Point-of-care diagnostiek op basis van CRISPR met voorgemengde en gevriesdroogde reagentia

Samenvatting

Hier presenteren we de stapsgewijze voorbereiding van voorgemengde, gevriesdroogde recombinase-gebaseerde isotherme amplificatie en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR)-gebaseerde reacties, die kunnen worden gebruikt voor de detectie van nucleïnezuurbiomarkers van infectieziekteverwekkers of andere genetische markers van belang.

Samenvatting

Moleculaire diagnostiek door detectie op basis van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) heeft een hoge diagnostische nauwkeurigheid en kenmerken die geschikt zijn voor gebruik op point-of-care-instellingen, zoals snelle doorlooptijden voor resultaten, handige eenvoudige uitlezingen en geen vereiste van ingewikkelde instrumenten. De reacties kunnen echter omslachtig zijn om uit te voeren op het zorgpunt vanwege hun vele componenten en handmatige hanteringsstappen. Hierin bieden we een stapsgewijs, geoptimaliseerd protocol voor de robuuste detectie van ziekteverwekkers en genetische markers met op recombinase gebaseerde isotherme amplificatie en op CRISPR gebaseerde reagentia, die worden voorgemengd en vervolgens worden gevriesdroogd in gemakkelijk op te slaan en gebruiksklare formaten. Voorgemengde, gevriesdroogde reagentia kunnen worden gerehydrateerd voor onmiddellijk gebruik en behouden een hoge versterkings- en detectie-efficiëntie. We bieden ook een gids voor het oplossen van veelvoorkomende problemen bij het bereiden en gebruiken van voorgemengde, gevriesdroogde reagentia voor op CRISPR gebaseerde diagnostiek, om het detectieplatform toegankelijker te maken voor de bredere diagnostische/genetische testgemeenschappen.

Inleiding

Op CRISPR gebaseerde diagnostiek voor de detectie van nucleïnezuurbiomarkers werd voor het eerst gerapporteerd in 2017 1,2,3,4, en is sindsdien bewezen als diagnostiek van de volgende generatie met door de Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde tests, met name voor de detectie van Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA, in meerdere landen ^5,6,7,8. Naast de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) is aangetoond dat de technologieën effectief zijn voor het detecteren van diverse virussen en bacteriën 9,10,11,12,13, genetische ziektemutaties en -deleties, en kunnen ze worden ontworpen om biomarkers voor eiwitten en kleine moleculen te detecteren ^2,12. Op CRISPR gebaseerde diagnostiek combineert vaak isotherme amplificatiemethoden, zoals recombinasepolymerase-amplificatie (RPA) of lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP)^14,15 - met op CRISPR gebaseerde detectie met behulp van RNA-geleide CRISPR-geassocieerde (Cas) enzymen met "collaterale" endonuclease-activiteit na doelherkenning 3. Het dubbele gebruik van isotherme amplificatie en op CRISPR gebaseerde detectie verleent verschillende wenselijke eigenschappen aan de technologieën, met name een hoge diagnostische nauwkeurigheid die die van de gouden standaard polymerasekettingreactie (PCR) benadert, en het vermogen om kleine sequentieverschillen te multiplexen en te detecteren, waaronder single-nucleotide polymorfismen ^1,9.

De meest nauwkeurige versies van op CRISPR gebaseerde diagnostiek bevatten echter meerdere componenten en stappen en kunnen ingewikkeld zijn om uit te voeren met niet-experts of op het zorgpunt (POC). Om deze uitdaging aan te gaan om het gebruik van zeer nauwkeurige CRISPR-gebaseerde diagnostiek uit te breiden naar POC-instellingen, hebben we protocollen ontwikkeld om voorgemengde, gevriesdroogde, op recombinase gebaseerde isotherme amplificatie en op CRISPR gebaseerde detectiereacties te bereiden, die gemakkelijk te gebruiken en op te slaan^{zijn 7}. Deze protocollen moeten een aanvulling vormen op bestaande uitstekende protocollen voor op CRISPR gebaseerde diagnostiek¹⁴, die aanvullende informatie bevatten over de productie van biochemische componenten die nodig zijn voor op CRISPR gebaseerde diagnostiek⁷, ontwerprichtlijnen¹ en formuleringen met behulp van alternatieve isotherme amplificatietechnieken ^2,14,15,16 en Cas-enzymen ¹². Uiteindelijk hopen we dat op CRISPR gebaseerde diagnostiek kan helpen bij het realiseren van snelle, goedkope en gevoelige nucleïnedetectie in omgevingen waar draagbare en instrumentvrije analyses vereist zijn ^1,9,17.

In onze protocollen gebruiken we voornamelijk de combinatie van RPA en Cas13-gebaseerde detectie. RPA functioneert bij temperaturen die dicht bij de omgevingstemperatuur liggen (37-42 °C) en heeft daarom weinig energie- en apparatuurvereisten. Andere isotherme versterkingsreacties vereisen hogere temperaturen (LAMP, 60-65 °C; streng-verplaatsingsversterking (SDA), 60 °C; exponentiële versterkingsreactie (EXPAR), 55 °C; en helicase-afhankelijke versterking (HDA), 65 °C)². Het ontwerp van RPA-primers is ook niet complex, in tegenstelling tot LAMP-primers, en kan worden uitgebreid tot multiplexed amplificatie ^7,9,14. Hoewel multiplexen met RPA in de praktijk moeilijk is om verder te multiplexen dan twee doelen, zijn er duidelijke richtlijnen voor het ontwerpen van gemultiplexte RPA-primers om interferentie te minimaliseren¹⁸.

Hoewel carryover-besmetting een groot probleem blijft in de tweestapsworkflow, zijn de gegenereerde amplicons van RPA klein van formaat en veroorzaken ze minder waarschijnlijk carry-over-besmetting in vergelijking met grote concatemere amplicons van LAMP¹⁴. RPA-primers kunnen worden ontworpen volgens standaardrichtlijnen¹⁴: ze zijn over het algemeen 25-35 nucleotide-lang met smelttemperaturen van 54 tot 67 °C. De grootte van het amplicon moet kleiner zijn dan 200 basenparen. Het reverse transcriptase-enzym (RT) kan aan RPA worden toegevoegd om amplificatie van RNA mogelijk te maken, en bij reverse transcriptie-RPA (RT-RPA) wordt een ander enzym Ribonuclease H (RNase H) meestal in kleine hoeveelheden toegevoegd om het resulterende RNA: DNA-hybride op te lossen en de amplificatiereactie te bevorderen ^5,19. Om T7-transcriptie voor Cas13-gebaseerde detectie mogelijk te maken, kan de T7 RNA-polymerasepromotor aan het 5'-uiteinde van de voorwaartse RPA-primer worden geplaatst.

Nadat amplicons zijn gegenereerd uit RPA, kunnen ze worden gedetecteerd met crRNA-geprogrammeerde Cas-enzymen. Van de verschillende Cas-enzymen die kunnen worden gebruikt voor amplicondetectie, geven we de voorkeur aan RNA-gerichte Cas13-varianten vanwege hun hoge splijtingsactiviteit¹ en goed gekarakteriseerde polynucleotide-splitsingsvoorkeuren ^7,9, waarvan de laatste kan worden gebruikt voor gemultiplexte detectie. De crRNA-sequentie voor Cas13 is ontworpen om complementair (omgekeerd complement) te zijn aan de doelplaats in het geproduceerde RNA met spacer- en directe herhaling (DR)-sequenties. De crRNA-sequentie en RPA-primers mogen elkaar niet overlappen om ongewenste Cas-gebaseerde detectie van off-target amplificatieproducten te voorkomen, wat de achtergrond- en valse positieven verhoogt¹⁴.

Cas-gebaseerde detectie is gebaseerd op verschillende detectiemodaliteiten om de splitsing van nucleïnezuurmoleculen van reporters te monitoren (RNA-reporters voor op Cas13 gebaseerde reacties)^1,2,14. Verschillende detectiemodaliteiten zijn onder meer colorimetrie, elektrochemische uitlezingen, fluorescentie, sequencing-uitlezingen en laterale stroomstrips². We richten ons op de fluorescentie-uitlezing gegeven van een verscheidenheid aan fluoroforen en reporters zoals cyanine 5 (Cy5), rhodamine X (ROX) en carboxyfluoresceïne (FAM), die effectief kunnen worden opgewekt met behulp van een enkele blauwe LED-lichtbron, en hun fluorescentie geanalyseerd door een microplaatlezer of een real-time thermische cycler ^7,14. Bovendien is de fluorescentie-uitlezing eenvoudig in te stellen en maakt continue monitoring mogelijk, wat real-time kwantificering mogelijk maakt. Multiplexed RPA-preamplificatie en multiplexed Cas13-gebaseerde detectie met behulp van Cas-enzymen kunnen worden gecombineerd met meerkleurige fluorescentie-uitlezingen voor de gelijktijdige detectie van meerdere genetische doelen ^2,7.

In onze protocollen amplificeren we RNA eerst isotherm met RT-RPA door het RNA-monster toe te voegen aan de gevriesdroogde vorm van het RT-RPA-reagens (Figuur 1). Tijdens RT-RPA wordt de T7-promotor toegevoegd aan het gegenereerde dubbelstrengs DNA-amplicon. Vervolgens worden de RPA-producten overgebracht naar de gevriesdroogde Cas13-gebaseerde detectie, die ook T7 RNA-polymerase bevat. Deze detectiereactie zal DNA-amplicons omzetten in RNA (via T7 RNA-polymerase), dat gemakkelijk kan worden gedetecteerd met crRNA-geprogrammeerd Cas13. Doel-geactiveerd Cas13 zal reportermoleculen splitsen om detecteerbaar fluorescentiesignaal ^2,7,14 te produceren. Hoewel de protocollen hier betrekking hebben op detectie door Leptotrichia wadei (LwaCas13a), kunnen ze worden uitgebreid tot gelijktijdige, gemultiplexte detectie van maximaal vier doelen met behulp van orthogonale Cas13- en Cas12-enzymen ^7,9. RPA- en Cas-gebaseerde detectiereacties kunnen ook worden gecombineerd in een enkele buis, zij het met verlies van gevoeligheid¹⁴.

Figuur 1: Op CRISPR gebaseerde detectieworkflow. De workflow illustreert de detectie van twee doelgenen. Ten eerste worden interessegebieden binnen het DNA-doelwit isothermisch geamplificeerd met RPA; de reactie kan worden uitgevoerd met reverse transcriptie (RT-RPA) bij het detecteren van RNA-doelen. Vervolgens zet T7-transcriptie dsDNA-amplicons om in RNA's, die op hun beurt worden herkend door Cas13-crRNA-complexen die in staat zijn om collaterale RNase-activiteit op te wekken bij doelbinding. Splitsing van gedoofde fluorescentiereporters produceert fluorescentiesignalen die kunnen worden bewaakt met behulp van een microplaatlezer, gevisualiseerd door een LED-transilluminator of kunnen worden gebruikt met een real-time thermische cycler. Afkortingen: CRISPR = geclusterde, regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindroomherhalingen; RT = omgekeerde transcriptie; RPA = versterking van recombinasepolymerase; Cas = CRISPR-geassocieerd eiwit; LED = lichtgevende diode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De belangrijkste kenmerken van de hier gepresenteerde protocollen zijn de voormengformuleringen voor vriesdrogen. Voormenging vereenvoudigt het reactiegebruik en verbetert de reproduceerbaarheid, maar veel componenten binnen RPA en Cas-gebaseerde detectie, met name reverse transcriptie en sommige labiele cofactoren zoals ATP, zijn niet stabiel in oplossing. Daarom formuleren we de voorgemengde oplossingen zo dat ze kunnen worden gevriesdroogd voor langdurige opslag en gemakkelijk transport en inzet ^1,9,20. Voorgemengde, gevriesdroogde reagentia helpen ook de detectiegevoeligheid te verbeteren, omdat een hoger monstervolume (en dus een hogere DNA/RNA-input) kan worden toegevoegd om de reactie te reconstrueren¹⁰. In onze formuleringen gebruiken we voornamelijk trehalose²¹ als cryoprotectant in gevriesdroogde RPA en Cas-gebaseerde detectiereacties⁷. Naast het behoud van reagentia bevordert trehalose ook de reacties via het verhogen van de enzymstabilisatie 16,22,23,24 en het verlagen van de smelttemperaturen van dsDNA²³. Exploraties van andere stabilisatoren 5,7,21,25,26 buiten trehalose kunnen nog optimalere formuleringen opleveren voor verschillende gebruiksscenario's.

Protocol

1. Bereiding van gevriesdroogde RT-RPA voorgemengde reagentia

1. Voorbereiding van de apparatuur
   1. Bereid een dewar of bak met vloeibare stikstof voor op het snel invriezen van reacties. Vul de dewar of bak met vloeibare stikstof.
   2. Vriesdroger
      1. Controleer op gecondenseerd water in de afvoerbuizen en de binnenkant van de kamer; Verwijder het water indien nodig.
      2. Reinig de binnenkant van de kamer en het metalen rek van de 1,5 ml microcentrifugebuis met RNase-ontsmettingsoplossing, gevolgd door 70% ethanol.
      3. Sluit de kamerdeur en de vacuümontlastklep.
      4. Zet de vriesdroger aan.
      5. Stel de schaptemperatuur handmatig in op -30 °C.
   3. Apparatuur voor moleculaire biologie
      1. Reinig het volgende met RNase-ontsmettingsoplossing: pipetten, pipetpuntrekken, een vortexmixer, een spin-down minicentrifuge en een permanente marker.
      2. Reinig het volgende met kraanwater en veeg vervolgens af met schoonmaakpapier: plastic rekjes voor microcentrifugebuisjes en een schuimdoos voor ijs.
      3. Bereid een verwarmingsblok voor (gebruikt voor het oplossen/oplossen van de triglycine-oplossing) door het te reinigen met RNase-ontsmettingsoplossing en 70% ethanol. Zet hem vervolgens aan en stel de temperatuur in op 60 °C.
2. Bereiding van voorgemengde RPA-reacties
   OPMERKING: Deze formulering is voor 10 reacties (met behulp van drie RPA-pellets).
   1. Controleer voor gebruik of er neerslag in de triglycineoplossing zit. Als er neerslag is, los deze dan op door te incuberen bij 60 °C en goed te mengen voor gebruik. Koel de triglycine-oplossing af voordat u andere warmtegevoelige reagentia toevoegt.
      OPMERKING: Neerslag kan zich gemakkelijk vormen als de buis gedurende langere tijd op kamertemperatuur wordt bewaard.
   2. Haal drie RPA-pelletstripbuizen uit de vriezer; Tik op de stripbuizen door ze zachtjes tegen de laboratoriumtafel te kloppen om de witte pellets los te maken.
   3. Breng alle drie de pellets over in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml A.
   4. Pipetteer 25 μL nucleasevrij water om eventueel achtergebleven RPA-poeder in de stripbuisjes te spoelen en breng de spoeloplossing over in een nieuw microcentrifugebuisje B van 1,5 ml.
   5. Voeg 10 μl van de 0,57 M triglycineoplossing en 10 μl primermix (elk 10 μM) toe aan de mastermixbuis B.
   6. Vortex-mix buis B; Draai vervolgens naar beneden en plaats de buis op ijs.
   7. Voeg 28,4 μL van de 5x RPA-buffer (bereid uit 500 μL 50% (w/v) PEG20000, 250 μL van 1 M Tris pH 7,4 en 100 μL 100 mM dithiothreitol (DTT)) toe aan de mastermix tube B en meng grondig door meerdere keren krachtig te tikken of te schudden.
      OPMERKING: We maken de oplossing op deze manier om de viscositeit van PEG in de mastermix-buis te verdunnen/verlagen, voordat we alles toevoegen om RPA-pellets op te lossen.
   8. Breng de pellets die in buis A uit stap 1.2.3 zijn verzameld over in de mastermixbuis B en keer de mastermixbuis vervolgens meerdere keren om om te mengen. Observeer of de oplossing homogeen en monofasisch lijkt (het ziet er ook enigszins ondoorzichtig uit) en plaats de tube vervolgens op ijs.
      OPMERKING: Als het mengen niet grondig is, kan PEG ervoor zorgen dat de oplossing/suspensie fase-scheidt.
   9. Voeg 0,71 μL 200 Unit/μL RT en 2,84 μL 5 Unit/μL RNase H toe aan de mastermixbuis. Tik of keer de mastermix-buis vele malen zachtjes op en neer. Draai naar beneden en plaats de buis op ijs.
      OPMERKING: We voegen deze enzymen toe na zware menging van eerdere stappen, aangezien RT en RNase H gevoelig zijn voor afschuiving als gevolg van menging; geen vortexen meer na toevoeging van RT/RNase H.
   10. Doseer 8,4 μl van de mastermix-oplossing in 10 voorgekoelde buisjes van 1,5 ml en leg de buisjes op ijs. Dompel hiervoor de pipetpunt in de mastermix-oplossing en zuig de mastermix-oplossing langzaam en gestaag in de tip om de vorming van luchtbellen te voorkomen en een nauwkeurige volumemeting te garanderen. Doseer de Mastermix-oplossing in een voorgekoeld buisje van 1,5 ml.
       OPMERKING: Met 8,4 μL aliquoteerd, zal er naar onze ervaring ~1-2 μL suspensie overblijven in de mastermix-buis. De onderzoeker kan het aliquoteringsvolume iets naar beneden aanpassen om ervoor te zorgen dat er voldoende reagentia zijn voor alle 10 reacties. Gebruik de juiste pipetteertechnieken bij het hanteren van viskeuze oplossingen.
   11. Nadat het aliquoteren is voltooid, plaatst u de buizen in een metalen rek ondergedompeld in vloeibare stikstof om ze voor te bereiden op vriesdrogen. Laat de buisjes 5 minuten ondergedompeld in vloeibare stikstof.
       OPMERKING: Omdat vriesdrogen overtollige oplossing verwijdert, kunnen we meer DNA/RNA-input toevoegen, wat de gevoeligheid helpt verhogen. Gevriesdroogde voorgemengde RPA-reacties kunnen 8 maanden worden bewaard bij -20 °C. Vriesdrogen helpt bij de reproduceerbaarheid als een bepaald experiment wordt uitgevoerd met behulp van RPA-mastermixen die in dezelfde batch zijn bereid, dus het maken van een grotere batch helpt ook.
3. Vriesdrogen
   1. Controleer bij de vriesdroger de temperatuur van de opvangbak en het schap. Wacht indien nodig tot de temperatuur van de opvangbak -75 ± 5 °C bereikt en de schaptemperatuur -30 ± 1 °C bereikt.
   2. Bedek open buizen in het metalen rek met een vel reinigingsdoekjespapier, plaats het metalen rek samen met de open buizen in het vriesdroogrek en sluit de deur van het schap.
   3. Selecteer het programma dat wordt weergegeven in Tabel 1 en druk op start. Na 30 minuten van de secundaire droogstap (20 °C, <0,1 mbar; de temperatuur wordt oneindig gehouden door de tijd van de stap in te stellen op "oneindig"), drukt u op stop het programma.
      LET OP: We laten de buizen opwarmen in de vriesdroger om watercondensatie te voorkomen.
   4. Laat de druk ontsnappen door de vacuümontlastklep te openen en verwijder vervolgens het rek van de plank. Sluit de buisjes onmiddellijk af en bewaar de gevriesdroogde reacties bij -20 °C.
      OPMERKING: Gevriesdroogde voorgemengde reacties van RPA en CRISPR-Cas13a kunnen 8 maanden bij -20 °C worden bewaard.

2. Bereiding van gevriesdroogde CRISPR-Cas13a voorgemengde detectiereagentia

OPMERKING: Volg stap 1.1 voor de voorbereiding van de apparatuur.

1. CRISPR-Cas13a voorgemengd reactiepreparaat (10 reacties)
   1. Haal de volgende items uit de opslag en leg ze op ijs: 10 μL LwaCas13a (in eigen huis geproduceerd ^7,8,14) (2 mg/ml), Cas-opslagbuffer, 10 ng/μL (225 nM) crRNA, 25 mM rNTP, 50 Unit/μL T7 RNA-polymerase, 2 μM FAM fluorescentiereporter.
   2. Bereid een werkoplossing van LwaCas13a in een verhouding van 126 μg/ml (900 nM) door 148,8 μl Cas-opslagbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,6 M NaCl, 5% glycerol, 2 mM DTT) toe te voegen aan 10 μl 2 mg/ml LwaCas13a.
   3. Bereid de CRISPR-Cas13a mastermix-reactie als volgt voor: 71 μL RNasevrij water, 20 μL 400 mM Tris pH 7,4, 20 μL 60% (w/v) trehalose, 10 μL 10 ng/μL (225 nM) crRNA (hier gericht op de s- en n-genen van SARS-CoV-2), 8 μL 100 mM rNTP-mix (elk 25 mM), 6 μL 50 Unit/μL T7 RNA-polymerase, 25 μL 2 μM FAM-fluorescentieverslaggever en 10 μL 126 μg/ml (900 nM) LwaCas13a. Meng goed door de mastermix-buis om te keren; Draai dan naar beneden.
   4. Doe 17 μl van de mastermix in 10 buisjes van 1,5 ml die op ijs worden geplaatst. Plaats de buisjes in een rek ondergedompeld in vloeibare stikstof en laat de buisjes 5 minuten onderdompelen in vloeibare stikstof.
2. Vriesdrogen
   1. Controleer in de vriesdroger de temperatuur van de opvangbak en het schap en wacht tot de temperatuur van de opvangbak -75 ± 5 °C bereikt en de houdbaarheidstemperatuur -30 ± 1 °C.
   2. Plaats de tubes in de vriesdroger. Selecteer het programma dat wordt weergegeven in Tabel 1 en druk op start. Na 30 minuten van de secundaire droogstap (25 °C, <0,1 mbar; de temperatuur wordt oneindig gehouden door de tijd van de stap in te stellen op "oneindig"), stopt u het programma.
   3. Laat de druk ontsnappen door de vacuümontlastklep te openen en verwijder het rek van de plank. Sluit de buisjes onmiddellijk af en bewaar de gevriesdroogde reacties bij -20 °C.
      OPMERKING: Gevriesdroogde RPA- en CRISPR-Cas13a voorgemengde reagentia kunnen 8 maanden bij -20 °C worden bewaard.

3. RT-RPA nucleïnezuur amplificatie

OPMERKING: Om kruisbesmetting te voorkomen, moeten werkplekgebieden en pipetten worden gescheiden voor voorversterking, monstertoevoeging en naversterking. We raden aan om gefilterde pipetpunten te gebruiken.

1. Verwarm een thermische schudincubator voor op 42 °C.
2. Voeg 1 μL magnesiumacetaat (Mg(OAc)₂) en kaliumacetaat (KOAc) oplossingsmix (bestaande uit 196 mM Mg(OAc)₂ en 1,5 M KOAc) toe aan de zijkant van de buis met de gevriesdroogde, voorgemengde RT-RPA-pellet (uit sectie 1).
   OPMERKING: Een truc om de Mg(OAc)₂ en KOAc-mix toe te voegen: de druppel moet rond de volumemarkering van 1 ml van de tube worden geplaatst. Hier is de druppel duidelijk zichtbaar en zal deze waarschijnlijk niet verloren gaan door het sluiten van de buis of andere handelingen. De versterking begint na het naar beneden draaien om de druppel op de buisbodem op te vangen. Bij het verwerken van meer dan één reactie tegelijk kan de versterking tegelijkertijd worden gestart.
3. Resuspendeer de RT-RPA-pellet door 12,4 μl van het RNA-monster (of de controlemonsters) toe te voegen.
   OPMERKING: De volgorde van toevoeging is negatief monster/negatieve controle, RNA/DNA te testen, positief monster/positieve controle.
4. Om de RT-RPA-reactie op gang te brengen, centrifugeert u de toegevoegde oplossing uit stap 3.2 en 3.3 kort met behulp van een spin-down minicentrifuge bij kamertemperatuur gedurende 3 s.
5. Meng door voorzichtig op de buis te tikken en draai dan nog een korte spin-down gedurende 3 seconden.
6. Incubeer de reactie bij 42 °C gedurende 60 minuten door deze in een voorverwarmd verwarmingsblok of een thermische schudincubator te plaatsen.
7. Haal na het einde van de reactie de reactiebuisjes eruit en plaats ze op ijs voordat u doorgaat naar de CRISPR-Cas-detectiestap (sectie 4).
   OPMERKING: Het RPA-versterkte product kan onmiddellijk in de detectiereactie worden gebruikt of kan enkele dagen bij 4 °C of enkele maanden bij -20 °C worden bewaard.

4. Detectie van CRISPR-Cas13-nucleïnezuur

1. Schakel een fluorescentie-microplaatlezer in, stel de verwarmingstemperatuur in en verwarm deze voor op 37 °C en selecteer het programma dat wordt weergegeven in tabel 2.
2. Leg een bord met 384 putjes op ijs.
3. Resuspendeer de gevriesdroogde CRISPR-Cas voorgemengde detectiereactie (uit sectie 2) door 17 μL 8 mM magnesiumchlorideoplossing toe te voegen. Meng door voorzichtig op de buis te tikken; Draai vervolgens kort 3 s naar beneden en plaats de buis op ijs.
4. Breng 18 μl van het geresuspendeerde reactiemengsel over naar elk putje van de voorgekoelde plaat met 384 putjes op ijs.
5. Voeg 2 μL van het in sectie 3 bereide RPA-product toe aan elk reactieputje.
6. Haal de plaat uit het ijs, plaats deze snel in een voorverwarmde fluorescentie-microplaatlezer en druk op start.
   OPMERKING: Een plaat met 384 putjes werd op ijs geplaatst om synchronisatie van de reactie-initiatie mogelijk te maken wanneer de plaat met 384 putjes wordt overgebracht naar een voorverwarmde fluorescentie-microplaatlezer.

Resultaten

We belichten de kinetiek van het genereren van FAM-fluorescentiesignalen uit de gecombineerde detectie van s - en n-genen van SARS-CoV-2, en hoe de informatie werd gebruikt om optimale omstandigheden te bepalen voor gevriesdroogde, voorgemengde reactieformuleringen. In alle gevallen hebben we monsters opgenomen met_C-t-waarden die ruim binnen de bepaalde detectielimiet (LoD) liggen (C_t ~31-33), evenals die met_C-t op de LoD (C_t ~35-37)⁷, om differentiatie van protocollen met een betere gevoeligheid mogelijk te maken.

Voor gevriesdroogde, voorgemengde RT-RPA vonden we dat de opname van KOAc in de voorgemengde reactie de reactiegevoeligheid negatief beïnvloedde (Figuur 2A). Daarom hebben we KOAc weggelaten uit de voorgemengde reactie en toegevoegd met de reactie-initiator, Mg(OAc)₂, nadat het RNA-monster was toegevoegd. We gebruikten ook vergelijkbare tests om de optimale concentratie van een cryoprotectieve trehalose te bepalen (Figuur 2B) en de effecten van triglycine⁷ in de gevriesdroogde RT-RPA-reactie (Figuur 2C). Daarom werden optimaal gevriesdroogde, voorgemengde RT-RPA-reacties bereid met 6% trehalose, geen KOAc (maar het werd later na het RNA-monster toegevoegd) en aangevuld met triglycine, zoals beschreven in protocolsectie 1.

Figuur 2: Optimalisatie van gevriesdroogde, voorgemengde RT-RPA-reacties. De RT-RPA-reactie werd bereid met behulp van primers gericht op het n-gen van SAR-CoV-2. Mg(OAc)₂ werd uitgesloten van alle voorgemengde reacties. Effecten van (A) KOAc, (B) trehalose en (C) triglycine toegevoegd aan de voorgemengde reacties werden geëvalueerd. Reactiemonitoring via gegenereerde FAM-fluorescentie werd uitgevoerd met behulp van een real-time thermische cycler of een fluorescentie-microplaatlezer. Individuele gegevens van drievoudige metingen worden weergegeven. Afkortingen: RT = reverse transcriptie; RPA = versterking van recombinasepolymerase; CRISPR = geclusterde, regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindroomherhalingen; Cas = CRISPR-geassocieerd eiwit; SAR-CoV-2 = Ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2; C_t = cyclusdrempel; FAM = carboxyfluoresceïne. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor gevriesdroogde, voorgemengde reacties op basis van Cas13a hebben we het belang van het juiste cryoprotectieve middel geverifieerd: ofwel 6% trehalose ofwel 2% sucrose¹⁹ werkte goed, terwijl lagere sucrose met 1% of 5% w/v PEG20000 de reactie-efficiëntie na vriesdrogen niet behield (Figuur 3). MgCl₂ werd bij alle reacties weggelaten en werd toegevoegd bij de rehydratatiestap. De optimale gevriesdroogde op Cas13 gebaseerde detectiereactie werd voorbereid met 6% trehalose, zoals weergegeven in protocolsectie 2.

Figuur 3: Optimalisatie van gevriesdroogde, voorgemengde Cas13-gebaseerde detectiereacties. De detectiereactie werd uitgevoerd bij 37 °C met behulp van het RPA-product van het SARS-CoV-2 n-gen. De tests werden gedaan voor en na vriesdrogen. MgCl₂ werd uitgesloten van alle voorgemengde reacties. De capaciteiten van (A) trehalose, (B) PEG20000 en (C) sucrose bij het behouden van de reactie-efficiëntie na vriesdrogen werden geëvalueerd. Reactiemonitoring via gegenereerde FAM-fluorescentie werd uitgevoerd met behulp van een real-time thermische cycler. Individuele gegevens van drievoudige metingen voor de "na vriesdroog"-omstandigheden en één replicatie van de "vóór vriesdroog"-omstandigheden worden getoond. Figuur 3A,B is ontleend aan Patchsung et ^al.7. Afkortingen: RPA = recombinase polymerase amplification; SAR-CoV-2 = ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2; FAM = carboxyfluoresceïne. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De gevriesdroogde, voorgemengde reagentia voor RT-RPA- en Cas13-gebaseerde reacties zijn stabiel bij -20 °C gedurende ten minste 8 maanden [Figuur 4].

Figuur 4: Stabiliteitstests van gevriesdroogde, voorgemengde RPA- en CRISPR-Cas13a-reagentia bij -20 °C. Stabiliteitstest bij (A) 30 dagen, (B) 45 dagen, (C) 3 maanden, (D) 5 maanden, (E) 8 maanden. Individuele gegevens van drievoudige metingen worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De LoD van gevriesdroogde RT-RPA- en Cas13-gebaseerde reacties voor de detectie van s - en n-genen van SARS-CoV-2 wordt weergegeven in figuur 5. De kinetiek van signaalgeneratie kan worden verbeterd bij detectie van dubbele genen in vergelijking met wanneer slechts één gen wordt gedetecteerd.

Figuur 5: Analytische sensitiviteit van detectie van één gen versus twee genen. (A) De LoD van gevriesdroogde singleplex RT-RPA en Cas-gebaseerde detectie gericht op het s-gen van SAR-CoV-2. (B) De LoD van gevriesdroogde singleplex RT-RPA en Cas-gebaseerde detectie gericht op het n-gen van SAR-CoV-2. (C) De LoD van gevriesdroogde multiplex RT-RPA en dubbele Cas-gebaseerde detectie gericht op de s - en n-genen . De LoD werd bepaald met behulp van serieel verdunde SARS-CoV-2-RNA's, waarvan de_C-t-waarden werden bepaald met behulp van een RT-qPCR-test gericht op het n-gen . Individuele gegevens van 3-6 replicatiemetingen worden weergegeven. Afkortingen: LoD = detectielimiet; RT = omgekeerde transcriptie; RPA = versterking van recombinasepolymerase; CRISPR = geclusterde, regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindroomherhalingen; Cas = CRISPR-geassocieerd eiwit; SAR-CoV-2 = Ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2; C_t = cyclusdrempel; qPCR = kwantitatieve polymerasekettingreactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naast virusdetectie tonen we een prototype van een POC-genotyperingstool op basis van CRISPR-diagnostiek, om giftige slangensoorten te helpen identificeren die endemisch zijn voor Thailand (Figuur 6). Snellere en nauwkeurige identificatie van slangensoorten door middel van DNA-monsters die uit bijtwonden zijn verzameld, kan helpen bij de snelle toediening van antigif, waardoor de overlevingskans van de patiënt wordt verbeterd. We richtten ons op regio's binnen het mitochondriale cytochroom b (cytb) gen van acht slangensoorten, waaronder Ophiophagus hannah (Koningscobra) (Figuur 6A) en toonden aan dat detectie van synthetisch DNA-surrogaten van het O. hannah cytb-gen het attomolaire gevoeligheidsniveau kan bereiken (Figuur 6B,C).

Figuur 6: Een prototype voor CRISPR-gebaseerde detectie om slangensoorten te identificeren op basis van slangenbeetgif. (A) RPA-primers en LwaCas13a crRNA-ontwerp voor de detectie van het cytb-gen van Ophiophagus hannah. T7 promotor (T7 overhang) werd geplaatst aan het 5' uiteinde van de voorwaartse RPA-primer. (B) Kinetiek van FAM-signaalgeneratie gedurende 60 minuten en (C) eindpunt FAM-fluorescentie van LwaCas13a-gemedieerde detectie van synthetische dsDNA-inputs die overeenkomen met de cytb-gensegmenten van O. hannah. Er werden verschillende ingangsconcentraties (0, ^10-9, ^10-12, ^10-15 en ^10-18 M) gebruikt. De gegevens zijn gemiddelde ± s.d. van drievoudmetingen. Afkortingen: RPA = recombinase polymerase amplification; CRISPR = geclusterde, regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindroomherhalingen; Cas = CRISPR-geassocieerd eiwit; FAM = carboxyfluoresceïne. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vriesdrogen van CRISPR-Cas13a voorgemengde detectiereagentia
Stap	Helling tarief	Temperatuur op de plank	Tijd (uu:mm)	Stofzuiger
	(°C/min)	(°C)		(mbar)
Bevriezen 1	3	-30	af	-
Droog 1	3	-30	af	0
Droog 2	3	4	01:00	0
Droog 3	3	20	∞	0

Tabel 1: Lyofilisatorinstellingen van voorgemengde RT-RPA- en CRISPR-Cas13a-detectiereagentia. Afkortingen: RT = reverse transcriptie; RPA = versterking van recombinasepolymerase; CRISPR = geclusterde, regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindroomherhalingen; Cas = CRISPR-geassocieerd eiwit.

Parameter		Montuur
Temperatuur		37 °C
Kinetische cyclus	Duur tijd	02:00 uur (mm:ss)
	Intervaltijd	02:30 (mm:ss)
Bevend	Duur tijd	1 seconde
	Wijze	Lineair
	Amplitude	1 mm
Fluorescentie intensiteit	Excitatie golflengte	488 Nm
	De golflengte van de emissie	520 nm
	Wijze	Boven
	Z-positie	24470
	Behalen	71
	Integratietijd	20 μs
	Aantal flitsen	25

Tabel 2: Fluorescentie-microplaatlezerprogramma voor nucleïnezuurdetectie.

Discussie

Er zijn cruciale stappen in dit protocol. Voor gebiedsscheiding wordt aanbevolen om aparte ruimtes te gebruiken voor nucleïnezuurextractie, mastermix-bereiding (pre-amplificatiegebied), monstertoevoeging en amplicondetectie (post-amplificatiegebied). Elk gebied moet worden ingesteld met behulp van een afzonderlijke set gereedschappen en apparatuur. Breng geen gereedschap van het ene gebied naar het andere gebied, vooral niet van het post-versterkingsgebied naar het voorversterkingsgebied. Reiniging van werkgebieden is noodzakelijk: men moet werkgebieden, pipetten, vortexers en permanente markers reinigen met RNase/DNase-ontsmettingsoplossing/3% Clorox gevolgd door 70% ethanol of geautoclaveerd gedeïoniseerd water. Het wassen van basislaboratoriumgerei en verwijderbare onderdelen van instrumenten, zoals plastic rekken van 1,5 ml buisjes en de rotoradapter van een minicentrifuge, is vereist. Nucleasevrij water wordt gebruikt als negatieve controle en reactiecomponent, en is dus een gevoelig reagens dat besmet kan raken als er niet voorzichtig mee wordt omgegaan. Daarom raden we aan om kleine hoeveelheden water te maken die slechts één keer kunnen worden gebruikt.

Voer altijd een negatieve controlereactie uit met behulp van de analyseprimers om te controleren op verontreiniging. Om contaminatieproblemen te voorkomen, raden we bovendien aan om de negatieve controlereactie voor te bereiden door nucleasevrij water toe te voegen in het vooramplificatiegebied in plaats van in de monstertoevoegingsruimte. Het mengsel van magnesiumacetaat en kaliumacetaat moet worden gedoseerd in kleine hoeveelheden (~20 μl/buis) die slechts één keer worden gebruikt om besmetting met reagens met carryover-amplicons te voorkomen. Bij het toevoegen van het magnesium-kaliumacetaatmengsel aan gevriesdroogde premix RPA-reacties, raden we aan om de pipetpunt elke keer te vervangen. Voor de workflow van experimenten houdt u de workflow unidirectioneel, van experimenten vóór amplificatie tot experimenten na amplificatie. Ga van "schonere" (pre-amplificatie) werkruimten naar "vuilere" (post-amplificatie) werkruimten.

Voor aanpassingen en probleemoplossing van de methode om carry-over contaminatie van amplicons te voorkomen, raden we aan om de drie belangrijkste stappen van het experiment ruimtelijk te scheiden: voorbereiding van de RPA-reactie; monster toevoeging; en de versterkings- en detectiestappen. De mastermix moet worden bereid in een sjabloonvrije ruimte van het lab. Wissel bij het omkleden ook handschoenen en laboratoriumjassen om. Werk in één richting van pre- naar post-versterking. Vermijd het gebruik van dezelfde pipet voor verschillende stappen. Het is het beste als er verschillende sets pipetten worden opgesteld voor deze stappen: bereiding van mastermixen; toevoeging van het sjabloon DNA/RNA; en de overdracht van het versterkte product. Gebruik gefilterde tips, probeer aërosolvorming zoveel mogelijk te voorkomen en vermijd het aanraken van de binnenkant van de tube bij het openen. Als amplificatie-experimenten contaminatie aantonen, moeten alle reagentia worden vervangen. Ga indien mogelijk naar een ander laboratorium met verse reagentia en controleer of de besmetting aanhoudt. Neem behalve reagentia niets anders mee, inclusief pipetten. Probeer autoclaveren pipetten als ze autoclaveerbaar zijn.

Om de versterkingssnelheid (assay-optimalisatie) te verbeteren, raadpleegt u eerst de instructies van de fabrikant, zoals de RPA-handleiding van TwistDx om optimale ontwerpen te garanderen. Probeer vervolgens empirische optimalisaties van de reacties, zoals het toevoegen van reactieadditieven waarvan bekend is dat ze RPA- en CRISPR-reacties stimuleren⁷; het verhogen van de reactietijden (bijv. RPA-reactietijd tot 60 min); of variërende primersequenties en concentraties. We raden ook aan om zoveel mogelijk monstervolume toe te voegen; Door gebruik te maken van gevriesdroogde reagentia kan meer monstervolume worden toegevoegd. Om achtergrondfluorescentie te verminderen, kan men een warmte-inactiveringsstap uitvoeren (75 °C gedurende 5 minuten) nadat RPA is voltooid, voordat men overgaat tot detectie, of de concentratie van de reporter optimaliseren. Te veel verslaggever zal een hogere achtergrond geven. Daarnaast helpt het toevoegen van RNaseremmers Cas-onafhankelijke degradatie van de melder te voorkomen.

Naast het optimaliseren van (RT)-RPA- en CRISPR-gebaseerde reactieomstandigheden en hun hanteringsprocedures, moet men ervoor zorgen dat de gebruikte reagentia van goede kwaliteit zijn en dat de nucleïnezuurextractiestap die aan alle reacties voorafgaat, succesvol is. Gevriesdroogde reagentia bieden een hoge detectiegevoeligheid, zijn draagbaar, maken POC-testen mogelijk en kunnen worden toegepast op diverse klinische monsters. Bovendien kan gevriesdroogde (RT)-RPA onmiddellijk worden gerehydrateerd door het nucleïnezuurextract uit klinische monsters toe te voegen. Een eerdere studie toonde een hogere gevoeligheid aan bij het plaatsen van een groter volume nucleïnezuurinvoer zonder beperkt volume, waardoor de totale hoeveelheid doelnucleïnezuur effectief werd verhoogd.

Op CRISPR gebaseerde diagnostiek is aangepast om ziekteverwekkers te detecteren door klinische monsters te verzamelen, zoals nasofaryngeale en keeluitstrijkjes, urine en serum ^7,8,11. Het is ook toegepast om varianten van één nucleotide te onderscheiden, antibioticaresistentiegenen in antimicrobieel resistente organismen te identificeren en kanker-geassocieerde mutaties te detecteren. Het nut van de technologie is misschien wel het grootst in veldtoepassingen waar gemanipuleerde biochemische reacties voor isotherme amplificatie en op CRISPR gebaseerde detectie kunnen worden gecombineerd met veldklare apparaten en uitlezingen zoals een draagbare fluorometer of laterale stroomstrips.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaal
Betaine oplossing	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-behandeld water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Geproduceerd in eigen beheer		Stamnaam:Leptotrichia wadei, Afkorting: Lwa, Eiwitnaam: LwaCas13a
Magnesium chloride oplossing, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
Poly(ethyleenglycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Kaliumacetaatoplossing, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Oplossingsmix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Sucrose	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalose Dihydraat	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma hydrochloride oplossing, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic kit	TwistDx	TABAS03KIT
Apparatuur
BluPAD Dual LED Blauw/Wit lichttransilluminator	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Model: EL-02
Fluorescentie microplaatlezer	Tecan	30050303	Model: Infinite 200 Pro
Vriesdroger	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplaat 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bodem, klein volume, Hibase, Med. Binding, Zwart
Real-time thermische cyclus (CFX Connect Real-Time PCR Systeem)	Bio-Rad	185-5201	Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gen voorwaartse RPA-primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gen omgekeerde RPA-primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gen voorwaartse RPA-primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gen omgekeerde RPA-primer	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA voor het s-gen	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA voor het n-gen	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA-primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA-primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC