Generatie en functionele verificatie van hypoxie-gevoelige chimere antigeenreceptor-T-cellen

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het genereren en functioneel verifiëren van hypoxiegevoelige chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen. Dit protocol presenteert de op lentivirus gebaseerde generatie van hypoxie-gevoelige CAR-T-cellen en hun karakterisering, inclusief de validatie van hypoxie-afhankelijke CAR-expressie en selectieve cytotoxiciteit.

Abstract

Uitgebreide studies hebben de belofte van chimere antigeenreceptor T (CAR-T) celtherapie bij de behandeling van hematologische maligniteiten bewezen. De behandeling van solide tumoren blijft echter een uitdaging, zoals blijkt uit de veiligheidsproblemen die ontstaan wanneer CAR-T-cellen normale cellen aanvallen die de doelantigenen tot expressie brengen. Onderzoekers hebben verschillende benaderingen onderzocht om de tumorselectiviteit van CAR-T-celtherapie te verbeteren. Een representatieve strategie langs deze lijn is de constructie van hypoxie-gevoelige CAR-T-cellen, die zijn ontworpen door een zuurstofafhankelijk afbraakdomein te fuseren met het CAR-deel en zijn gestrategiseerd om alleen een hoge CAR-expressie te bereiken in een hypoxische omgeving - de tumormicro-omgeving (TME). Dit artikel presenteert een protocol voor het genereren van dergelijke CAR-T-cellen en hun functionele karakterisering, inclusief methoden om de veranderingen in CAR-expressie en dodingscapaciteit te analyseren als reactie op verschillende zuurstofniveaus die worden vastgesteld door een mobiele incubatorkamer. Van de geconstrueerde CAR-T-cellen wordt verwacht dat ze CAR-expressie en cytotoxiciteit op een zuurstofgevoelige manier vertonen, waardoor hun vermogen om onderscheid te maken tussen hypoxische TME en normoxische normale weefsels voor selectieve activering wordt ondersteund.

Introduction

Therapie met chimere antigeenreceptor-T-cellen (CAR-T) heeft een belangrijke doorbraak betekend in de behandeling van kanker. Sinds de Food and Drug Administration (FDA) in 2017 de eerste CAR-T-therapie voor de behandeling van gevorderd/resistent lymfoom en acute lymfatische leukemie goedkeurde, hebben^{wereldwijd 1,2,3}, 10 CAR-T-therapieën gericht op CD19 of B-celrijpingsantigeen (BCMA) goedkeuring gekregen 4. Ondanks uitgebreid onderzoek blijft het echter een uitdaging om de opmerkelijke werkzaamheid van CAR-T-therapie bij de behandeling van hematologische maligniteiten te repliceren voor de toepassing ervan op solide tumoren 5,6,7,8.

De immunosuppressieve tumormicro-omgeving (TME) levert een primaire bijdrage aan de slechte werkzaamheid van CAR-T in de solide tumoromgeving. TME belemmert de activiteit en overleving van CAR-T-cellen door onvoldoende voedingsstoffen, hypoxie, een zure pH en de ophoping van metabolisch afval 9,10,11,12. Verdere vijandigheid komt van infiltrerende immunosuppressieve cellen zoals regulerende T-cellen (Tregs), myeloïde-afgeleide suppressorcellen (MDSC's) en tumor-geassocieerde macrofagen (TAM), die, naast tumorcellen, immunosuppressieve cytokines afscheiden die extra remming van CAR-T-cellen veroorzaken zodra ze de tumor binnenkomen^13,14.

Afgezien van de onbevredigende therapeutische efficiëntie, zijn veiligheidsproblemen een andere achilleshiel van CAR-T-cellen bij het omgaan met solide tumoren^15,16. Het veiligheidsprobleem komt voort uit het feit dat geen van de tumorspecifieke antigenen (TSA) die tot nu toe zijn geïdentificeerd, strikt beperkt is tot tumorcellen. Met andere woorden, de tumor-geassocieerde antigenen (TAA) die als doelwit van CAR zijn gekozen, vertonen weliswaar een hogere expressie in tumorcellen, maar worden vaak ook tot expressie gebracht door normale weefsels¹⁷. On-target, off-tumor effecten kunnen daarom optreden door de onverwachte activering van CAR-T-cellen bij CAR die efficiënt normale weefsels herkent, wat leidt tot cytokine release syndrome (CRS), CAR-T-gerelateerd encefalopathiesyndroom (CRES)¹⁸ en andere nadelige uitkomsten¹⁹.

Er zijn veel strategieën onderzocht om dergelijke effecten te voorkomen, waaronder het verminderen van de affiniteit van CAR om CAR-T-cellen in staat te stellen tumorcellen te onderscheiden van normale cellen op basis van de expressieniveaus van de beoogde TAA; het uitrusten van CAR-T-cellen met een uit-schakelaar, zoals een zelfmoordgen of eliminatiemarker om hun eliminatie te bevorderen bij onverwachte activering; het verdelen van de CD3ζ- en co-stimulerende signalen in twee CAR-groepen, waarvan de gelijktijdige inschakeling bijgevolg vereist is voor effectieve activering van CAR-T-cellen; met behulp van een synthetisch Notch (synNotch)-gebaseerd circuit dat de activiteit van CAR-T-cellen beperkt tot gerichte cellen die samen twee verschillende TAA's tot expressie brengen; en het ontwerpen van CAR-T-cellen om TME-gevoeligheid te bereiken door een mechanisme te implementeren om CAR-expressie af te stemmen op veranderende omgevingssignalen 20,21,22,23,24,25,26.

Een belangrijke overweging bij de hierboven beschreven TME-gevoeligheidsoptie is het lage zuurstofgehalte in de TME als gevolg van de snelle proliferatie van tumorcellen. De accommodatie van tumorcellen aan hypoxie hangt af van de activering van hypoxie-induceerbare factor-1 (HIF-1), een heterodimeer transcriptionele factor bestaande uit een induceerbare subeenheid, HIF-1α, en een constitutief tot expressie gebrachte subeenheid, HIF-1β²⁷. Onder normoxische omstandigheden ondergaat het HIF-1α-eiwit ubiquitinatie en snelle proteasomale afbraak, afhankelijk van het zuurstofafhankelijke afbraakdomein (ODD)²⁸. Wanneer de cellulaire toevoer van zuurstof beperkt wordt, wordt HIF-1 gestabiliseerd en activeert het de transcriptie van zijn stroomafwaartse doelgenen door zich te binden aan hypoxie-responselementen (HRE's)²⁹. Gezien de aard van ODD en HRE als zuurstofgevoelige elementen, zijn ze onderzocht om de voorwaardelijke expressie van CAR's binnen de hypoxische TME³⁰ te realiseren. Hier presenteren we een protocol dat zich richt op methoden voor fenotypische en functionele karakterisering van hypoxiegevoelige CAR-T-cellen, voorafgegaan door een korte beschrijving van het CAR-ontwerp en de voorbereidingsprocedures van deze cellen. Dit protocol is bedoeld om een nuttige richtlijn te bieden voor het benutten van hypoxie-responsieve CAR om CAR-T-cellen te genereren met beperkte off-tumor toxiciteit.

Protocol

In deze studie werd HER2-BBz-ODD, een hypoxiegevoelige CAR gericht op HER2 (Gen ID: 2064) vergeleken met zijn reguliere tegenhanger, HER2-BBz. De schema's van de twee CAR's worden geïllustreerd in figuur 1A, die laat zien dat HER2-BBz-ODD is afgeleid van HER2-BBz door de ODD-sequentie toe te voegen aan de C-terminal van CD3ξ. De constructie van lentivirale vectoren die de twee CAR's tot expressie brengen en de generatie van het overeenkomstige lentivirus door 293T-celtransfectie is eerder beschreven³¹.

1. Generatie van hypoxie-gevoelige CAR-T-cellen door lentivirale infectie

1. Ontdooi gecryopreserveerde humane perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) snel bij 37 °C in een waterbad. Breng de ontdooide PBMC's over in een buis van 15 ml met 9 ml serumvrij lymfocytenkweekmedium aangevuld met 400 IE IL-2, 5 ng/ml IL-7 en 10 ng/ml IL-15 (menselijk T-celgroeimedium, hierna TGM genoemd).
2. Na het nemen van een aliquot voor het tellen van cellen, centrifugeert u de buis bij 300 × g gedurende 5 minuten. Resuspendeer de gepelleteerde PBMC's met TGM met een dichtheid van 4 × 10⁶ cellen/ml en breng de suspensie over in een plaat met 6 putjes.
3. Bereid immunobeads met anti-hCD3/hCD28-coating voor.
   1. Breng 100 μL IgG magnetische muizen IgG over in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml en was ze 2 keer met behulp van een magnetische standaard met PBS.
   2. Resuspendeer de korrels in 100 μL PBS en voeg 0,2 μg anti-humaan CD3-antilichaam tegen muizen en 2 μg anti-humaan CD28-antilichaam toe. Meng het mengsel voorzichtig met een pipet en schud een nacht op 4 °C.
   3. Was de kralen 2 keer met behulp van een magnetische standaard met PBS en resuspendeer ze in 100 μL PBS.
4. Voeg anti-hCD3/hCD28-gecoate immunobeads toe aan de plaat in stap 1.2 met een kraal-tot-celverhouding van 1:1. Plaats de plaat in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ bij 37 °C.
5. Breng na 48 uur incubatie de celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml nadat u de cellen voorzichtig met een pipet hebt gemengd. Plaats de buis gedurende 3 minuten op een magnetische standaard en breng het supernatans vervolgens voorzichtig over in een nieuw buisje van 15 ml om immunobeads uit de PBMC's te verwijderen.
6. Neem een aliquot voor het tellen van cellen en zaai vervolgens de PBMC's bij 5 × 10⁵ cellen/putje in 300 μL TGM in een platte plaat met 48 putjes. Voeg 200 μL lentivirale bouillon toe aan de bijbehorende putjes en voeg protaminesulfaat toe tot een eindconcentratie van 10 μg/ml.
7. Centrifugeer de plaat bij 1.000 × g bij 32 °C gedurende 1,5 uur en verwijder voorzichtig 300 μl supernatans uit elk putje met behulp van een pipet en gooi het weg. Voeg vervolgens 1 ml verse TGM toe met behulp van een pipet en plaats de plaat in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ bij 37 °C.
8. Voeg elke 2-3 dagen verse TGM toe om de celdichtheid aan te passen naar 0,5-2 × 10⁶ cellen/ml. Begin met het overbrengen van cellen eerst naar een plaat met 12 putjes en vervolgens naar een plaat met 6 putjes. Ga door met het kweken van de cellen totdat het totale aantal 6 × 10⁶ bereikt in een volume van 4 ml.
   OPMERKING: Voer tegelijkertijd de CAR-transductie van Jurkat T-cellen uit volgens dezelfde procedures die hierboven zijn beschreven, behalve dat TGM wordt vervangen door RPMI1640 medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat.

2. Beoordeling van zuurstofafhankelijke CAR-expressie in CAR-T-cellen met behulp van flowcytometrie

1. Plaat de CAR-getransduceerde T-cellen uit stap 1.8 in twee platen met 12 putjes met een dichtheid van 2.5 × 10⁶ cellen/putje in 2 ml TGM. Plaats de ene plaat rechtstreeks in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ bij 37 °C (normoxische toestand, aangezien de standaardvoorwaarde voor het kweken van cellen 21% O₂ heeft) en plaats de andere plaat in een mobiele CO₂/O₂/N₂ incubatorkamer met het O_2-niveau vooraf ingesteld op 1% (hypoxische toestand) en houd de kamer vervolgens in een bevochtigde, 5% CO₂/94% N₂ incubator bij 37 °C.
2. Verzamel elke 24 uur 5 × 10⁵ cellen van de platen onder hypoxische of normoxische omstandigheden in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Centrifugeer de buisjes bij 500 × g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in 1 ml PBS door te pipetteren. Herhaal de PBS-was nog een keer.
3. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 50 μL FACS-buffer (PBS aangevuld met 2% FBS) in elk buisje. Voeg 50 μl van een verdunning van 1:100 PE-geconjugeerd anti-vlagantilichaam (0,2 μg/ml) toe en meng grondig door te pipetteren. Incubeer 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
4. Voeg aan het einde van de incubatie 1 ml FACS-buffer toe aan elke buis. Meng grondig door te pipetteren en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten op 500 × g .
5. Verwijder het supernatans voorzichtig en gooi het weg met een pipet en herhaal stap 2.4 nog een keer.
6. Verwijder het supernatans voorzichtig en gooi het weg met behulp van een pipet. Resuspendeer de cellen in 200 μL FACS-buffer en breng de resulterende celsuspensie vervolgens over in stroombuizen van 5 ml.
7. Voer flowcytometrie uit op de celsuspensie in stap 2.6 om de CAR-expressie van het oppervlak te bepalen. Neem niet-getransfecteerde T-cellen op als negatieve controle.
   1. Gebruik de FSC/SSC- en FSC-A/FSC-H-poorten om levende afzonderlijke cellen te screenen. Verzamel 1 × 10⁴ live afzonderlijke gebeurtenissen voor elke steekproef. Gate de cellen positief voor EGFP (een constitutieve marker die in de lentivirale vector wordt gedragen als een indicator van succesvol getransduceerde T-cellen) en vervolgens de cellen die positief zijn voor phycoerythrin (PE) (cellen die CAR tot expressie brengen) om PE-positiviteit en mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) te meten.

3. Analyse van zuurstofafhankelijkheid van CAR-expressie in CAR-gemodificeerde Jurkat T-cellen door western blot

1. Plaat de CAR-getransduceerde Jurkat T-cellen uit sectie 1 in twee platen met 48 putjes met een dichtheid van 5 × 10⁵ cellen per putje (500 μL kweekvolume) in RPMI1640 medium met 10% FBS.
2. Voeg voor één plaat CoCl₂ toe aan de experimentele putjes tot een eindconcentratie van 0 μM, 50 μM of 200 μM. Plaats de plaat vervolgens in een bevochtigde incubator van 5% CO₂ -graden Celsius bij 37 °C (normoxische toestand). Voeg voor de andere plaat geen CoCl₂ toe en plaats deze in een mobiele CO₂/O₂/N₂ incubatorkamer met het O₂ niveau vooraf ingesteld op 1% (hypoxische toestand) voordat u deze naar dezelfde incubator overbrengt.
3. Breng na 24 uur incubatie de celsuspensies over in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Centrifugeer de buisjes bij 500 × g gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatanten volledig en gooi ze eerst weg met een pipet van 1 ml, vervolgens met een pipet van 100 μl en resuspendeer de celpellets in 50 μl 1x SDS-PAGE-monsterbuffer.
4. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten in een kokend waterbad. Plaats de buis onmiddellijk gedurende 30 s op ijs en centrifugeer vervolgens gedurende 30 s bij 16.000 × g .
5. Plaats 30 μl van de geklaarde monsters in elke gleuf van een 10-wells, 10% SDS PAGE-gel met een dikte van 1,5 mm. Laat de gel 30 minuten op 80 V draaien, verhoog vervolgens de spanning tot 100 V en laat 1,5 uur draaien.
6. Breng aan het einde van de elektroforese eiwitten over van de gel naar een PVDF-membraan met behulp van de standaard natte overdrachtsmethode, waarbij de stroom en duur zijn ingesteld op respectievelijk 400 mA en 1 uur.
7. Blokkeer het membraan in de blokkeerbuffer (5% melk (w/v) in PBST (PBS+0,05% Tween-20)) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Knip vervolgens het stuk tussen 30 kD en 40 kD uit voor detectie van de GAPDH-laadregeling en het stuk tussen 50 kD en 70 kD voor detectie van de CAR-moleculen.
8. Incubeer de stukken van 30-40 kD en 50-70 kD met een anti-GAPDH-antilichaam tegen muizen (verdunning van 1:2.000) en een anti-vlagantilichaam van muizen (verdunning van 1:2.000) in respectievelijk 3 ml blokkeringsbuffer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur of bij 4 °C 's nachts.
9. Was de membranen met PBST op kamertemperatuur op een platformwip gedurende 3 x 5 min.
10. Incubeer de membranen met HRP-geconjugeerd geitenanti-muisantilichaam (1:5.000 verdunning) in 3 ml blokkeerbuffer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur; Was het membraan vervolgens 5 x 10 minuten met PBST.
11. Ontwikkel de membranen door ze te incuberen met een HRP-substraat en visualiseer vervolgens de gedetecteerde eiwitbanden met behulp van een lichtgevende beeldanalysator.

4. In vitro beoordeling van de zuurstofafhankelijkheid van cytotoxiciteit gemedieerd door hypoxiegevoelige CAR-T-cellen

1. Op dag 0 × zaad 10⁴ doelcellen (SKOV3-Luc-cellen) per experimenteel putje in 200 μL DMEM bevattend 10% FBS in twee zwarte weefselkweekplaten met 96 putjes met platte bodem.
2. Verwijder op dag 1 voorzichtig 100 μl van het supernatans van de bovenkant van elk putje. Voeg CAR-T-cellen of niet-getransduceerde T-cellen toe met effector-tot-doelverhoudingen van 1:1, 2:1 en 4:1 in 100 μL DMEM-medium dat 10% FBS bevat.
3. Plaats de ene plaat in een atmosfeer van 21% O₂ en de andere in een atmosfeer van 1% O₂ atmosfeer met behulp van een mobiele CO₂ / O₂/N₂ -incubatorkamer, zoals beschreven in stap 2.1.
   OPMERKING: Als er geen mobiele CO₂/O₂/N₂ incubatorkamer beschikbaar is, kan het toevoegen van CoCl₂ aan het kweekmedium worden gebruikt om een hypoxische toestand na te bootsen.
4. Breng op dag 2, na 24 uur co-culturatie, voorzichtig al het supernatans (ongeveer 150-200 μL) over in een nieuwe U-bottom plaat met 96 putjes met behulp van een pipet. Bewaren bij -20 °C voor latere detectie van cytokines, volgens de procedures beschreven in rubriek 5.
5. Voeg 60 μL 1x passieve lysisbuffer toe aan elk experimenteel putje van de zwarte platbodemplaten met 96 putjes uit stap 4.4. Plaats de platen vervolgens op een shaker en schud gedurende 30 minuten om een efficiënte cellyse te garanderen.
6. Voeg 60 μL luciferasesubstraat van vuurvliegjes toe aan elk experimenteel putje en meet de luciferase-activiteit onmiddellijk met behulp van een microplaatlezer.
7. Bereken de genormaliseerde cytotoxiciteit (%) met behulp van vergelijking (1):
   Genormaliseerde cytotoxiciteit (%) = 100 - ×100 (1)

5. Detectie van IL-2- en IFN-γ secretie door hypoxiegevoelige CAR-T-cellen

1. Bereid op dag 0 een verdunning van 1:250 IL-2 of IFN-γ antilichaam in Coating Buffer voor. Voeg 100 μl van het verdunde antilichaam toe aan elk putje van een ELISA-plaat met 96 putjes en incubeer de plaat een nacht bij 4 °C.
   OPMERKING: Coatingbuffer wordt gemaakt door 7,13 g NaHCO₃ en 1,59 g Na₂CO₃ op te lossen in 1 l gedestilleerd water en de pH aan te passen aan 9,5.
2. Verwijder op dag 1 het niet-geadsorbeerde vangantilichaam door de plaat krachtig ondersteboven te draaien en was de putjes vervolgens 3x met 200 μL wasbuffer (PBS met 0,05% Tween 20).
3. Voeg 200 μL Assay verdunningsmiddel (PBS met 10% FBS) toe aan elk putje en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
4. Gooi de oplossing weg door de plaat krachtig ondersteboven te draaien; Was de putjes vervolgens 3x met 200 μL Wash Buffer.
5. Ontdooi de ingevroren bovendrijvende monsters/plaat uit stap 4.4 bij kamertemperatuur. Eenmaal volledig ontdooid, verdunt u de monsters en standaarden met Assay verdunningsmiddel. Voeg 100 μl verdunde monsters of standaarden toe aan elk putje van de gecoate ELISA-plaat en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Voor IL-2-detectie wordt een 10-voudige verdunning aanbevolen, terwijl voor IFN-γ-detectie een 50-voudige verdunning de voorkeur heeft.
6. Verwijder de monsters en standaarden door de plaat krachtig ondersteboven te draaien en was de putjes vervolgens 5x met 200 μL wasbuffer per putje.
7. Bereid een werkende detectieoplossing voor door het IL-2-detectieantilichaam of IFN-γ-detectieantilichaam/Streptavidin-HRP (SAv-HRP) te verdunnen in een verhouding van 1:250 in een verdunningsmiddel voor analyse. Voeg 100 μL van de werkdetectieoplossing toe aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.
8. Gooi de oplossing weg en was de putjes 7x met 200 μL Wash Buffer.
9. Voeg 100 μL substraatreagens toe aan elk putje en incubeer de plaat 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
10. Voeg 50 μL stopoplossing (1 M H₂SO₄) toe aan elk putje. Lees onmiddellijk de absorptie bij 450 nm af met behulp van een microplaatlezer.

Results

Het samensmelten van het ODD-domein van HIF-1α met het CAR-deel vertegenwoordigt een primaire strategie voor het genereren van een hypoxiegevoelige CAR. De hypoxiegevoelige HER2-gerichte CAR die in deze studie werd geanalyseerd, genaamd HER2-BBz-ODD, werd geconstrueerd met behulp van deze strategie door de ODD-sequentie te integreren in zijn conventionele HER2-BBz (Figuur 1A). In deze studie gebruikten we lentivirale transductie om HER2-BBz-ODD CAR of HER2-BBz CAR tot expressie te brengen en onderzochten we vervolgens hun zuurstofgevoeligheid in twee celtypen: menselijke PBMC's en Jurkat T-cellen.

Het eerste onderzoek is de expressie van CAR onder hypoxische omstandigheden versus normoxische omstandigheden, die werd uitgevoerd in zowel CAR-getransduceerde PBMC-afgeleide T-cellen door flowcytometrie als CAR-getransduceerde Jurkat T-cellen door western blotting. In de setting van CAR-getransduceerde PBMC-afgeleide T-cellen zagen we dat HER2-BBz-ODD CAR een significant hogere expressie had onder 1% O₂ dan onder 21% O₂ in termen van zowel het percentage CAR-positieve cellen als de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) (Figuur 1B). De immunoblotting-analyse van CAR-getransduceerde Jurkat T-cellen bevestigde ook de hypoxie-afhankelijke inductie van HER2-BBz-ODD.

Het is vermeldenswaard dat in deze context de hypoxische aandoening gemakkelijk kan worden nagebootst door CoCl₂, een chemische inductor van hypoxie, aan het kweekmedium toe te voegen. Zoals geïllustreerd in figuur 1C, toonden onze immunoblottingresultaten aan dat blootstelling aan 50 of 200 μM CoCl₂ het effect van blootstelling aan 1% O₂ recapituleerde, waardoor de expressie van de HER2-BBz-ODD CAR duidelijk werd geïnduceerd, maar niet die van de HER2-BBz CAR. De functionele karakterisering van hypoxie-gevoelige CAR werd uitgevoerd met PBMC-afgeleide CAR-T-cellen. In de studie werd een vuurvliegluciferase-dragende SKOV-3-cellijn gebruikt als de doelcellijn. Deze opstelling stelde ons in staat om de luciferase-activiteit van doelcellen te meten als een proxy voor het beoordelen van de cytotoxiciteit gemedieerd door co-gekweekte CAR-T-cellen.

Zoals te zien is in figuur 1D, gaven de metingen aan dat de HER2-BBz CAR-T-cellen doelcellen effectief doden, ongeacht of de atmosfeer normoxisch of hypoxisch was. Daarentegen vertoonden de HER2-BBz-ODD CAR-T-cellen een significant zwakkere cytotoxiciteit onder normoxische omstandigheden voor alle drie de onderzochte E:T-ratio's. Hun cytotoxiciteit werd echter aanzienlijk verhoogd bij blootstelling aan hypoxische omstandigheden. De supernatantieniveaus van IL-2 en IFN-γ werden ook gemeten door ELISA na co-kweek van CAR-T-cellen met doelcellen gedurende 24 uur. Voor beide cytokinen werd een hogere secretie van minder dan 1% O₂ waargenomen in vergelijking met 21% O₂ voor HER2-BBz-ODD CAR-T-cellen, wat consistent is met de cytotoxiciteitsgegevens. Daarentegen vertoonden HER2-BBz CAR-T-cellen een lagere secretie van de twee cytokinen onder 1% O₂ in vergelijking met 21% O₂, wat wijst op een nadelig effect van hypoxie op de cellulaire activiteit (Figuur 1E). Alles bij elkaar bevestigden deze resultaten overtuigend de hypoxiegevoelige aard van HER2-BBz-ODD CAR.

Figuur 1: Opbouw en karakterisering van hypoxie-gevoelige CAR-T cellen. (A) Schematische weergave van de ontwerpen van een hypoxie-gevoelige CAR, HER2-BBz-ODD, en zijn conventionele tegenhanger, HER2-BBz. Beide CAR's bestaan uit een N-terminaal CD8α-signaalpeptide, een FLAG-tag, een humaan HER2-gericht scFv, een CD8-scharnier- en transmembraandomein en een intracellulair deel dat bestaat uit een costimulatoirdomein van 4-1BB, een CD3ξ-signaleringsdomein, een IRES en een EGFP. HER2-BBz-ODD verschilt van HER2-BBz in de fusie van een ODD-domein met de C-terminal van het CD3ξ-signaleringsdomein, waardoor zijn hypoxisch-afhankelijke expressie mogelijk is door zijn ubiquitine-afhankelijke degradatie onder normoxische omstandigheden te bevorderen. (B,C) Beoordelingen van zuurstofafhankelijke expressie van HER2-BBz-ODD CAR. (B) Er werd één beoordeling uitgevoerd met menselijke PBMC-afgeleide CAR-T-cellen na kweek onder 1% of 21% O₂ gedurende 24, 48 of 72 uur met behulp van flowcytometrie. (C) De andere beoordeling was met CAR-getransduceerde Jurkat T-cellen, waarbij cellysaten 24 uur na kweek onder 21% O₂, 50 of 200 μM CoCl₂, of 1% O₂ werden geoogst en geanalyseerd op CAR-expressie met behulp van western blotting, met HER2-BBz CAR-getransduceerde cellen als controle. (D,E) In vitro cytotoxiciteit en cytokinesecretie van CAR-T-cellen onder verschillende zuurstofomstandigheden. (D) CAR-T-cellen werden samen gekweekt met SKOV3-cellen die luciferase tot expressie brengen van vuurvliegjes met aangegeven E:T-verhoudingen van minder dan 1% of 21% O₂. Na 24 uur co-culturatie werd de efficiëntie van het doden van doelcellen bepaald door de verandering in cel-geassocieerde vuurvliegluciferase-activiteit te meten ten opzichte van die met niet-getransduceerde T-cellen. (E) De supernatanten werden verzameld voor de detectie van uitgescheiden IL-2 en IFN-γ. De resultaten worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM (n = 3 gezonde donoren) (****p < 0,0001). Afkortingen: scFv = single-chain fragment variable; CAR = chimere antigeenreceptor. Panelen C en D zijn overgenomen van Liao et ^al.31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Veiligheidsproblemen zijn belangrijke kwesties die moeten worden aangepakt om ervoor te zorgen dat CAR-T-celtherapie klinisch wordt gebruikt. Het gebruik van de unieke eigenschappen van tumorcellen of de TME is een primaire onderzoeksrichting geworden die zich richt op de ontwikkeling van CAR-T-cellen die zich selectief richten op tumorweefsels. Het ontwerpen van een hypoxie-gevoelige CAR-T is een aantrekkelijke strategie in deze richting, waarbij verschillende benaderingen worden onderzocht, waaronder de benadering die in deze studie wordt gepresenteerd - het samensmelten van de CAR-groep met het natuurlijk voorkomende hypoxie-gevoelige ODD-eiwitdomein. Een alternatieve benadering is het vervangen van een constitutieve promotor die gewoonlijk wordt gebruikt om CAR-expressie te stimuleren door een hypoxie-responselement (HRE), dat in eerdere studies veelbelovend is gebleken. Er wordt aangenomen dat het combineren van HRE- en ODD-elementen (wild-type of technische versies die een strakkere controle van de expressie bieden) een optimaal ontwerp vormt voor een hypoxie-induceerbare CAR.

Dit protocol schetst experimentele procedures voor het genereren en valideren van hypoxiegevoelige CAR-T-cellen. De implementatie van dit protocol omvat een aantal belangrijke overwegingen. Een primaire overweging is het creëren van hypoxische aandoeningen. Tussen de twee benaderingen is de toevoeging van CoCl₂ aan het kweekmedium veel gebruikt in eerdere hypoxie-gerelateerde studies, grotendeels dankzij het gemak^32,33. Het is echter onmogelijk om de mate van hypoxie te meten die door deze benadering wordt nagebootst. Het gebruik van een mobiele CO₂ /O₂/N₂ incubatiekamer is daarentegen voordelig omdat de O₂ niveaus nauwkeurig kunnen worden ingesteld en is dus geschikt voor een fijne analyse van de hypoxie-gevoeligheid van CAR-T cellen. In dit opzicht varieert het hypoxieniveau in tumoren tussen verschillende soorten solide tumoren en verschillende perioden van tumorprogressie³⁴, terwijl slechts 1% O₂ in het protocol wordt geïllustreerd. Het is een optimale praktijk voor onderzoekers om het zuurstofniveau aan te passen aan de werkelijke vraag. Als de CoCl_2-methode de enige beschikbare benadering is, raden we aan om een reeks CoCl_{2-concentraties} in de test op te nemen om verschillende zuurstofniveaus te simuleren.

Het kiezen van een geschikte methode voor het onderzoeken van hypoxie-afhankelijke CAR-expressie is een andere belangrijke overweging. Hoewel immunoblotting-analyse van CAR-getransduceerde Jurkat T-cellen een handige optie is tijdens CAR-constructieoptimalisatie, dient het analyseren van het effect van zuurstofniveaus op CAR-oppervlakte-CAR-expressie in CAR-getransduceerde menselijke PBMC's door middel van flowcytometrie als de ultieme validatie. Het is optimaal om de dynamiek van CAR-expressie te onderzoeken als reactie op de overgang van hypoxische naar normoxische omstandigheden, zoals we eerder deden met een verbeterde versie van hypoxiegevoelige CAR, namelijk HiTA-CAR³⁵. Dit zou hypoxie-beperkte CAR-expressie verder aantonen.

Voor functionele verificatie van hypoxiegevoelige CAR-T-cellen omvat de cytotoxiciteitstest die in het protocol wordt beschreven, het gebruik van vuurvliegluciferase-dragende doelcellen. Deze op reporters gebaseerde test kan worden vervangen door andere beoordelingsmethoden voor het doden van doden, zoals de CCK8-methode en de real-time cellulaire analyse (RTCA) -methode, waarbij niet-gemodificeerde tumorcellen kunnen worden gebruikt. RTCA-analyse is ook voordelig voor het meten van de real-time dodende kinetiek van CAR-T-cellen. Om de specifieke cytotoxiciteit veroorzaakt door CAR-T-cellen te meten, moeten niet-getransduceerde PBMC's als controle worden opgenomen. Hoge transductie-efficiëntie van PBMC's is wenselijk om bezorgdheid te voorkomen dat verschillen in gedetecteerde cytotoxiciteit tussen experimentele en controlegroepen het gevolg zijn van niet-specifieke doding gemedieerd door verschillende hoeveelheden toegevoegde effectorcellen.

Er zijn verschillende beperkingen in dit protocol. Hypoxische omstandigheden kunnen de levensvatbaarheid van zowel doelcellen als T-cellen beïnvloeden ^36,37, wat de bezorgdheid doet ontstaan dat celdood die geen verband houdt met CAR-T-celgemedieerde cytotoxiciteit de interpretatie van testresultaten kan verwarren. Ervoor zorgen dat zowel CAR-T-cellen als doelcellen een uitstekende levensvatbaarheid hebben onmiddellijk voordat de test wordt voorgesteld om dergelijke problemen te voorkomen of te minimaliseren. Er moet ook worden opgemerkt dat in-vitrovalidatie geen garantie is voor succesvolle in-vivovertaling. In vivo beoordelingen zijn altijd nodig om te bevestigen of de hypoxiegevoelige CAR-T-kandidaat zou kunnen vermijden zich te richten op normale weefsels die het beoogde antigeen tot expressie brengen

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge tube	QSP	509-GRD-Q	Supernatants en cellen cellection Protocol Stap 2,3,4
10% ExpressCast PAGE	NCM biotech	P2012	Immunoblotting Protocol Stap 3
10x PBS	NCM biotech	20220812	Celcultuur Protocol Stap 4
10 mL pipet	Yueyibio	YB-25H	Pipetten Protocol Stap 1
10xTRIS-Glycine-SDS elektroforese buffer	Epizyme	3673020	Immunoblotting Protocol Stap 3
15 mL Centrifuge tube	Thermo Scientific	339650	Supernatants en cellen cellection Protocol Stap 1
25 cm2 EasYFlask	Thermo Scientific	156367	Celcultuur Protocol Stap 3,4
4x Protein SDS PAGE Loading Buffer	Takara	9173	Immunoblotting Protocol Stap 3
6-well flat-bottom weefselcultuur platen	Thermo Scientific	140675	T Cellen cultuur Protocol Stap 1
96-well zwarte flat-bottom weefselcultuur platen	Greiner	655090	Cytotoxiciteits test Protocol Stap 4
96-well ELISA platen	Corning	3590	ELISA Protocol Stap 5
96-well plate shaker	QILINBEIER	MH-2	Schudden Protocol Stap 4
96-well U-bottom weefselcultuur platen	Thermo Scientific	268200	Supernatants cellection Protocol Stap 4,5
anti-FLAG antilichaam	Sigma	F1804-50UG	Immunoblotting Protocol Stap 3
Carbinol	Sinopharm	10010061	Immunoblotting Protocol Stap 3
Koolstofdioxide incubator	Thermo Scientific	360	Celcultuur Protocol Stap 1,2,3,4
Celtelling plate	Hausser scientific	1492	Celtelling Protocol Stap 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG Kit	Thermo Scientific	11531D	Mouse IgG magnetische kralen Protocol Stap 1
Centrifuge	Thermo Scientific	75002432	Celcultuur Protocol Stap 1,3,4
Chemiluminescentie gel beeldvorming systeem	BIO-RAD	12003154	Immunoblotting Protocol Stap 3
Kobaltchloride oplossing (0.5 M)	bioleaper	BR4000203	Hypoxische conditie Protocol Stap 2,3,4
DMEM	Corning	10-103-CV	Celcultuur Protocol Stap 4
Elektronische weegschaal	Sartorius	PRACTUM612-1CN	Wegen Protocol Stap 5
FBS	BI	04-001-1ACS	Celcultuur Protocol Stap 3,4
GAPDH Mouse mAb	ABclonal	AC002	Immunoblotting Protocol Stap 3
Gel elektroforese apparaat	BIO-RAD	1645070	Immunoblotting Protocol Stap 3
GloMax Microplate Readers	Promega	GM3000	Luciferase activiteitsmeting Protocol Stap 4
Geit anti-Muis IgG (H+L)	Yeasen	P1126151	Immunoblotting Protocol Stap 3
Hoge snelheid microvriescentrifuge	eppendorf	5810 R	Celcultuur Protocol Stap 1
Human IFN-γ ELISA Set	BD	555142	ELISA Protocol Stap 5 Items: Recombinant Human IFN-γ Gelyofiliseerd Standaard, Detectie Antilichaam Biotine Anti-Human IFN-γ, Vang Antilichaam Gezuiverd Anti-Human IFN-γ, Enzym Reagens Streptavidin-paardenradenperoxidase conjugaat (SAv-HRP)
Human IL-2 ELISA Set	BD	555190	ELISA Protocol Stap 5 Items: Recombinant Human IL-2 Gelyofiliseerd Standaard, Detectie Antilichaam Biotine Anti-Human IL-2, Vang Antilichaam Gezuiverd Anti-Human IL-2, Enzym Reagens Streptavidin-paardenradenperoxidase conjugaat (SAv-HRP)
IL-15	R&D systems	P40933	T Cellen cultuur Protocol Stap 1
IL-21	Novoprotein	GMP-CC45	T Cellen cultuur Protocol Stap 1
IL-7	R&D systems	P13232	T Cellen cultuur Protocol Stap 1
Omgekeerd microscoop	Olympus	CKX41	Celcultuur Protocol Stap 1,3,4
Jurkat	ATCC	TIB-152	CAR-Jurkat constructie Protocol Stap 3
LSRFortessa	BD	LSRFortessa	Flowcytometrie Protocol Stap 2
Luciferase Assay Systeem	Promega	E1501	Luciferase reporter test Protocol Stap 4 Items: Passieve lysis buffer, vuurvlieg luciferase substraat
Microplaat lezer	BioTek	HTX	ELISA Protocol Stap 5
mobiele CO2/O2/N2 Incubator Kamer	China Innovation Instrument Co., Ltd.	Smartor118	Hypoxische conditie Protocol Stap 2, 3, 4
Muis Anti-Hexa Histidine tag	Sigma	SAB2702218	Immunoblotting Protocol Stap 3
NcmBlot Rapid Transfer Buffer	NCM biotech	WB4600	Immunoblotting
NcmECL Ultra	NCM biotech	P10300	Immunoblotting Protocol Stap 3 Items: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagens (A),NcmECL Ultra Gestabiliseerde Peroxide Reagens (B)
NovoNectin -gecoate 48-well flat platen	Novoprotein	GMP-CH