het bloed en de CG-waarden in de urine van de vrouwtjes. Detectie van CG is een indicatie van ovulatie binnen een paar dagen (meestal de volgende dag). Op de dag dat de P4-spiegels stijgen en de E2-spiegels dalen in vergelijking met de vorige dag, verzamel MII-eicellen of embryonale dag 0 (E0) zygoten van de eileiders17,18.
    5. Voor het verzamelen van embryo's, zoals beschreven in de literatuur, voert u spoelingen uit van de eileiders (E1-E3, 1-8 cellen)17,18 of de baarmoeder (E5-E10, 8-cellen-blastocyst)19,20,21,22 op het juiste tijdstip, afhankelijk van het beoogde stadium.

Resultaten

Details met betrekking tot de dieren die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn vermeld in tabel 1.

Anatomische analyses van de dijbeenader
Anatomische analyses van de dijbeenader werden uitgevoerd met behulp van een 2-jarige mannelijke zijdeaapje (I 7713M) dat euthanasie onderging. De dijbeenaders en slagaders bevinden zich in de dijbeendriehoek. De femurdriehoek wordt gevormd op de grens tussen de buikwand en de dijspieren (figuur 1B-D). Aan de basis van de dij loopt een grote ader door het midden van de omgekeerde driehoek en een slagader loopt parallel buiten de ader. In het onderste deel worden de aders en slagaders dunner en overlappen ze, waarbij de slagaders bovenop de aders worden geplaatst (Figuur 1D).

Voor bloedafname moet de ader het doelwit zijn, omdat een arteriële verwonding een hematoom van de dijbeenslagader kan veroorzaken, wat kan leiden tot cardiovasculaire shock wanneer de bloeding ernstig is13. Hoewel bloed kan worden afgenomen uit elk deel van de ader in de driehoek en het distale gebied, wordt venapunctie vanaf de proximale plaats van de femurdriehoek aanbevolen vanwege de grote omvang van de ader en de schijnbaar kleine overlap met de slagader. Bovendien is de ader in de proximale plaats oppervlakkig, waardoor deze gemakkelijk met een naald kan worden gelokaliseerd. Omdat het pulseert, wordt de slagader in de femurdriehoek soms visueel of door palpatie geïdentificeerd en loopt de ader er net mediaal naartoe. De observatie van slagaderpulsatie helpt dus om de locatie van de ader te voorspellen.

Bovendien wordt meestal een blauwe verkleuring die wijst op de ader waargenomen onder de huid aan de bovenkant van de driehoek (Figuur 1B,C). Lymfeklieren in de driehoek bevinden zich echter vaak dicht bij de ader en vertonen een donkerblauwe kleur, dus hun uiterlijk is vergelijkbaar. Gelukkig zijn ze te onderscheiden door hun mobiliteit: de ader staat stil en de lymfeklieren zijn beweeglijk. De pulsatie van de slagader en de blauwe kleur van de ader zijn dus twee belangrijke aanwijzingen die worden gebruikt om de ader te lokaliseren, hoewel het nodig kan zijn om het haar te scheren om ze te visualiseren.

Bepaling van het stadium in de ovariële cyclus
P4- en E2-niveaus werden gecontroleerd bij zes vrouwelijke zijdeaapjes (variërend van 1 tot 3 jaar oud) om de duur van de folliculaire en luteale fasen te onderzoeken. De resultaten toonden een gemiddelde duur van 11,58 dagen (n = 6 van vier zijdeaapjes) en 16,8 dagen (n = 5 van drie zijdeaapjes) voor respectievelijk de folliculaire en luteale fasen (tabel 2). Hieronder wordt de P4- en E2-dynamiek van één (I6751F, 3 jaar oud) van de zes zijdeaapjes in detail beschreven. Bloedafname en hormoonmetingen bij dit dier werden gedurende 38 dagen om de paar dagen uitgevoerd (tabel 3).

Luteale fase (dag 1-10)
De startdag van de meting is vastgesteld op dag 1. Op basis van het P4-niveau (21 ng/ml) bevond het dier zich waarschijnlijk in de luteale fase. Een hoog P4-niveau werd waargenomen van dag 1 tot 10 (≥21 ng/ml), wat wijst op de luteale fase. Op dag 12 daalde het sterk tot 4 ng/ml. Deze significante afname duidde op de overgang van de luteale naar de folliculaire fase. Een daling van het E2-niveau van dag 10 (241 ng/ml) naar 12 (189 ng/ml) ondersteunde deze overgang ook.

Folliculaire fase (dag 12-22)
Na de overgang naar de folliculaire fase bleef het P4-niveau laag (4-6 ng/ml) tot dag 19 en nam vervolgens licht toe van dag 19 tot 24 (dag 19, 6 ng/ml; dag 22, 8 ng/ml; dag 24, 9 ng/ml). Daarentegen steeg het E2-niveau significant van dag 19 (94 ng/ml) tot 22 (322 ng/ml) en daalde vervolgens van dag 22 tot 24 (158 ng/ml). Op basis van de verhoogde P4- en verlaagde E2-spiegels werd voorspeld dat de eisprong zou hebben plaatsgevonden tussen dag 22 en 24, overgaand van de folliculaire naar de luteale fase.

Luteale fase (dag 24-36)
Na de eisprong bleef het P4-gehalte hoog tot dag 36 en daalde vervolgens tot 3 ng/ml op dag 38. Het is dus waarschijnlijk dat de overgang van de luteale naar de folliculaire fase plaatsvond tussen dag 36-38. In overeenstemming met deze overgang daalde het E2-niveau tijdens deze periode (dag 36, 2517 ng/ml; dag 38, 73 ng/ml).

Voorspelling en bepaling van de timing van de eisprong

Om de relatie tussen het CG-gehalte in de urine en de ovulatiedatum te onderzoeken, werden zeven zijdeaapjes (nr. 1-7) bereid. Cloprostenol werd geïnjecteerd om de ovulatiecyclus te resetten (dag 0). Vervolgens werden vanaf dag 7 de P4/E2-spiegels in het bloed en de CG-spiegels in de urine gecontroleerd. Urine werd onmiddellijk na het aansteken verzameld. Bloedafname werd voornamelijk 's ochtends uitgevoerd. Er werd aangenomen dat de eisprong plaatsvindt wanneer het E2-niveau grotendeels is gedaald in vergelijking met die van de vorige dag, zoals gerapporteerd17. Op die dag werd inderdaad de folliculaire ruptuur waargenomen op het oppervlak van de eierstokken en de aanwezigheid van zygoten/eicellen in de eileiders (Tabel 4).

CG werd voor het eerst gedetecteerd tijdens dag 7 tot 11 (dag 7, N = 1; dag 8, N = 2; dag 9, N = 1; dag 10, N = 2; dag 11, N = 1) (Tabel 4). De grote daling van de E2-spiegels (indicatie van de eisprong) werd 0-3 dagen na het eerste CG-signaal waargenomen. De duur van de eerste CG-detectie tot de E2-afname leek groot te zijn toen de eerste CG-detectie eerder was (Figuur 3A). Bijvoorbeeld, één dier (nr. 1) vertoonde een daling van het E2-signaal 3 dagen na de eerste CG-detectie op dag 7 (tabel 4). Daarentegen werd het gelijktijdig voorkomen van de eerste CG-detectie en de daling van het E2-signaal waargenomen bij één dier (nr. 2) op dag 10. Dus, hoewel de eerste CG-detectie en ovulatie op dezelfde dag werden waargenomen bij een van de vijf dieren, vond de ovulatie plaats binnen een paar dagen na de eerste detectie van CG.

De immunochromatografische testkit voor zijdeaapje CG is ontworpen om urine te gebruiken voor testen. Onderzoek van het CG-niveau gaat meestal gepaard met de bepaling van P4/E2-niveaus met behulp van bloedplasma. Het zal nuttig zijn als bloedplasma, in plaats van urine, kan worden gebruikt voor de CG-test. Om dit te testen is gekeken naar het bloedplasma dat overbleef na de P4/E2 niveaumeting in bovenstaande experimenten. Bloedplasma en urine werden verzameld van de vier dieren op elk van de dagen van de bovengenoemde experimenten (de dagen van onderzoek waren aangegeven met dubbele sterretjes [**] in tabel 4). Met behulp van urine vertoonden twee van de vier dieren positieve resultaten (scores 5 en 3) en de andere twee negatieve resultaten (score 1). Bloedplasma vertoonde in wezen dezelfde resultaten als urine (figuur 3B). Het sterkere signaal werd verkregen door gebruik te maken van bloedplasma. Daarom moet bij gebruik van bloedplasma de beoordeling worden gemaakt vóór 10 minuten, die is ingesteld voor urine.

figure-results-1
Figuur 1: Bloedafname van zijdeaapjes. (A) Voor de bloedafname wordt een restrainer gebruikt. (B) Zijdeaapje bovenbeen. (C) Dijbeendriehoek en bloedvaten. De dijbeenslagader in de driehoek is vaak zichtbaar en vertoont pulsatie. De blauwe kleur van de dijbeenader is soms zichtbaar in het proximale gebied van de driehoek (aangegeven als de aderlatingsplaats). Lymfeklieren vertonen ook een blauwe kleur. Lymfeklieren zijn echter beweegbaar omdat lymfeklieren aan de huid zijn bevestigd. (D) Anatomisch beeld van de dij van het geëuthanaseerde dier. De slagader, ader en aderlating zijn aangegeven. Hetzelfde dier wordt getoond in B-D. (E) Bloedafname met behulp van een restrainer. De positie van de poten van het zijdeaapje en het bloed dat wordt afgenomen worden weergegeven. (F) Urineverzameling van een zijdeaapje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Typische patronen van P4-, E2- en CG-niveaus tijdens de ovariële cyclus bij zijdeaapjes. De tijdstippen van FSH-, hCG- en PGF2α-injecties worden aangegeven. Stippellijnen geven het verwachte hormonale patroon aan na PGF2α-injectie. Afkortingen: P4 = progesteron; E2 = oestradiol; CG = choriongonadotrofine; FSH = follikelstimulerend hormoon; hCG = humaan choriongonadotrofine; PGF2α = prostaglandine F2α. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Bepaling van het CG-niveau om het optreden van de eisprong te voorspellen. (A) De mogelijke relatie tussen de eerste dag van CG-detectie (score > 1) en de duur tot de eisprong (E2-daling). (B) Bloedplasma kan worden gebruikt voor immunochromatografische CG-tests. Een representatief resultaat van elke score (boven). De score werd 10 minuten na het laden van het monster bepaald. Score 2 staat voor geen band binnen 5 minuten, maar het verschijnen van een band binnen 10 minuten. Bloedafname werd kort na het verzamelen van urine uitgevoerd. Vier zijdeaapjes (nr. 1, 2, 3, 5 in tabel S4) werden onderzocht. De hier gebruikte steekproeven zijn in tabel 4 aangegeven als dubbele sterretjes. Bloedplasma werd verdund tot 50% door verdunningsbuffer die werd gebruikt voor E2-meting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Dieren die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Duur van de folliculaire en luteale fasen. De fase werd bepaald op basis van het P4-niveau (folliculaire fase P4 ≤ 8, luteale fase P4 > 8). Wanneer faseverandering werd waargenomen tussen de metingen, werd het middelpunt tussen de meetdata bepaald als het veranderingspunt. De duur tussen de twee veranderingspunten werd beschouwd als folliculaire of luteale fasen. Om de duur van een enkele fase te kunnen meten, werden de gegevens met een lang interval (≥7 dagen) of twee keer intervallen van ≥6 dagen in dezelfde fase, ook wanneer deze zich uitstrekken over de twee fasen, niet gebruikt voor de analyses. Alleen als er twee metingen in dezelfde fase werden uitgevoerd, werden de gegevens gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Resultaten van P4- en E2-metingen gedurende 38 dagen in één zijdeaapje.Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Bepaling en voorspelling van ovulatiedagen. De sporen van ovulatie werden als aanwezig beschouwd als er bloedingsplaatsen of scheurplaatsen in de eierstokken werden waargenomen. Eicel/zygote geeft de stadia van eicel/zygote aan die zijn verkregen uit eileiders op de dag van de E2-druppel. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Het lokaliseren van de ader is de meest kritieke stap in bloedafname. Op basis van anatomische observaties introduceert dit protocol het proximale gebied in de femurdriehoek als een gemakkelijke plaats voor bloedafname bij zijdeaapjes. Met behulp van dit gebied kan eenvoudig bloedafname uit een grote ader worden uitgevoerd. Maar zelfs bij gebruik van dit protocol treedt soms letsel aan een slagader op. Bij beschadiging van een slagader wordt voorgesteld om het bloeden volledig te stoppen door gedurende >5 minuten druk uit te oefenen om hematoom te voorkomen. Bovendien is het ook effectief om tijdens het uitoefenen van druk de punctate plaats af te koelen met een ijsblokje. Hematomen kunnen worden behandeld met heparine (bijv. Tensolvet 5.000 IE-gel). De meeste hematomen verdwijnen na 3-4 opeenvolgende dagen behandeling met heparine en 0,05 ml meloxicam (0,5 mg/ml, p.o.). De slagader loopt lateraal naar de ader in het proximale gebied van de dij. In het distale gebied leken de ader en de slagader dichter bij elkaar en overlapten ze elkaar in grotere mate, waarbij de slagader zich ventraal ten opzichte van de ader bevond. Op basis van deze positionele relatie heeft bloedafname uit het proximale gebied van de dij waarschijnlijk een verminderd risico op arteriële verwonding.

Bovendien is de dijbeenader in het proximale gebied dik en oppervlakkig gelegen, waardoor deze gemakkelijk met een naald kan worden gelokaliseerd. Bloedafname uit het distale gebied heeft echter het voordeel dat de proximale plaatsen intact blijven, waardoor onmiddellijke herhaalde venapunctie vanuit het proximale gebied van hetzelfde been mogelijk is, zelfs als de ader tijdens de bloedafname wordt beschadigd. Dit komt omdat het distale gebied van de beschadigde plaats meestal niet beschikbaar is voor onmiddellijke venapunctie. Wanneer bloedafname echter niet succesvol is, kan herhaalde bemonstering worden uitgevoerd vanaf de proximale plaats op het andere been.

Het volume circulerend bloed in zijdeaapjes is ~25 ml (70 ml/kg)23. Een zijdeaapje van 350 g heeft 1 week nodig om te herstellen van een bloedafname van 2 ml, wat overeenkomt met 7,5% van het totale bloedvolume6. Uit de dijbeenaders kan zonder problemen 500-700 μL bloed worden verzameld. Wanneer herhaalde bemonstering nodig is, wordt aanbevolen kleinere hoeveelheden bloed af te nemen en een verdunningsbuffer voor de automatische analysator te gebruiken.

Hoewel anesthesie over het algemeen niet wordt gebruikt voor bloedafname, kan voor beginners bloedafname van verdoofde dieren veel gemakkelijker zijn dan van wakkere dieren. Voorzichtigheid is echter geboden bij het gebruik van anesthesie voor bloedafname, omdat anesthesie de gemeten waarden van bloedbestanddelen kan beïnvloeden. Met betrekking tot hormonale metingen voor het bepalen van het stadium in de ovariële cyclus, werd gerapporteerd dat alfaxalone resulteerde in onverwacht hogere niveaus van P424. Dit werd veroorzaakt door de kruisreactiviteit van anti-P4-antilichaam tegen alfaxalone, een P4-derivaat.

Structuren van P4 en E2 (steroïde hormonen) zijn identiek tussen mensen en zijdeaapjes. Commerciële ELISA-kits voor menselijke P4 en E2 zijn daarom beschikbaar voor zijdeaapje P4 en E2. Uitbestedingsdiensten voor het meten van menselijk bloedhormoon zijn ook beschikbaar. Daarentegen zijn er kleine verschillen in aminozuursequenties voor polypeptidehormonen, zoals FSH, CG en Inhibin. Voor deze polypeptidehormonen, als een kit kan worden gebruikt voor zowel mensen als andere evolutionaire verre soorten, zoals muizen, zal het ook werken voor zijdeaapjes. Voor Inhibin B-meting kan een Human/Mouse/Rat Inhibin B (Beta B-subeenheid) Enzyme Immunoassay Kit worden gebruikt.

Een verhoging van het P4-niveau is een kenmerk van ovulatie (overgang van de folliculaire naar de luteale fase). Hoewel variaties tussen individuen het moeilijk maken om de datum van de ovulatie vast te stellen op basis van alleen het P4-niveau, kan een P4-niveau van >8 ng/ml worden gebruikt als een ruwe indicator van het optreden van de eisprong. Een betrouwbaardere indicator van de ovulatiedatum is een afname van het E2-niveau 3,17. Ovulatie-eicellen/zygoten werden inderdaad waargenomen in de eileiders op de dag van de E2-afname (tabel 4). De meting van E2 stelt ons dus in staat om de exacte ovulatiedatum vast te stellen. Naast de hormonale niveaus is informatie over het aantal dagen na toediening van PGF2α een voorspeller van de dag van de eisprong (tabel 4). Evenzo helpt combinatorisch gebruik van P4- en E2-niveaus om de timing van de overgang naar de folliculaire fase te identificeren, wanneer P4-niveaus dramatisch afnemen en E2-niveaus op hun laagst zijn.

Bij zijdeaapjes wordt CG, in plaats van LH, vrijgegeven uit de hypofyse om de eisprong op te wekken. Bovendien wordt CG uitgescheiden uit trofoblastcellen wanneer embryo's zich hechten aan en implanteren in het baarmoederslijmvlies. Omdat zijdeaapjes geen functioneel LH-gen hebben, wordt CG, in plaats van LH, vrijgegeven uit de hypofyse om de eisprong te stimuleren5. Een studie meldde dat E2- en CG-pieken, indicatief voor ovulatie, op dezelfde dag worden waargenomen12. Een andere studie meldde dat E2-pieken (8,6 dagen na toediening van PGF2α) gemiddeld voorafgaan aan CG-pieken (9,3 dagen na toediening van PGF2α)25, wat aangeeft dat de eisprong kan plaatsvinden voordat de CG-pieken worden bereikt. CG wordt, in tegenstelling tot E2, vlak voor zijn piek door de puls vrijgegeven. De pulsafgifte van CG begint gemiddeld ~1 dag voor de piek. Er werd echter een grote variatie in duur waargenomen vanaf de eerste detectie van het CG-niveau tot de daling van het E2-niveau (figuur 3A en tabel 4). Bovendien wordt gemeld dat CG voor het eerst wordt gedetecteerd in zowel ochtend- als middagmonsters25.

Voor zover wij weten, is er geen melding van ovulatie bij zijdeaapjes die op een bepaald tijdstip van de dag plaatsvindt. Bovendien geven zijdeaapjes meestal twee of drie eicellen tegelijk af, dus er kan een bepaalde periode zijn waarin alle eicellen vrijkomen. Aangezien verhoogde CG-niveaus vóór de eisprong optreden, maakt CG-meting het mogelijk om de ovulatiedatum van tevoren te voorspellen. Dergelijke informatie is met name nuttig voor het verzamelen van MII-eicellen of embryo's van dag 0 op de dag van de eisprong. Een combinatorische meting van de P4/E2-spiegels in het bloed en de CG-waarden is dus nuttig (Figuur 3B). Bij de meeste primatensoorten, waaronder de mens, vindt de eisprong pas een tijdje na de bevalling plaats. De ovulatie na de bevalling vindt echter plaats bij zijdeaapjes ~10 dagen na de bevalling. Bijgevolg wordt de volgende bevalling vaak ~155 dagen na de vorige bevalling waargenomen. Deze opeenvolgende zwangerschap, samen met de bevalling van een tweeling, resulteert in een hoge vruchtbaarheid bij zijdeaapjes.

Hormonale schommelingen variëren van persoon tot persoon en sommige hebben geen constante cyclus. Sommige vrouwelijke zijdeaapjes vertonen constant lage P4/E2-waarden, wat wijst op een gebrek aan ovulatie. Het ontbreken van een ovulatiecyclus kan worden toegeschreven aan onvolwassenheid, gezondheidsproblemen, stress of ovulatieremming door dominante reproductieve vrouwtjes 26,27. Drie van de 21 zijdeaapjes (>2 jaar oud) die hormonale niveaus meten, toonden het ontbreken van een regelmatige ovulatiecyclus in de faciliteit van de auteur. Inzicht in de oorzaken en het ontwikkelen van passende behandelingen zal een effectiever gebruik van dieren in experimenten mogelijk maken. Personen met een verlengde luteale fase van ~1 maand en een daarmee gepaard gaand hoog P4-niveau werden waargenomen2. In de faciliteit van de auteur wordt een verlengde luteale fase herhaald bij dezelfde individuen. Twee van de 21 zijdeaapjes vertoonden deze afwijking. Een van de twee dieren was eenpersoonsgehuisvest, waardoor de mogelijkheid werd uitgesloten dat het dier tijdens de verlengde luteale fase drachtig was. De andere wordt door bestraling gekoppeld aan een vermoedelijk onvruchtbare man en daarom is het onwaarschijnlijk dat ze zwanger was tijdens de verlengde luteale fase. Zelfs in een verlengde luteale fase verlaagt de toediening van PGF2α het P4-niveau en reset de ovariële cyclus. Het meten van geslachtshormonen en het begrijpen van de status van de ovulatiecyclus helpt bij het effectieve gebruik van dieren in experimenten en fokkerij.

Bloedafname van individuen wordt niet alleen gebruikt voor het schatten van de ovulatiedatum, maar ook voor serologische tests voor diagnostische doeleinden. Evenzo wordt de meting van hormoonspiegels niet alleen gebruikt voor het schatten van de dag van de eisprong, maar ook voor het bestuderen van sociale interactie, de ontwikkeling van kinderen en ziekten. In de toekomst wordt voor het maken van genetisch gemodificeerde zijdeaapjes de ontwikkeling van eierstokken en teelballen uit iPS-cellen verwacht. Geschikte hormonale niveaus moeten belangrijk zijn voor een normale ontwikkeling. Het hier beschreven protocol zal nuttig zijn voor de meting en controle van geslachtshormonen voor het maken van iPS-cel-afgeleide geslachtsklieren in zijdeaapjes.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

We willen Chunshen Shen, Hiroko Akutsu, Fumiyo Sugiki, Yuuna Hashimoto, Hina Naritomi, Yuuki Sakamoto en Mikiko Horigome bedanken voor hun steun bij het opstellen van dit protocol en bij de dagelijkse verzorging van zijdeaapjes; Takayuki Mineshige voor commentaar op het manuscript; Yukiko Abe en de leden van het Aiba-lab voor het delen van zygote-verzameltechnieken; CIEA voor het delen van de informatie over zijdeaapjes, huisvesting en experimenten die ze gedurende 40 jaar hebben gekweekt. Dit onderzoek werd ondersteund door AMED, JST en KAKENHI onder de subsidienummers JP19gm6310010, JP20gm6310010, JP21gm6310010 en JP22gm6310010 (AMED), JPMJPR228B (JST), 20H05764, 20H03177 en 22K18356 (KAKENHI).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AIA-360Tosoh Corporation0019945Hormoonmeting (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATETosoh Corporation0020956Hormoonmeting (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET IITosoh Corporation0020968Hormoonmeting (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATETosoh Corporation0020955Hormoonmeting (P4/E2)
CMS-1CLEA JapanMarmosetenvoer
EstrumateMSD Animal HealthPGF2alpha analoog (kloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150Merck Biopharma Co., Ltd.FSH
Gonatropin voor intramusculaire injectie 1000ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.872413hCG
Heparine natrium injectieoplossing 5.000 eenheden/5 mLMochida Pharmaceutical Co., Ltd.224122458Bloedafname
Immunochromatografisch testkit voor detectie van gemeenschappelijk marmosethormoon (Dual Checker)CLEA Japan, Inc.Bepalen CG-niveau
Laagprofiel dubbel-arm microscoopverlichting LPF-SDSHIOKAZE GIKENBureaulamp voor bloedafname
Marmoset bloedafnamebeveiligingsapparaatJIC JapanJM-1006Bloedafname
http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html
email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0,05%Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.Hematoombehandeling
Staalbeker, 3 mL, PS, voor Tosoh 360 en AIA-600 II, 1000/ZakGlobe Scientific110913Hormoonmeting (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2Tosoh Corporation0025224Hormoonmeting (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SETTosoh Corporation0025324Hormoonmeting (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTIONTosoh Corporation0025524Hormoonmeting (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIIITosoh Corporation0025240Hormoonmeting (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SETTosoh Corporation0025340Hormoonmeting (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTIONTosoh Corporation 0025540Hormoonmeting (P4/E2)
Spuit met 25 G (0,50 x 25 mm) naaldTERUMOSS-01T2525Bloedafname
Tensolvet 5.000 I.E. gel.Dechra Pharmaceuticals14033492Hematoombehandeling
TOSOH MULTI-CONTROL SETTosoh Corporation0015965Hormoonmeting (P4/E2)

Referenties

  1. Kholkute, S. D. Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus). Primates. 25 (1), 123-126 (1984).
  2. Harding, R. D., Hulme, M. J., Lunn, S. F., Henderson, C., Aitken, R. J. Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus). J Med Primatol. 11 (1), 43-51 (1982).
  3. Gilchrist, R. B., Wicherek, M., Heistermann, M., Nayudu, P. L., Hodges, J. K. Changes in follicle-stimulating hormone and follicle populations during the ovarian cycle of the common marmoset. Biol Reprod. 64 (1), 127-135 (2001).
  4. Gromoll, J., et al. A new subclass of the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor lacking exon 10 messenger RNA in the New World monkey (Platyrrhini) lineage. Biol Reprod. 69 (1), 75-80 (2003).
  5. Müller, T., et al. Chorionic gonadotrophin beta subunit mRNA but not luteinising hormone beta subunit mRNA is expressed in the pituitary of the common marmoset (Callithrix jacchus). J Mol Endocrinol. 32 (1), 115-128 (2004).
  6. Pacchiarotti, A., et al. Ovarian stimulation protocol in IVF: an up-to-date review of the literature. Curr Pharm Biotechnol. 17 (4), 303-315 (2016).
  7. Ezcurra, D., Humaidan, P. A review of luteinising hormone and human chorionic gonadotropin when used in assisted reproductive technology. Reprod Biol Endocrinol. 12, 95(2014).
  8. Lopez-Gatius, F. Ovarian response to prostaglandin F(2alpha) in lactating dairy cows: A clinical update. J Reprod Dev. 68 (2), 104-109 (2022).
  9. Marini, R. P., Wachtman, L. M., Tardif, S. D., Mansfield, K., Fox, J. G. The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , Elsevier Science. (2018).
  10. Schultz-Darken, N. J. Sample collection and restraint techniques used for common marmosets (Callithrix jacchus). Comp Med. 53 (4), 360-363 (2003).
  11. Hopper, J. Common marmosets. Handbook of Exotic Pet. Kubik, M. , 27-42 (2020).
  12. Harlow, C. R., Hearn, J. P., Hodges, J. K. Ovulation in the marmoset monkey: endocrinology, prediction and detection. J Endocrinol. 103 (1), 17-24 (1984).
  13. Ludlage, E., Mansfield, K. Clinical care and diseases of the common marmoset (Callithrix jacchus). Comp Med. 53 (4), 369-382 (2003).
  14. Summers, P. M., Wennink, C. J., Hodges, J. K. Cloprostenol-induced luteolysis in the marmoset monkey (Callithrix jacchus). J Reprod Fertil. 73 (1), 133-138 (1985).
  15. Takahashi, T., et al. Birth of healthy offspring following ICSI in in vitro-matured common marmoset (Callithrix jacchus) oocytes. PLoS One. 9 (4), e95560(2014).
  16. Tomioka, I., Takahashi, T., Shimada, A., Yoshioka, K., Sasaki, E. Birth of common marmoset (Callithrix jacchus) offspring derived from in vitro-matured oocytes in chemically defined medium. Theriogenology. 78 (7), 1487-1493 (2012).
  17. Abe, Y., et al. Efficient marmoset genome engineering by autologous embryo transfer and CRISPR/Cas9 technology. Sci Rep. 11 (1), 20234(2021).
  18. Summers, P. M., Shephard, A. M., Taylor, C. T., Hearn, J. P. The effects of cryopreservation and transfer on embryonic development in the common marmoset monkey, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 79 (1), 241-250 (1987).
  19. Thomson, J. A., Kalishman, J., Hearn, J. P. Nonsurgical uterine stage preimplantation embryo collection from the common marmoset. J Med Primatol. 23 (6), 333-336 (1994).
  20. Hanazawa, K., et al. Minimally invasive transabdominal collection of preimplantation embryos from the common marmoset monkey (Callithrix jacchus). Theriogenology. 78 (4), 811-816 (2012).
  21. Ishibashi, H., et al. Efficient embryo transfer in the common marmoset monkey (Callithrix jacchus) with a reduced transfer volume: a non-surgical approach with cryopreserved late-stage embryos. Biol Reprod. 88 (5), 115(2013).
  22. Kishimoto, K., et al. Establishment of novel common marmoset embryonic stem cell lines under various conditions. Stem Cell Res. 53, 102252(2021).
  23. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  24. Daskalaki, M., Drummer, C., Behr, R., Heistermann, M. The use of alfaxalone for short-term anesthesia can confound serum progesterone measurements in the common marmoset: a case report. Primate Biol. 9 (2), 23-28 (2022).
  25. Hodges, J. K., Cottingham, P. G., Summers, P. M., Liang, Y. N. Controlled ovulation in the marmoset monkey (Callithrix jacchus) with human chorionic gonadotropin following prostaglandin-induced luteal regression. Fertil Steril. 48 (2), 299-305 (1987).
  26. Barrett, J., Abbott, D. H., George, L. M. Extension of reproductive suppression by pheromonal cues in subordinate female marmoset monkeys, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 90 (2), 411-418 (1990).
  27. Barrett, J., Abbott, D. H., George, L. M. Sensory cues and the suppression of reproduction in subordinate female marmoset monkeys, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 97 (1), 301-310 (1993).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Reproductie bijmarmosetsgesexhormoonspiegelsprogesteronmetingoestradiolmetingchoriongonadotropinefemorale vene afnamegenetisch gemodificeerde marmosets
Bloedafname en hormoonmeting voor het bepalen van het stadium in de eierstokcyclus bij zijdeaapjes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.