Hier presenteren we een protocol dat in vivo elektroporatie en denervatie van de craniale levator auris longus (LAL) spier combineert. Deze procedure maakt het mogelijk om de mogelijke rol van spiereiwitten bij de regeneratie van de neuromusculaire synaps te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gecombineerde in vivo elektroporatie en kortdurende reïnnervatie van de skeletspier van de craniale levator Auris longus
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De neuromusculaire junctie (NMJ) is de perifere synaps die de samentrekking van skeletspiervezels regelt om de gecoördineerde beweging van veel organismen mogelijk te maken. Bij het NMJ maakt een presynaptische motoraxonterminal contact met een postsynaptisch spierdomein en wordt bedekt door terminale Schwann-cellen. De integriteit en functie van de NMJ wordt aangetast onder verschillende omstandigheden, waaronder veroudering, neuromusculaire aandoeningen en traumatische verwondingen. Om de potentiële bijdrage van spier-afgeleide eiwitten aan het onderhoud en de regeneratie van NMJ te analyseren, is een in vivo genoverdrachtsstrategie gecombineerd met de denervatie van de craniale levator auris longus (LAL) spier na mechanisch zenuwletsel. Eerdere bevindingen toonden aan dat de geforceerde expressie van controlefluorescerende eiwitten de NMJ-organisatie of neurotransmissie niet verandert. Deze procedure heeft tot doel een gedetailleerde methode te beschrijven van in vivo elektroporatie van de LAL-spier, gevolgd door doorsnede of verplettering van de specifieke tak van de aangezichtszenuw die de schedelspieren innerverdrijft, wat leidt tot respectievelijk NMJ-denervatie en reïnnervatie. De combinatie van deze experimentele strategieën in de handige LAL-spier vormt een efficiënte methode om de mogelijke bijdrage van overexpressie of uitschakeling van spiereiwit te bestuderen in de context van NMJ-reïnnervatie op korte termijn.
Inleiding
De neuromusculaire junctie (NMJ) is de perifere synaps die de spiercontractie regelt en, indirect, de gecoördineerde beweging van organismen1. Het wordt gevormd door een presynaptisch motoraxon-terminal, een postsynaptisch spierdomein verrijkt met acetylcholinereceptoren (AChR's) en niet-myelinische terminale Schwann-cellen die het axon-uiteindebedekken 2,3,4. Bij NMJ-denervatie als gevolg van traumatisch perifeer zenuwletsel, ziekte of farmacologische interventie gaat de contractiele spieractiviteit verloren 5,6. Aangezien bepaalde permissieve micro-omgevingen tijdig en efficiënt functioneel herstel mogelijk maken, is de zoektocht naar eiwitten die het regeneratieproces kunnen helpen een permanente noodzaak. Hier zijn twee procedures gecombineerd om specifiek de mogelijke rol van het manipuleren van spiereiwitexpressie in de kortetermijnregeneratie van het NMJ na zenuwbeschadiging te evalueren.
De levator auris longus (LAL) spier, gelegen op het dorsale oppervlak van de schedel, is een dunne en platte spier die de beweging van de oorschelp regelt. De LAL-spier bestaat uit rostrale en caudale banden, die elk twee of drie lagen spiervezels bevatten 7,8. De achterste auriculaire tak van de aangezichtszenuw innerveert de LAL-spier en genereert een goed beschreven innervatiepatroon dat bestaat uit vijf rostrale (R1-R5) en twee caudale (C1-C2) innervatiegebieden 8,9,10. De LAL is een oppervlakkig blootgestelde en gemakkelijk toegankelijke spier, dus het gebruik ervan vereist minimaal invasieve procedures. Dit maakt visualisatie van het NMJ mogelijk met behulp van real-time microscopie, medicijnafgifte en de tussenkomst van volledige spierpreparaten, zowel in vivo als ex vivo11,12. Al met al maken deze kenmerken de LAL-spier tot een uitstekend model om NMJ-gedrag en -functie te bestuderen10,13.
In vivo elektroporatie is een techniek voor genoverdracht die de opname van exogeen DNA in het weefsel mogelijk maakt door de voorbijgaande permeabilisatie van celmembranen en de mobiliteit van DNA in de cellen, beide gegenereerd na het induceren van een elektrisch veld14,15. Deze procedure is lokaal en kan in elk stadium van de ontwikkeling van het dier worden uitgevoerd. Gezien de unieke kenmerken van de LAL-spier, vertegenwoordigt de in vivo elektroporatie een minimaal invasieve, zeer efficiënte en snelle procedure16, waardoor het mogelijk is om twee of drie dagen na elektroporatie een robuuste eiwitexpressie waar te nemen.
De procedure voor het verpletteren van de aangezichtszenuw is veel gebruikt in onderzoek omdat het verschillende voordelen biedt 5,17,18. Dit protocol is eerder aangepast om specifiek gericht te zijn op de achterste auriculaire tak van de aangezichtszenuw die de schedelspieren innerveert, inclusief de LAL-spier, om gezichtsverlamming te voorkomen; Bijgevolg hebben muizen na de operatie geen speciale zorg nodig (bijv. Oogzalf smeren voor het verlies van de knipperreflex). Aangezien NMJ-reïnnervatie van de LAL-spier begint tussen 7-9 dagen na verwonding6, is het een goed kortetermijnreïnnervatiemodel in vergelijking met het veelgebruikte zenuwverbrijzelingsmodel van de heupzenuw om de spieren van de achterpoten te denerveren, waar reïnnervatie ongeveer drie weken na zenuwbeschadiging optreedt18.
De combinatie van in vivo elektroporatie en aangezichtszenuwbeschadiging in de LAL-spier zal onderzoekers in staat stellen het gedrag van synaptische componenten tegen spierafgeleide eiwitmodulatie op verschillende tijdstippen van NMJ-regeneratie te evalueren, inclusief morfologische effecten op korte en lange termijn 6,16, door middel van een breed scala aan technieken, waaronder immunohistochemische, histologische en functionele assays.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Commissie bio-ethiek van de Universidad Austral de Chile, Chili (protocol nr. 503/2023), en volgden de normen die zijn opgelegd door de Commissie bio-ethiek van het Nationaal Agentschap voor Onderzoek en Ontwikkeling, Chili (ANID), evenals de richtlijnen van de Richtlijn van de Europese Raad voor de zorg voor proefdieren. In de huidige studie werden volwassen (3-6 maanden oude) CF-1-muizen van beide geslachten (30-45 g) gebruikt. Euthanasie werd bereikt door een overdosis inhalatie-anesthesie, gevolgd door verbloeding. De reagentia en apparatuur die in het onderzoek worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. In vivo LAL-spierelektroporatie
- Voorbereiding
- Verdoof de muis voorzichtig in een inductiekamer van acryl onder inademing van 2,5% isofluoraan met 0,8 l/min zuurstof (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Houd daarna de sedatie van de muis in stand met behulp van een neusbuismasker dat is aangesloten op een inhalatie-anesthesiemachine onder een ontleedstereomicroscoop.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de muis in slaap is voordat u de procedure start; Test de aanraakreflex van de muis door voorzichtig met een pincet in één voet te knijpen (doe deze stap elke keer na het induceren van anesthesie). - Desinfecteer het cervicale gebied ter hoogte van de sagittale hechting van de schedel met het antisepticum chloorhexidinegluconaat 2% en injecteer subcutaan 20 μL 2 mg/ml hyaluronidase in PBS met behulp van een Hamilton-spuit om de toegang van het DNA-plasmide tot het spieroppervlak te vergemakkelijken.
- Schakel de isofluoraanstroom uit en laat de muis gedurende 1 minuut zuivere zuurstof inademen.
- Weeg de muis om de juiste dosis Meloxicam te berekenen (zie stap 1.3.2.).
- Plaats het dier in een lege kooi (zonder bodembedekking) om te herstellen van de narcose.
- Breng het dier terug naar de normale huisvesting gedurende 30 min16.
- Verdoof de muis voorzichtig in een inductiekamer van acryl onder inademing van 2,5% isofluoraan met 0,8 l/min zuurstof (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Houd daarna de sedatie van de muis in stand met behulp van een neusbuismasker dat is aangesloten op een inhalatie-anesthesiemachine onder een ontleedstereomicroscoop.
- Chirurgische ingreep
- Verdoof de muis opnieuw door inademing van 2,5% isofluoraan met een zuurstofmengsel van 0,8 l/min (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) en houd het tijdens de chirurgische ingreep verdoofd met behulp van een inhalatie-anesthesieapparaat, onder een ontleedstereomicroscoop.
- Scheer het cervicale gebied met een tweesnijdend scheermesje en desinfecteer 3 keer met chloorhexidine en 70% ethanol.
- Maak een incisie van 8 mm over de sagittale hechting van de schedel en leg de LAL-spier bloot door het vet en bindweefsel dat zich net onder de huid bevindt voorzichtig te verwijderen met een schaar/pincet.
OPMERKING: De LAL-spier is de meest oppervlakkige spier in het craniale gebied na de incisie in de huid. Het is gemakkelijk te herkennen aan de oriëntatie van spiervezels die diagonaal van de middelste schedel naar elke oorschelp lopen 8,16. - Injecteer met een Hamilton-spuit 10 μl van het commercieel verkregen DNA (0,8-1 μg/μl) in PBS in de fascia die door de spier wordt verdeeld en een bel vormt.
- Plaats twee gouden naaldelektroden 5 mm uit elkaar, evenwijdig en over spiervezels, en beslaan de gehele lengte van de LAL-spier (Figuur 1A).
- Genereer met behulp van een elektroporator vijf pulsen van 100 V/cm met elk een duur van 20 ms, met een frequentie van 1 Hz.
- Herhaal de procedure in de contralaterale LAL-spier (herhaal stap 1.2.4-1.2.6).
- Hechten en herstel
- Hecht (5/0 rekgrootte, HR15 naald) de huid met resorbeerbare polyglycolzuurdraad.
- Injecteer subcutaan de pijnstiller Meloxicam in doses van 1-2 mg/kg gewicht om de pijn na de operatie te verminderen.
- Schakel de isofluoraanstroom uit en laat de muis gedurende 1 minuut zuivere zuurstof inademen.
- Plaats het dier in een lege kooi (zonder bodembedekking) om te herstellen van de narcose.
- Breng het dier terug naar zijn normale huisvesting en houd het gedurende 2 dagen na de operatie of tot zijn herstel in de gaten. Bewaak pijn- of stresssignalen en wijs scores toe voor elk van de verschillende parameters, rekening houdend met de eerder beschreven humane eindpuntcriteria19.
NOTITIE: Plaats de muis in een verwarmd kussentje bedekt met een chirurgisch kussentje om te voorkomen dat de lichaamstemperatuur tijdens de operatie daalt. Probeer niet langer dan 30 minuten de tijd te nemen voor de chirurgische ingreep, om te voorkomen dat de muis sterft door overmatige anesthesie. Als het tot expressie gebrachte eiwit lage fluorescentieniveaus oplevert, wordt aanbevolen om samen met een tracer (bijv. tdTomaat of GFP) in een verhouding van 1:5 te elektropoleren (tracer: interessant DNA).
2. Verplettering zenuwbeschadiging-geïnduceerde denervatie
OPMERKING: Dit protocol is een wijziging van een eerder beschreven protocol17. Voer deze procedure uit met een verschil van ten minste 3 dagen vanaf de elektroporatie. Afhankelijk van de onderzoeksvragen kan deze procedure voor of na elektroporatie worden uitgevoerd.
- Anesthesie en positionering van dieren
- Voer de sedatie van de dieren uit in een acrylinductiekamer onder inhalatie van 2,5% isofluoraan met 0,8 l/min zuurstof (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
- Weeg de muis om de dosis Meloxicam te berekenen (zie stap 2.3.2.).
- Handhaaf de sedatie van de muis met een neusbuismasker dat is aangesloten op een inhalatie-anesthesieapparaat onder een ontleedstereomicroscoop.
- Plaats de muis op zijn linkerzij (om de rechter LAL-spier te denerveren). Plak het rechteroor af in de richting van de neus om het achterste deel van de oorschelp bloot te leggen.
- Chirurgische ingreep
- Scheer het achterste deel van de oorschelp met een tweesnijdend scheermesje en desinfecteer 3 keer met chloorhexidine en 70% ethanol.
- Lokaliseer de achterste auriculaire ader en maak met een veerschaar een incisie in de huid, op 2 mm afstand ervan, van ongeveer 5 mm. Vermijd het doorsnijden van bloedvaten en/of spierweefsel.
- Knip het vet en bindweefsel af met een tang en een schaar. Zoek de spinale accessoire zenuw; ga door totdat de buik van de digastrische spier en de kraakbeenachtige gehoorgang (semi-transparant witachtig weefsel) zijn gevonden (Figuur 2A).
- Lokaliseer het begin van de aangezichtszenuw die zich net onder de digastrische spier vertakt.
- Volg de achterste auriculaire tak (de meest dorsale tak van de aangezichtszenuw) en verwijder voorzichtig het bindweefsel eromheen, waarbij u directe zenuwmanipulatie zorgvuldig vermijdt.
- Plet de achterste auriculaire tak van de aangezichtszenuw gedurende 30 s en oefen constante druk uit op de zenuw met een pincet met een schuine punt van 45°.
- Hechten en herstel
- Hecht (5/0 rekgrootte, HR15 naald) de huid met resorbeerbare polyglycolzuurdraad.
- Injecteer subcutaan de pijnstiller Meloxicam in doses van 1-2 mg/kg gewicht om de pijn na de operatie te verminderen.
- Verwijder de tape van het oor, schakel de isofluoraanstroom uit en laat de muis gedurende 1 minuut pure zuurstof inademen.
- Plaats het dier in een lege kooi (zonder bodembedekking) om te herstellen van de narcose.
- Plaats de muis terug in zijn normale behuizing en houd hem 2 dagen na de operatie of tot herstel in de gaten.
- Onderzoek de muis na herstel op fouten in de beweging van het aangedane oor als teken van efficiënte denervatie.
OPMERKING: Maak bij schijncontroledieren een incisie in de huid, leg de aangezichtszenuw bloot zonder deze direct aan te raken en hecht vervolgens aan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hoge fluorescentie-kwantumopbrengst van het tdTomato-eiwit20 maakt het een geschikte tracer voor elektroporatie-efficiëntie. Daarom werd de expressie van tdTomato-eiwit in LAL-spieren door in vivo elektroporatie geëvalueerd (Figuur 1). LAL-spieren werden 21 dagen na elektroporatie ontleed. Preparaten voor de hele montage tonen de dunne caudale band (cLAL, cyaanpolygoon) van de LAL-spier met zijn twee innervatiegebieden, en...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De combinatie van in vivo spierelektroporatie en denervatie is een waardevolle experimentele benadering voor het onderzoeken van een regeneratieve niche in de NMJ4. Aangezien de LAL-spier oppervlakkig wordt blootgesteld, kunnen deze gecombineerde procedures gemakkelijk worden aangevuld met de toediening van sondes of geneesmiddelen die de eiwitexpressie of -activiteit kunnen beïnvloeden12. Bovendien zou elektroporatie van reporterg...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken de zeer collaboratieve en stimulerende omgeving van de NeSt Lab-leden voor nuttige discussies en opmerkingen over dit werk. Het werk in het NeSt Lab wordt momenteel gefinancierd door FONDECYT 1221213. Het schema in figuur 1A is gemaakt met BioRender.com.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| #5/45 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Steriliseer voor gebruik |
| anti 2H3 | DSHB | Verdun 1 : 300 | |
| anti S100 Klaar voor gebruik | Dako | IR504 | Verdun 1 : 5 |
| anti SV2 | DSHB | Verdun 1 : 50 | |
| Chlorhexidine gluconate 2% | DifenPharma | ||
| Koud licht stereomicroscoop voor dissecties | Motic | Model SMZ-171 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Verdun 1 : 100 |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Steriliseer voor gebruik |
| Dumont Mini Forceps –Style 5 | Fine Science Tools | 11200-14 | Steriliseer voor gebruik |
| ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | ||
| Gold naald-type elektroden | Genetrodes, BTX | 45-0114 | 10 mm recht |
| Hamilton-spuit | Hamilton | 80400 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| Inhalatie-anesthesie-apparaat | SciVerma Scientific | M3000 Table Top | |
| Isofluraan | Baxter | 218-082 | |
| Muizen | Instituto de Salud Publica - Chile | Volwassen (3-6 maanden oude) CF-1 muizen, van beide geslachten (30-45 g) | |
| Scheermessen | Schick | ||
| Suture Glicosorb 5/0 | TAGUM | GS0812.J | Absorbeerbare polyglycolzuurdraad |
| tdTomato plasmid | Addgene | 54642 | tdTomato plasmid onder de controle van de CMV-promotor |
| Tramadol hydrochloride 5% (Triamcol) | Drag Pharma | ||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Steriliseer voor gebruik |
| WGA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | W7024 | Verdun |
| α-BTX Alexa Fluor 488 | Invitrogen | B13422 | Verdun 1 : 500 |
Referenties
- Slater, C. R. The functional organization of motor nerve terminals. Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: Coordinating partners with multiple functions. Nat Rev Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
- Zelada, D., Bermedo-Garcia, F., Collao, N., Henriquez, J. P. Motor function recovery: Deciphering a regenerative niche at the neuromuscular synapse. Biol Rev Camb Philos Soc. 96 (2), 752-766 (2021).
- Kobayashi, J., et al. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20 (7), 858-866 (1997).
- Bermedo-Garcia, F., Zelada, D., Martinez, E., Tabares, L., Henriquez, J. P. Functional regeneration of the murine neuromuscular synapse relies on long-lasting morphological adaptations. BMC Biol. 20 (1), 158(2022).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: A convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20 (11), 740-743 (2010).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol Appl Neurobiol. 36 (2), 133-156 (2010).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre-and postsynaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J Vis Exp. (55), e3124(2011).
- Zelada, D., Barrantes, F. J., Henríquez, J. P. Lithium causes differential effects on postsynaptic stability in normal and denervated neuromuscular synapses. Sci Rep. 11 (1), 17285(2021).
- Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, Pt 4 1081-1101 (2012).
- Mcmahon, J. M., Signori, E., Wells, K. E., Fazio, V. M., Wells, D. J. Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: Increased expression with reduced muscle damage. Gene Ther. 8 (16), 1264-1270 (2001).
- Difranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp. (32), e1520(2009).
- Ojeda, J., et al. The mouse levator auris longus muscle: An amenable model system to study the role of postsynaptic proteins to the maintenance and regeneration of the neuromuscular synapse. Front Cell Neurosci. 14, 225(2020).
- Olmstead, D. N., et al. Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury. J Vis Exp. (96), e52382(2015).
- Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp Neurol. 207 (1), 64-74 (2007).
- Lloyd, M., Wolfensohn, S. Practical use of distress scoring systems in the application of humane endpoints. Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research. , 48-53 (1999).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. Red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Perez, V., et al. The p75(ntr) neurotrophin receptor is required to organize the mature neuromuscular synapse by regulating synaptic vesicle availability. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 147(2019).
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. J Anat. 237 (5), 827-836 (2020).
- Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Rep. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biol. 6 (12), 160240(2016).
- Ma, C. H., et al. Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice. J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).
- Sakuma, M., et al. Lack of motor recovery after prolonged denervation of the neuromuscular junction is not due to regenerative failure. Eur J Neurosci. 43 (3), 451-462 (2016).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4262-4267 (1999).
- Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry A. 93 (5), 556-562 (2018).
- Morris, L. M., Klanke, C. A., Lang, S. A., Lim, F. Y., Crombleholme, T. M. Tdtomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 20 (11), 2776(2019).
- Pérez-García, M. J., Burden, S. J. Increasing musk activity delays denervation and improves motor function in ALS mice. Cell Rep. 2 (3), 497-502 (2012).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
