Een gemodificeerd inflammatoir pijnmodel om het pijnstillende effect bij muizen te bestuderen

Samenvatting

Hier presenteren we een aangepast inflammatoir pijnmodel met de carrageeninjectie met beide achterpoten om het pijnstillende effect te evalueren.

Samenvatting

De hete plaattest wordt veel gebruikt om pijnstillende effecten op ontstekingspijn bij muizen te evalueren. Een veelgebruikt model van ontstekingspijn werd geïnduceerd met een intraplantaire injectie van carrageen in één achterpoot. De bevindingen van ons laboratorium toonden echter aan dat muizen met een enkele achterpootinjectie van carrageen hun poten optilden om thermische nociceptie te vermijden tijdens de hete plaattest. Vanwege deze respons kan de vorige injectiemethode de thermische pijngrens niet nauwkeurig weergeven. Daarom hebben we een nieuwe methode onderzocht om dit probleem te voorkomen. In de huidige studie hebben we de vorige methode aangepast door carrageen in beide achterpoten te injecteren om het model van ontstekingspijn vast te stellen. De resultaten toonden aan dat injectie met carrageen aan beide achterpoten gevoelig was en een betere methode om ontstekingspijn op te wekken bij gebruik van de kookplaattest dan injectie met één achterpoot. Op basis van deze bevindingen ontwierpen we verdere experimenten waarin muizen met zowel achterpoot als enkelvoudige achterpootinjectie van carrageen intragastrisch werden behandeld met celecoxib (30 mg/kg). De resultaten van de hete plaattest toonden aan dat celecoxib de thermische pijngrens verhoogde bij muizen met injectie van carrageen met beide achterpoten, maar niet bij muizen met injectie van carrageen met één achterpoot. Samenvattend hebben we een superieure methode ontwikkeld om een model van ontstekingspijn te induceren om het pijnstillende effect te evalueren.

Inleiding

Pijn is wereldwijd een probleem voor de volksgezondheid. Het wordt veroorzaakt door schadelijke thermische, mechanische of chemische stimulatie. Het is moeilijk om pijnstudies bij mensen uit te voeren vanwege ethische bezwaren. Daarom is het gebruik van pijnmodellen bij dieren een belangrijke benadering voor het begrijpen van pijnmechanismen en het onderzoeken^{van behandelingen.} De warmeplaattest is veel gebruikt voor de beoordeling van thermische nociceptie en hyperalgesie². Momenteel wordt het model van ontstekingspijn dat wordt gebruikt voor de hete plaattest geïnduceerd met een intraplantaire injectie van carrageen in één achterpoot. Om bijvoorbeeld het antinociceptieve effect van met rotigotine beladen microsferen te onderzoeken, werd een diermodel van ontstekingspijn bereid door middel van een injectie met één achterpoot³. Om de effecten van catechol-o-methyltransferaseremmers op thermische nociceptie bij muizen te beoordelen, werd carrageen toegediend in het plantaire gebied van de rechter achterpoot⁴. Om de pijnstillende rol van het extract van Posidonia oceanica (L.) Delile te onderzoeken, werd een inflammatoir pijnmodel bij muizen opgesteld door intraplantaire injectie van carrageen in de rechter achterpoot⁵. De bevindingen van ons laboratorium toonden echter aan dat een muis met de injectie met één achterpoot van carrageen zijn poot zou optillen om thermische nociceptie te vermijden, wat de reactie van het dier op een thermische stimulus in de hete plaattest onnauwkeurig verlengt. Daarom veronderstelden we dat het inflammatoire pijnmodel met de injectie van carrageen met één achterpoot de thermische pijndrempel niet nauwkeurig kon weergeven. Daarom hebben we de methode geoptimaliseerd door carrageen in beide achterpoten te injecteren om een aangepast ontstekingspijnmodel op te stellen.

De muizen die werden onderworpen aan injectie met carrageen met beide achterpoten hadden geen manier om de thermische stimulus voor beide achterpoten tegelijkertijd te vermijden. De pijngrens werd gedefinieerd als de tijd tussen het plaatsen van de muis op de hete plaat tot het likken van een van de achterpoten door de muis. De resultaten bevestigden dat het aangepaste inflammatoire pijnmodel geschikter is voor het evalueren van de nociceptieve temperatuurdrempel. Dit kan de werkzaamheid van de kookplaattest voor het onderzoek naar en de ontwikkeling van pijnstillers verbeteren.

Protocol

Het experimentele protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Yantai University (nr. YTDX20220425). De procedures volgden de richtlijnen van de National Institutes of Health voor het gebruik van proefdieren.

1. Dieren

1. Gebruik ICR vrouwelijke muizen met een gewicht van 20-25 g voor de experimenten.
2. Laat de dieren 3 dagen acclimatiseren in de omgeving van de proefruimte voordat u met de experimenten begint.
3. Onderhoud de experimenteerruimte met een licht-donkercyclus van 12 uur en geef de muizen vrije toegang tot water en voer.

2. Bereiding van carrageenoplossing

1. Weeg 0,1 g carrageen af. Voeg 10 ml gesteriliseerde normale zoutoplossing toe aan een buisje.
2. Voeg 0,1 g carrageen toe aan de tube en draai de tube gedurende 30 s.
3. Verzamel de 1% gesteriliseerde carrageenoplossing.
4. Bereid de carrageenoplossing voor de experimenten.

3. Intraplantaire injectie van carrageen

1. Gebruik een spuit (0,05 ml, 29G x 1/2 inch, 0,33 mm × 12,7 mm) om de 1% carrageenoplossing te injecteren.
2. Schud de carrageenoplossing voordat u deze in de spuit opzuigt. Zorg ervoor dat er geen luchtbel in de spuit zit.
3. Ontsmet de injectieplaats (achterpoot) met 75% alcohol.
4. Injecteer 30 μL ^6,7 van 1% carrageenoplossing subcutaan in het plantaire oppervlak van de achterpoot. Injecteer voor de controlegroep muizen 30 μl normale zoutoplossing.
   1. Steek de naald diagonaal omhoog in het voetkussen van de achterpoot. Behoud de stabiliteit van de spuit.
   2. Trek de spuit na de injectie langzaam op en druk gedurende 2 s op de injectieplaats om lekkage te voorkomen.

4. Test van de kookplaat

1. Voer de kookplaattest 3 uur na de intraplantaire injectie uit.
2. Reinig en desinfecteer het oppervlak van de kookplaat.
3. Start het apparaat van de kookplaat. Klik op de knop Temperatuurmodus . Klik op CONSTANT om de temperatuur in te stellen op 55 ± 0.2 °C.
4. Klik op de knop Experiment starten en klik op REACH. Pak een muis uit de accommodatiecontainer. Pak zijn slurf voorzichtig vast. Plaats de muis in het midden van de kookplaat. Klik op START.
5. Observeer en noteer de tijd om de linker achterpoot (voor muizen met injectie met één achterpoot) of achterpoot (voor muizen met injectie met beide achterpoten) te likken als reactie op de warmtestimulatie. Druk op het pedaal van de kookplaat om de tijd op het scherm van de kookplaat te zien. Definieer de pijngrens als de tijd tussen het plaatsen van de muis op de hete plaat en het likken van de achterpoot.
6. Stel een limiet van 60 s in voor de kookplaattest ^4,8,9. Noteer een pijngrens van 60 s als de limiet is bereikt.
   NOTITIE: Reinig het kookplaatapparaat met 75% alcohol voordat u de volgende muis plaatst om mogelijke vertekening door achtergebleven geur van de vorige muis te voorkomen.

5. Bereiding van 1,5 mg/ml celecoxib suspensie

1. Neem 1 capsule van 200 mg celecoxib. Pak de inhoud van de capsule en vermaal het tot een poeder.
2. Voeg 0,5% natriumcarboxymethylcellulose toe. Het uiteindelijke volume is 13,3 ml. Dit is de winkelsuspensie van celecoxib.
3. Neem 1 ml van de bewaarsuspensie celecoxib. Voeg 9,0 ml 0,5% natriumcarboxymethylcellulose toe om 1,5 mg/ml celecoxibsuspensie te verkrijgen.
4. Dien 0,2 ml/10 g van de celecoxib-suspensie intragastrisch toe aan de muizen.
   OPMERKING: Selecteer een sondenaald met een lengte van 4.0-4.5 cm voor muizen met een gewicht van 20-25 g.

6. Evaluatie van het gewijzigde inflammatoire pijnmodel

1. Verdeel ICR-vrouwelijke muizen willekeurig in drie groepen: controle-, model- en celecoxib-groepen.
2. Injecteer 30 μL 1% carrageenoplossing subcutaan in het plantaire oppervlak van de achterpoot (enkele achterpoot of beide achterpoten). Injecteer voor de controlegroep muizen 30 μl normale zoutoplossing.
3. Na de injectie van carrageen of normale zoutoplossing moet de behandeling onmiddellijk worden uitgevoerd. Intragastrisch celecoxib toedienen in een dosis van 30 mg/kg voor de muizen in de celecoxib-groep. Voor de muizen in de controle- en modelgroepen, intragastrisch 0,5% natriumcarboxymethylcellulose toedienen.
4. Voer de kookplaattest (sectie 2) 3 uur na de injectie met carrageen uit.

7. Statistische methoden

1. Presenteer de experimentele resultaten als gemiddelde ± standaarddeviatie. Voer een normaliteitsverdelingstest uit met de Kolmogorov-Smirnov statistische goodness of fit-test.
2. Analyseer de vergelijking tussen de twee groepen met behulp van een ongepaarde t-toets. Voer vergelijkingen uit met meerdere groepen met behulp van een eenrichtingsanalyse van variantie, gevolgd door de test van Dunnett. Beschouw de waarde van p < 0,05 als statistisch significant.

Resultaten

De pijngrens in inflammatoire pijnmodellen
De pijngrens van het inflammatoire pijnmodel met injectie van carrageen met één achterpoot was 32,23 ± 11,11 s, terwijl de pijngrens van de controlegroep 27,73 ± 7,08 s was. Vergeleken met de controlegroep vertoonde de pijngrens van het injectiemodel met één achterpoot geen significante vermindering (p > 0,05, figuur 1A). De pijngrens van het inflammatoire pijnmodel met injectie van carrageen met beide achterpoten was 21,84 ± 5,63 s, terwijl de pijngrens van de controlegroep 28,21 ± 8,61 s was. Vergeleken met die van de controlegroep daalde de pijngrens van het beide-achterpoot-injectiemodel significant (p < 0,05, figuur 1B).

Het pijnstillende effect van celecoxib in verschillende inflammatoire pijnmodellen
In het inflammatoire pijnmodel met een injectie van carrageen met één achterpoot vertoonde de pijngrens van de celecoxibgroep (27,01 ± 10,98 s) geen significante toename in vergelijking met die van de modelgroep (29,77 ± 13,97 s, p > 0,05). In overeenstemming met de bovenstaande resultaten vertoonde de pijngrens van de modelgroep geen significante vermindering in vergelijking met die van de controlegroep (30,94 ± 14,54 s), wat aangaf dat injectie van carrageen met één achterpoot geen inflammatoir pijnmodel induceerde (Figuur 2A). In het inflammatoire pijnmodel met injectie van carrageen met beide achterpoten daalde de pijngrens van de modelgroep (15,61 ± 4,85 s) significant in vergelijking met die van de controlegroep (23,55 ± 3,96 s, p < 0,05). Vergeleken met de modelgroep was de pijngrens van de celecoxibgroep (20,29 ± 3,10 s) significant verlaagd (Figuur 2B).

Figuur 1: De pijndrempels in inflammatoire pijnmodellen. (Gemiddelde ± standaarddeviatie, n = 15). (A) De pijngrens van het inflammatoire pijnmodel met de injectie met één achterpoot van carrageen. (B) De pijngrens van het inflammatoire pijnmodel met injectie van carrageen met beide achterpoten, (^#P<0.05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Het pijnstillende effect van celecoxib in verschillende inflammatoire pijnmodellen (gemiddelde ± standaarddeviatie, n = 14). (A) Het pijnstillende effect van celecoxib in het inflammatoire pijnmodel met de injectie met één achterpoot van carrageen. (B) Het pijnstillende effect van celecoxib in het inflammatoire pijnmodel met injectie van carrageen aan beide achterpoten ( ^#P<0.05, *P<0.05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Pijn is een beschermende reactie die wordt veroorzaakt door weefselbeschadiging of letsel. Het heeft echter ook een negatieve invloed op de kwaliteit van leven¹⁰. Daarom blijven de ontwikkeling van effectieve analgetica en de exploratie van pijnmechanismen actieve onderzoeksgebieden. De methoden voor het evalueren van pijn spelen een sleutelrol bij de ontwikkeling van pijnstillers. Injectie met één achterpoot van carrageen is een klassieke methode voor de hete plaattest. Het aangepaste model dat wordt geïnduceerd door injectie van carrageen met beide achterpoten dat we hier presenteren, biedt een betrouwbare manier om de werkzaamheid van potentiële therapeutische middelen om pijn te verlichten te onderzoeken.

In de huidige studie ontdekten we dat muizen met de injectie met één achterpoot van carrageen geen afname van de pijngrens vertoonden. In andere onderzoeken leidde deze methode echter tot significante verlagingen van de pijngrens in de warmeplaattest^11,12. De discrepantie in resultaten tussen de vorige studies en deze studie kan worden verklaard door de verschillende diersoorten die in de experimenten zijn gebruikt 13,14,15,16. Een andere mogelijke verklaring is dat we hebben waargenomen dat de muizen met de injectie met één achterpoot van carrageen vaak de geïnjecteerde poot optillen of lichtjes op de plaat stappen om de thermische stimulus te vermijden. Evaluatie van de pijngrens vereist het observeren van de typische nociceptieve reactie van het likken of schudden van de geïnjecteerde poot. We kregen dus een negatief resultaat, wat aangeeft dat de pijngrens van het model met de injectie met één achterpoot van carrageen niet significant afnam. Muizen met injectie met carrageen met beide achterpoten waren niet in staat om de thermische stimulus te vermijden door de poot op te tillen of licht op de plaat te stappen. De pijngrens werd beschouwd als likken of schudden van een van beide achterpoten, wat de werkelijke nociceptieve reactie van muizen weerspiegelde.

Om de superioriteit van het gemodificeerde inflammatoire pijnmodel te verifiëren, werden muizen met injecties met carrageen met één achterpoot of beide achterpoten behandeld met intragastrische toediening van celecoxib. In overeenstemming met de hypothese van deze studie oefende celecoxib een pijnstillend effect uit in het gemodificeerde inflammatoire pijnmodel, maar het vertoonde geen effecten in het model met injectie van carrageen met één achterpoot. Deze bevinding toonde aan dat het gemodificeerde inflammatoire pijnmodel betrouwbaar is voor het screenen van potentiële analgetica.

Er zijn beperkingen in deze studie. Er zijn veel verschillende muizenstammen gebruikt in warmplaattests. Verschillende muizenstammen kunnen verschillende reacties op thermische stimuli vertonen. Het huidige experiment gebruikte alleen ICR-muizen om de hypothese te testen. Daarom moet nog worden bepaald of de gewijzigde methode nauwkeurig en consistent pijndrempels detecteert in de andere muizenstammen in de warmeplaattest. Bovendien hebben we geen pilotexperiment ontworpen om de pijngrens van de muizen te evalueren en hebben we dus geen dieren met een hoge pijngrens uitgesloten. Deze beperking kan echter ook als een voordeel van de huidige gewijzigde methode worden beschouwd. Het vereenvoudigt niet alleen het proces van de pijnstillende test, maar weerspiegelt ook het bereik van de reacties van muizen in de warmeplaattest. Bovendien zal de meting van het volume van de achterpoten helpen om de inductie van ontsteking te bevestigen en het pijnstillende effect van niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) te verifiëren. Onze ervaring heeft echter aangetoond dat het niet eenvoudig is om het volume van de poot van muizen te meten. De poot van de muis is te klein om een exacte waarde te krijgen. Daarom was de huidige studie niet bedoeld om de verandering in het volume van de poot na ontsteking te onderzoeken.

Concluderend, volgens de hierboven beschreven stappen, maakt het inflammatoire pijnmodel met injectie van carrageen met beide achterpoten het mogelijk om de thermo-nociceptieve drempels van muizen op een betrouwbare manier te bepalen. Bovendien werd bij toediening van analgetica statistisch een verhoging van de pijngrens gedetecteerd. Het aangepaste inflammatoire pijnmodel is nuttig voor het screenen van potentiële analgetica. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor pijnbiologisch onderzoek, de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en klinische behandeling, maar ook om nieuwe ideeën en oplossingen voor pijnbestrijding te bieden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AL204 elektronische weegschaal	Yuheng Battery Co., Ltd	YH-400A
Carboxymethylcellulose	Tianjin Chemical Co., Ltd	20210326
Carrageenan	Sigma, MO, USA	29H0715
Celecoxib	Pfizer Inc.	8142838
Hot plate	UGO Ltd. Co., Italy	PB-200
ICR vrouwelijke muizen	Jinan Pengyue  Co., Ltd.	SCXK20220007
Normale zoutoplossing	Kelun Pharmaceutical Co., Ltd	H51021157